CN102002486A - 一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶b及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。该磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，其基因全长1272bp，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为45.8kDa，其中1～69bp编码磷脂酶B信号肽，70～1272bp编码磷脂酶B成熟肽。利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本发明的磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，制备方法简单、产品质量高、生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。
背景技术
磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶A1、A2、B、C、D等。其中磷脂酶A1和A2分别水解Sn-1和Sn-2位酰基，产生溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶B具有水解酶和溶血磷脂酶的活性。水解酶的活性能同时水解Sn-1和Sn-2位酰基，溶血磷脂酶的活性则能水解溶血磷脂剩余的酰基。
磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物(特别是小麦淀粉的水解产物)的后续处理以提高过滤通透能力。此外，磷脂酶在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有效。低温磷脂酶B的最适酶活温度一般在40℃以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而应用于植物油酶法脱胶和修饰磷脂乳化剂等工业生产中可简化生产工艺、节能减耗、提高产品质量、保护环境、降低生产成本。
磷脂酶B已从动物、植物、微生物等不同的来源获得。动物包括天竺鼠[A.Gassama-Diagne等，(J.Biol.Chem.)，264，9470-9475，1989]；老鼠[S.Pind et al.，(Biochem.Cell.Biol.)，69，346-357，1991]；兔子[W.Boll et al.，(J.Biol.Chem.)，268，12901-12911，1993]。植物有蚕豆[Y.Lee et al.，(FEBS Lett.)，343，213-218，2001]。微生物包括酿酒酵母[M.Ichimasa et al.，(Agric.Biol.Chem.)，49(4)，1083-1089，1985；F.Paultaufet al.，(J.Biol.Chem.)，269，19725-19730，1994]；粟酒裂殖酵母[H.Oishi.et al.，(Biosci.Biotech.Biochem.)，60(7)，1087-1092，1996]；产黄青霉[N.Kawasaki.et al.，(J.Biol.Chem.)，77，1233-1244，1975；N.Masuda.etal.，(Eur.J.Biochem.)，202，783-787，1991]；牛莫氏杆菌[J.M.Tennent et al.，(J.Bacteriol.)，183，6717-6720，2001]；鼠麻风分支杆菌[Shinji Maeda et al.，(Biochimica et Biophysica Acta)，1303，31-38，1996]。但动植物磷脂酶B来源有限，且价格昂贵。微生物磷脂酶B的研究发现为磷脂酶的应用提供了新的来源，并且其发酵条件简单，大大降低了生产成本，为以后的工业化生产奠定了基础。到目前为止，有关产生低温磷脂酶B的荧光假单胞菌的研究，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，该磷脂酶B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，该方法简单、产品质量高、生产成本低。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的一种来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的磷脂酶B，该磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性。磷脂酶B基因全长1272bp，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为45.8kDa，其中1～69bp编码磷脂酶B信号肽，70～1272bp编码磷脂酶B成熟肽；利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。
本发明的一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B的生产方法，在合适的发酵培养基中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，磷脂酶B发酵酶活达43.2U.mL-1。其中发酵培养基为：终浓度百分含量(g/mL)0.01～5％大豆磷脂，0.1～10％淀粉，0.01～5％牛肉膏，0.01～5％蛋白胨，0.01～3％NaCl，0.01～2％MgSO4·7H2O，调pH3.0～11.0。通过SDS-PAGE以及从荧光假单胞菌克隆到磷脂酶B基因，进一步确定了菌株BIT-18只产生磷脂酶B，无脂肪酶活性。
