CN102008016B

CN102008016B - 益生菌固体粉剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102008016B
Application number: CN201010535819XA
Authority: CN
Inventors: 周岩民; 孙亚楠; 王龙昌; 王恬
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: CN102008016A

Abstract

本发明公开了一种益生菌固体粉剂及其制备方法，该益生菌固体粉剂为含有活性益生菌和活性沸石混合物，活性益生菌的含量为120～500亿CFU/g。活性沸石混合物中各组分的重量百分含量为：沸石30％～50％、凹凸棒石黏土20％～40％、膨润土10％～30％。该益生菌固体粉剂为养殖业提供优质、价廉的抗生素替代产品，在每克饲料中添加100～400万CFU活菌的益生菌固体粉剂能提高肉鸡、猪和鱼类的生长速度2.0～15.6％，提高饲料转化率1.1～9.3％，并可明显降低动物的腹泻率和死亡率；其制备方法简单、成本低、可减少环境污染、所得产品菌含量高。

Description

益生菌固体粉剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种益生菌固体粉剂及其制备方法。

背景技术

益生菌通过改善肠道内微生物平衡而发挥作用，是可以直接饲喂动物的有益活体微生物，益生菌应用于饲料中具有安全、环保、促进动物生长、抑制病原菌繁殖、预防消化道疾病、增强动物免疫机能、提高饲料利用率、补充营养、改善水环境、清除毒素等功效。

目前，饲料中应用的益生菌均为固体粉剂产品。益生菌的生产工艺主要有固体发酵法和液体发酵法两种。固体发酵所用原料多为农产品加工副产物，来源丰富，价格低廉，具有投资少、技术要求较低等特点，但所生产的产品含活菌数少，纯度低。液体发酵生产益生菌产品效率高、生物活性物质种类多、活菌数和纯度高，但生产工艺复杂、设备投资大、能耗高，特别是用于饲料中的益生菌需制成固体粉剂，而将发酵液中益生菌制成粉剂产品主要采用真空冷冻干燥或喷雾干燥技术，设备要求高，投入大，生产成本高，且在高温干燥过程中会造成部分活菌失活，影响产品中的有效活菌数量。本发明旨在提供一种新的由液体益生菌生产成固体粉剂产品的方法，以解决传统工艺中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种益生菌固体粉剂。

本发明的另一目的在于提供一种益生菌固体粉剂的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种益生菌固体粉剂，其在于该益生菌固体粉剂含有益生菌和活性沸石混合物，所述的活性沸石混合物中各组分的重量百分含量为：沸石30％～50％、凹凸棒石黏土20％～40％、膨润土10％～30％。

上述的益生菌固体粉剂，其在于所述的在该益生菌固体粉剂中活性益生菌的含量为120～500亿CFU/g(CFU为菌落形成单位)。

上述的益生菌固体粉剂，其在于所述的益生菌为芽孢杆菌。所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

一种益生菌固体粉剂的制备方法，其在于该方法包括以下步骤：按重量百分数计将益生菌发酵液60％～95％和活性沸石混合物5％～40％混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载、静置、过滤分离，将分离得到的固体物料在45～70℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎至颗粒细度≤0.1毫米，即制得益生菌固体粉剂。

上述的益生菌固体粉剂的制备方法，其在于搅拌转速为100～200转/分，加温负载时温度为20～50℃，吸附时间为5～60分钟。

上述的益生菌固体粉剂的制备方法，其在于所述的活性沸石混合物各组分的重量百分含量为：沸石30％～50％、凹凸棒石黏土20％～40％、膨润土10％～30％。

上述的益生菌固体粉剂的制备方法，其在于所述的益生菌发酵液中活性益生菌的含量为50～100亿CFU/g。

上述的益生菌固体粉剂的制备方法，其在于所述的益生菌为芽孢杆菌。所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明内容的详细说明：

