CN101995472A

CN101995472A - 一种细胞周期检查点调控蛋白用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用

Info

Publication number: CN101995472A
Application number: CN2009100567849A
Authority: CN
Inventors: 曾嵘; 阮宏强; 徐孟杰; 李辰; 武祎
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-08-21
Also published as: CN101995472B

Abstract

本发明提供了一种细胞周期检查点调控蛋白的应用。本发明提供的细胞周期检查点调控蛋白为Phospho-Rad9A-S387，其应用为Phospho-Rad9A-S387作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达，因此，可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。

Description

一种细胞周期检查点调控蛋白用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种细胞周期检查点调控蛋白用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。

背景技术

肝细胞癌是世界范围内第四位常见的恶性肿瘤，也是我国第二位常见恶性肿瘤，每年大约有250,000名患者死于肝细胞癌。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。但由于西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，因此，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。

到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。

因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义，寻找新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。

Rad9A蛋白(Cell cycle checkpoint control protein RAD9A，hRAD9A，EC＝3.1.11.2，DNArepair exonuclease Rad9A homolog A)的NCBI登录号为NP_004575，Swissprot登录号为Q99638，IPI号为IPI00005277.4(human3.28 version)。Rad9A的一个主要功能是提高细胞对DNA损伤的抗性并维持基因组的完整性。这与Rad9A参与以下生理过程有关：参与构成Rad9A-Rad1-Hus1复合物，调控细胞周期检测点；参与修复DNA损伤，主要是碱基切除修复(base excision repair)；参与维持端粒的稳定。Rad9A还参与细胞凋亡：DNA损伤促使Rad9A被caspase 3剪切，产生的N端片段从细胞核转移到细胞质，随后与抗凋亡的Bcl-XL蛋白结合而抑制其功能，从而促进凋亡。另外，Rad9A还具有以下功能：反式激活目标基因、3’-5’核酸外切酶活性、抑制雄性激素受体的反式激活活性以及参与核糖核苷酸的合成等(http://www.uniprot.org/uniprot/Q99638)。在Rad9A蛋白的387位的丝氨酸残基上发生磷酸化获得的蛋白即为Phospho-Rad9A-S387。

另外，有少量研究显示，Rad9A蛋白与部分癌症相关，如Cheng等在48例乳腺癌样本中发现有25例乳腺癌样本中Rad9A的mRNA水平显著上调，但没有1例乳腺癌样本中Rad9A的mRNA水平显著下调(The cell cycle checkpoint gene Rad9A is a novel oncogene activatedby 11q13 amplification and DNA methylation in breast cancer.Cancer Res 2005，65，(19)，8646-54)；随后，Kebebew等证实在甲状腺癌中Rad9A的mRNA水平显著上升(Diagnosticand prognostic value of cell-cycle regulatory genes in malignant thyroid neoplasms.World JSurg 30(5)：767-74)；Zhu等发现前列腺癌细胞系中Rad9A的表达水平较正常的前列腺细胞系显著升高(Rad9A has a functional role in human prostate carcinogenesis.Cancer Res 68(5)：1267-74)；Maniwa等证实Rad9A的表达水平在部分非小细胞肺癌样本中显著升高，同时发现Rad9A存在过度磷酸化现象(Accumulation of hRad9A protein in the nuclei of nonsmall celllung carcinoma cells.Cancer 103(1)：126-32)。

但是到目前为止，现有文献中未见有Rad9A，特别是Phospho-Rad9A-S387，与肝细胞癌的相关性的报道。

发明内容

通过筛选在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了一种在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中表达上调)，经质谱鉴定为Phospho-Rad9A-S387。免疫印迹实验证实，Phospho-Rad9A-S387的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。利用人肝细胞癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株L02进行的免疫荧光实验，证明Phospho-Rad9A-S387在这两种细胞株间存在差异表达(在人肝细胞癌细胞株HepG2中表达上调)。通过对62对人肝细胞癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验进一步证实了Phospho-Rad9A-S387在人类肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。

基于Phospho-Rad9A-S387与肝细胞癌的这种相关性，这种蛋白质可以作为一种蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。