有益效果
本发明的磷脂酶基因B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，本发明的制备方法简单、产品质量高、生产成本低。
附图说明
图1为棕榈酸甲酯的标准品气相色谱图；
图2为油酸甲酯的标准品气相色谱图；
图3为荧光假单胞菌BIT-18表达磷脂酶的气相色谱鉴定图；
图4为磷脂酶B温度变化曲线；
图5为磷脂酶B pH值变化曲线；
图6为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B基因保守片段的琼脂糖凝胶电泳；其中M表示DL2000Marker，1表示单引物PLB-1PCR产物，2表示双引物PLB-1和PLB-2PCR产物，3单引物PLB-2PCR产物；
图7为PCR扩增荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B全长基因的琼脂糖凝胶电泳；其中M表示DL2000Marker，1表示磷脂酶B全长基因PCR产物；
图8为大肠杆菌重组质粒pET28a(+)-plb单酶切和双酶切图；其中M表示1kbMarker，1表示EcoRI和Hind III双酶切，2表示EcoRI单酶切，3表示HindIII单酶切；
图9为在大肠杆菌中表达的磷脂酶B的SDS-PAGE；其中M表示蛋白Marker，1和6表示荧光假单胞菌BIT-18表达的磷脂酶B，2表示重组大肠杆菌BL21(DE3)诱导前全细胞，3表示重组大肠杆菌BL21(DE3)诱导后全细胞，4：表示重组大肠杆菌BL21(DE3)的周质部分，5表示重组大肠杆菌BL21(DE3)的上清部分。
具体实施方式
实施例1
一、产生磷脂酶菌株的筛选
1、菌种的分离筛选
采自新疆维吾尔自治区石河子市、山西省大同市、运城市、河南省郑州市，其中包括大豆油、菜籽油、棉籽油加工车间周围及大豆和菜籽种植基地的土样，均为地表以下10cm处采集，共18份。取土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶，室温振荡12h后静置。吸取1mL上层液体接种于49mL富集培养基(大豆磷脂4.0g/L，KN031.0g/L，K2HPO41.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L)中，30℃摇瓶培养24h，然后取少量富集培养液涂布于初筛培养基(大豆磷脂4.0g/L，蛋白胨10.0g/L，K2HPO41.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂18.0g/L)平板上，分离得到能够以大豆磷脂为唯一碳源生长且产生水解圈的单菌落，水解圈直径与菌落直径比值(R)越大则表明磷脂酶的活力越大。采用分离培养基筛选得到136株产磷脂酶的微生物，其中有4株菌的水解圈较大。
将平板初筛获得的4株菌接种于LB磷脂平板(分别采用酚红和罗丹明染色)，30℃培养72h，水解圈直径与菌落直径比值(R)越大则表明磷脂酶的活力越大。选出产酶能力较强的菌株进行斜面保存。单菌株摇瓶发酵(葡萄糖10.0g/L，牛肉膏7.5g/L，蛋白胨7.5g/L，NaCl 3.0g/L，MgS04·7H201.0g/L，大豆磷脂4g/L)试验复筛表明菌株BIT-18所产磷脂酶活力最高，酶活力达到25U.mL-1，可作为进一步研究的原始菌株。
2.菌种鉴定
(1)生理生化检测
形态特征参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》中的方法进行，生理生化特征采用细菌生化试验鉴定仪及配套革兰氏阴性菌检测试验卡对复筛菌株进行生理生化特征鉴定。产生磷脂酶的微生物菌株BIT-18的生物学特性如表1所示：
表1菌株BIT-18的生理生化特征
注：+：利用或该反应为阳性；-：不利用或该反应为阴性
(2)分子生物学鉴定
①菌株BIT-18基因组DNA的提取
用本领域技术人员已知的常规方法提取菌株BIT-18基因组DNA。取1mL培养物于1.5mL EP管中，室温10,000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中；加入6μl 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl 50μl，10％SDS 110μl，50℃作用3h或37℃过夜；菌液均分到两个1.5mLEP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。14,000rpm离心10min，抽提两次。加入等体积的氯仿，轻轻混合，14,000rpm 4℃离心3min，上清吸入另一干燥离心管中；加入1/10体积的醋酸钠(10mmol/L)溶液，混匀，加0.6倍体积冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30min，14,000rpm离心10min；沉淀用75％的乙醇洗涤两次，真空干燥，直至无乙醇味；抽(凉)干后，溶于40～50μl TE或ddH2O中，取5μl电泳，剩余-20℃保存备用。
②16S rDNA序列分析
采用16S rDNA的通用引物16SL(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16SR(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，以BIT-18菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，结果表明菌株BIT-18与荧光假单胞菌形成一簇，其同源性达99％以上，其16S rDNA基因序列如下：
1 ATTAGAGTTT GATCCTGGCT CAGATTGAAC GCTGGCGGCA GGCCTAACAC ATGCAAGTCG