益生菌固体粉剂的生产方法是发酵、吸附、分离、干燥、粉碎、包装为成品。

益生菌固体粉剂由益生菌、沸石、凹凸棒石黏土、膨润土组成。

益生菌是一种活的微生物饲料添加剂，通过改善肠道内微生物的平衡而发挥作用。

沸石是呈架状结构的多孔性含水铝硅酸盐晶体的总称，由硅铝氧四面体相互连接形成架状硅铝氧骨架，并在其中形成许多孔道和孔穴，比表面积大，具有选择性吸附和择形催化特性；沸石表面还有很大的色散力和静电力，故其吸附力较大；沸石亦具有较大的阳离子交换容量、催化、热稳定性，并可吸附胃肠道中细菌毒素和霉菌毒素。研究表明，沸石应用于饲料和养殖业中，对动物无任何毒副作用，可促进动物生长、吸附有毒有害物质、增强动物免疫力、预防疾病、提高动物产品品质和养殖经济效益，并具有改善环境的作用。

凹凸棒石黏土具有独特的吸附、脱色、悬浮、触变、胶体、充填、流变性、热稳定性、黏性和抗盐性等性能，具有较大的层间距或孔径。

膨润土吸水后体积膨胀，体积能膨胀增大几倍到十几倍，膨润土在水介质中能分散呈胶体悬浮液，这种悬浮液具有一定的粘滞性和触变性。

沸石、凹凸棒石黏土和膨润土共同改性处理后，不但能大量吸附和寄生益生菌发酵液中的益生菌，还有利于进行益生菌固体粉剂的干燥处理。

琼脂主要作用是使液体培养基凝固。

蛋白胨由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物，主要为微生物提供氮源和维生素。

葡萄糖为微生物提供碳源和能源。

牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素。

酵母膏富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素，主要作用是补充氮源，提供微生物生长所需的各种维生素、氨基酸及生长因子。

氯化钠提供营养元素钠和氯，并维持渗透压。

磷酸氢二钾为磷、钾的来源，同时作为缓冲系统维持培养基的pH值。

硫酸镁作为缓冲剂降低pH值的变化速度，达到稳定酸碱度的作用。镁是畜禽体内参与造骨过程和肌肉收缩时不可缺少的因子，对畜禽体内的物质代谢和神经功能起着极其重要的作用。

本发明通过下述技术方案予以实现：

1、益生菌固体粉剂的生产方法：将益生菌固体粉剂的配料进行混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载，搅拌转速控制在100～200转/分，温度控制在20～50℃，吸附时间控制在5～60分钟，静置5～20分钟后用滤布过滤分离，分离得到的固体物料在45～70℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎，粉碎后的粉状物料颗粒细度≤0.1毫米，将粉状物料包装为益生菌固体粉剂成品；

所述益生菌固体粉剂的配料按重量百分比由下列组分组成：益生菌发酵液60～95％，活性沸石混合物5～40％。

2、所述益生菌发酵液的生产方法：

(1)在无菌条件下，将保藏的益生菌菌种置于细菌培养箱内的选择分离培养基中，细菌培养箱温度控制在36～38℃，恒温培养14～18小时，冷却后放入冰箱内作生产菌种保存，冰箱温度控制在2～4℃；

选择分离培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：琼脂1～3％、蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖0.2～0.8％、牛肉膏0.2～0.8％、酵母膏0.2～0.8％、氯化钠0.2～0.8％和水93～96％；

生产菌种的配料按重量百分比由下列组分组成：益生菌菌种1～10％和选择分离培养基90～99％。

(2)在无菌条件下，将生产菌种转接到有扩培培养基的茄子瓶斜面上，放入细菌培养箱内，细菌培养箱温度控制在36～38℃，恒温培养10～14小时，至斜面长满较厚、不透明且有明显皱纹的菌苔后为扩培后的菌种；

扩培培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：土豆汁16～22％、豆芽汁8～12％、葡萄糖1～3％、琼脂1.8～2.2％、蛋白胨0.5～1.5％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.02～0.08％和水60～70％；

