CN102008720B

CN102008720B - 抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法

Info

Publication number: CN102008720B
Application number: CN201010231142.0A
Authority: CN
Inventors: 刘松梅; 李一经; 葛俊伟; 朱延明
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2030-07-20
Also published as: CN102008720A

Abstract

抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法。目前免疫接种抗魏氏梭菌病的疫苗保护率较低。本发明包括：(1)以含编码魏氏梭菌毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌毒素基因，将获得的魏氏梭菌毒素基因和Ti或Ri质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti或Ri质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌或发根农杆菌，筛选、鉴定阳性重组农杆菌；(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的农杆菌分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株。

Description

抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法

技术领域：

本发明涉及一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法。

背景技术：

魏氏梭菌(Clostridium welchii)，又称产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是动物肠道正常菌群之一，也是引起魏氏梭菌病的原凶。其发病机理是在饲养环境和饲料突然改变等诱因下，肠道内魏氏梭菌大量繁殖，产生的毒素经消化道吸收，导致动物出现肠毒血症，坏死性肠炎，绵羊软肾病，仔猪红痢、羔羊痢疾、兔出血性下痢，创伤性气性坏疽，动物猝死症等。根据菌体分泌外毒素不同，将魏氏梭菌分为五个血清型，即A、B、C、D、E型(见表1)。外毒素是魏氏梭菌的毒力因子，目前已发现有15种之多，但致死性因子只有4种，即α、β、ε和ι，其中最根本、最重要的致病因子——α毒素(C.perfringens alpha toxin，CPA)是A～E型所共有的毒力因子。α毒素具有磷脂酶C(PhospholipaseC，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，能水解卵磷脂和鞘磷脂使细胞膜破裂，因而具有溶血性、细胞毒性、致死性和皮肤坏死等特性。

表1各型魏氏梭菌及其主要分泌毒素

注：“+”表示分泌毒素；“-”表示不分泌毒素。

自八十年代中期有报道以来，全国约有二十个多个省市的兔、牛、羊、猪群中出现了一种发病呈超急性经过，死亡快，死亡率高的顽症，根据其发病急、死亡快的特点定名为“猝死症”。农业部在90年代中期曾组织科研人员在山东、四川、河南、吉林、湖北、宁夏等地进行调查，经过对病原分离鉴定证明家畜“猝死症”与魏氏梭菌的感染有直接关系。我国各地每年反刍动物坏死性肠炎或肠毒血症、羔羊和仔猪红痢的发病率呈上升趋势，给养殖业带来了巨大的经济损失。魏氏梭菌对人类危害亦较大，特别是一次世界大战期间，受伤战士气性坏疽的发病率和死亡率都很高，气性坏疽以局部水肿、产气、肌肉坏死及全身中毒为特征，英国士兵中该病占外伤的比例高达12％，引发伤口感染夺去了15万军人的生命；在我国四川省汶川大地震中，很多人也因为伤口感染魏氏梭菌，产生气性坏疽而不得不截肢。同时，魏氏梭菌还能引起人类食物中毒，在美国等西方国家，魏氏梭菌引起的食物中毒排在第二位；在我们国家该菌引起的食物中毒，仅次于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

魏氏梭菌的致病性主要是外毒素作用而诱发的，抗生素只能对魏氏梭菌本身起作用，对细菌已经释放到血液中的毒素没有任何作用，这就导致本病一旦发生，往往来不及治疗即很快死亡，可见，预防魏氏梭菌病的意义远远大于治疗。为了防治魏氏梭菌引起的动物坏死性肠炎，目前通常采用的方法是在饲料中加入抗菌素类药物饲料添加剂，但这常常会带来兽药残留的问题，并且可能会导致耐药菌株的产生。所以，疫苗接种是预防该病的主要途径，生产高效保护性疫苗一直是研发的热点。目前普遍使用的类毒素疫苗、多联疫苗、基因工程疫苗，虽有一定效果但保护率都较低；常规疫苗还存在一定的缺陷，如灭活不彻底，毒力返强等风险，且成本较高，所以亟待一种新型治疗方法出现。

魏氏梭菌外毒素的化学成分为蛋白质，具有良好的免疫原性，国外研究表明类毒素疫苗对本病的预防能够达到确实可靠的效果。郭明章(1988)报道，家兔免疫魏氏梭菌菌苗后第5天血清中开始出现毒素抗体，1个月左右达最高峰为6.0log2。刘文波(2002)在国内首次研制了魏氏梭菌类毒素疫苗，家兔免疫后能产生较高水平的毒素抗体。柴同杰(2005)研究表明魏氏梭菌类毒素铝胶苗免疫家兔后第一周抗毒素水平为1.125log2，高峰时达到7.125log2，17周抗体效价为4.7log2。吕静(2009)对A型魏氏梭菌类毒素油乳剂疫苗和灭活菌苗免疫家兔进行比较，灭活菌苗接种部位均有肉芽肿现象，类毒素疫苗除个别有轻微肉芽肿外几乎未产生不良反应，可见油乳剂类毒素疫苗对动物安全性高；免疫后用强毒攻击，油乳剂类毒素疫苗保护率达到100％，未出现不良反应，灭活菌苗达到75％的保护率，且未死亡家兔精神不振，有轻微腹泻；免疫家兔后对抗体水平进行比较，油乳剂类毒素疫苗的免疫效果明显优于灭活菌苗，与国外Uzal研究基本一致。本发明抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗预防疾病的原理与类毒素疫苗相似。

目前对外毒素灭活常用的化学物质仍是甲醛，其灭活效果主要与甲醛的浓度、温度、作用时间和pH有关，采用高浓度甲醛和高温灭活，虽然能减少灭活时间，但对抗原的损失也很大，甲醛溶液具有还原作用能抑制蛋白质活性，还涉及到保留毒素的抗原性和最大限度地消除其毒性的问题，由于影响灭活的因素很多，很难达到一个理想的灭活条件。甲醛脱毒的魏氏梭菌α毒素类毒素免疫羊后，有保护作用，但类毒素中可能还含有魏氏梭菌的其它抗原成分，需要多次腹腔注射免疫，并且存在甲醛灭活不彻底造成魏氏梭菌对环境污染，最大问题在于类毒素诱发抗体产生所需时间常超过气性坏疽症状出现的时间。同时，灭活疫苗不易刺激机体产生局部黏膜免疫，介导细胞免疫能力较弱，降低了灭活疫苗的免疫效力，而且制造工艺较繁琐，必须经过非口服途径接种才能诱导机体产生循环性抗体，难以产生分泌型局部抗体，因此不能阻挡毒素从黏膜吸收进入机体。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能口服的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法。本发明针对魏氏梭菌病的发病机理，即由于肠道内魏氏梭菌快速繁殖而产生大量毒素，经消化道吸收引发全身性中毒反应的特点，设计将魏氏梭菌毒素基因转入植物，通过口服转基因植物疫苗，有效刺激肠道黏膜免疫系统，阻断致病因子入侵机体的首要防线，为科学预防魏氏梭菌病提供新的途径。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，该方法包括：