61 AGCGGATGAA AGGAGCTTGC TCCTGGATTC AGCGGCGGAC GGGTGAGTAA TGCCTAGGAA
121TCTGCCTGGT AGTGGGGGAC AACGTTTCGA AAGGAACGCT AATACCGCAT ACGTCCTACG
181GGAGAAAGCA GGGGACCTTC GGGCCTTGCG CTATCAGATG AGCCTAGGTC GGATTAGCTA
241GTTGGTGAGG TAATGGCTCA CCAAGGCGAC GATCCGTAAC TGGTCTGAGA GGATGATCAG
301TCACACTGGA ACTGAGACAC GGTCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGG
361ACAATGGGCG AAAGCCTGAT CCAGCCATGC CGCGTGTGTG AAGAAGGTCT TCGGATTGTA
421AAGCACTTTA AGTTGGGAGG AAGGGTTGTA GATTAATACT CTGCAATTTT GACGTTACCG
481ACAGAATAAG CACCGGCTAA CTCTGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACAGAG GGTGCAAGCG
541TTAATCGGAA TTACTGGGCG TAAAGCGCGC GTAGGTGGTT TGTTAAGTTG GATGTGAAAT
601CCCCGGGCTC AACCTGGGAA CTGCATTCAA AACTGACAAG CTAGAGTATG GTAGAGGGTG
661 GTGGAATTTC CTGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGATATAGG AAGGAACACC AGTGGCGAAG
721 GCGACCACCT GGACTGATAC TGACACTGAG GTGCGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA
781 GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GTCAACTAGC CGTTGGGAGC CTTGAGCTCT
841 TAGTGGCGCA GCTAACGCAT TAAGTTGACC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGTTAAAAC
901 TCAAATGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC
961 GCGAAGAACC TTACCAGGCC TTGACATCCA ATGAACTTTC CAGAGATGGA TTGGTGCCTT
1021CGGGAGCATT GAGACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT
1081TAAGTCCCGT AACGAGCGCA ACCCTTGTCC TTAGTTACCA GCACGTTATG GTGGGCACTC
1141TAAGGAGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAGT CATCATGGCC
1201CTTACGGCCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGTCGGTAC AAAGGGTTGC CAAGCCGCGA
1261GGTGGAGCTA ATCCCATAAA ACCGATCGTA GTCCGGATCG CAGTCTGCAA CTCGACTGCG
1321TGAAGTCGGA ATCGCTAGTA ATCGCGAATC AGAATGTCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC
1381TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCATGGGAG TGGGTTGCAC CAGAAGTAGC TAGTCTAACC
1441TTCGGGAGGA CGGTTACCAC GGTGTGATTC ATGACTGGGG TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC
1501CGTAGGGGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC TTAATC
从菌株BIT-18的显微特征菌、生理生化特征和分子特性可以确定，产磷脂酶菌株BIT-18，属于荧光假单胞菌系，因将其命名为荧光假单胞菌BIT-18，在GenBank数据库中的登陆号为GU367870。
二、荧光假单胞菌BIT-18产生磷脂酶种类的确定
通过气相色谱测定与磷脂酶与磷脂标准品反应产物中脂肪酸的种类，从而判断其种类。
待测样品的预处理。25mg PC标准品(1-棕榈酰-2-油酰磷脂酸)溶于0.5mL乙醚中；取0.1mL溶解后标准品与2.9mL酶液于25℃，150rpm反应3h；加6mL 5％盐酸-甲醇溶液于95℃，反应2h；加6mL己烷，振荡摇匀，1500rpm离心15min，收集上清液，重复两次；用氮气去除机除尽己烷，然后用100μL无水甲醇溶解，用于下一步气相色谱分析。
气相色谱(Shimadzu，GC-2010)条件：FFAP毛细管柱(0.32mm×25m)；FID检测器；采用程序升温，180℃维持0.5min后，以10℃/min的速度升温至250℃，维持7min；进样口温度和检测器温度分别为250℃和275℃；进样量，4μL。结果如图1-3所示，其中图1和图2分别表示棕榈酸和油酸的标准品气相色谱图，图3表示待测样品的气相色谱图。从图3可以看出，荧光假单胞菌BIT-18所产磷脂酶水解PC标准品同时产生棕榈酸和油酸，说明该磷脂酶同时水解PC的Sn-1位酰基和Sn-2位酰基，从而可以判断其为磷脂酶B。