扩培菌种的配料按重量百分比由下列组分组成：生产菌种1～10％和扩培培养基90～99％。

(3)将扩培后的菌种加入含有基础培养基的液体发酵罐中进行发酵，发酵时间控制在16～32小时，温度控制在36～38℃，发酵后的液体为益生菌发酵液；

基础培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：葡萄糖1～3％、蛋白胨0.5～1.5％、氯化钠0.2～0.8％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、硫酸镁0.02～0.08％和水94～98％；

益生菌发酵的配料按重量百分比由下列组分组成：扩培后的菌种1～10％和基础培养基90～99％；

益生菌发酵过程中，发酵液中的菌体量与发酵液在660nm处吸光值成正比，吸光值上升，菌体量增加，继续进行发酵，吸光值下降则表明菌体量不再增加，终止发酵。

3、所述活性沸石混合物的生产方法：(1)将沸石混合物的配料混合后进行破碎，破碎后的颗粒细度≤2毫米；(2)将破碎后的沸石混合物输入焙烧炉中进行焙烧，焙烧温度控制为280～400℃；(3)将焙烧后的沸石混合物输入磨粉机中进行磨粉，磨粉后的颗粒细度≤0.074毫米，包装为活性沸石混合物备用；

沸石混合物的配料按重量百分比由下列组分组成：沸石30～50％、凹凸棒石黏土20～40％和膨润土10～30％。

本发明的有益效果：

本发明的益生菌固体粉剂，活菌数可达到120～500亿CFU/g，而常规固体发酵法和液体发酵法生产的益生菌活菌数只有50～100亿CFU/g。

本发明的益生菌固体粉剂的制备方法，能简化分离提纯工艺、提高益生菌产品的活菌数和质量、降低生产成本、减少环境污染，为养殖业提供优质、价廉的抗生素替代产品。

将益生菌固体粉剂添加于饲料中，动物摄入的益生菌在肠道中通过与有害菌竞争氧、营养或定植位点，抑制有害菌增殖，从而改善肠内菌群的平衡，对动物具有促进生长、提高饲料转化率、抗氧化、免疫刺激、改善健康、预防疾病、治疗疾病、提高产品品质和养殖经济效益等作用，并具有改善水环境的作用。

试验证明：在每克饲料中添加100～400万CFU活菌的益生菌固体粉剂能提高肉鸡、猪和鱼类的生长速度2.0～15.6％，提高饲料转化率1.1～9.3％，并可明显降低动物的腹泻率和死亡率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1制备沸石混合物

(1)将沸石混合物的配料按以下重量百分比：沸石40％、凹凸棒石黏土35％和膨润土25％混合后进行破碎，破碎后的颗粒细度≤2毫米；(2)将破碎后的沸石混合物输入焙烧炉中进行焙烧，焙烧温度控制为300～320℃；(3)将焙烧后的沸石混合物输入磨粉机中进行磨粉，磨粉后的颗粒细度≤0.074毫米，包装为活性沸石混合物备用。

实施例2制备芽孢杆菌发酵液

2.1制备枯草芽孢杆菌发酵液

(1)在无菌条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种置于细菌培养箱内的选择分离培养基中，细菌培养箱温度控制在37～38℃，恒温培养15～16小时，冷却后放入冰箱内作生产菌种保存，冰箱温度控制在3～4℃；

选择分离培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：琼脂2.4％、蛋白胨1.3％、葡萄糖0.6％、牛肉膏0.4％、酵母膏0.4％、氯化钠0.3％和水95％；

生产菌种的配料按重量百分比由下列组分组成：枯草芽孢杆菌菌种6％和选择分离培养基94％。

(2)在无菌条件下，将生产菌种转接到有扩培培养基的茄子瓶斜面上，放入细菌培养箱内，细菌培养箱温度控制在37～38℃，恒温培养12～13小时，至斜面长满较厚、不透明且有明显皱纹的菌苔后为扩培后的菌种；

扩培培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：土豆汁18％、豆芽汁10％、葡萄糖2％、琼脂1.8％、蛋白胨1.1％、磷酸氢二钾0.08％、硫酸镁0.02％和水67％；