因此，本发明的首要目的在于提供Phospho-Rad9A-S387的一种应用。

本发明提供的Phospho-Rad9A-S387的应用为作为用作检测肝细胞癌的分子标记物。

本发明的另一个目的在于提供一种Phospho-Rad9A-S387的抗体的应用。

本发明提供的Phospho-Rad9A-S387的抗体的应用，为用于制备检测肝细胞癌的制剂和/或用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。

根据本发明，抗Phospho-Rad9A-S387的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝组织中Phospho-Rad9A-S387的表达是否异常的方法。

本发明提供的方法为：检测待测肝组织中Phospho-Rad9A-S387的数量，并与正常肝组织中的Phospho-Rad9A-S387的数量进行比较。

鉴于到目前为止，还没有Phospho-Rad9A-S387的表达量与肝细胞癌早期诊断的相关性报道。因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。

附图说明

图1A为Phospho-Rad9A-S387的免疫印迹实验结果，其中，泳道1-6为肝细胞癌组织的检测结果，泳道1’-6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。

图1B为Rad9A的免疫印迹实验结果，其中，泳道1-6为肝细胞癌组织的检测结果，泳道1’-6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。

图2A为对图1A的免疫印迹结果进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图，其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织。

图2B为对图1B的免疫印迹结果进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图，其中，HCC为肝细胞癌患者的癌组织，non-HCC为癌旁组织。

图3为Phospho-Rad9A-S387的免疫荧光实验结果，其中，A1为HepG2细胞中Phospho-Rad9A-S387的分布情况，A2为HepG2的细胞核，A3为A1和A2的叠加图，B1为L02细胞中Phospho-Rad9A-S387的分布情况，B2为L02的细胞核，B3为B1和B2的叠加图。

图4为Phospho-Rad9A-S387的免疫组织化学实验结果，其中，A为肝细胞癌组织，B为癌旁组织，物镜放大倍数为20倍。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-¹³C6，98％)购自剑桥同位素实验室；透析胎牛血清购自Gibco公司；D9785细胞培养粉末、β-巯基乙醇、L-Gln、L-Lys和L-Met购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)购自Promega公司；SCX柱和SAX柱以及pH缓冲液试剂盒购自Column Technology公司；HepG2细胞株和L02细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞研究所的细胞库。

在本发明的下述实施例中，使用的溶液/培养基配方如下：

不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基：5％透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mM EDTA，苯甲异恶唑青霉素25mg/mL，庆大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100mg/mL，两性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL。

裂解液：8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmol/L DTT。

裂解缓冲液：8mol/L尿素，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT。

TBST：Tris 2.42g/L，氯化钠8g/L，Tween-201ml/L，用HCl调节pH到7.6。

本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备了肝细胞癌的癌组织与癌旁组织的蛋白质样品，并以¹³C标记的HepG2和L02细胞的蛋白质样品等比例混合物作为内标，采用CDIT技术结合以溶液内酶解结合阴阳多维液相色谱串联质谱的蛋白质组学标记定量技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较其表达量，结果发现Rad9A在肝细胞癌组织中上调表达。免疫印迹实验、免疫荧光实验和免疫组织化学实验证明Phospho-Rad9A-S387的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达。

实施例1、肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备

从东方肝胆外科医院获取5例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，该5例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，5例患者的病理资料如表1所示。

表1、5例肝细胞癌患者的病理资料

No.

性别

年龄

HBV

HCV

等级

AFP

肿瘤尺寸

P1

男性

58

+

-

III

1000

5.2×6.4

P2

男性

44

+

-

III

1000

8×8×7

P3

男性

55

+

-

III

1000

4×3

P4

男性

40

+

-

III

1000

10×8×6

P5

男性

65

+

-

III

1000

11.5×6.5

以非酶解样品制备法制备上述5例患者的肝细胞癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品(所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品)，具体过程如下：

手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，然后将细胞沉淀分别溶于裂解液中，然后于冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪(JY92-2D，宁波新芝科器研究所)间歇超声破碎2min后，于15000r/min、4℃离心1h，取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)进行总蛋白质定量。