(1)以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将获得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pA(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404/pA)：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2010130，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。

(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的根瘤农杆菌pA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、 Northern blot或Western blot鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。

所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，步骤(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti质粒也可以采用Ri质粒，同时所述的根瘤农杆菌采用发根农杆菌。

所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，步骤(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或农作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜蓿，所述的蔬菜包括马铃薯，所述的农作物包括玉米，所述的水果包括西红柿，所述的模式植物包括烟草。

一种利用上述的方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服，还为将植物表达的蛋白抗原经提取、加工成口服或注射制剂使用。

一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，该方法包括：

(1)以含黏膜佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得黏膜佐剂LT-B基因，以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将所述的黏膜佐剂LT-B基因与所述的魏氏梭菌α毒素基因融合获得融合基因，将获得融合基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pLA(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404/pLA)：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2010131，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。

(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的根瘤农杆菌pLA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot或Western blot鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。

所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，步骤(1)中所述的大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)也可以采用霍乱毒素B亚基(CT-B)。

一种利用上述方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服，还为将植物表达的蛋白抗原经提取、加工成口服或注射制剂使用。

这个技术方案有以下有益效果：

1、本发明比传统免疫途径更安全，不需要针头和注射器之类的设备。针头和注射器不仅花费资金，而且不安全。如果使用没经过消毒的针头和注射器，很可能通过它们传播血液传染性疾病。其他疫苗在大规模细胞培养或繁殖过程中，很容易发生病原微生物特别是霉形体的污染，而转基因植物疫苗不存在这一问题，因为植物病毒不感染动物。

2、本发明比传统免疫途径更方便，直接口服即可。传统免疫途径必须经过非口服途径接种才能诱导机体产生循环性抗体IgG，难以产生分泌型IgA局部抗体，因此不能阻挡毒素从黏膜吸收进入机体，而口服免疫可以产生分泌型IgA。

3、本发明不仅提供疫苗，而且提供营养。利用转基因植物生产的口服疫苗，不仅提供了抗原蛋白，而且提供了丰富的营养物质，动物食用后有助于提高机体免疫力。

4、本发明比传统免疫途径更有效。植物疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，直接到达肠内粘膜诱导部位，刺激粘膜和全身免疫反应，传统的非经肠道疫苗几乎不能产生特异的粘膜免疫。在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接用抗原诱发免疫反应可大大提高其有效性。

5、本发明比传统疫苗更易于储存和分发，不需要冷藏和低温运输。不仅节省了冷藏设备，降低了成本，而且使用方便，可随时长期给药，给药过程非常方便，避免了繁琐的免疫程序。而且与传统疫苗相比，给药范围更广，既可用于人和家畜，还可用于野生食草性动物。

6、本发明生产成本更低廉，不需要复杂的医疗设备，易大规模生产。疫苗抗原基因转入可食用的植物后，只需适宜的场地、水、肥和少量农药就可以大规模生产，不需象传统生产疫苗那样进行严格的分离纯化。通过简单的无性繁殖可获得大批植物疫苗，节约许多仪器和设备，生产成本显著降低，对于缺乏资金的发展中国家来说，尤其是个喜讯。

7、本发明与其他疫苗相比，具有完整的真核表达系统，使表达产物具有较好的免疫原性和生物活性。转基因植物能对蛋白质能进行准确的翻译后加工修饰，使三维空间结构更趋于自然状态，表达的抗原与感染动物抗原有相似的免疫原性和生物活性。

8、本发明构建了魏氏梭菌α毒素基因植物表达载体pA，同时构建了大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)和魏氏梭菌α毒素融合基因植物表达载体pLA，通过冻融法成功转入根瘤农杆菌LBA 4404，通过农杆菌介导法获得转化苜蓿，经Basta除草剂筛选，获得除草剂抗性苜蓿经PCR检测、PCR产物测序、SDS-PAGE和Western blot鉴定，证明转基因苜蓿表达了目的基因蛋白。

9、将表达抗原蛋白的转基因苜蓿进行无性繁殖，共获得克隆三代，经0.02％Basta除草剂筛选、PCR和Western blot鉴定，证明重组抗原100％能在转基因苜蓿克隆后代中稳定表达并遗传。

10、用pA和pLA转基因苜蓿口服免疫本源动物兔子和小鼠，结果表明两种转基因苜蓿表达系统均能诱导本源动物产生血清抗体IgG，刺激黏膜系统分泌IgA抗体，且具有免疫原性；带有粘膜免疫佐剂LT-B的α毒素具有更好的免疫原性；转基因苜蓿表达的α毒素抗原蛋白安全无毒，能刺激机体产生免疫保护作用，抵抗致病性A型产气荚膜梭菌α毒素的强毒攻击，诱导机体产生的IgG血清抗体能有效中和A型产气荚膜梭菌分泌的天然毒素，为转基因植物口服疫苗的研发提供物质基础。

附图说明：

附图1是免疫兔子血清中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgG水平。

附图2是免疫小鼠血清中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgG水平。

附图3是免疫兔子粪便中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图4是免疫小鼠粪便中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图5是免疫兔子外生殖道冲洗液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图6是免疫小鼠外生殖道冲洗液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图7是免疫兔子鼻腔冲洗液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图8是免疫小鼠鼻腔冲洗液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白IgA水平。

附图9是免疫小鼠眼冲洗液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白sIgA水平。

附图10是免疫小鼠肠黏液中特异性抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白sIgA水平。

具体实施方式：

实施例1：

抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，该方法包括：

(1)以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将获得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pA：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2010130。

(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的根瘤农杆菌pA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot或Western blot鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。

实施例2：

(1)以含黏膜佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得黏膜佐剂LT-B基因，以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将所述的黏膜佐剂LT-B基因与所述的魏氏梭菌α毒素基因融合获得融合基因，将获得融合基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pLA：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2010131。