三、荧光假单胞菌BIT-18产生的磷脂酶B基因的活力测定
磷脂酶B活性测定采用NaOH电位滴定法。取一定量大豆磷脂、0.5％PVA溶于预定pH值的缓冲液中，用高速均质机在10000r/min的条件下均质3min，得到底物溶液。取4个100mL的三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液9mL，再于空白瓶中加入95％乙醇20mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入酶液预定稀释倍数的稀释液1mL(用缓冲液稀释)，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应一定时间，于样品瓶中立即补加95％乙醇20mL终止反应，取出，用0.05mol/L NaOH标准溶液进行滴定，记录标准碱液平均消耗量，计算磷脂酶活力，其计算公式
式中：X-样品的磷脂酶活力，U/mL；
V-滴定样品时消耗的NaOH标准溶液体积，mL；
V0-滴定空白时消耗的NaOH标准溶液体积，mL；
c-NaOH标准溶液的浓度，mol/L；
50-0.05mol/L NaOH标准溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；
t-测定酶活的反应时间。
脂肪酶活力测定参照国标GB/T1803-93(2002)采用NaOH滴定法。
根据磷脂酶活力的计算公式可得到磷脂酶活力随温度和pH的变化曲线，如图5和图6所示，结果表明磷脂酶B最适作用温度25～30℃，最适pH6.5。
实施例2
一、荧光假单胞菌BIT-18的磷脂酶B基因的克隆
1.PCR扩增磷脂酶B基因保守片段
根据NCBI上已公布的细菌磷脂酶B的保守序列设计了一对简并引物P1-F(5’-GVSAACAACGGCGGCTACGC-3’)和P2-R(5’-GCCARYTCCAYTGCGGRTGC-3’)，以荧光假单胞菌BIT-18基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后72℃延伸10min。PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳分离，如图6所示。结果表明扩增到大小约为450bp的DNA片段。
将PCR扩增出的大小约为450bp的DNA片段连接到pMD19-T载体上，将转化好的大肠杆菌涂布在含有终浓度为50μg/mL Amp的LB固体培养基，37℃下培养16-18h。在含有Amp的LB固体培养基中挑取白色的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性克隆，再通过经EcoR I和Hind III双酶切鉴定，最后送往北京六合华大基因有限公司测序。测序结果表明，扩增得到426bp的保守片段，将保守片断测序结果在NCBI中进行BLAST比对，在比对的结果中发现，保守片断与荧光假单胞菌Pf0-1中一个未知酶蛋白基因(GenBank登陆号：CP000094.2)的同源性最高，达到91％。
2.PCR扩增磷脂酶B全长基因
将未知蛋白基因序列作为模板设计一对特异性引物P2-F(5’-ATAGCGCCGGGACGAAAATG-3’)和P2-R(5’-AGCTCGCCGTGCAGCATCA-3’)，以荧光假单胞菌BIT-18基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，59℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后72℃延伸10min。PCR反应液经1％琼脂糖凝胶电泳分离，如图7所示。结果表明扩增到大小约为1300bp的DNA片段。
将PCR扩增出的大小约为1300bp的DNA片段连接到pMD19-T载体上，将转化好的大肠杆菌涂布在含有终浓度为50μg/mL Amp的LB固体培养基，37℃下培养16-18h。在含有Amp的LB固体培养基中挑取白色的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性克隆，再通过经EcoR I和Hind III双酶切鉴定，最后送往北京六合华大基因有限公司测序。测序结果表明，扩增得到1272bp的磷脂酶B基因完整的核苷酸序列，参见磷脂酶B核苷酸序列SEQ NO.1。
二、磷脂酶B基因在大肠杆菌中的诱导表达
1.大肠杆菌重组质粒的构建
以荧光假单胞菌BIT-18的基因组DNA为模板，采用引物P3-F(5’-CCGGAATTCATGAAAAAAGTCATGCTCAA-3’，含EcoR I酶切位点)和引物P3-R(5’-CCCAAGCTTTCAGAAGCGGTAGGTCGCGC-3’，含Hind III酶切位点)，PCR扩增含有plb基因的DNA片段。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，62.4℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min。回收PCR产物用EcoR I/Hind III双酶切，酶切片段回收纯化后与经EcoR I/HindIII双酶切的pET28a(+)载体连接，获得重组质粒pET28a(+)-plb。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，提取质粒，并进行酶切鉴定，如图8所示。结果表明获得阳性克隆BL21/pET28a(+)-plb。
2.磷脂酶B基因在大肠杆菌中的诱导表达