实施例2、¹³C标记的HepG2和L02细胞的培养和样品制备

在含有¹³C标记的CLM-2262L-Leu，10％透析胎牛血清，L-Gln，L-Lys以及L-Met的D9785培养基的6cm的培养皿中分别培养HepG2或L02细胞。

待细胞生长到6代后，将HepG2细胞或L02细胞转移到10cm培养皿中进行培养。

待细胞生长密度达到80％时，用4℃预冷的PBS洗三遍，加入裂解液进行裂解。然后用刮刀将这两种¹³C标记的细胞分别刮下收集，冰浴超声破碎，15000g离心1h，取上清，用改良的Bradford法(见Bio-Rad公司产品说明书)定量其总蛋白质含量。

实施例3、癌组织及癌旁组织的差异表达蛋白的筛选

采用CDIT技术(参照Yasushi Ishihama et al.Nat Biotechnol.2005；23(5)：617-621)结合溶液内酶解技术(参照William M.Old et al.Mol Cell Proteomics.2005；4：1487-1502)与阴阳多维液相色谱串联质谱技术(参照Jie Dai et al.J Proteome Res.2007；6(1)：250-262)进行差异表达蛋白的筛选，具体过程如下：

取实施例1中获得的5对肝细胞癌组织及癌旁组织蛋白质样品各100ug，分别将5例肝细胞癌组织蛋白质样品以及5例肝细胞癌的癌旁组织样品进行混合，得到500ug癌组织蛋白质样品和500ug癌旁组织蛋白质样品。

取实施例2中¹³C标记的HepG2和L02细胞的蛋白质样品，将二者等比例混合作为内标。

取500ug的肝细胞癌的癌组织或癌旁组织蛋白质样品分别与500ug¹³C标记的内标混合，得到两种组织-细胞混合蛋白质样品各1mg。

分别向混合蛋白质样品中加入裂解缓冲液至总体积100μl，再加入8ul的1M DTT，混匀后37℃反应2小时，然后加入20μl的1M IAA，混匀后室温避光反应45分钟。

然后用4倍体积的-20℃预冷的丙酮进行沉淀，-20℃反应至少4小时。25000g离心45分钟，去上清，加入50mmol/L的碳酸氢铵200μl，再加入20μg胰蛋白酶(蛋白质和胰蛋白酶的比例为50∶1)，37℃酶解反应4小时后，补加胰蛋白酶至总蛋白质和胰蛋白酶比例为25∶1，酶解过夜至总酶解时间16小时。酶解完成后用Millipore10KD孔径大小的超滤膜超滤，收取滤过液，真空冷冻干燥。

酶解后的每份肽段混合物首先用SCX/SAX柱进行分析，然后用完全自动化的多维液相色谱串联质谱仪LTQ^TMOrbitrap^TM(购自Thermo Finnigan公司)进行分析，得到的原始数据采用SEQUEST软件(Thermo Finnigan公司)进行数据库搜索，并采用Census定量分析软件(http://fields.scripps.edu/census/index.php)对鉴定到的蛋白质进行定量分析，定量结果如表2和表3所示。

表2、肝细胞癌组织/¹³C标记细胞含有定量信息肽段的定量结果

肽段序列	比率	R²值	X Corr值	Delta Cn值
					R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	2.3	0.96	2.4996	0.246
R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	2.3	0.96	3.2436	0.4317
					R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	2.3	0.96	2.9681	0.3876
R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	2.3	0.96	3.2753	0.3951

表3、肝细胞癌的癌旁组织/¹³C标记细胞含有定量信息肽段的定量结果

肽段序列	比率	R²值	X Corr值	Delta Cn值
					R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	2.5128	0.2123
R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	3.0377	0.3639
					R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	3.666	0.4844

R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	3.1339	0.4756
					R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	3.3497	0.4656
R.SPQGPSPVLAEDS^*EGEG.-	0.19	0.94	3.24	0.3535

根据表2和表3的结果，Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌组织/13C标记细胞和癌旁组织/¹³C标记细胞中的定量结果分别为1.4801879和0.2614234，在肝细胞癌组织中高表达5倍以上，肝细胞癌组织中表达明显上调，其中，Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌组织/¹³C标记细胞中有1条非重复肽段(共鉴定到4次)包含定量信息，而在癌旁组织/¹³C标记细胞中有1条非重复肽段(共鉴定到6次)包含定量信息。

实施例4、Phospho-Rad9A-S387的验证

取6对NESP法制备的肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品，其病理资料如表4所示。

表4、6例肝细胞癌标本的病理资料

No.