扩培菌种的配料按重量百分比由下列组分组成：生产菌种7％和扩培培养基93％。

(3)将扩培后的菌种加入含有基础培养基的液体发酵罐中进行发酵，发酵时间控制在26～28小时，温度控制在37～38℃，发酵后的液体为枯草芽孢杆菌发酵液；

基础培养基的配料按重量百分比由下列组分组成：葡萄糖2.4％、蛋白胨1.3％、氯化钠0.2％、磷酸氢二钾0.06％、硫酸镁0.04％和水96％；

枯草芽孢杆菌发酵的配料按重量百分比由下列组分组成：扩培后的菌种8％和基础培养基92％；

枯草芽孢杆菌发酵过程中，发酵液中的菌体量与发酵液在660nm处吸光值成正比，吸光值上升，菌体量增加，继续进行发酵，吸光值下降则表明菌体量不再增加，终止发酵。

测得枯草芽孢杆菌的发酵液中活菌数含量为86亿CFU/g。

2.2制备地衣芽孢杆菌发酵液

(1)在无菌条件下，将保藏的地衣芽孢杆菌菌种置于细菌培养箱内的选择分离培养基中，细菌培养箱温度控制在37～38℃，恒温培养15～16小时，冷却后放入冰箱内作生产菌种保存，冰箱温度控制在3～4℃；

生产菌种的配料按重量百分比由下列组分组成：地衣芽孢杆菌菌种6％和选择分离培养基94％。

(3)将扩培后的菌种加入含有基础培养基的液体发酵罐中进行发酵，发酵时间控制在26～28小时，温度控制在37～38℃，发酵后的液体为地衣芽孢杆菌发酵液；

地衣芽孢杆菌发酵的配料按重量百分比由下列组分组成：扩培后的菌种8％和基础培养基92％；

地衣芽孢杆菌发酵过程中，发酵液中的菌体量与发酵液在660nm处吸光值成正比，吸光值上升，菌体量增加，继续进行发酵，吸光值下降则表明菌体量不再增加，终止发酵。

测得地衣芽孢杆菌的发酵液中活菌数含量为90亿CFU/g。

实施例3芽孢杆菌固体粉剂的制备及菌含量测定过程

3.1枯草芽孢杆菌固体粉剂的制备过程

枯草芽孢杆菌固体粉剂的配料按重量百分比由下列组分组成：枯草芽孢杆菌发酵液70％，活性沸石混合物30％，将以上配料进行混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载，搅拌转速控制在150～180转/分，温度控制在35～45℃，吸附时间控制在45～50分钟，静置15分钟后用滤布过滤分离，分离得到的固体物料在55～65℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎，粉碎后的粉状物料颗粒细度≤0.1毫米，将粉状物料包装为枯草芽孢杆菌固体粉剂成品。

3.2地衣芽孢杆菌固体粉剂的制备过程

地衣芽孢杆菌固体粉剂的配料按重量百分比由下列组分组成：地衣芽孢杆菌发酵液75％、活性沸石混合物25％，将以上配料进行混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载，搅拌转速控制在150～180转/分，温度控制在35～45℃，吸附时间控制在45～50分钟，静置15分钟后用滤布过滤分离，分离得到的固体物料在55～65℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎，粉碎后的粉状物料颗粒细度≤0.1毫米，将粉状物料包装为地衣芽孢杆菌固体粉剂成品。

3.3枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合固体粉剂的制备过程

混合固体粉剂的配料按重量百分比由下列组分组成：枯草芽孢杆菌发酵液40％、枯草芽孢杆菌发酵液40％、活性沸石混合物20％，将以上配料进行混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载，搅拌转速控制在150～180转/分，温度控制在35～45℃，吸附时间控制在45～50分钟，静置15分钟后用滤布过滤分离，分离得到的固体物料在55～65℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎，粉碎后的粉状物料颗粒细度≤0.1毫米，将粉状物料包装为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合固体粉剂成品。

