CN102007209B

CN102007209B - 细小病毒rep和cap蛋白在昆虫细胞中的表达优化

Info

Publication number: CN102007209B
Application number: CN2009801135713A
Authority: CN
Inventors: A·C·巴克尔; W·T·J·M·C·赫尔门斯; Y·诺尔得曼
Original assignee: Amsterdam Molecular Therapeutics AMT BV
Current assignee: Uniqure IP BV
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: IL207671A0; CA2715924A1; ES2929031T3; CA2715924C; US20110136227A1; WO2009104964A1; EP2250256A1; AU2009215987A1; EP3257937B1; EP2250256B1; US20140127801A1; AU2009215987B2; JP2011512156A; CN102007209A; EP3257937A1; US9260724B2; ES2644880T3; EA020969B1; EA201070970A1; US8642314B2

Abstract

本发明涉及重组细小病毒病毒体在昆虫细胞中的改进生产。具体而言，本发明涉及在昆虫细胞中生产重组细小病毒病毒体的改进方法，其中所述完整/空壳细小病毒病毒体的比值增加。本发明还涉及可用于基因治疗的细小病毒载体的生产，并涉及提高细小病毒载体生产力的病毒Rep蛋白表达的改进。

Description

细小病毒rep和cap蛋白在昆虫细胞中的表达优化

技术领域

本发明涉及细小病毒载体的生产，特别是重组腺伴随病毒(rAAV)在昆虫细胞中的生产，包含本发明的构建体的杆状病毒表达载体，以及包含这类杆状病毒表达载体的细胞。

背景技术

杆状病毒表达系统因其作为真核克隆和表达载体的应用而众所周知(King，L.A.，and R.D.Possee，1992，“The baculovirus expression system”，Chapman and Hall，United Kingdom；O’Reilly，D.R.，et al.，1992.Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual.New York：W.H.Freeman.)。杆状病毒表达系统的优点包括所表达蛋白几乎总是可溶的、正确折叠的和具有生物学活性的等。其他优点包括蛋白表达水平高、生产更快、适于表达大分子量蛋白以及适于大规模生产。然而，在使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中大规模或连续生产异源蛋白时，生产水平的不稳定——也称为传代效应(passage effect)——是一个主要障碍。此效应至少部分是由杆状病毒DNA中的重复同源序列之间的重组造成的。

杆状病毒表达系统也已被成功地用于生产重组腺伴随病毒(AAV)载体(Urabe et al.，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943；US 6,723,551和US 20040197895)。AAV可能被认为是用于人类基因治疗的最有前途的病毒载体之一。AAV具有有效感染人类分裂细胞和非分裂细胞的能力，AAV病毒基因组整合到宿主细胞基因组的单个染色体位点上，并且最重要的是，尽管AAV存在于许多人中，但其从未与任何疾病有关。鉴于这些优点，重组腺伴随病毒(rAAV)在对血友病B、恶性黑素瘤、囊性纤维化、I型高脂蛋白血症和其他疾病的基因治疗临床试验中正被评价。

为克服哺乳动物AAV生产系统的问题，Urabe et al.(2002，见上文)开发出了一种昆虫细胞中的AAV生产系统。为在昆虫细胞中产生AAV，必须进行一些修饰以获得三种AAV壳体蛋白(VP1、VP2和VP3)的正确化学计量比，这倚赖于将交替使用两个剪接受体位点和次优利用不能被昆虫细胞精确复制的VP2的ACG起始密码子相结合。为在昆虫细胞中模仿壳体蛋白的正确化学计量比，Urabe et al.(2002，见上文)使用一种构建体，所述构建体被转录成一个不需剪接就能表达全部三种VP蛋白的单个多顺反子信使并且其中最上游起始密码子被替换为次优起始密码子ACG。WO2007/046703公开了，通过最优化在昆虫细胞中生产的AAV壳体蛋白的化学计量比，进一步提高了基于杆状病毒生产的rAAV载体的感染性的生产力。

为在最初由Urabe et al.(2002，见上文)开发的AAV昆虫细胞表达系统中表达AAV Rep蛋白，使用一个含有两个独立Rep表达单元(一个用于Rep78，一个用于Rep52)的重组杆状病毒构建体，其中所述两个表达单元每个分别在独立的昆虫细胞启动子即ΔIE1和PolH启动子的控制下。然而，Kohlbrenner et al.(2005，Mol.Ther.12：1217-25；WO2005/072364)报道了Urabe et al.所用的用于表达两种Rep蛋白的杆状病毒构建体存在固有的不稳定性。通过打断Urabe的原始载体中的两个Rep基因的回文方向和设计用于表达Rep52和Rep78的两种独立的杆状病毒载体，Kohlbrenner et al.(2005，见上文)增加了所述载体的传代稳定性。然而，尽管两个独立的杆状病毒-Rep构建体的Rep78和Rep52稳定地在昆虫细胞中表达至少超过5代，rAAV载体的产量仍然比Urabe et al.(2002，见上文)设计的原始杆状病毒-Rep构建体低5-10倍。

在申请WO2007/148971中，本发明人通过使用Rep78和Rep52蛋白的单条编码序列显著地提高了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性，在所述序列中对Rep78蛋白使用了一个次优起始密码子，该密码子被扫描核糖体部分跳过以使翻译起始也可发生在更下游的Rep52蛋白的起始密码子上。

国际专利申请WO 2007/084773公开了一种在昆虫细胞中生产rAAV的方法，其中感染性病毒颗粒的生产通过相对于VP2和VP3补加VP1而增加。补加可以通过以下方式实现：向所述昆虫细胞引入包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的壳体载体，并另外向所述昆虫细胞引入表达VP1的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以在同一壳体载体上或者在不同载体上。

然而，在昆虫细胞中大规模(商业化)生产细小病毒载体仍然需要进一步提高。因此，本发明的目标是提供允许细小病毒载体稳定和高产量(大规模)生产的手段和方法，以及允许导致完整：空壳颗粒比增大(即更大比例的完整颗粒)的生产的手段和方法。

发明内容

本发明涉及一种生产重组细小病毒病毒体的方法。使用这类方法可使得以增加的生产滴度来生产这类病毒体。使用所述方法可替代地或额外地使得生产具有更大比例的完整颗粒，即更有利的完整：空壳比或总体：完整比。

本发明提供了一种生产重组细小病毒病毒体的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供包含一种或多种核酸构建体的昆虫细胞，所述核酸构建体包含：

(i)包含转基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列以至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼；

(ii)包含编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的第一表达盒，所述核苷酸序列可操作地连接于能够驱动所述Rep蛋白在所述昆虫细胞中表达的第一启动子；

(iii)包含编码细小病毒壳体蛋白的核苷酸序列的第二表达盒，所述核苷酸序列可操作地连接于能够驱动所述壳体蛋白在所述昆虫细胞中表达的第二启动子；

(b)在有助于所述Rep和所述壳体蛋白表达的条件下培养(a)中定义的细胞；和

(c)任选地回收所述重组细小病毒病毒体；

其中所述第一和第二表达盒存在于单个核酸构建体上，并且其中所述第一和第二表达盒在以等摩尔量存在于所述昆虫细胞中时，可产生的编码Rep蛋白的mRNA与编码壳体蛋白的mRNA的水平比至少为0.5，该水平比通过在转染后24和72小时之间的时间点进行定量逆转录PCR确定。

本发明还提供了：

-包含上文定义的第一和第二表达盒的核酸构建体，其中：

(a)所述第一启动子为p10启动子，所述第二启动子为PolH启动子或4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子；

(b)所述第一启动子为4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子，所述第二启动子为PolH启动子；

(c)所述第一启动子为PolH启动子，所述第二启动子为p10启动子、ΔE1启动子或E1启动子；

(d)所述第一启动子为PolH启动子，所述第二启动子为ΔE1启动子或E1启动子；

(e)所述第一启动子为p10启动子，所述第二启动子为ΔE1启动子或E1启动子；或者

(f)所述第一启动子为PolH启动子，所述第二启动子为PolH启动子；

并且其中所述第一表达盒任选地包含增强子元件；

-上文定义的昆虫细胞；以及

-一种试剂盒，其包含：

(a)包含上文定义的第一和第二表达盒的核酸构建体；以及

(b)包含编码转基因多克隆位点的核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列以至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼，所述转基因可操作地连接于能够驱动所述转基因在宿主细胞中表达的启动子。

附图说明

图1示出构建pVD118(新)的示意图。

图2示出构建pVD118(新)+HR1的示意图。

图3示出构建pVD165的示意图。

图4示出构建pVD165+HR1的示意图。

图5示出构建pVD165+4xEcRE CAP的示意图。

图6示出构建pVD165+4^＊EcRE Rep78的示意图。

图7示出构建pVD165+ΔIE1CAP的示意图。

图8示出构建ΔIE1Cap+pPolh Rep(pVD190)的示意图。

图9示出构建p10Cap+pPolh Rep的示意图。

图10示出构建pVD194的示意图。

图11A示出在以杆状病毒比1∶1和5∶1(C＝Bac.VD88∶Bac.VD84∶Bac.VD43分别以5∶1∶1)感染后3天， Bac.VD194表达的Cap和Rep蛋白的蛋白质印迹分析。图11B示出图11A中分析的相同生产的病毒滴度。

本发明的定义

定义

本文中所用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件在一种功能关系上的连接。当一段核酸被置于与另一段核酸序列具有一种功能关系的位置时，它就是“可操作地连接”的。例如，如果一段转录调控序列影响一段编码序列的转录，则它就与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接意味着，相连接的DNA序列通常是连续的，并在有必要将两段蛋白编码区域连接起来时，所述相连接的DNA序列是连续的且在阅读框中。