性别

年龄

HBV

HCV

等级

AFP

尺寸

P6

男性

55

+

-

III

＞1000

4×3

P7

男性

40

+

-

III

＞1000

10×8×6

P8

男性

65

+

-

III

＞1000

11.5×6.5

P9

男性

56

+

-

III

＞1000

7×6

P10

男性

50

+

-

III

＞1000

5×6

P11

男性

55

+

-

III

＞1000

5×5.5

使用购买的抗Phospho-Rad9A-S387抗体对上述6对肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫印迹分析，以确认Phospho-Rad9A-S387的差异表达，过程如下：

每个样品取40μg蛋白质，用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自GE Healthcare公司)上；

一抗使用兔抗人Phospho-Rad9A-S387多克隆抗体(购自Abgent公司，1∶250稀释)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次5分钟；

二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，1∶5000稀释)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟；

加入ECL plus试剂(GE Healthcare)，反应5分钟，X-光片曝光检测，检测结果如图1A所示。

同时，使用购买的抗Rad9A抗体对上述6对肝细胞癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫印迹分析，以检测Rad9A在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中的表达情况，过程如下：

每个样品取40μg蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自GEHealthcare公司)上；

一抗使用兔抗人Rad9A多克隆抗体(购自Abcam公司，1∶100稀释)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次5分钟；

二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司1∶10000稀释)，室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟；

加入ECL plus试剂(GE Healthcare)，反应5分钟后，以X-光片曝光检测，检测结果如图1B所示。

然后对图1A和1B的免疫印迹图谱采用Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析软件(MediaCybernetic公司)进行数据分析，得出蛋白质表达量的相对分布图，结果如图2A和图2B所示。

图1A结果显示，肝细胞癌组织中Phospho-Rad9A-S387的杂交条带的浓度都明显高于相应的癌旁组织；

图2A结果显示，肝细胞癌组织中Phospho-Rad9A-S387的表达量均明显高于相应的癌旁组织组织，其平均比值为1.533，P值(配对t检验)为0.01222；

根据上述结果，Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌组织存在高表达，该结果与质谱结果一致。

同时，根据图1B和图2B的结果，免疫印迹实验发现Rad9A在肝细胞癌组织和癌旁组织之间也存在表达差异，平均比值为3.054，P值(配对t检验)为0.00989。

综合上述结果，证明肝细胞癌组织中Rad9A的磷酸化水平(387位丝氨酸残基)显著上调，同时表达水平亦有显著上调。

选取HepG2细胞(人肝细胞癌细胞株)和L02细胞(人正常肝细胞株)进行免疫荧光实验，过程如下：

在圆形盖玻片上，用含10％透析胎牛血清的DMEM培养L02细胞和HepG2细胞；

PBS洗涤两次后，-20℃预冷的100％丙酮固定；PBS洗涤两次，5％脱脂牛奶封闭30分钟；

加入兔抗人Phospho-Rad9A-S387多克隆抗体(购自Abgent公司，1∶30封闭液稀释)，室温孵育1h，TBST洗3遍，每次7分钟；

加入荧光染料Cy3标记的羊抗兔抗体(购自Jackson公司，1∶500封闭液稀释)，室温孵育45分钟，TBST洗3遍，每次7分钟；

加入DAPI溶液(购自Sigma公司，1∶1000双蒸水稀释)孵育1分钟，PBS洗10分钟；

封片，4℃避光保存。

激光共聚焦显微镜观察，结果如图3所示。

根据图3结果，Phospho-Rad9A-S387在HepG2细胞中的表达水平明显高于其在L02细胞中的表达水平，这与从组织中得到的结果相一致。

为了进一步证实Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌组织和癌旁组织之间的表达差异，随机选取62对肝癌的癌组织和对应的癌旁组织样本，使用两张肝癌组织芯片(分别为OD-CT-DgLiv03-002肝癌组织芯片和OD-CT-DgLiv03-003肝癌组织芯片，均购自上海芯超生物科技有限公司)进行免疫组织化学研究，其中，选取的样本的具体资料分别如表5和表6所示：