实施例3：

1试验材料

1.1质粒和菌种

质粒pET-30b-a含有魏氏梭菌α毒素基因序列，由本实验室构建；质粒pLT-b含有大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)基因序列，由本实验室葛俊伟老师构建；植物表达型载体p33EG含有E12启动子序列、增强翻译的Ω序列、抗PPT(Phosphinothricin)除草剂的Bar基因、原核表达NptⅡ(Km抗性)基因及根瘤农杆菌LBA 4404由东北农业大学生命科学学院朱延明教授惠赠；A型魏氏梭菌(C57-1)购自中国兽医药品监察所。

1.2抗体制剂

抗魏氏梭菌α毒素兔血清、小鼠血清和抗大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)小鼠血清由本实验室制备；HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗鼠IgA、HRP标记的羊抗兔IgA、HRP标记的羊抗兔IgG均购自sigma公司。

1.3酶制剂

rTaq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、BmaHI、SacI、XbaI等限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司。

1.4生化试剂及试剂盒

DNA MarkerDL2000、DNA MarkerDL15000、预染Protein Marker(118～19kDa)、Protein Marker(116.0～14.0kDa)等购自大连宝生物工程有限公司；小量质粒DNA提取试剂盒、小量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；CTAB、6-Benzylaminopurine(6-BA)、IBA、Basta、Glufosinate-ammonium等生化试剂购自Sigma公司；卡那霉素(Km)、链霉素(Sm)、利福平(Rif)等购自北京索莱宝生物公司。

1.5试验动物和植物

6～8周龄BALB/c小鼠(16±2g)为清洁级，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；45天左右未免疫家兔(1±0.2kg)，购自哈尔滨医科大学附属第二医院。

肇东紫花苜蓿种子由东北农业大学朱延明教授惠赠。

1.6引物合成

以质粒pET-30b-a(含有编码魏氏梭菌α毒素蛋白基因)为模板，根据植物表达载体酶切位点及植物密码子使用的偏爱性，应用oligo6.0软件设计一对引物P1和P2如表1-1所示：

表1-1引物序列

下划线部分为设计的酶切位点：P1、P3引入BamHI，P2引入SacI，P4、P5引入XbaI；

方框部分为：P1、P3引入Kozak序列，P2引入SEKDEL序列，P4引入Linker序列。

以质粒pLT-b(大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位)为模板，根据植物表达载体、连接α毒素基因酶切位点及植物密码子使用的偏爱性，应用软件设计一对引物P3和P4；以质粒pET-30b-a为模板，根据植物表达载体及连接LT-B毒素基因酶切位点，应用软件设计一条上游引物P5；以α毒素部分基因为模板，应用软件设计一对用于检测该基因表达的引物P6和P7。

2试验方法

2.1魏氏梭菌α毒素基因植物表达载体的构建

2.1.1PCR扩增α毒素基因

(1)pET-30b-a质粒的提取

采用LB平板划线法活化-70℃保存的菌种BL21(DE3)pET-30b-a，挑取单菌落，接种于5mL含50mg/LKm的LB培养基中，220r/min 37℃培养过夜。利用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒pET-30b-a，-20℃保存备用。

(2)α毒素基因的获得

以pET-30b-a质粒为模版，P1和P2为引物，PCR扩增α毒素目的基因

反应总体积 50.0μL

pET-30b-a模板 1μL

EX Taq DNA聚合酶 0.5μL

10×EX PCR Buffer 5μL

引物P1(25pmol/μL) 1μL

引物P2(25pmol/μL) 1μL

dNTP 4μL

去离子水 37.5μL

反应条件为：95℃预变性5min后进入PCR循环，94℃变性1min，53.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察PCR扩增结果：获得约930bp的α毒素目的基因片段。

2.1.2α毒素基因与植物表达载体的连接

(1)植物表达载体与目的基因的双酶切

植物表达载体为Ti质粒，采用LB平板划线法活化-70℃保存的菌种p33EG/JM109，挑取单菌落，接种于5mL含50mg/L Km的LB培养基中，220r/min37℃培养过夜。利用质粒DNA小量提取试剂盒提取p33EG质粒。取25μLα毒素目的基因的PCR产物，加50μL无水乙醇沉淀30min，12000r/min离心10min，弃上清，加70％乙醇200μL洗沉淀2次，待沉淀干燥后，同时取p33EG质粒7μL按下列体系进行双酶切。

PCR产物沉淀 p33EG质粒 7μL

BamH I 1μL BamH I 1μL

Sac I 1μL Sac I 1μL

10×KBuffer 1μL 10×K Buffer 1μL

ddH₂O 17μL ddH₂O 10μL

BamH I/SacI双酶切总体系为20μL，37℃水浴4h，PCR及p33EG质粒双酶切产物分别与10×Loading Buffer3μL混匀，取2μL样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察结果：p33EG获得约12500bp和1800bp基因片段。

(2)胶回收与连接

电泳结束后，分别切下含有目的片段的凝胶，用小量DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，回收产物-20℃保存备用。经胶回收试剂盒回收的α毒素基因PCR酶切产物与植物表达载体p33EG质粒酶切大片段连接，连接反应体系如下：

总体系 20μL

p33EG质粒酶切大片段 2μL

α毒素基因PCR酶切产物 6μL

T4 DNALigase 1μL

10×Ligase Buffer 2μL

ddH₂O 9μL

轻轻混匀后，将其置于连接仪中，16℃水浴连接过夜，连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞。随机挑取若干LB转化平板中的菌落，接种于5mL含 50mg/LKm的LB培养基中，220r/min 37℃培养过夜，提取质粒备用。

(3)重组植物表达载体的筛选与鉴定

对重组质粒pa进行BamHI和SacI单、双酶切鉴定及PCR和测序鉴定。

①单酶切鉴定

BamHI单酶切体系 SacI单酶切体系

pa质粒 2μL pa质粒 2μL

BamHI 1μL SacI 1μL

10×K Buffer 1μL 10×L Buffer 1μL

ddH₂O 6μL ddH₂O 6μL

单酶切总体系为10μL，37℃水浴2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察结果：获得约13430bp目的片段。

②双酶切鉴定

pa质粒 4μL

BamHI 1μL

SacI 1μL

10×K Buffer 1μL

ddH₂O 13μL

双酶切总体系为20μL，37℃水浴4h，0.8％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果：获得约12500bp和930bp目的基因片段。

③PCR鉴定(总体系25μL)

pa模板 0.5μL

rTaq DNA聚合酶 0.5μL

10×PCR Buffer 2.5μL

引物P1(25pmol/μL) 0.5μL

引物P2(25pmol/μL) 0.5μL

dNTP 2.0μL

去离子水 18.5μL

反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，53.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察PCR结果：获得约930bp目的基因片段。

④测序鉴定

将酶切鉴定和PCR鉴定均为阳性的菌株进行测序，测序结果与预期完全一致。

2.1.3LT-B和α毒素融合基因与植物表达载体的连接

(1)目的基因的获得

以pLT-b质粒为模版，P3和P4为引物，PCR扩增LT-B目的基因：

反应总体积 50.0μL

pLT-b模板 1μL

EX Taq DNA聚合酶 0.5μL

10×EX PCR Buffer 5μL

引物P3(25pmol/μL) 1μL

引物P4(25pmol/μL) 1μL

dNTP 4μL

去离子水 37.5μL

反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，47.5℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。1.5％琼脂糖胶电泳，观察结果：获得约340bp的LT-B目的基因片段。

以pET-30b-a质粒为模版，P5和P2为两侧引物，PCR扩增α毒素目的基因：

反应总体积 50.0μL

pET-30b-a模板 1μL

EX Taq DNA聚合酶 0.5μL

10×EX PCR Buffer 5μL

引物P5(25pmol/μL) 1μL

引物P2(25pmol/μL) 1μL

dNTP 4μL

去离子水 37.5μL

反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，53.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。0.8％琼脂糖胶电泳，观察结果：获得约930bp的α毒素目的基因片段。

(2)目的基因与植物表达载体的酶切与连接

分别取7μLT-B和α毒素基因的PCR产物混匀，加30μL无水乙醇沉淀30min，12000r/min离心10min，弃上清，加70％乙醇100μL洗沉淀2次，待沉淀干燥后，按下列体系进行BamH I、Xba I和Sac I三酶切。

目的基因PCR产物沉淀

BamHI 1μL

XbaI 1μL

SacI 1μL

10×K Buffer 1μL

ddH₂O 16μL

三酶切总体系为20μL，37℃水浴4h，PCR酶切产物全部进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，分别切下含有目的片段的凝胶，用小量DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，经胶回收试剂盒回收的LT-B和α毒素基因PCR三酶切产物与植物表达载体p33EG质粒双酶切大片段连接，20μL连接反应体系如下：

p33EG质粒双酶切大片段 2μL

LT-B基因PCR三酶切产物 3μL

α毒素基因PCR三酶切产物 3μL

T4 DNA Ligase 1μL

10×Ligase Buffer 2μL

ddH₂O 9μL

轻轻混匀后，将其置于连接仪中，16℃水浴连接过夜，连接产物用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞。随机挑取若干LB转化平板中的菌落，接种于5mL含50mg/LKm的LB培养基中，220r/min 37℃培养过夜，利用试剂盒提取质粒。

(3)重组植物表达载体的鉴定

对重组质粒pla进行BamHI和SacI单、双酶切鉴定，PCR鉴定总体系(50μL)：

pla模板 1μL

rTaq DNA聚合酶 0.5μL

10×PCR Buffer 5μL

引物P3(25pmol/μL) 1μL

引物P2(25pmol/μL) 1μL

dNTP 4μL

ddH₂O 37.5μL

反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果：pla经BamHI和SacI单酶切，获得约13770bp目的片段；pla经BamHI和SacII双酶切，获得约12500bp和1270bp基因片段；PCR扩增获得约1270bp目的片段。

测序鉴定：将酶切鉴定和PCR鉴定均为阳性的菌株测序，结果与预期一致。

2.2α毒素基因转化苜蓿及其表达蛋白的鉴定

2.2.1目的基因冻融法转化农杆菌

(1)制备农杆菌感受态细胞

将-70℃保存的农杆菌LBA4404菌液解冻，划线接菌于YEB固体培养基；挑取农杆菌单菌落接种于5mL含有50mg/LSm、50mg/L Rif的YEB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜；上述菌液按1∶10比例接种于50mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中继续培养，直至OD₆₀₀为0.5左右；4℃、5000r/min离心5min，弃上清；转入无菌离心管，用20mmol/L CaCl₂100μL重悬菌体，冰浴30min；4℃、5000r/min离心5min，弃上清；用1mL冷的CaCl₂(20mmol/L) 悬浮，分装成100μL/管，加入100μL预冷的40％甘油，液氮速冻后至-70℃保存。

(2)冻融法转化农杆菌

取1μL提纯的目的基因重组质粒pa和pla，分别加入100μL LBA4404农杆菌感受态细胞中混匀；冰浴5min，液氮冷冻8min，迅速至37℃温浴8min；加YEB液体培养基600μL，28℃，200r/min预表达4～5h；3000r/min离心5min，去大部分上清，将剩余约50μL菌液用移液器转至含有100mg/LKm、50mg/LSm、50mg/LRif的YEB固体培养基上涂匀；28℃、200r/min，培养48～96h。

(3)PCR筛选和鉴定重组农杆菌

以冻融法转化平板上长出的单菌落为模板，用目的基因特异性引物进行PCR扩增，PCR反应体系和程序同2.1，将重组质粒转化阳性的农杆菌命名为pA，将重组质粒pla转化阳性的农杆菌命名为pLA。

2.2.2目的基因农杆菌介导法转化苜蓿

(1)外植体的培养

种子的消毒和春化：将精选的苜蓿种子充分洗涤，70％酒精消毒1min，0.1％升汞表面消毒15min，倒掉废液后加入两滴吐温，于摇床上105r/min震荡15min，用无菌水冲洗4～5遍，最后用水浸没种子，4℃冰箱中保存48h以上，取出，接种于种子萌发培养基上，培养条件为26℃，1500lx，16h/d光照。然后是子叶节的剪切：接种后6～7d，待子叶完全展开，于子叶节下1mm处剪下，撕开两片子叶接种于不定芽诱导培养基上，预培养3～4d，材料切口处刚膨大时即可进行侵染。

(2)农杆菌的侵染

将pA和pLA重组农杆菌接种于附加100mg/LKm，50mg/L Sm，50mg/LRif的YEB固体培养基上，26℃暗培养至长出单菌落。用接菌环挑取单菌落，接种在5mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，200r/min 28℃培养过夜，待菌液长至OD₆₀₀为0.4～0.6时，按1∶10的比例接种于新鲜上述培养基中振荡培养，进行二次活化。当OD₆₀₀为0.5～0.6时，吸取菌液于无菌离心管中，2000r/min离心10min，去上清，用等体积的YEB液体培养基重悬，备用。取预培养3～4d的外植体于无菌三角瓶内，加入适量重悬的菌液，150r/min，28℃，侵染15min。侵染过的外植体接种在附加100mg/L Awei acid的芽诱导培养基上，在26℃暗处共培养3～4d，以肉眼可见菌落为准。

(3)除菌及幼苗的培养

取经过共培养的外植体于无菌三角瓶内，用附加100mg/L阿莫西林钠克拉维酸钾除菌剂的液体冲洗3～4次，再转移到附加0.5mg/LGlufosinate-ammonium的除菌筛选培养基上。培养条件为26℃，1500lx，16h/d光照。筛选培养2周后，外植体的转化细胞将分化出抗性芽，将其转入相应的不定芽伸长培养基中进行继代培养。将经过继代培养的幼苗，植入生根培养基中培养，直至生根。将生根的、长到瓶口的无菌苗，转移至草炭∶土壤＝1∶3的苗钵中培养，长到一定程度后移植到花盆中，于温室中继续培养，最后获得238株转化苜蓿植株，其中转pA的苜蓿131株，转pLA的苜蓿107株。

2.2.3除草剂Basta筛选转化苜蓿

(1)筛选用Basta浓度的确定

18％商用Basta除草剂加去离子水配制成梯度浓度：0.07％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％。以未转基因苜蓿植株为对照，将叶片上分别涂抹不同浓度的Basta，2天后观察结果：涂抹0.07％、0.05％和0.04％的叶片均出现严重药害反应，说明浓度过高，不适于筛选转基因苜蓿；涂抹0.01％的叶片没有反应，说明浓度过低，也不适于筛选转基因苜蓿；涂抹0.03％和0.02％的叶片药害反应适中，初步确定除草剂Basta的筛选浓度为0.03％。

(2)Basta筛选转化苜蓿

将18％商用Basta除草剂配制成0.02％的浓度，利用喷雾器均匀喷涂转化苜蓿，同时以未转基因苜蓿为对照，将存活下来的苜蓿视为转基因苜蓿。0.03％商用Basta除草剂初步喷涂38株转化苜蓿，同时以未转基因苜蓿为对照。喷后7天，未转基因苜蓿迅速枯萎发黄，绝大多数转化苜蓿的茎和叶也都出现严重药害反应，只有少数苜蓿仍保持绿色。喷后15天，转化苜蓿的茎和叶几乎全部枯干，绿色苜蓿也因药害的进一步作用而枯萎，可见0.03％的筛选浓度仍然过高，决定采用0.02％的筛选浓度喷涂余下200株转化苜蓿。0.02％商用Basta除草剂喷涂200株转化苜蓿，同时以未转基因苜蓿为对照。喷后15天，未转基因苜蓿逐渐枯萎死亡，转化苜蓿的茎和叶也都有不同程度的枯萎，但绝大部分转化苜蓿能很快萌发出嫩芽，进一步长成新的植株；只有少数部分与未转基因苜蓿一样全部枯萎，最后因为根部腐烂而死亡。将存活下来的苜蓿视为抗除草剂转化苜蓿，共获201株转基因苜蓿，其中转pA的116株，转pLA的85株。

2.2.4PCR筛选和鉴定转基因苜蓿

(1)CTAB法提取苜蓿基因组DNA

取0.05g新鲜苜蓿叶片于1.5mL离心管中，液氮研磨。加预热65℃的2×CTAB900mL，65℃水浴20min，每隔2min摇匀一次，取出冷却至室温。加氯仿∶异戊醇(24∶1)500mL混合摇匀，4℃、7500r/min、离心10min，重复一遍。取上清，加1/10体积3mol/LNaAC和等体积的异丙醇，轻摇至絮状沉淀出现。离心，弃上清，用70％乙醇清洗2次，室温干燥1h，沉淀溶于50μL无菌去离子水中。

(2)PCR筛选和测序鉴定转基因苜蓿

以转基因苜蓿基因组DNA为模板，用α毒素基因通用性引物进行PCR扩增：

总体积 25.0μL

转基因苜蓿基因组DNA 0.5μL

rTaq DNA聚合酶 0.5μL

10×PCR Buffer 2.5μL

引物P6(25pmol/μL) 0.5μL

引物P7(25pmol/μL) 0.5μL

dNTP 2.0μL

MgCl₂(25mmol/L) 2.5μL

ddH₂O 16.0μL

随机抽取pA和pLA转化苜蓿各30株，以其基因组为模板进行PCR筛选和鉴定，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，52.8℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果：共获得51株α毒素阳性转基因苜蓿，其中转pA阳性的24株，转pLA阳性的27株。以27株苜蓿为模板，进行LT-B目的基因的检测，结果获得21株PCR阳性苜蓿。将阳性植株的PCR产物进行测序，测序结果与预期一致。

2.2.5苜蓿表达α毒素蛋白的鉴定

(1)苜蓿表达蛋白的SDS-PAGE分析

诱导重组大肠杆菌表达α毒素蛋白：挑取单个重组菌落BL21(DE3)pET-30b-a，接种到含50mg/LKm的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日，1％接种含50mg/LKm的LB培养基中。37℃培养至OD₆₀₀约为0.5时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，37℃诱导培养2h。所有样品8000r/min离心5min，100μL PBS重悬，加2×SDS上样缓冲液(含DTT)100μL，充分混匀，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳。

提取苜蓿表达蛋白：取对照未转基因苜蓿和PCR鉴定为阳性的转基因苜蓿叶片各0.5g置组织匀浆器中，未转基因苜蓿蛋白作对照，加入1mL植物蛋白提取液，冰浴，迅速研磨，收集于1.5mL离心管中，4℃、12000r/min、离心20min。取50μL上清，加入2×SDS上样缓冲液(含DTT)50μL，充分混匀，煮沸10min，蛋白质标准分子量为参考，进行SDS-PAGE电泳。

10μL样品加入样品孔中，以蛋白质标准分子量作为参考，进行电泳，初始电压为90V，待指示剂进入分离胶时，电压提高至120V，至电泳结束；取出凝胶，经考马斯亮蓝染色、脱色后，观察目的蛋白表达效果：重组菌BL21(DE3)pET-30b-a经IPTG诱导菌液与pA转基因苜蓿蛋白均有35kD左右的α毒素蛋白泳带，而未转基因苜蓿蛋白无，初步证明目的蛋白获得表达。

(2)苜蓿表达蛋白的Western blot鉴定

重组大肠杆菌表达的α毒素蛋白和苜蓿蛋白经SDS-PAGE分析后，进一步用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达，一抗为1∶100稀释的兔抗魏氏梭菌α毒素血清，二抗为1∶3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，观察显色结果：在表达蛋白的预期位置均出现明显颜色反应，说明利用转基因植物表达的蛋白也可被兔血清中魏氏梭菌α毒素抗体所识别，表明重组α毒素蛋白在苜蓿中获得了有效表达，而且表达的蛋白和原核表达蛋白一样具有抗原特异性。

2.3α毒素转基因苜蓿遗传稳定性的研究

2.3.1转基因苜蓿的克隆

选取PCR鉴定、测序鉴定和Western blot鉴定均为阳性的pA和pLA转基因苜蓿各1株，挑选健壮的枝条各3个用剪刀剪下，插入到液体生根培养基中进行生根培养。过20天左右根部生成，待根部强壮时植入苗钵中继续培养，一段时间后种到花盆中，从而获得转基因苜蓿克隆一代，同样获得克隆二代和克隆三代。

2.3.2转基因苜蓿克隆后代的筛选和鉴定

待转基因苜蓿克隆后代长到一定高度后，进行0.02％Basta筛选、PCR鉴定，结果100％为阳性。进一步将鉴定为阳性的pA和pLA转基因苜蓿一代蛋白样品各5μL混合上样、二代和三代样品同样混合上样，以1∶100稀释的LT-B和α- 毒素混合小鼠高免血清为一抗，1∶3000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot鉴定。结果出现两条预期大小的免疫反应带：pA阳性苜蓿克隆后代均出现约35kD的α毒素蛋白带，pLA阳性苜蓿克隆后代均出现约45kD的LTB-α毒素融合蛋白带，而未转基因苜蓿蛋白无此反应，证明通过无性繁殖获得的转基因苜蓿克隆后代具有稳定的遗传特性。

2.4口服α毒素转基因苜蓿免疫学指标的测定

2.4.1α毒素转基因苜蓿免疫试验动物

(1)口服免疫用苜蓿的制备

苜蓿汁的制备：采集pA和pLA转基因苜蓿及未转基因苜蓿的新鲜叶片，分别准确称量，加PBS溶液至0.4g/mL，组织捣碎机搅拌至稀糊状，八层纱布过滤，每次免疫时现用现制，滤汁4℃备用。

苜蓿兔粮的制备：采集pA和pLA转基因苜蓿及未转基因苜蓿的新鲜叶片和嫩枝，阴凉处自然风干，中药粉碎机粉碎至粉末状，准确称重，按1∶10的比例分别添加到普通兔粮中，干燥后备用。

(2)试验小鼠分组及其免疫

试验鼠分为3组，每组24只(雌雄各半)。试验Ⅰ组每只小鼠日灌服一次苜蓿汁200μL(0.08g/日鲜叶)转pA的苜蓿汁；试验Ⅱ组口服同等剂量转pLA的苜蓿汁；试验III组口服同等剂量未转基因的苜蓿汁，每次连续免疫7d，每日1次，共免疫五次，前三次免疫时间间隔1周，后两次免疫时间间隔3周。

(3)试验兔子分组及其免疫

试验兔分为3组，每组6只(均为雌兔)。试验Ⅰ组每只兔子饲喂100g(200g/日鲜叶)转pA的苜蓿兔粮，每日1次；试验Ⅱ组饲喂同等剂量转pLA的苜蓿兔粮；试验III组饲喂同等剂量未转基因的苜蓿兔粮，每次连续免疫7d，共免疫三次，每次免疫时间间隔1周；后又免疫两次，由饲喂苜蓿兔粮改为口服苜蓿汁，每只兔子日口服5mL苜蓿汁(2g/日鲜叶)，免疫时间间隔3周。

2.4.2免疫动物血清中特异性抗体IgG的测定

(1)样品处理

免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集免疫小鼠和免疫兔子血液，37℃促凝1h，4℃静止过夜，4000r/min离心5min，收集血清，-40℃保存备用。

(2)制备重组大肠杆菌表达的α毒素蛋白抗原

BL21(DE3)pET-30b-a菌液经IPATG诱导后进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，切下α毒素蛋白目的带，电洗脱过夜，紫外分光光度计测定洗脱蛋白含量(17mg/mL)，按1000倍稀释后作为抗原用于ELISA检测。

(3)ELISA检测

将重组大肠杆菌表达的魏氏梭菌α毒素蛋白以1∶1000稀释，取100μL/孔作为抗原包被ELISA反应板，4℃包被过夜；用含有5％脱脂乳的PBS液37℃封闭过夜；加入100μL/孔1∶100稀释的鼠或兔血清样品，37℃反应1h；加入1∶3000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔IgG100μL/孔，37℃反应1h加入OPD-H₂O₂底物显色液100μL/孔，37℃避光显色5～10min，加入50μL/孔终止液后，酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收(OD₄₉₀)值。

在连续五次口服免疫转基因pA和pLA苜蓿后，兔子和小鼠均产生了抗魏氏梭菌α毒素蛋白较高水平的IgG抗体，如附图1和附图2所示：分别于免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集口服转基因苜蓿和未转基因苜蓿免疫组兔子和小鼠血清样本1∶100稀释，以重组大肠杆菌表达的魏氏梭菌α毒素蛋白作为抗原，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组样本中的IgG水平。兔子血清样本中IgG抗体水平持续升高，但兔子前三免升高速度缓慢(免疫兔粮)，后两免升高速度较快(免疫苜蓿汁)。小鼠血清样本中IgG抗体水平上升速度相对较为平稳(均免疫苜蓿汁)，持续2周后有所下降(见第57天)。从诱导IgG抗体水平看，转基因苜蓿免疫组均明显高于未转基因苜蓿免疫组，免疫pLA转基因苜蓿组均好于免疫pA转基因苜蓿组。

2.4.3免疫动物特异性抗体IgA测定

(1)样品处理

粪便样品的处理：分别于免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集兔子和小鼠粪便，以免疫小组为单位，每0.1g粪便加入0.4mL粪便裂解液(含0.05mol/LEDTA-Na₂的PBS)，置于振荡器上，振荡4～5h，4℃浸润过夜。10000r/min离心5min，收集上清，-20℃保存待用。

外生殖道冲洗液的收集：分别于免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集兔子和小鼠外生殖道洗液，以免疫小组为单位，用200μLPBS反复冲洗兔子和雌性小鼠外生殖道，收集洗液，-20℃保存待用。

鼻冲洗液的收集：分别于免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集兔子和小鼠鼻冲洗液，以免疫小组为单位，用300μL和100μL PBS分别反复冲洗兔子和小鼠鼻腔，收集冲洗液，-20℃保存待用。

眼冲洗液的收集：分别于免疫第0、15、29、43、57、71、99天采集小鼠眼冲洗液，以免疫小组为单位，用50μLPBS反复冲洗小鼠眼结膜，收集冲洗液，-20℃保存待用。

肠黏液的收集：免疫第99天每个免疫组随机抽取四只小鼠，无菌条件下眼球采集血液，血清用于α毒素抗体中和试验；同时解剖小鼠，剪下无粪便的小肠，收集黏液，用PBS适当稀释，-20℃保存。

(2)ELISA检测

将重组大肠杆菌表达的魏氏梭菌α毒素蛋白1∶1000稀释，取100μL/孔作为抗原包被96孔聚苯乙烯微量板，4℃包被过夜；用含5％脱脂乳的PBS液37℃封闭，过夜；分别加入处理好的100μL/孔粪便上清液、眼冲洗液或鼻冲洗液、外生殖道冲洗液及小鼠肠黏液，37℃反应1h；加入1∶3000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔IgA100μL/孔，37℃反应1h；加入OPD-H₂O₂底物显色液100μL/孔，37℃避光显色15min，加入100μL/孔终止液后，酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收(OD₄₉₀)值。

①兔子和小鼠粪便中抗α毒素特异性sIgA检测结果

如附图3和附图4所示，连续五次免疫后，兔子和小鼠均产生了抗A型魏氏梭菌α毒素蛋白sIgA抗体，每次免疫后1周(见第15、29、43、71和99天)取的粪便样本中sIgA抗体水平持续升高。兔子前三免抗体sIgA水平升高速度同样缓慢，后两免升高速度较快，这与口服免疫方式不同有关。小鼠五免抗体sIgA水平上升速度也相对平稳，抗体水平持续2周后同样有所下降(见第57天)。从诱导sIgA抗体水平看，pLA转基因苜蓿组高于pA组。

②兔子和小鼠外生殖道冲洗液中抗α毒素特异性sIgA检测结果

如附图5和附图6所示，兔子样品在前三免sIgA抗体水平上升速度缓慢，于第57天出现下降；在第四次加强免疫后sIgA抗体水平急剧上升，这与口服方式发生改变有关。相比粪便样品中sIgA抗体水平要高，可能与粪便样品处理方式有关。小鼠外生殖道冲洗液样品中sIgA抗体水平上升速度相对稳定，首次免疫后即出现较高水平的抗体，加强免疫后抗体水平持续升高，但后两次加强免疫升高速度趋缓，可能与间隔时间延长1周有关；小鼠生殖道冲洗液sIgA抗体水平相对低于粪便样本。

③兔子和小鼠鼻腔冲洗液中抗α毒素特异性sIgA检测结果

如附图7和附图8所示，sIgA抗体水平总体分泌趋势与粪便样品和外生殖道冲洗液相同，与血清IgG水平几乎同步。兔子鼻腔较大，冲洗液混浊，蛋白含量多，sIgA表达水平相对比粪便样品和外生殖道冲洗液样品要高一些。而小鼠鼻腔虽然较小，但收集样品时会混有部分唾液，所以sIgA检测水平比外生殖道冲洗液也要高一些。

④小鼠眼部冲洗液和肠黏液中抗α毒素特异性sIgA检测结果

如附图9所示，sIgA抗体水平分析结果与粪便样品、外生殖道冲洗液和鼻腔冲洗液相同，但由于眼部采样相对小鼠较为痛苦，取样量不多，所以相对其他样品抗体含量不是很高，但总体趋势相同。

免疫第99天采集小鼠肠黏液，1∶5稀释，用重组大肠杆菌表达的魏氏梭菌α毒素蛋白做为抗原，以未免疫小鼠肠黏液作对照，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果见附图10，从诱导sIgA抗体水平看，免疫pLA转基因苜蓿组要高于pA转基因苜蓿组，口服未转基因苜蓿也会产生少量抗体，说明苜蓿多糖有一定佐剂作用。

2.5A型魏氏梭菌致病性试验

2.5.1A型魏氏梭菌形态学鉴定

取-70℃保存的A型魏氏梭菌株划线于血平板上，厌氧、37℃培养过夜。挑取溶血环较大的单菌落接种于5mL新鲜肉肝胃酶消化汤中，加入2mL无菌液体石蜡，37℃厌氧、静止培养24h，涂片镜检，观察A型魏氏梭菌菌体形态。

2.5.2A型魏氏梭菌致病能力提高试验

如果A型魏氏梭菌的毒力非常弱，甚至无治病性，则需要通过毒力恢复和提高试验：取200μL活化的A型魏氏梭菌腹腔注射2只BALB/c小鼠，隔天注射一次。三次后小鼠如果仍然不死，无菌条件下取其肝脏于血平板上划线，37℃厌氧、静止培养过夜，次日涂片镜检，选取形态正确、溶血环增大的单菌落接种于新鲜肉肝胃酶消化汤中，37℃厌氧、静止过夜。次日涂片镜检，以2只小鼠重复致病性试验，直至200μLA型魏氏梭菌α-毒素腹腔注射后，小鼠24h时内死亡。

2.5.3A型魏氏梭菌α-毒素致病性试验

将形态正确的A型魏氏梭菌以1∶10培养接种于新鲜肉肝胃酶消化汤中，加入2mL无菌液体石蜡，37℃厌氧、静止培养7h，取α-毒素上清10μL、50μL和200μL分别腹腔注射3只BALB/c小鼠；取α-毒素上清50μL、300μL和500μL分别耳静脉注射3只兔子，注射后至少观察24h，记录并判断A型魏氏梭菌α-毒素的毒力。

表2-1A型魏氏梭菌α-毒素的致病性试验

注射剂量(小鼠) 死亡数量死亡时间注射剂量(兔子) 死亡数量死亡时间

10μL(3只) 0 0 50μL(2只) 0 0

50μL(3只) 2 16～42h 300μL(2只) 2 15～38h

200μL(3只) 3 8～12h 500μL(2只) 2 6～11h

注射50μL的3只未免疫小鼠中有2只出现腹泻、拒食，24h内死亡一只，48h内死亡一只，还有一只在注射3h后精神萎靡、拒绝进食、行动迟缓、呼吸加速，约12h后缓慢恢复，24h后正常进食；注射200μL毒素的3只小鼠在12h内全部死亡，证明毒素剂量偏大；而注射10μL毒素的3只小鼠在24h内均正常进食，无任何异常反应，说明该剂量偏低。同样，注射300μL的2只兔子均出现腹泻、拒食拒水，24h内死亡一只，48h内死亡一只；而注射50μL毒素的2只兔子在24h内均可正常进食，说明使用剂量偏低。

2.6免疫动物攻毒素试验和血清抗体中和试验

2.6.1免疫攻毒用试验动物

致死量测定用动物：与免疫组同龄未免疫BALB/c小鼠或同龄未免疫兔子。

攻毒用试验动物：五免后1周的免疫小鼠，将每个免疫组随机分成六个小组，每个小组四只小鼠(雌雄各半)，五个小组用于攻毒试验，另一小组通过眼部采血获得大量血清用于α-毒素抗体中和试验；五免后1周的兔子全部用于攻毒。

2.6.2A型魏氏梭菌α-毒素攻毒试验

(1)A型魏氏梭菌α-毒素致死量的测定

取A型魏氏梭菌静止培养物α-毒素上清，按15μL、25μL、50μL、100μL、150μL和200μL六个不同剂量腹腔注射6组小白鼠；按50μL、100μL、300μL和 500μL四个不同剂量耳静脉注射4组兔子，注射后至少观察24h，判断A型魏氏梭菌α-毒素的致死量：未免疫小鼠A型魏氏梭菌α-毒素的最小致死量(minimum lethal dose，MLD)为25μL，半数致死量(LD₅₀)为50μL，绝对致死量(LD₁₀₀)为150μL；未免疫兔子A型魏氏梭菌α-毒素的MLD为100μL，LD50为300μL，LD₁₀₀为500μL。

表2-2α-毒素致死量的测定实验

剂量(μL) 小鼠数量死亡数量剂量(μL) 兔子数量死亡数量

15 3 0 50 2 0

25 4 1

50 4 2 100 3 1

100 4 3 300 4 2

150 4 4 500 4 4

200 3 3

(2)攻毒感染试验

五次免疫结束后1周即第99天，对试验Ⅰ～III组及未免疫组试验动物进行魏氏梭菌α-毒素攻毒试验。每个实验组中的20只小鼠随机分成五组，分别腹腔注射2MLD、4MLD、6MLD、8MLD和10MLD的α-毒素；将每个实验组中的6只兔子随机分成三组，每个实验组中的2只兔子耳静脉注射3MLD、5MLD和7MLD的α-毒素，至少观察24h，根据结果判断口服转基因苜蓿的免疫保护效果。五免小鼠于免疫后1周(第99天)采完样后，按表2-3分组，每组四只小鼠，分别腹腔注射不同倍数MLD的α-毒素进行攻毒试验。

表2-3魏氏梭菌α-毒素对小鼠的攻毒试验

组别 2MLD 4MLD 6MLD 8MLD 10MLD

pLA苜蓿免疫组 0 0 0 0 1

pA苜蓿免疫组 0 0 0 1 2

未转基因苜蓿免疫组 1 2 3 4 4

未免疫组 2 3 4 4 4

攻毒后小鼠死亡结果显示：pA组能完全抵抗6MLD(相当于LD₁₀₀)A型魏氏梭菌α-毒素的攻击，8MLD攻击时保护率为75％，10MLD攻击时保护率为50％；pLA免疫组至少能抵抗8MLD的A型魏氏梭菌α-毒素攻击，10MLD攻击时保护率为75％；而未免疫组小鼠经6MLD攻击后24h内全部死亡，表明转基因苜蓿免疫小鼠能抵抗天然A型魏氏梭菌α-毒素的强毒攻击，产生良好的免疫保护作用。

表2-4魏氏梭菌对兔子的攻毒感染试验

组别 3MLD 5MLD 7MLD

pLA苜蓿免疫组 0 0 1

pA苜蓿免疫组 0 1 2

未转基因苜蓿免疫组 1 2 2

未免疫组 2 2 2

兔子于五次免疫后1周耳静脉注射不同倍数MLD的A型魏氏梭菌α-毒素，进行攻毒试验。攻毒后兔子死亡结果(表2-4)显示：pA免疫组至少能抵抗3MLD(相当于LD₅₀)A型魏氏梭菌α-毒素的攻击，5MLD(相当于LD₁₀₀)攻击时保护率为50％，pLA组能完全抵抗5MLD(相当于LD₁₀₀)的攻击，7MLD攻击时保护率为50％，而未转基因苜蓿免疫组和阴性对照未免疫组经5MLD攻击后均在24h内全部死亡，表明转基因苜蓿免疫兔子后能够产生免疫保护作用。

2.6.3A型魏氏梭菌α-毒素抗体中和试验

A型魏氏梭菌强毒株以1∶10接种于肉肝胃酶消化汤，37℃厌氧、静止培养7h，取培养液α-毒素上清用于抗体中和试验。

表2-5小鼠抗体中和试验

组别死亡小鼠(只) 保护率(％)

等量无菌生理盐水 5 0

稀释10倍未免疫鼠血清 5 0

稀释10倍未转基因苜蓿免疫鼠血清 4 20

稀释10倍转pA苜蓿免疫鼠血清 2 60

稀释10倍pLA转苜蓿免疫鼠血清 1 80

取五免后1周采集的转pA苜蓿免疫鼠血清、转pLA苜蓿免疫鼠血清、未转基因苜蓿免疫鼠血清及未免疫阴性鼠血清，用无菌生理盐水稀释10倍，分别与等量6MLD(相当于LD₁₀₀)A型魏氏梭菌α-毒素混合，无菌生理盐水作为对照，37℃作用30min。每组分别取150μL腹腔注射BALB/c小鼠5只，至少观察24h，记录死亡及存活情况。攻24h后小鼠死亡结果(表2-5)显示：稀释10倍的pA免疫组血清在中和6MLDA型魏氏梭菌α-毒素攻击时保护率为60％，pLA免疫组稀释血清保护率为80％，而未免疫组及生理盐水组在6MLD攻击后，小鼠24h内全部死亡，表明转基因苜蓿免疫小鼠血清中存在较高α毒素抗体，稀释10倍后仍能中和大部分α毒素，起到了免疫保护作用。

Claims

1.一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是：该方法包括：

（1）以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将获得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pA：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO: M 2010130；

（2）苜蓿种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤（1）中重组的根瘤农杆菌pA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot 或Western blot鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。

2.一种利用权利要求1的方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，其特征是：所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服疫苗，口服免疫产生分泌型IgA，或者将植物表达的蛋白抗原经提取、加工成口服或注射制剂使用。

3.一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是：该方法包括：

（1）以含黏膜佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位（LT-B）的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得黏膜佐剂LT-B基因，以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将所述的黏膜佐剂LT-B基因与所述的魏氏梭菌α毒素基因融合获得融合基因，将获得融合基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌pLA：已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO: M 2010131；

（2）苜蓿种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤（1）中重组的根瘤农杆菌pLA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot 或Western blot鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。

4.一种利用权利要求3方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，其特征是：所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服，口服免疫产生分泌型IgA，或者将植物表达的蛋白抗原经提取、加工成口服或注射制剂使用。