“表达控制序列”是指一段调控与之可操作地相连的一段核苷酸序列表达的核酸序列。

当一段表达控制序列控制和调控一段核苷酸序列的转录和/或翻译时，所述表达控制序列就与所述核苷酸序列“可操作地连接”。因此，一段表达控制序列可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”在最低限度上意图包括一段为了影响表达而存在的序列，也可包括其他有利组件。例如，前导序列和融合伙伴序列(fusion partner sequence)也是表达控制序列。该术语还可包括将框内外不想要的可能的起始密码子从序列中除去的核酸序列设计。其还可包括将不想要的可能的剪接位点除去的核酸序列设计。其包括指导添加polyA尾的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，所述polyA尾即为位于mRNA的3’末端的一串腺嘌呤残基，该序列被称为polyA序列。其还可被设计成可增加mRNA的稳定性。昆虫细胞中影响转录和翻译稳定性的表达控制序列(如启动子)以及实现翻译的序列(如Kozak序列)是已知的。表达控制序列具有调节与之可操作地连接的核苷酸序列从而降低或提高表达水平的性质。

本文所用的术语“启动子”或“转录调控序列”是指这样一段核酸片段，所述核酸片段具有控制一条或多条编码序列的转录的作用，它位于所述编码序列的转录起始位点的转录方向上游，并且可通过存在的DNA 依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列来进行结构性识别，所述其他DNA序列包括但不限于：转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的可直接或间接起到调控启动子转录量作用的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是一种在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子为例如通过使用化学诱导物来进行生理或发育调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定的组织或细胞类型中具有活性。

“序列同一性”和“序列相似性”可以根据两条序列的长度使用全局或局部比对算法通过比对两条肽序列或两条核苷酸序列确定。长度相似的序列优选使用在整个长度上进行最佳比对序列的全局比对算法(例如Needleman Wunsch)进行比对，而长度显著不同的序列优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)进行比对。当序列(例如用缺省参数通过GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时)至少共有某一最小百分比的序列同一性(如下文定义)时，它们就可称为是“大体同一的”或“基本相似的”。GAP采用Needleman和Wunsch全局比对算法对两条序列在其整个长度(全长)上进行比对，并使匹配数最大，使空位数最小。全局比对适合用于在两序列具有相似长度时确定序列同一性。通常采用GAP缺省参数，空位生成罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位扩展罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。针对核苷酸，采用的缺省计分矩阵为nwsgapdna，针对蛋白质采用的缺省计分矩阵为Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。可以利用计算机程序通过序列比对和计分来确定序列同一性百分比，所述计算机程序例如GCG Wisconsin Package，版本10.3(可购自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA)，或者使用开放源码软件例如版本2.10.0的EmbossWIN中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用的是与上文GAP相同的参数或者是默认设置(同时适用于“needle”和“water”并且同时适用于蛋白和DNA比对，默认空位开放罚分是10.0，且默认空位扩展罚分是0.5；蛋白的默认打分矩阵是Blossum62，DNA的是DNAFull)。如果序列大体上具有不同的总长度，优选局部比对例如使用Smith Waterman算法的局部比对。或者，可以通过使用FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库确定相似性或同一性的百分比。

本发明的编码细小病毒Cap和/或Rep蛋白的核苷酸序列也可按照它们分别与核苷酸序列SEQ ID NO 20、22、24和1-4在温和或优选地在严格杂交条件下的杂交能力来定义。

本文定义的严格杂交条件是下述的条件：具有至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75个核苷酸或100个核苷酸，并且最优选约200个或更多核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下和在含约1M盐的溶液，优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中可以进行杂交；并且，在65℃下和含约0.1M或更少的盐的溶液，优选0.2xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中进行漂洗。优选地，杂交过夜进行，即进行至少10小时，并优选地进行至少1小时的漂洗，其中至少换2次漂洗液。这些条件通常会使具有约90％或更高序列同一性的序列特异性地杂交。

本文定义的温和条件是下述的条件：至少有50个核苷酸，优选约200个或更多核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下和含约1M盐的溶液，优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中可以进行杂交；并且，在室温下和含约1M盐的溶液，优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中进行漂洗。优选地，杂交过夜进行，即进行至少10小时，并优选地进行至少1小时的漂洗，其中至少换2次漂洗液。这些条件通常会使具有最高至50％序列同一性的序列特异性地杂交。本领域技术人员能够修改这些杂交条件，以特异性地识别同一性在50％和90％之间的序列。

“载体”是用于将过客核酸序列(即DNA或RNA)转移至宿主细胞的核酸分子(一般是DNA或RNA)。三种常见类型的载体包括质粒、噬菌体和病毒。载体优选为病毒。同时含启动子和多核苷酸可以可操作地连接于其中的克隆位点的载体是本领域中公知的。这类载体能够在体外或体内转录RNA，可市购自诸如Stratagene(La Jolla，Calif.)和PromegaBiotech(Madison，Wis.)等供应商。为了优化表达和/或体外转录，需要去除、添加或改变所述克隆的5′和/或3′非翻译部分以除去额外的可能不合适的可变翻译起始密码子或可在转录或翻译水平干涉或减少表达的其他序列。或者，可以将共有的核糖体结合位点插入紧靠起始密码子的5’端以增强表达。

“病毒载体”是指包含下列中的一些或全部的载体：编码基因产物的病毒基因、控制序列和病毒包装序列。

“细小病毒载体”可定义为包含将送递至宿主细胞(在体内(in vivo)、离体(ex vivo)或在体外(in vitro))中的多核苷酸的重组产生的细小病毒或细小病毒颗粒。细小病毒载体的实例包括例如腺伴随病毒载体。在本文中，细小病毒载体构建体是指包含病毒基因组或其部分并包含转基因的多核苷酸。

编码酶的核苷酸序列与宿主细胞的密码子选择的适应度可表示为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文中被定义为：在具体的宿主细胞或生物体中，一个基因的密码子选择相对于高表达基因的密码子选择的相对适应度的量度。每个密码子的相对适应度(w)是每个密码子的使用相对于相同氨基酸的丰度最高的密码子的使用的比值。CAI指数被定义为这些相对适应度值的几何平均值。不包括非同义密码子和终止密码子(依赖于遗传密码)。CAI值介于0到1之间，此值越高表明丰度最高的密码子的比例越大(参见Sharp and Li，1987，Nucleic AcidsResearch 15：1281-1295；另见：Jansen et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31(8)：2242-51)。

术语“报告物”(或报告基因或蛋白)主要用于指编码可见标记蛋白的核苷酸序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)、eGFP、其他荧光蛋白、萤光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、GUS等等，以及nptII标记物等等。

具体实施方式

本发明涉及细小病毒——特别是依赖病毒例如感染性人类或猿猴AAV——和其组成部分(例如细小病毒基因组)用于在哺乳动物细胞中作为诱导和/或表达核酸的载体的用途。具体而言，本发明涉及用昆虫细胞生产这类细小病毒载体时对这类病毒载体生产力的改进。

这里的生产力涵盖生产滴度的增加以及所生成产物的质量的改善，例如总体：完整比(包含核酸的颗粒数目的量度)改善的产物。也就是说，终产物具有的完整颗粒的比例可能增加，这里的完整是指颗粒含有核酸。

细小病毒科的病毒为小DNA病毒。细小病毒科可分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染无脊椎动物(包括昆虫)的浓核病病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒，并且包括依赖病毒属。从依赖病毒属的属名就可推知，依赖病毒属的成员的独特性在于，它们通常需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒一起共感染来在细胞培养物中进行生产性感染。依赖病毒属包括AAV——AAV通常感染人类(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)——和感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、犬、马和羊腺伴随病毒)。细小病毒和其他细小病毒科成员相关的进一步信息在Kenneth I.Berns，″Parvoviridae：The Viruses and Their Replication，″Fields Virology，第69章(3d Ed.1996)中有记载。为方便起见，本文将参照AAV对本发明进行进一步举例说明和描述。但应理解的是，本发明并不限于AAV，本发明同样可应用于其他细小病毒。

所有已知的AAV血清型的基因组结构都非常相似。AAV基因组是长度小于约5000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。末端反向重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白质和结构(VP)蛋白质独特的编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白质(VP1、VP2和VP3)形成壳体。末端145个核苷酸自身互补，并排布成可形成能量稳定的分子内双链体的结构，所述双链体形成T形发夹结构。这些发夹结构起到病毒DNA复制起点的作用，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在wtAAV感染哺乳动物细胞后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，所表达的两种Rep蛋白都在该病毒基因组的复制中起作用。该Rep ORF中的剪接事件实际上导致四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。

然而，已证明，在哺乳动物细胞中，编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA足以产生AAV载体。在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白也足以产生AAV载体。

本文的“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)是指包含以至少一条细小病毒或AAV末端反向重复序列(ITR)为侧翼的一条或多条目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体。优选地，所述转基因以ITR为侧翼，在所述转基因的每一侧各一个。当这种rAAV载体存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，其可被复制并包装到有感染力的病毒颗粒中。当rAAV载体整合至更大的核酸构建体中时(如染色体中或另一个载体如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒中)，则所述rAAV载体通常被称为在AAV包装功能和必要辅助功能的存在下可通过复制和壳体化被“拯救”出来的“前载体”。

本发明涉及一种在昆虫细胞中生产包含重组细小病毒(rAAV)载体的重组细小病毒(rAAV)病毒体的方法。

在第一方面中，本发明涉及一种生产重组细小病毒病毒体的方法，所述方法包括步骤：(a)提供包含一种或多种核酸构建体的昆虫细胞，所述核酸构建体包含：(i)包含转基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列以至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼；(ii)包含编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的第一表达盒，所述核苷酸序列可操作地连接于能够驱动所述Rep蛋白在所述昆虫细胞中表达的第一启动子；(iii)包含编码细小病毒壳体蛋白的核苷酸序列的第二表达盒，所述核苷酸序列可操作地连接于能够驱动所述壳体蛋白在所述昆虫细胞中表达的第二启动子；(b)在有助于所述Rep和所述壳体蛋白表达的条件下培养(a)中定义的细胞；和(c)任选地回收所述重组细小病毒病毒体。在所述昆虫细胞中，所述第一和第二表达盒优选存在于单个核酸构建体上。

所述第一和第二表达盒在以等摩尔量存在于所述昆虫细胞中时，优选产生的编码Rep蛋白的mRNA与编码壳体蛋白的mRNA的水平比为至少约0.5、至少约0.75、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0、至少约5.0或至少约10.0。编码Rep和壳体的mRNA水平优选通过定量逆转录PCR、RNA印迹或本领域中已知用于RNA定量的其他方法确定。

优选，编码Rep和壳体的mRNA的所述水平比在昆虫细胞中在转染后24、30、36、40、44或46小时至转染后72、66、60、54、52或50小时的时间点产生。更优选，编码Rep和壳体的mRNA的所述水平比至少在昆虫细胞中在转染后48小时前后的2或1小时产生。

或者，所述第一和第二表达盒在以等摩尔量存在于昆虫细胞中时，优选产生的Rep蛋白与壳体蛋白的水平比为至少约0.5、至少约0.75、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0、至少约5.0或至少约10.0。优选，Rep和壳体蛋白水平在定量免疫测定(如ELISA或定量蛋白质印迹)中使用抗Rep和壳体蛋白的参照抗体确定。优选，Rep和壳体蛋白的水平比在昆虫细胞中在转染后24、30、36、40、44或46小时至转染后72、 66、60、54、52或50小时的时间点产生。更优选，Rep和壳体蛋白的水平比在昆虫细胞中在转染后48小时前后的2或1小时中产生。用于定量测得AAV Rep和壳体蛋白水平的合适参照抗体有例如可获自PROGEN Biotechnik GmbH的抗AAV-rep的小鼠单克隆抗体克隆303.9，或抗AAV VP1/VP2/VP3的小鼠单克隆抗体克隆B1。

在本发明的方法中，所述第一和第二表达盒存在于单个核酸构建体上。两表达盒存在于单个核酸构建体的一个优点是转染的昆虫细胞将同时表达Rep蛋白和壳体蛋白。只有在昆虫细胞中同时表达Rep蛋白和壳体蛋白才会导致细小病毒病毒体的形成。另一个优点是，在所述第一和第二表达盒位于单个构建体时，可以控制最低需要的所述Rep蛋白与所述壳体蛋白的表达比。

本发明的一个实施方案是，所述细胞中还可以存在包含编码Rep蛋白的核苷酸序列的另一核酸构建体。

在本发明的一种方法中，所述第一表达盒(ii)的核苷酸序列可优选地仅包含一个含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框。也就是说，一种或多种Rep蛋白将由单个开放阅读框编码，不是由两个或多个开放阅读框编码。换句话说，所述第一表达盒将一般不具有两个或多个独立的编码相同或不同Rep蛋白的开放阅读框。然而，为了避免歧义，单个开放阅读框可能能够编码不止一种蛋白，例如2种、3种或4种蛋白。

以上所有都可以同样适用于VP1、VP2和VP3蛋白，即这些蛋白的两种或全部都可方便地由单个开放阅读框编码。

一般，在本发明的一种方法中，包含编码VP1、VP2和VP3壳体蛋白的核苷酸序列的至少一个开放阅读框或者包含含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框的至少一个开放阅读框不包含人工内含子(或者源自人工内含子的序列)。也就是说，至少用于编码Rep或VP蛋白的开放阅读框将不包含人工内含子。人工内含子是指不是天然出现在腺伴随病毒Rep或Cap序列中的内含子，例如已被设计使得可在昆虫细胞中进行功能性剪接的内含子。因此，该情况中的人工内含子涵盖野生型昆虫细胞内含子。本发明的表达盒可包含天然的截短的内含子序列(天然是指天然出现在腺伴随病毒中的序列)，这类序列意欲不落在本文定义的人工内含子的含义内。

在本发明中，一个可能性是，含编码VP1、VP2和VP3壳体蛋白的核苷酸序列的开放阅读框以及/或者含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框不包含人工内含子。

在本发明的一个优选实施方案中，含所述转基因的核苷酸序列也与第一和第二表达盒在同一核酸构建体上。这样的一个优点是，所有转染细胞均包含3条核苷酸序列中的每一条，这是细小病毒病毒体生产需要的。

另外，本发明人发现，Rep蛋白∶壳体蛋白的比值越大，完整病毒体与空壳病毒体的比值越大。术语“完整病毒体”是指包含细小病毒载体的病毒体颗粒。术语“空壳病毒体”是指不含细小病毒载体的病毒体颗粒。在本发明的一个优选实施方案中，完整病毒体与空壳病毒体的比值为至少1∶100，更优选至少1∶10，甚至更优选至少1∶1。甚至更优选的是，检测不到空壳病毒体，最优选不存在空壳病毒体。本领域技术人员应知道怎样确定所述完整病毒体与空壳病毒体的比值，例如以(总壳体-基因组拷贝数)除基因拷贝数，因为每个病毒体应仅存在一个基因组拷贝。相反，Rep蛋白∶壳体蛋白的比值越大，空壳病毒体与总病毒体(即完整病毒体+空壳病毒体)的比值越小。本领域技术人员应知道如何确定这类比值。例如，空壳病毒体与总壳体的比值可通过以总细小病毒颗粒的量(即细小病毒颗粒的数目)除基因组拷贝的量(即基因组拷贝数)进行确定，其中每ml中基因组拷贝的量可通过定量PCR测量，每ml中总细小病毒颗粒的量以酶免疫测定(如来自Progen)测量。在本发明的一个优选实施方案中，空壳病毒体与总病毒体的比值小于100∶1，更优选小于10∶1，甚至更优选小于1∶1。甚至更优选的是，检测不到空壳病毒体，最优选不存在空壳病毒体。

在一个优选实施方案中，所述Rep与所述壳体蛋白的表达比受下列一种或多种因素的调节：(a)所述第一启动子与所述第二启动子一样强，或者比所述第二启动子更强，这由报告基因表达(如萤光素酶或SEAP)或者RNA印迹确定；(b)与所述第二表达盒相比，在所述第一表达盒中存在更多和/或更强的增强子元件；(c)与编码所述壳体蛋白的核苷酸序列相比，编码所述细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列具有更高的密码子适应指数；(d)所述细小病毒Rep蛋白的温度优化；以及/或者(e)与相应野生型Rep蛋白相比，氨基酸序列中有一个或多个变化的变体Rep蛋白，其中所述一个或多个氨基酸变化导致Rep功能活性的增加，这一点通过检测所述昆虫细胞中的AAV生产的增加进行评估。生成、选择和/或筛选具有增加的Rep功能活性的变体Rep蛋白(这一点通过检测昆虫细胞中的AAV生产的增加进行评估)可通过以下途径获得：改变US20030134351中描述的方法的昆虫细胞，以获得与哺乳动物中的AAV生产相比功能增加的变体Rep蛋白。在本文中与相应野生型Rep蛋白相比氨基酸序列具有一个或多个改变的变体Rep蛋白可理解为包括与相应野生型Rep蛋白的氨基酸序列相比，在变体氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失的Rep蛋白。

所述第一启动子与所述第二启动子一样强或者比所述第二启动子更强是指，在编码Rep蛋白的核苷酸序列比编码壳体蛋白的核苷酸序列更多的情况下，可使用相等强度的启动子，这是因为与壳体蛋白的表达相比，Rep蛋白的表达将会增加；而在编码Rep和编码壳体蛋白的核苷酸序列的量相似的情况下，可将更强的启动子用于表达Rep蛋白而非用于表达壳体蛋白。启动子强度可通过在本发明的方法中使用的条件下获得的表达来确定。在一个优选实施方案中，所述第一启动子或所述第二启动子选自PolH启动子、p10启动子、碱性蛋白启动子(basic proteinpromoter)、诱导型启动子或ΔE1启动子或E1启动子，或任何其他晚期或极晚期杆状病毒基因启动子。更优选地，所述第一启动子选自PolH启动子、p10启动子或碱性蛋白启动子，且其中所述第二启动子为ΔE1启动子或E1启动子，或任何其他早期或晚期杆状病毒基因启动子。优选地，本发明核酸构建体中的第一启动子为p10启动子，第二启动子为PolH启动子或4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子，第二启动子为PolH启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为p10、ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为p10启动子，第二启动子为ΔE1或E1启动子。在另一个实施方案中，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为PolH启动子。最优选地，本发明核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为ΔE1启动子。

“增强子元件”或“增强子”意图定义一段增强启动子活性(即增加所述启动子下游序列的转录速率)的序列，与启动子不同，增强子并不具有启动子活性，并且通常可不依赖于其相对启动子的位置(即启动子的上游或下游)而起作用。增强子元件在本领域中为公知的。可用于本发明的增强子元件(或其部分)的非限制性实例包括杆状病毒增强子和在昆虫细胞中发现的增强子元件。优选地，所述增强子元件在细胞中使与启动子可操作地连接的基因的mRNA表达与不存在所述增强子元件时该基因的mRNA表达相比增加至少25％，更优选地至少50％，再更优选地至少100％，最优选地至少200％。mRNA表达可通过例如定量RT-PCR测定。

本文优选使用一种增强子元件以增强细小病毒Rep蛋白的表达。因此，在另一个优选的实施方案中，所述第一表达盒包含至少一个杆状病毒增强子元件和/或至少一个蜕皮激素应答元件。优选地，所述增强子元件选自hr1、hr2、hr3、hr4和hr5。

细小病毒Rep蛋白的密码子优化在下文中更详细地论述。

细小病毒Rep蛋白的温度优化是指关于昆虫细胞可生长的温度以及Rep起作用的温度的最佳条件。Rep蛋白例如可在37℃下有最佳活性，而昆虫细胞可在28℃下最佳生长。Rep蛋白有活性并且昆虫细胞生长的温度可为30℃。在一个优选实施方案中，所述优化温度超过27、28、29、30、31、32、33、34或35℃并且/或者小于37、36、35、34、33、32、31、30或29℃。

如本领域技术人员应理解的，所述完整病毒体∶空壳病毒体的比值还可以通过弱化Cap表达而增大，例如借助较弱的启动子，如与中度至高度Rep表达相比。

本发明的核酸构建体优选为昆虫细胞相容的载体。“昆虫细胞相容的载体”或“载体”可理解为能够生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物学载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。只要是昆虫细胞相容的，任何载体都可使用。所述载体可以整合进昆虫细胞基因组中，但所述载体在昆虫细胞中的存在并不需要是永久的，瞬间游离载体也包括在内。所述载体可以用已知的任何方法例如细胞化学处理、电穿孔或感染来导入。在一个优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在一个更优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒，即所述核酸构建体是杆状病毒表达载体。杆状病毒表达载体及它们的使用方法在例如Summers and Smith.1986.A Manual of Methods forBaculovirus Vectors and Insect Culture Procedures，Texas AgriculturalExperimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.；Luckow.1991.In Prokop et al.，Cloning and Expression of Heterologous Genes in InsectCells with Baculovirus Vectors′Recombinant DNA Technology andApplications，97-152；King，L.A.and R.D.Possee，1992，The baculovirusexpression system，Chapman and Hall，United Kingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，Baculovirus Expression Vectors：ALaboratory Manual，New York；W.H.Freeman and Richardson，C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols，Methods in Molecular Biology，volume 39；US 4,745,051；US2003148506；和WO 03/074714中有所描述。

为生产重组细小病毒(rAAV)载体而在昆虫细胞中应用的核酸构建体数目在本发明中没有限制。例如，可以依照本发明的方法应用1个、2个、3个或更多个分离的构建体，以在昆虫细胞中生产rAAV。如果应用2个构建体，那么一个构建体可包含含转基因的以至少一条细小病毒ITR序列为侧翼的核苷酸序列，并且另一个构建体可包含第一和第二表达盒。如果应用3个构建体，那么一个构建体可包含含转基因的以至少一条细小病毒ITR序列为侧翼的核苷酸序列，另一个构建体可包含所述第一和第二表达盒，并且剩下的一个构建体可包含编码Rep蛋白的其他核苷酸序列，任选进行了密码子优化、AT优化或者GC优化，目的是使重组最少或者阻止重组，如下文所述。

编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，在本文中可理解为编码非结构Rep蛋白的核苷酸序列，所述非结构Rep蛋白对于在昆虫细胞中生产细小病毒载体而言是必需的且充分的，例如Rep78或Rep68，以及/或者Rep52或Rep40蛋白。细小病毒核苷酸序列优选来自依赖病毒，更优选来自人或猿腺伴随病毒(AAV)，最优选来自通常感染人(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(如血清型1和4)的AAV。编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的一个实例在SEQ ID No.5中给出，它描绘了AAV血清型2的序列基因组中编码Rep蛋白的一部分。Rep78编码序列包括核苷酸11-1876，Rep52编码序列包括核苷酸683-1876，还分别描述于SEQ ID No.5和7中。应理解Rep78和Rep52蛋白的精确分子量，以及翻译起始密码子的精确位置，可能随细小病毒的不同而有所不同。然而，技术人员懂得如何识别AAV-2以外的其他细小病毒核苷酸序列的相应位置。

在一个优选实施方案中，所述第一表达盒包含编码细小病毒Rep52或40蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列以及/或者编码细小病毒Rep78或68蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。细小病毒Rep蛋白优选为腺伴随病毒(AAV)Rep蛋白。

在一个优选实施方案中，本发明涉及含有不超过一种类型核苷酸序列的昆虫细胞，所述核苷酸序列含有编码细小病毒Rep蛋白的单个开放阅读框。所述单个开放阅读框优选编码一种或多种细小病毒Rep蛋白，所述开放阅读框更优选编码所有的细小病毒Rep蛋白，所述开放阅读框最优选编码全长Rep78蛋白，优选至少Rep52和Rep78蛋白在昆虫细胞中都可由此开放阅读框表达。本文中可理解的是，所述昆虫细胞可含有超过一个的拷贝的单一类型核苷酸序列，例如在多拷贝游离载体中超过一个的拷贝的单一类型核苷酸序列，但是这些拷贝基本上是一个或者同一核酸分子的多个拷贝，或至少是编码一个或同一Rep氨基酸序列的核酸分子，例如只是由于遗传密码简并性而相互不同的核酸分子。只存在单一类型的编码细小病毒Rep蛋白的核酸分子避免了含有Rep序列的不同类型载体中可能存在的同源序列之间的重组，所述重组会产生影响细小病毒在昆虫细胞中的生产水平(的稳定性)的缺陷型Rep表达构建体。

在本发明的另一个实施方案中，所述第一表达盒包含多于一条编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列。优选地，(ii)的核苷酸序列包含含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框。所述核苷酸序列优选是相同血清型。更优选地，所述核苷酸序列之间的不同之处在于它们可以是密码子优化的、AT优化的或者GC优化的，以使重组最少或者阻止重组。所述第一表达盒优选包含两条编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，即第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。编码细小病毒Rep蛋白的共同氨基酸序列的第一和第二核苷酸序列的差异通过下列一种或多种手段最大化(即，使核苷酸同一性最小化)：a)改变编码细小病毒Rep共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的密码子偏好；b)改变编码细小病毒Rep共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的密码子偏好；c)改变编码共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的GC含量；以及d)改变编码共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的GC含量。密码子优化可基于本发明方法使用的昆虫细胞的密码子选择进行，所述昆虫优选草地贪夜娥(Spodoptera frugiperda)，所述密码子选择可获自密码子选择数据库(参见如http://www.kazusa.or.jp/codon/)。合适的用于密码子优化的计算机程序是本领域技术人员可获得的(参见如Jayaraj et al.，2005，Nucl.AcidsRes.33(9)：3011-3016；以及在互联网上)。或者，所述优化可使用相同的密码子选择数据库手工完成。

编码细小病毒Rep52蛋白的第一表达盒核苷酸序列可定义为如下核苷酸序列：

a)其编码包含与SEQ ID NO.6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、88％、89％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；

b)其与SEQ ID NO.1-5的任一条核苷酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性；

c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；

d)由于遗传密码的简并性，序列与(c)的核酸分子的序列不同的核苷酸序列。

编码细小病毒Rep78蛋白的第一表达盒核苷酸序列可定义为如下核苷酸序列：

a)其编码包含与SEQ ID NO.8的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、88％、89％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；

b)其与SEQ ID NO.7的11-1876位的核苷酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性；

c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；

优选地，所述核苷酸序列编码对于在昆虫细胞中生产细小病毒载体而言所需的且充分的细小病毒Rep蛋白。

在其他细小病毒的Rep蛋白编码序列中消除Rep78和Rep52翻译起始位点之外的可能的错误翻译起始位点是本领域技术人员公知的，消除在昆虫细胞中可被识别的推定剪接位点也如此。

在一个优选实施方案中，用于翻译所述细小病毒Rep78蛋白的起始密码子是次优起始密码子。次优起始密码子优选是实现部分外显子跳跃的起始密码子。本文中的部分外显子跳跃可理解为指，至少部分核糖体不在Rep78蛋白的次优起始密码子而在更下游的起始密码子起始翻译，由此，优选地，更下游的起始密码子是Rep52蛋白的起始密码子。次优起始密码子优选在所述核苷酸序列在昆虫细胞中表达时实现部分外显子跳跃。优选地，使用杆状病毒表达时，次优起始密码子在昆虫细胞中实现部分外显子跳跃，从而优选在感染后约20-40小时，更优选在感染后约30-40小时，在昆虫细胞中产生的Rep78和Rep52的摩尔比范围为1∶10到10∶1、1∶5到5∶1或1∶3到3∶1。Rep78和Rep52的摩尔比可通过蛋白质印迹测定，优选地使用可识别Rep78和Rep52两者的共有表位的单克隆抗体，或使用例如小鼠抗-Rep抗体(303.9，Progen，Germany；1∶50稀释)。

本文使用的术语“次优起始密码子”不仅指三核苷酸起始密码子自身，还指它的背景。因此，次优起始密码子可由在次优背景例如非Kozak背景中的“最优”ATG密码子组成。然而，更优选三核苷酸起始密码子自身是次优(即不是ATG)的次优起始密码子。本文中的次优可理解为指所述密码子与在同样背景中的正常ATG密码子相比，在翻译起始方面的效率较低。优选地，次优密码子的效率低于同样背景下的正常ATG密码子的效率的90％、80％、60％、40％或20％。技术人员清楚用于比较翻译起始的相对效率的方法本身。优选的次优起始密码子可从ACG、TTG、CTG和GTG中选择。更优选为ACG。编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，在本文中可理解为编码对于在昆虫细胞中生产细小病毒载体而言是必需的且充分的非结构Rep蛋白的核苷酸序列，所述非结构Rep蛋白例如Rep78和Rep52蛋白。

还可以用编码甲硫氨酸的不同密码子替换序列中的其他ATG，使得从这类ATG开始翻译的可能性减小。

为在昆虫细胞中正确的表达而对包括例如野生型细小病毒序列在内的前述编码核苷酸序列进行多种修饰可通过应用公知的遗传工程技术实现，如Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York中所描述的。本领域的技术人员了解对能够增加编码蛋白产量的编码区的多种进一步修饰。这些修饰都在本发明的范围之内。

编码细小病毒壳体(Cap)蛋白的核苷酸序列在本文中可理解为包括编码细小病毒壳体蛋白VP1、VP2和VP3中的一种或多种的核苷酸序列。所述细小病毒核苷酸序列优选来自依赖病毒，更优选地来自人或猿腺伴随病毒(AAV)，最优选地来自通常感染人类(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(如血清型1和4)的AAV。编码细小病毒壳体蛋白的核苷酸序列的实例在SEQ ID No 20、22和24中给出。

在一个优选实施方案中，(iii)的核苷酸序列包含编码VP1、VP2和VP3壳体蛋白的核苷酸序列的开放阅读框。编码壳体蛋白的序列可以多种形式存在。例如可使用分别针对壳体蛋白VP1、VP2和VP3中的每一种的各独立的编码序列，其中每条编码序列可操作地连接于用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列。然而，更优选地，所述第二表达盒包含含编码全部三种细小病毒(AAV)VP1、VP2和VP3壳体蛋白的单个开放阅读框的核苷酸序列，其中VP1壳体蛋白翻译的起始密码子是非ATG的次优起始密码子，例如如Urabe et al.(2002，见上文)和WO2007/046703中所述。VP1壳体蛋白的次优起始密码子可如上文对于Rep78蛋白的定义。VP1壳体蛋白的次优起始密码子更优选可选自ACG、TTG、CTG和GTG，其中CTG和GTG是最优选的。在第二表达盒中所含的用于表达壳体蛋白的核苷酸序列还可含有如WO2007/046703所述的一种或多种修饰。本领域技术人员知晓对VP编码区的能够增加VP和病毒体的产量或具有其他所需效果的多种进一步修饰，所述其他所需效果例如为改变病毒体的向性或减少病毒体的抗原性。这些修饰都在本发明的范围之内。

在一个优选实施方案中，VP1表达与VP2和VP3表达相比增加。VP1表达的增加可通过补充VP1、通过向昆虫细胞中导入包含VP1核苷酸序列的单个载体实现，这已被记载于WO 2007/084773中。

在本发明的上下文中，“至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列”可理解意为一个回文序列，其含有大部分互补、对称排列的也称为“A”、“B”和“C”区的序列。ITR的功能为作为复制起点——一个在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为反式作用复制蛋白如Rep78(或Rep68)的识别位点，所述反式作用复制蛋白识别所述回文结构和所述回文结构内部的特定序列。所述ITR序列对称性的一个例外是所述ITR的“D”区。它是独特的(在一个ITR内无互补序列)。单链DNA的切开发生在A区和D区之间的结合处。它是新DNA合成起始的区域。D区通常位于所述回文结构的一侧并为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒通常含有两个ITR序列。然而，可以设计一种ITR，使结合位点在A区的两条链上，并使D区对称分布，在所述回文结构的每一侧各一个。因此在双链环形DNA模板(如质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制在两个方向上进行，且单个ITR序列足以进行环形载体的细小病毒复制。因此，一个ITR核苷酸序列可用于本发明的上下文中。然而，优选地使用两个或其他偶数个规则的ITR。最优选地，使用两个ITR序列。一种优选的细小病毒ITR是AAV ITR。出于安全原因，可能希望构建一种在第二种AAV的存在下在最初引入细胞后不能再繁殖的重组细小病毒(rAAV)载体。通过使用如US2003148506所述的具有嵌合ITR的rAAV可提供这种在受者中限制不希望的载体繁殖的安全机制。

就以另外的元件为侧翼的序列而言，术语“以......为侧翼”在本文中是指相对于所述序列在上游和/或下游，即5’和/或3’，存在一个或多个侧翼元件。术语“以......为侧翼”不是意在指序列必须连续。例如，在编码转基因的核酸和侧翼元件之间可具有间隔序列。以两个其他元件(例如ITR)为“侧翼”的序列表示一个元件位于所述序列的5’，另一元件位于所述序列的3’；然而，在其间可具有间隔序列。在一个优选实施方案中，在(i)的核苷酸序列的任一侧以细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼。

在本发明的实施方案中，包含转基因(编码目的基因产物)的以至少一条细小病毒ITR序列为侧翼的核苷酸序列优选整合到在昆虫细胞中生产的重组细小病毒(rAAV)载体的基因组中。优选地，所述转基因编码用于在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。优选地，包含所述转基因的核苷酸序列以两条细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列为侧翼，其中所述转基因位于两条细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列之间。优选地，如果编码目的基因产物的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)位于两个规则ITR之间或位于用两个D区进行改造的ITR的任一侧时，那么它将会整合到在昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体中。

可用于本发明以在昆虫细胞中生产重组AAV病毒体的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上有明显的同源性的基因组序列，提供一系列相同的遗传功能，产生在物理上和功能上基本等价的病毒体，并通过几乎相同的机制进行复制和装配。对于各种AAV血清型的基因组序列和对基因组相似度的综述，参见如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini et al.(1997，J.Vir.71：6823-33)；Srivastava et al.(1983，J.Vir.45：555-64)；Chlorini et al.(1999，J.Vir.73：1309-1319)；Rutledgeet al.(1998，J.Vir.72：309-319)和Wu et al.(2000，J.Vir.74：8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本发明上下文中的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，用于本发明上下文中的AAV ITR序列源自AAV1、AAV2和/或AAV4。同样，Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，用于本发明上下文的编码VP1、VP2和VP3壳体蛋白的序列可获自已知的42种血清型中的任一种，更优选获自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通过例如壳体穿梭(capsid shuffling)技术和AAV壳体文库获得的新开发的AAV样颗粒，或者获自新设计、开发或进化的ITR。

AAV Rep和ITR序列在大多数血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白有例如超过89％的同一性，AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间在基因组水平的总核苷酸序列的同一性为约82％(Bantel-Schaal et al.，1999，J.Virol.，73(2)：939-947)。另外，在哺乳动物细胞中生产AAV颗粒方面，已知许多AAV血清型的Rep序列和ITR与其他血清型的相应序列是有效交叉互补的(即功能替代的)。US2003148506报道了，在昆虫细胞中，AAV Rep和ITR序列与其他AAV Rep和ITR序列也是有效交叉互补的。

已知AAV VP蛋白决定了AAV病毒体的细胞向性。不同AAV血清型的VP蛋白编码序列的保守性明显比Rep蛋白和基因的要低。Rep和ITR序列与其他血清型的相应序列交叉互补的能力可使得产生假型rAAV颗粒，该颗粒包含一种血清型(如AAV3)的壳体蛋白和另一种AAV血清型(如AAV2)的Rep和/或ITR序列。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。

经修饰的“AAV”序列也可用于本发明的上下文中，如用于在昆虫细胞中生产rAAV载体。这种经修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9至少有约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高核苷酸和/或氨基酸序列同一性(例如具有约75-99％核苷酸序列同一性的序列)的序列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAVITR、Rep或VP序列。

尽管在许多方面，AAV5与其他AAV血清型相似，但它与其他人和猿AAV血清型的不同比其他已知的人和猿血清型的要大。因此，rAAV5与其他血清型在昆虫细胞中的生产不同。当使用本发明的方法来生产rAAV5时，优选一种或多种构建体(总之在超过一种构建体的情况下)含有：含AAV5 ITR的核苷酸序列、含AAV5 Rep编码序列的核苷酸序列(即含AAV5 Rep78的核苷酸序列)。这种ITR和Rep序列可根据需要被修饰，以在昆虫细胞中有效生产rAAV5或假型rAAV5载体。例如可修饰Rep序列的起始密码子，可修饰或除去VP剪接位点，和/或可修饰VP1起始密码子和附近核苷酸，从而提高rAAV5载体在昆虫细胞中的生产。

因此本文上面定义的包含所述转基因的核苷酸序列可含有编码至少一个用于在哺乳动物细胞中表达的“目的基因产物”的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。在本发明的上下文中应理解，表达所述“目的基因产物”的特别优选的哺乳动物细胞是人细胞。任何核苷酸序列都可被整合，以随后在以根据本发明生产的重组细小病毒(rAAV)载体转染的哺乳动物细胞中表达。可编码例如蛋白的核苷酸序列可表达出RNAi试剂，即能够进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RNA)。″siRNA″指小干扰RNA，它是对哺乳动物细胞无毒的短双链RNA(Elbashir et al.，2001，Nature411：494-98；Caplen et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47)。在一个优选实施方案中，包含所述转基因的核苷酸序列可含有两个编码核苷酸序列，每一个都编码用于在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。编码目的基因产物的两个核苷酸序列的每一个的位置都可使其可被整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。

在哺乳动物细胞中表达的目的产物可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物可以是多肽或RNA分子(siRNA)或其他基因产物，所述其他基因产物在靶细胞中表达时可提供想要的治疗效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的细胞或补足遗传缺陷(如导致酶活性不足)。治疗性多肽基因产物的实例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL，优选为LPL S447X；参见WO 01/00220)、载脂蛋白A1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、视网膜色素变性GTP酶调节因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和细胞因子或白细胞介素例如IL-10、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经营养因子例如源自神经胶质细胞系的神经营养因子(GDNF)以及丙氨酸：乙醛酸转氨酶(AGT)。

替代地或者额外地，作为另一基因产物，本文上面定义的包含所述转基因的核苷酸序列还可包含编码用作标记蛋白的多肽的核苷酸序列，以评估细胞转化和表达。用于此目的的合适的标记蛋白有例如荧光蛋白GFP和选择性标记基因HSV胸苷激酶(用于对HAT培养基选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于对潮霉素B选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于对G418选择)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于对甲氨蝶呤选择)、CD20(低亲和性神经生长因子基因)。获得这些标记基因的来源和其使用方法见Sambrook and Russel，见上文。另外，本文上面定义的包含所述转基因的核苷酸序列可包含编码可用作故障保险机制的多肽的又一核苷酸序列，在认为必要时，所述多肽使得可以用由本发明的重组细小病毒(rAAV)载体转导的细胞来治愈受试者。这种通常被称为自杀基因的核苷酸序列编码能够将前药转变为有毒物质的蛋白，所述有毒物质能够杀死所述蛋白在其中表达的转基因细胞。这种自杀基因的合适的实例包括例如大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶基因或单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，在这些实例中，更昔洛韦可用作杀死受试者中转基因细胞的前药(参见例如Clair et al.，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849)。

在另一实施方案中，一个目的基因产物可以是AAV蛋白，特别是Rep蛋白，如Rep78或Rep68，或其功能片段。编码Rep78和/或Rep68的核苷酸序列如果存在于本发明的重组细小病毒(rAAV)载体的基因组中并在被所述载体转导的哺乳动物细胞中表达，则可使重组细小病毒(rAAV)载体整合到经转导的哺乳动物细胞的基因组中。Rep78和/或Rep68在rAAV转导或感染的哺乳动物细胞中的表达，可通过允许经所述重组细小病毒(rAAV)载体引入细胞的任何其他目的基因产物长期或永久地表达，而有利于所述载体的某些应用。

在本发明的重组细小病毒(rAAV)载体中，所述至少一个编码用于在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物的核苷酸序列，优选与至少一个哺乳动物细胞相容的表达控制序列例如启动子可操作地连接。本领域已知许多这类启动子(见Sambrook and Russel，2001，见上文)。可使用在许多种细胞中广泛表达的组成型启动子，例如CMV启动子。然而，更优选的启动子是诱导型的、组织特异的、细胞种类特异的或细胞周期特异的。例如，对于肝脏特异性表达，启动子可选自α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、LPS(甲状腺素结合球蛋白)启动子、HCR-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因增强子(Ealb)元件结合的AAT启动子和载脂蛋白E启动子。其他实例包括用于肿瘤选择性——特别是神经细胞肿瘤选择性——表达的E2F启动子(Parr et al.，1997，Nat.Med.3：1145-9)或在单核血细胞中使用的IL-2启动子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med；185：2101-10)。

AAV能感染多种哺乳动物细胞。参见如Tratschin et al.(1985，Mol.Cell Biol.5：3251-3260)和Grimm et al.(1999，Hum.Gene Ther.10：2445-2450)。然而，人类滑膜成纤维细胞的AAV转导明显比类似的鼠细胞中更有效(Jennings et al.，Arthritis Res，3∶1，2001)，且AAV的细胞向性在各血清型中不同。参见如Davidson et al.(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：3428-3432)，该文献讨论了AAV2、AAV4和AAV5在哺乳动物CNS细胞向性和转导效率方面的不同。在一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞可为任何可被细小病毒病毒体感染的哺乳动物细胞，例如但不限于肌细胞、肝细胞、神经细胞、神经胶质细胞和上皮细胞。在一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞为人细胞。

优选地，在该构建体中，编码细小病毒Rep蛋白和/或细小病毒壳体蛋白的核苷酸序列可操作地连接于用于昆虫细胞表达的表达控制序列。这些表达控制序列应至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实施本发明。在昆虫细胞中的分子工程和多肽表达的方法学在文献中有所描述，如Summers and Smith.1986.A Manual ofMethods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，CollegeStation，Tex.；Luckow.1991.见Prokop et al.，Cloning andExpression of Heterologous Genes in Insect Cells with BaculovirusVectors′Recombinant DNA Technology and Applications，97-152；King，L.A.and R.D.Possee，1992，The baculovirus expression system，Chapman and Hall，United Kingdom；O′Reilly，D.R.，L.K.Miller，V.A.Luckow，1992，Baculovirus Expression Vectors：A LaboratoryManual，New York；W.H.Freeman and Richardson，C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols，Methods in Molecular Biology，volume 39；US 4,745,051；US2003148506和WO 03/074714。用于转录本发明的第一和第二构建体中包含的核苷酸序列的合适启动子包括例如多角体(PolH)、p10、p35、IE-1或ΔIE-1启动子，以及上面文献中描述的其他启动子。

所述包含至少第一和/或第二表达盒的核酸构建体还可含有表达控制序列，所述表达控制序列包含SEQ.ID NO：9的九核苷酸序列或与SEQ.ID NO：9基本同源的核苷酸序列，并位于编码所述细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的起始密码子和/或编码所述细小病毒VP1壳体蛋白的核苷酸序列的起始密码子的上游。与SEQ.ID NO：9的核苷酸序列具有基本同一性并会帮助增加所述细小病毒Rep蛋白的表达的序列为，例如，与SEQ.ID NO：9的九核苷酸序列具有至少60％、70％、80％或90％同一性的序列。

所述昆虫细胞可为适于异源蛋白生产的任何细胞。所述昆虫细胞优选允许杆状病毒载体的复制并可在培养中维持。所述昆虫细胞更优选还可允许重组细小病毒载体包括rAAV载体的复制。例如，所用细胞系可来自草地贪夜蛾、果蝇(Drosophila)细胞系，或蚊细胞系，如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易被杆状病毒感染的昆虫种的细胞，包括如S2(CRL-1963，ATCC)、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen，CA，USA)和

(US 6,103,526；Protein SciencesCorp.，CT，USA)。本发明的优选昆虫细胞为用于生产重组细小病毒载体的昆虫细胞。

本发明的方法的一种或多种核酸构建体可稳定地整合到昆虫细胞的基因组中。本领域普通技术人员了解如何将核苷酸序列稳定地导入昆虫基因组中，以及如何识别在基因组中有这种核苷酸序列的细胞。可通过例如使用含有与昆虫基因组的区域高度同源的核苷酸序列的载体来帮助整合到基因组中。将核苷酸序列引入基因组的另一种方法是使用特殊序列，如转座子。

本领域中公知培养昆虫细胞的培养条件以及培养昆虫细胞中异源产物的生产，这些例如在上面引用的有关昆虫细胞分子工程学的参考文献中有所描述(也参见WO2007/046703)。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，回收所述重组细小病毒病毒体。回收优选包括使用抗AAV抗体(优选固定化抗体)对重组细小病毒(rAAV)载体(或含有所述载体的病毒体)进行亲和纯化的步骤。所述抗AAV抗体优选为单克隆抗体。特别合适的抗体为单链驼科动物(cameloid)抗体或其片段，可例如从骆驼或美洲驼获得(参见如Muyldermans，2001，Biotechnol.74：277-302)。用于AAV亲和纯化的抗体优选为与AAV壳体蛋白上的表位特异结合的抗体，因此，所述表位优选为在多种AAV血清型的壳体蛋白上存在的表位。例如，所述抗体可基于与AAV2壳体特异性结合产生或选择，但同时它也可与AAV1、AAV3和AAV5壳体特异性结合。

在第二方面，本发明涉及一种包含一种或多种本文上面定义的本发明表达盒的核酸构建体。在一个优选实施方案中，本发明的核酸构建体包含本发明的第一和第二表达盒，并任选包含(i)的核酸序列。本发明的核酸构建体中的第一启动子优选是p10启动子，所述第二启动子优选是PolH启动子或4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子。所述第一启动子更优选可操作地连接有增强子，优选HR1增强子。在另一实施方案中，本发明的核酸构建体中的第一启动子为4xHsp27EcRE+最小Hsp70启动子，所述第二启动子为PolH启动子。在又一实施方案中，本发明的核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，所述第二启动子为p10、ΔE1或E1启动子。在又一实施方案中，本发明的核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，所述第二启动子为ΔE1或E1启动子。在又一实施方案中，本发明的核酸构建体中的第一启动子为p10启动子，所述第二启动子为ΔE1或E1启动子。在又一实施方案中，本发明的核酸构建体中的第一启动子为PolH启动子，第二启动子为PolH启动子。在另一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子的任何其他组合是本发明的一部分。所述第一启动子可选自PolH启动子、p10启动子、碱性蛋白启动子、诱导型启动子、ΔE1启动子、E1启动子或任何其他晚期或极晚期杆状病毒基因启动子。所述第二启动子可选自PolH启动子、p10启动子、碱性蛋白启动子、诱导型启动子、ΔE1启动子、E1启动子或任何其他晚期或极晚期杆状病毒基因启动子。更优选地，所述第一启动子选自PolH启动子、p10启动子或碱性蛋白启动子，并且其中所述第二启动子为ΔE1启动子、E1启动子或任何其他早期或晚期杆状病毒基因启动子。

在一个优选实施方案中，本发明的核酸构建体中所含的第一表达盒包含上文定义的增强子元件。

在第三方面，本发明涉及上文定义的昆虫细胞。

在第四方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含(a)包含上文定义的第一和第二表达盒的核酸构建体；以及(b)包含编码转基因多克隆位点的核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列以至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼，所述转基因可操作地连接于能够驱动所述转基因在宿主细胞中表达的启动子。

在一个优选实施方案中，所述核酸构建体(b)包含编码转基因的以至少一条细小病毒末端反向重复核苷酸序列为侧翼的核苷酸序列，所述转基因可操作地连接于能够驱动所述转基因在宿主细胞中表达的启动子。

所述试剂盒还包含昆虫细胞以及编码用于在昆虫细胞中表达杆状病毒辅助功能物的核酸序列。

在又一方面中，本发明涉及在本发明的上述方法中生产的一批细小病毒病毒体。“一批细小病毒病毒体”在本文中定义为在同一轮生产中产生的所有细小病毒病毒体，任选每容器的昆虫细胞产生的所有细小病毒病毒体。在一个优选实施方案中，本发明的所述一批细小病毒病毒体包含上文描述的完整病毒体：总病毒体比和/或上文描述的完整病毒体：空壳比。

在本说明书及其权利要求中，动词“包含”及其各种形式是以其非限制性的含义表示包括该词之后的项目，但并不排除未具体提到的项目。另外，用“一种”或“一个”提及的要素不排除存在多个该要素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个该要素。因此“一种”或“一个”通常是指“至少一个”。

以下实施例对本发明进行举例说明：

实施例

实施例1

1.1材料和方法

1.1.1重组杆状病毒的生成

生成如下构建体：

1.1.1.1pVD118(新)的构建

pVD118(新)是包含如下两个表达盒的对照载体，一个表达盒包含在p10启动子控制下的Rep78的核苷酸序列，另一表达盒包含在多角体(PolH或pPH)启动子控制下的Cap基因的核苷酸序列。pVD118(新)如图1中所示进行构建。在终质粒pVD118(新)能够被制备之前，构建前体pFastBac Dual Rep78/ACG和pVD118(lot#1)。简而言之，将质粒REP-ACG/PSC(专利申请WO2007148971；在本文中也称为pVD88)pVD88以SpeI^＊XbaI消化，并使5’突出形成平端。将2057bp的片段从琼脂糖凝胶分离，纯化并连接至SmaI线性化的pFastBac Dual(Invitrogen)，形成pFastBac Dual Rep78/ACG。此后，将该质粒以BstZ17I和SnaBI消化，并将2537bpp10_Rep78/ACG片段分离并连接至BstZ17I线性化的pVD84，生成pVD118(lot#1)。然而，Rep78/ACG表达盒的方向是不正确的，因此通过进行以NheI^＊BlpI的消化删除。在使5’突出形成平端后，将12431bp载体片段从凝胶中分离并纯化。随后，将来自REP-ACG/PSC的2057bp纯化片段连接至所述载体中，并将该转化混合物转化至化学感受态TOP10细胞(Invitrogen)，并铺板于含氨苄西林的板上。以NaeI^＊SacI对从小量制备的培养物分离的DNA进行限制性分析。正确的克隆呈现2204bp和12292bp大小的片段。

1.1.1.2pVD118(新)+HR1的构建

pVD118(新)+HR1与pVD118相同，且另外具有位于p10和多角体启动子之间的hr1增强子，如图2中所示进行构建。简而言之，以引物HR1-Fw 5’-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3’(SEQ ID No：10)和HR1-Rv 5’-gtatacgatcgattattgctccaatactag-3’(SEQ ID No：11)在AcMNPV病毒DNA(Protein Sciences Corporation，Meriden，USA)上进行的PCR产生了904bp的产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以BstZ17I消化后，将898bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以BstZ17I切开并去磷酸化的pVD118(新)载体中。以SpeI^＊EcoNI对正确克隆进行的对照消化产生1269bp和14125bp的片段。

1.1.1.3pVD84(+p10Rep)(＝pVD165)的构建

pVD165是包含如下两个表达盒的对照载体，一个表达盒包含在p10启动子控制下的起始密码子已突变成ACG的Rep78的核苷酸序列，另一表达盒包含在PolH启动子控制下的Cap基因的核苷酸序列。所述表达盒在质粒中的方向相反。pVD165如图3中所示进行构建。简而言之，以引物polyA Fw 5’-agatct gtagtggctatggcagggc-3’(SEQ IDNo：12)和p10Rv 5’-agatct cccggg acggacctttaattcaacccaac-3’(SEQ IDNo：13)在pVD118(新)上进行的PCR产生了2566bp的产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以BglII消化后，将2541bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以BglII切开并去磷酸化的pVD84载体中。以SpeI^＊XbaI对正确克隆进行的对照消化产生1269bp和11810bp的片段。

1.1.1.4pVD165+HR1的构建

pVD165+HR1与pVD165相同，且另外具有位于p10启动子下游的hr1增强子，如图4中所示进行构建。简而言之，以引物HR1-Fw 5’-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3’(SEQ ID No：10)和HR1-Rv5’gtatacgatcgattattgctccaatactag-3’(SEQ ID No：11)在AcMNPV病毒DNA上进行的PCR产生了904bp的产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以BstZ17I消化后，将898bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以SmaI切开并去磷酸化的pVD165载体中。以ClaI对正确克隆进行的对照消化产生875bp、1184bp、4160bp和9180bp的片段。

1.1.1.5CAP上游具有诱导型启动子的pVD165(pVD165+4xEcRE CAP)的构建

pVD165+4xEcRE CAP类似于pVD165，但包含诱导型启动子来代替多角体(pPH)启动子。pVD165+4xEcRE CAP如图5中所示进行构建。简而言之，将包含4个连续的EcRE、最小hsp70启动子(Poels et al.Insect Biochem Mol Biol 2004，34(5)：451-458)和CAP编码序列部分的诱导型启动子合成并连接至pCRII-平端-TOPO(Invitrogen)中。在以BstZ17I和EcoNI消化后，将375bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以BstZ17I和EcoNI切开的pVD165载体中。以PmeI^＊EcoRV对正确克隆的对照消化产生2554bp和12116bp的片段。

1.1.1.6Rep上游具有诱导型启动子的pVD165(pVD165+4^＊EcRERep78-52)的构建

pVD165+4^＊EcRE Rep78类似于pVD165，但包含诱导型启动子来代替p10启动子。pVD165+4^＊EcRE Rep78如图6中所示进行构建。简而言之，将包含4个连续的EcRE、最小hsp70启动子的诱导型启动子合成并连接至pCRII-平端-TOPO(Invitrogen)中。在以BstZ17I和SpeI消化后，将290bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以SmaI和SpeI切开的pVD165载体中。以SpeI^＊BglII对正确克隆进行的对照消化产生298bp、2376bp和11954bp的片段。

1.1.1.7pVD190构建体(ΔIE1Cap+pPolh Rep)的构建

ΔIE1Cap+pPolh Rep类似于pVD165，但包含ΔIE1启动子来代替pPH启动子，pPolH启动子代替p10启动子。ΔIE1 Cap+pPolh Rep如图7和8中所示进行构建。至此，以如下的方式构建载体前体。以引物BstZ17I-ΔIE1Fw：5’-ggtcc gtatacgacgataacgccgttggtggcg-3’ (SEQ ID No：14)和AflII-ΔIE1 Rv：5’-cgacttaagacggcgaattctgcagatggc-3’(SEQ ID No：15)在pFBDSLR(Urabe et al.Human genetherapy 2002；13(16)：1935-1943)上进行PCR，形成了181bp的产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以BstZ17I^＊AflII消化后，将165bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以BstZ17I和AflII切开的pVD165+4xEcRE CAP载体中。所产生的质粒为pVD165+ΔIE1CAP，以BstZ17I^＊AflII进行的对照消化应产生165bp和14374bp的片段。随后，将多角体蛋白启动子克隆在pVD165+ΔIE1CAP中的Rep表达盒之前。至此，以引物SmaI-pPolhFw：5’-tctcccgggagatcatggaga taattaaaatgataac-3’(SEQ ID No：16)和SpeI-pPolh Rv：5’-gttactagtgagctcgtcgac-3’(SEQ ID No：17)在pVD88上进行PCR。这生成了198bp的PCR产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以SpeI^＊SmaI消化后，将188bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以SpeI和SmaI切开的pVD165+ΔIE1_Cap载体中。最后，这形成了pVD165+ΔIE1 CAP构建体。

1.1.1.8p10-Cap-pPolh-Rep构建体的构建

p10_Cap+pPolh_Rep构建体类似于Δ-IE1-Cap-pPolh-Rep构建体，但在Cap表达盒的前面包含p10启动子来代替Δ-IE1启动子，如图9中所示进行构建。以引物BstZ17I-p10Fw：5’-agtatacggacctttaattcaac-3’(SEQ ID No：18)和AflII-p10Rv：5’-cgacttaagagcgggccgctttcgaatc-3’(SEQ ID No：19)在pFastBac Dual上进行的PCR产生了171bp的产物，将该产物克隆至pCRII-平端-TOPO载体(Invitrogen)中。在以BstZ17I^＊AflII消化后，将160bp的片段从凝胶分离，纯化并连接至以BstZ17I和AflII切开的Δ-IE1-Cap-pPolh-Rep构建体中。

1.1.1.9pVD194(Rep78/CTG(Δ ATGs))的构建

通过依照SEQ ID NO：31中列出序列合成必需基因，首先构建了具有CTG起始密码子而无任何内部ATG位点的rep质粒。然后使用限制性酶RsrII和XbaI从质粒pVD88删除rep基因。然后使用限制性位点RsrII和XbaI将合成的基因连接于质粒pVD88中，得到pVD195。然后将pVD195以BglII消化，产生9297bp和2231bp的片段。将5’突出以Klenow补齐，然后以SexAI消化。这可产生9297bp、1372和859bp的片段。然后分离859bp的片段。通过以SpeI消化pVD165以得到14501bp的线性片段而生成所需的载体。将5’突出以Klenow补齐，然后以SexAI消化，生成13600bp和901bp的片段。分离13600bp的片段。然后将859bp BglII(Klenow)^＊SexAI片段连接至pVD165(SpeI(Klenow)^＊SexAI)，以生成pVD194(见图10)。以SexAI^＊XmaI进行的对照消化应产生13435bp和1029bp的片段。

1.1.1.10pVD84的构建

为了将杆状病毒表达载体pFBAAV1VPm11(Urabe et al.，2002，Hum.Gene Ther.13：1935-1943)的起始位点从ACG转换成GTG，使用如下引物进行PCR：

含BamHI位点的正向引物序列(AMT质粒#169；SEQ ID NO：29)

5，-TTAGGATCCTGTTA AGGTGGCTGCCGACGG-3’

含StuI位点的反向引物序列(AMT质粒#158；SEQ ID NO：30)

5’-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3’

使用引物#169和#158进行PCR，并将PCR产物(250bp)使用PCR纯化试剂盒(Qiagen Lot#11879372)纯化并以限制性酶BamHI和StuI剪切。还将所述杆状病毒表达载体以BamHI和StuI消化。在以SAP(Promega Lot#17501504)将所述载体去磷酸化后，在凝胶上同时纯化插入物(具有GTG起始位点的Cap)和载体。在将载体和插入物连接之后，将它们转化至化学感受态DH5α细胞(InvitrogenLot#1241753)并在含氨苄西林的LB板上划线。将pVD63(Cap/GTG起始位点)的DNA纯化，并使用通过BaseClear和限制性进行的序列分析检查特性。

为了将具有GTG起始位点的Cap基因克隆到所述杆状病毒表达载体pPSC10(Protein Sciences)中，将其以SmaI和AvrII从pVD63中剪切出，并连接至以EcoRV和XbaI切开的去磷酸化表达载体中。随后，将所述连接混合物转化至化学感受态DH10β细胞(invitrogen lot#1268527)中，并划线于LB-氨苄西林板上。在使用QIAprep Spin小量制备试剂盒(Qiagen lot#12180218)进行小量制备DNA分离之后，通过以SphI的限制性分析选择一个小量制备(克隆#13)。将该克隆DNA(pVD84)以SNAP中型制备试剂盒(Invitrogen溶液Lot#1256921和柱Lot#1259367)纯化。通过对起始密码子周围序列分析来检查pVD84的特性，这通过BaseClear以及通过以BamHI和SphI的限制性分析进行(SEQ ID NO：28)。

1.1.1.11重组杆状病毒生产

以Protein Sciences System(Protein Sciences Corporation，Meriden，USA)产生重组Bac.VD118(新)、Bac.VD118(新)+HR1、Bac.VD165、Bac.VD165+HR1、Bac.VD165+4xEcRE CAP、Bac.VD165+4^＊EcRE Rep78、Bac.VD190和Bac.VD194(p0)。通过将重组杆状病毒以1∶100稀释成2x10⁶SF⁺个细胞/ml对其进行扩增。感染后3天，将细胞离心并回收包含病毒的上清液。以相同的方式对后代进行扩增。

1.1.2rAAV生产

除了用两种重组杆状病毒代替3种外，依照Urabe et al.，2002(见上文)产生成批rAAV。一种杆状病毒包含在CMV启动子控制之下并以AAV ITR为侧翼的表达构建体。另一种杆状病毒是包含两个表达盒的Rep-Cap杆状病毒：一个表达盒用于AAV复制基因，另一个用于AAV壳体。在诱导型启动子控制之下的复制基因或壳体基因的表达通过将0.001-1uM松甾酮A(Ponasterone A)加入培养基中得到调节。以包含在CMV启动子控制之下的LPL转基因的杆状病毒原种Bac.VD43p5以及不同世代的Rep/Cap杆状病毒(p3、p4或p5)进行不同的rAAV1生产实验。在每项实验中，将标准rAAV1生产(Bac.VD88∶Bac.VD84∶Bac.VD43之比为5∶1∶1)作为对照。

1.1.3完整/总AAV颗粒确定

为了确定完整壳体与总壳体的比，用基因组拷贝(gc)的量除以总AAV颗粒的量。通过Q-PCR测定来测量gc/ml的量，以Progen的酶免疫测定来确定总AAV颗粒的量(见下文)。对于Q-PCR反应，依照生产商的说明书使用了SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems，#4309155)(25μl总体积；PCR程序：10分钟95℃， 40循环的15秒95℃和1分钟60℃)，其中使用如下引物组之一：

pr59 AATGGGCGGTAGGCGTGTA CMV SEQ ID NO：26

pr60 AGGCGATCTGACGGTTCACTAA CMV SEQ ID NO：27

该比例与如下的比例相当：在标准生产条件下使用5∶1∶1体积比的Bac.Rep、Bac.Cap和Bac.ITR得到的比例。

1.1.4蛋白质印迹分析

在rAAV生产后3天，通过加入0.1V 10x TRIS裂解缓冲液(1.5MNaCl，0.5M TRIS，0.01M MgCl，1％TRITON X-100，pH8.5，滤器除菌)并在冰上孵育30分钟裂解细胞。通过在37℃下与Benzonase一起孵育15分钟降解游离的DNA和RNA。离心细胞裂解物(1,900x g；15分钟；4℃)。将NuPAGE LDS样品缓冲物(4x，Invitrogen)加入上清液样品中，并上样至4-12％Bis-Tris凝胶(120V)。以10V将蛋白在PVDF膜(BioRad)上印迹30分钟(半干印迹(Semidryblotting))。通过以下方式进行蛋白质免疫化学：以Superblock-PBS封闭缓冲液(PIERCE)封闭所述膜，随后与小鼠抗Rep抗体(303.9，Progen，Germany；稀释度1∶50)和兔抗小鼠——HRP(DAKO，稀释度1∶500)进行孵育。通过以发光加蛋白质印迹底物(Roche)进行的化学发光染色显示Rep蛋白。

1.1.5总rAAV1颗粒ELISA

每次生产中制备的rAAV1颗粒的总量(tp)以AAV1 TitrationELISA试剂盒(Progen，Heidelberg，Germany)确定，并且依照制造商提供的方案进行，不同之处在于所有样品和对照均在粗裂解储液(CLB)中预稀释。简而言之，CLB通过以下方式制备：在三天后收集expressSF+细胞，加入10X裂解缓冲液并在28℃下孵育1小时。在37℃下以Benzonase处理1小时后，以1900g离心所述裂解物并将上清液在4℃下保存。为了确定每次生产的粗裂解物中的总rAAV1颗粒，将所述样品50倍预稀释于CLB中，这是初始稀释度。此后，在CLB中进行另外的250、1250和6250倍稀释。标准种系也稀释于CLB中。来自以Bac.VD190生产的样品仅稀释50倍和100倍，因为壳体蛋白的表达水平低。

1.1.6使用HPLC的总颗粒分析

将未知AAV-1原种注射进入HPLC-系统，产生色谱图中的峰。可用Chemstation软件对该峰积分，该峰代表注入的总颗粒的量。通过电子显微镜滴定每毫升浓缩AAV-1原种的总颗粒的量，并设置于所述方法中。使用该标准物作为校准物，可以计算未知的总颗粒的量。另外，在注入标准范围内的具体量的基因组拷贝时(这大致代表完整颗粒的量)，可以估计完整颗粒和空壳颗粒的比值。

1.2结果

在使用两种杆状病毒系统特别是在使用具有高Rep蛋白表达和中度Cap蛋白表达的两种杆状病毒系统时，完整：空壳AAV颗粒的比值增加

详细研究了3种构建体：pVD165、pVD190和pVD194。

为了对以Bac.VD165生产的rAAV1颗粒确定总体/完整比，在两项独立实验中确定了总颗粒在粗裂解物中的浓度。这些ELISA的结果和相应总体/完整比显示于表1中。

表1：以杆状病毒原种Bac.VD165生产的rAAV1的总体/完整比。以总AAV1颗粒ELISA确定总颗粒浓度。通过Q-PCR确定完整颗粒浓度。总体/完整比只能与同一实验中生产的对照相对比。

与对照相比，1∶1生产的总体/完整比在两实验中都改善1.6倍。对于5∶1的生产，总体/完整比比对照好2.1倍和1.4倍。结论是，以Bac.VD165生产的rAAV1颗粒的总体/完整比得到改善。

在Bac.VD190中，Cap表达盒在弱ΔIE1启动子的控制之下。这可能造成壳体的表达低于以其他Rep/Cap杆状病毒进行生产或者对照的情形，原因是所有这些条件下Cap表达受强多角体蛋白启动子的诱导。为了测试这种来自以Bac.VD190进行的两不同实验的假设，确定了总颗粒浓度。结果显示于表2中。

表2：以杆状病毒原种Bac.VD190生产的rAAV1的总体/完整比。以总AAV1颗粒ELISA确定总颗粒浓度。通过Q-PCR确定完整颗粒浓度。总体/完整比只与同一实验中生产的对照相对比。

来自生产#1(表2)的结果表明，与对照相比，以1∶1和5∶1生产获得的总体/完整比分别改善114倍和8倍。在生产#2中，1∶1或5∶1生产的总体/完整比减少1.4倍或增加1.4倍。结论是，以Bac.VD190生产的rAAV1颗粒的总体/完整比似乎也有改善(对Bac.VD165也观察到这一点)。

对于Bac.VD194，进行蛋白质印迹分析来确定Rep和Cap表达。因此，在细胞以2种不同杆状病毒比(即1∶1和9∶1，5∶1∶1为三组分对照)感染后3天，将细胞裂解物收获并进行蛋白质印迹分析。如图11A中所示，Cap表达在以1∶1杆状病毒比生产中较低，但以9∶1比进行的生产与所述3组分对照相当。然而，对于所述1∶1和9∶1比的生产，Rep表达与所述3组分对照相比有显著减少。然而，图11B显示，病毒生产在以Bac.VD194的生产中较多。生产力越高而Cap表达越低这一事实表明了更有利的总体：完整比。同时，结论是，具有等摩尔量Rep和Cap的2组分体系——特别是具有高Rep表达和中Cap表达的2组分体系——可导致较小的总体：完整比(即更大百分数的完整颗粒)。

实施例2

材料和方法

将3只摇瓶(在感染前都在28℃下培养)以接种物P5接种；4mL Bac.VD43、4mL Bac.VD84和20mL Bac.VD88。在3个不同温度下(26、28和30℃)将摇床孵育72小时进行病毒生产。

使用0.9％(v/v)Triton X-100在1个摇床孵育器中进行所有摇瓶的裂解处理。在加入裂解缓冲物后，将摇床在设定点28℃下孵育30分钟，加入Benzonase(每400mL中16μL)，将摇床在设定点37℃下孵育1小时。在Benzonase处理后，将所有摇瓶在29℃下放置过夜以清除病毒，随后在4℃下保存最多3天。

从每个摇床孵育器中，取200ml粗裂解储液在1mL亲和柱上以1mL/分钟的流速处理。在洗涤后，使用pH 3.5的PBS洗脱产物。

结果

用于温度研究的摇瓶的过程中细胞计数显示于表1中。温度升高与收获时的总细胞浓度和活力降低有关。在28℃下得到的活力与以Wave生物反应器系统获得的结果相当。

表1：过程中细胞计数摇床生产

粗裂解储液和摇瓶洗脱物的测试结果显示于表2中。

表2：以不同温度生产的rAAV颗粒的总体：完整比。

讨论和结论：

在用SF⁺细胞生产rAAV过程中，升高温度可轻微地增加生产的rAAV颗粒的总量，但可更多地增加生产的完整颗粒的量，这会导致总体：完整比减小。