表5、OD-CT-DgLiv03-002肝癌组织芯片资料及打分情况

表6、OD-CT-DgLiv03-003肝癌组织芯片资料及打分情况

免疫组织化学研究的实验过程如下：

将组织切片置于60℃恒温箱烘烤约3个小时，取出后依次使用二甲苯、二甲苯/乙醇(1∶1)、100％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、50％乙醇和水，进行脱蜡水化处理；

PBS洗3次，每次5分钟；0.3％H₂O₂(甲醇稀释)浸泡半小时，PBS洗3次，每次5分钟；

高压修复抗原，双蒸水洗2次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；10％血清室温封闭20分钟；

加入兔抗人Phospho-Rad9A-S387多克隆抗体(购自购自Abgent公司，1∶30稀释)，4℃过夜，PBST洗3次，每次5分钟；

加入生物素标记的羊抗兔抗体(来自ABC试剂盒，购自VECTOR公司)，室温孵育30分钟，PBST洗3次，每次5分钟；PBS洗2次，每次5分钟；

加入ABC溶液(来自ABC试剂盒，购自VECTOR公司)，室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；

DAB溶液(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)显色；苏木精(购自VECTOR公司，H3404)染色20秒；

组织切片依次使用：50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇、二甲苯/乙醇(1∶1)、二甲苯，进行脱水透明处理。

然后使用中性树脂封片，于显微镜观察，结果如图4所示。

对组织芯片进行评估，并根据染色强度和阳性率打分，其中，染色强度打分标准为：阴性为0分、弱阳性为1分、中等阳性为2分、强阳性为3分；阳性率打分标准为：低于5％为0分，5％～30％为1分，31％～60％为2分，60％以上为3分，然后，将染色强度的得分与阳性率的得分相加，获得组织切片的综合得分，结果如表5、表6所示。

根据表5、表6的结果：综合细胞质与细胞核中的信息，肝细胞癌组织的平均综合得分为4.13，癌旁组织的平均综合得分为3.25，两者具有极显著差异，P值(Wilcoxon rank sumtest)为0.00686。统计发现，在约59％(35对)的样本对中，Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌中高表达。该结果与前面的质谱结果、免疫印迹结果以及免疫荧光结果相一致。

综上所述，Phospho-Rad9A-S387在肝细胞癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，显然与肝细胞癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用于检测肝细胞癌。相应的，特异性抗Phospho-Rad9A-S387的抗体，包括各种抗Phospho-Rad9A-S387的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测Phospho-Rad9A-S387的表达量，因而可以用于检测肝细胞癌，或者用于制备检测肝细胞癌的制剂或试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

虽然有关Phospho-Rad9A-S387动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将它作为检测肝细胞癌的标记物却是肯定的。Phospho-Rad9A-S387可作为肝细胞癌的潜在标志，而它在胞内的生物学功能提示Phospho-Rad9A-S387可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。

Claims

1.一种细胞周期检查点调控蛋白的应用，所述细胞周期检查点调控蛋白为Phospho-Rad9A-S387，其特征在于，所述应用为用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记是检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表达量。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测这种蛋白质在肝细胞组织中的表达量是检测这种蛋白质在肝细胞组织中是否均存在上调表达。

4.一种抗Phospho-Rad9A-S387的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的制剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗Phospho-Rad9A-S387的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

6.一种抗Phospho-Rad9A-S387的抗体的应用，其特征在于，所述应用为用于制备检测肝细胞癌的试剂盒。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗Phospho-Rad9A-S387的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

8.一种体外检测肝组织中Phospho-Rad9A-S387的表达是否异常的方法，其特征在于，所述方法为检测待测肝组织中Phospho-Rad9A-S387的数量，并与正常肝组织中的Phospho-Rad9A-S387的数量进行比较。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测为使用抗Phospho-Rad9A-S387的抗体进行检测。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗Phospho-Rad9A-S387的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。