重组大肠杆菌在含有50μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养(37℃，170rpm)过夜，以1％的接种量转接于50mL含50μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中，摇床培养(37℃，170rpm)至0.6，再加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mmol/L，于22℃，170rpm下诱导培养5h后，冷冻离心(4℃，10000rpm，8min)收集菌体和上清液。上清液用于酶活测定，菌体悬于50mmol/L(pH 7.0)的醋酸缓冲液中，冰浴超声破碎。破碎后的菌体再离心获得的上清液用于酶法活性测定和SDS-PAGE分析。其中上清液酶活为3U.mg-1，细胞周质酶活为84.5U.mg-1，结果表明磷脂酶B基因在大肠杆菌中的表达产物绝大部分位于细胞周质中，只有少量在上清液中。
所有的可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，如图9所示，结果表明上清液无明显的蛋白条带，而周质部分有明显的表达蛋白条带。重组大肠杆菌BL21/pET28a(+)-plb经IPTG诱导在分子量约为50kDa的位置出现了特异的蛋白条带，在扣除4kDa的融合蛋白后，分子量约为45.8kDa，与荧光假单胞菌BIT-18表达的磷脂酶大小一致，也与原始与磷脂酶B氨基酸序列推测的理论值大小一致，说明表达产物中存在磷脂酶B蛋白，而含有pET28a(+)空质粒的对照菌经IPTG诱导后在同一位置上没有特异的条带。以上的电泳分析结果和酶活测定结果均证明荧光假单胞菌BIT-18磷脂酶B基因能够在大肠杆菌中进行有效地表达。
三、生产磷脂酶B工程菌的核苷酸序列
生产磷脂酶B的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞：
(1)序列表中的SEQ NO.1；
(2)编码序列表中SEQ NO.2蛋白质序列的多核苷酸；
(3)与序列表中SEQ NO.1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(4)在中度严谨条件下能与序列表中SEQ NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
其中所述原核或真核细胞优选的为大肠杆菌和酵母细胞，也可以是其它的各种动植物细胞。可选用本领域技术人员熟知的各种合适的表达载体，如市场销售的各种质粒、噬菌体及病毒载体等。可以直接将磷脂酶基因序列直接连接于表达载体中表达调控序列下游，形成磷脂酶B表达载体。包含本发明的分离的核酸分子的宿主细胞可以是常规使用的原核宿主细胞、酵母、哺乳动物、昆虫细胞等。
Claims (10)
1.一种磷脂酶B，其能够水解磷脂中的两个脂酰基基团，其特征在于：来源于荧光假单胞菌的一个株系。
2.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于：荧光假单胞菌的一个株系为BIT-18，其GenBank号为GU367870。
3.根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于：由423个氨基酸组成，酶蛋白理论分子量为45.8kDa。
4.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于：423个氨基酸包含与序列SEQ NO.2所示氨基酸序列有至少90％同源性的氨基酸序列，且能够水解磷脂中的两个脂酰基基团。
5.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于：423个氨基酸包含的N端氨基酸序列是序列SEQ NO.2的第1-423位所示序列。
6.根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于：423个氨基酸所对应的核苷酸序列为SEQ NO.1，全长为1272bp，其中1～69bp编码磷脂酶信号肽，70～1272bp编码磷脂酶成熟肽。
7.一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于：在合适的发酵培养基中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系；通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，以及随后离心回收磷脂酶B；其中发酵培养基为：终浓度百分含量g/mL，0.01～5％大豆磷脂，0.1～10％淀粉，0.01～5％牛肉膏，0.01～5％蛋白胨，0.01～3％NaCl，0.01～2％MgSO4·7H2O，调pH3.0～11.0。
8.一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于步骤为：从可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系中分离编码磷脂酶B的DNA序列；在合适的载体上将该DNA片段连上合适的表达信号；用该载体转化合适的异源宿主生物体；在可导致磷脂酶B表达的条件下培养经转化的宿主生物体，并从培养基中回收磷脂酶B。
9.根据权利要求8所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于：异源宿主物体为原核细胞。
10.根据权利要求9所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于：原核细胞为大肠杆菌。
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