根据固体粉剂中菌数的测定方法检测芽孢杆菌固体粉剂中的菌含量：

1试剂和培养基

1.1无菌生理盐水：

氯化钠8.5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。

1.20.1mol/L NaOH溶液：

氢氧化钠4g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。

1.3琼脂培养基：

葡萄糖5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，NaC l5g，琼脂20g，用0.1mol/L NaOH溶液将pH值调至7.0-7.2，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。

2操作步骤

2.1样品的稀释

称取1g样品，放入盛有9mL生理盐水的无菌离心管中(瓶内预置1-2个无菌玻璃珠)，振荡器均质1min-2min，制成1∶10的样品匀液。

用微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入盛有9mL生理盐水的无菌离心管中，振荡器均质1min-2min，制成1∶100的样品匀液。

用微量移液器吸取1∶100样品匀液0.1mL，沿管壁缓缓注入盛有0.9mL生理盐水的无菌离心管中，并反复吹打，使其混合均匀，制成1∶1000的样品匀液。

按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，均须换用微量移液器枪头。

2.2平板计数

提前将15mL-20mL的培养基倾注于每个平皿中，待冷却凝固后，选取10^-8、10^-9及10^-10三个稀释度的样品匀液，分别用微量移液器吸取100μl接种于培养基上，用L型或者三角形玻璃棒进行涂板。37℃下恒温有氧培养24h，选取菌落数范围在30-300个的培养皿进行计数，换算稀释倍数，计算结果用亿个/g表示(同时做三个平行重复，结果取平均值)。

3实验结果：测得枯草芽孢杆菌固体粉剂、地衣芽孢杆菌固体粉剂、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合固体粉剂中的菌数分别为260亿CFU/g、350亿CFU/g、380亿CFU/g。

实施例4益生菌固体粉剂在动物饲养中的应用及效果

试验证明：在每克饲料中添加100～400万CFU活菌的实施例3中制备的益生菌固体粉剂能提高肉鸡、猪和鱼类的生长速度2.0～15.6％，提高饲料转化率1.1～9.3％，并可明显降低动物的腹泻率和死亡率。

Claims

1.一种益生菌固体粉剂，其特征在于该益生菌固体粉剂含有活性益生菌和活性沸石混合物，所述的活性沸石混合物中各组分的重量百分含量为：沸石30％～50％、凹凸棒石黏土20％～40％、膨润土10％～30％；所述益生菌固体粉剂的制备方法包括以下步骤：按重量百分数计将益生菌发酵液60％～95％和活性沸石混合物5％～40％混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载、静置、过滤分离，将分离得到的固体物料在45～70℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎至颗粒细度≤0.1毫米，即制得益生菌固体粉剂。

2.根据权利要求1所述的益生菌固体粉剂，其特征在于所述的益生菌固体粉剂中活性益生菌的含量为120～500亿CFU/g。

3.根据权利要求1所述的益生菌固体粉剂，其特征在于所述的活性益生菌为芽孢杆菌。

4.根据权利要求3所述的益生菌固体粉剂，其特征在于所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌。

5.一种益生菌固体粉剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：按重量百分数计将益生菌发酵液60％～95％和活性沸石混合物5％～40％混合搅拌后，输入吸附器中进行加温负载、静置、过滤分离，将分离得到的固体物料在45～70℃下进行干燥，干燥后的固体物料进行粉碎至颗粒细度≤0.1毫米，即制得益生菌固体粉剂；所述的活性沸石混合物各组分的重量百分含量为：沸石30％～50％、凹凸棒石黏土20％～40％、膨润土10％～30％。

6.根据权利要求5所述的益生菌固体粉剂的制备方法，其特征在于搅拌转速为100～200转/分，加温负载时温度为20～50℃，负载时间为5～60分钟。

7.根据权利要求5所述的益生菌固体粉剂的制备方法，其特征在于所述的益生菌发酵液中活性益生菌的含量为50～100亿CFU/g。

8.根据权利要求5所述的益生菌固体粉剂的制备方法，其特征在于所述的益生菌为芽孢杆菌。

9.根据权利要求8所述的益生菌固体粉剂的制备方法，其特征在于所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌。