CN101974539B

CN101974539B - 多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用

Info

Publication number: CN101974539B
Application number: CN 201010534123
Authority: CN
Inventors: 王海庆; 刘永安; 窦全文; 陈志国
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: CN101974539A

Abstract

本发明涉及一种多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用。该基因为Sty8.1编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或者具有序列表中SEQ ID NO.1中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因；或者具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；或者具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。本发明所获得的基因具有比优质基因1Dy10更优良的二级结构，可以在小麦品质改良中发挥重要作用。

Description

多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用

技术领域

本发明涉及属于生物基因工程技术领域，尤其涉及多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，以及基于此基因通过生物技术方法改良小麦品质的应用。

背景技术

小麦胚乳储藏蛋白可分为醇溶蛋白(gliadins)和谷蛋白(glutenins)，二者使小麦面团具有延展性和弹性，因而能加工成各种各样的食品，其中决定面团弹性的谷蛋白又可分为高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)(Payne et al.，1985；Gupta and Shepherd，1990)。尽管高分子量谷蛋白亚基只占小麦种子总蛋白的很小一部分(约12％)(Halfordet al.，1992)，但其对面包烘烤品质的贡献率却达到70％(Payne，1987)。在普通六倍体小麦中，高分子量谷蛋白亚基有3个位点编码，即Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D，三者分别位于1A、1B和1D染色体的长臂上，且每一位点由紧密连锁的编码x-型亚基(分子量较大)和编码y-型亚基的基因(分子量较小)组成(Payne，1987；Shewry et al.，1992)。通常，由于基因沉默等原因，在一个小麦品种中通常有3～5个亚基基因表达(Payne，1987)。所有的高分子量谷蛋白亚基都有相似的结构：信号肽(在成熟的谷蛋白亚基中被切除)、保守的非重复N-、C-端区和中间重复区(Shewry et al.1992)。一般情况下，位于N-端和C-端的半胱氨酸的数量和位置非常保守，高分子量谷蛋白的变异主要由中间重复区中重复单元的数量变化决定，含有优质高分子量谷蛋白亚基的小麦籽粒面粉具有较高的SDS(十二烷基磺酸钠)沉淀值和谷蛋白膨胀指数(SIG)(McDermott and Redman，1977；Wang and Kovacs，2002)。

大量研究表明，高分子量谷蛋白亚基的组成和数目对小麦烘烤品质影响很大。一般认为具有Dx5+Dy10亚基组合的品种具有较好的烘烤品质，而具有Dx2+Dy12亚基组合的品种具有较差的烘烤品质。我国大多数小麦品种具有Dx2+Dy12亚基组合，而具有Dx5+Dy10等优质亚基组合的品种则很少。除了充分利用现有的优质高分子量谷蛋白基因基因资源外，鉴定新的优质谷蛋白亚基及其基因，用来培育含有优质高分子量谷蛋白亚基的小麦品种，将是改良我国小麦烘烤品质的重要途径。

老芒麦(Elymus Sibiricus L.)(StStHH)为小麦近缘种，具有抗旱、耐盐碱等特性，其St和H染色体组可分别编码谷蛋白和大麦醇溶蛋白，是提高小麦产量和改良小麦品质的重要种质资源。目前，还未见从老芒麦克隆出优质高分量谷蛋白亚基的报道，因此，从老芒麦中克隆鉴定优质高分子量谷蛋白亚基，通过远缘杂交、基因工程等方法将其转到普通小麦中，对小麦品质的改良具有重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种培育优质小麦、改善小麦品质的多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供基于该基因在改良小麦品质方面的应用。

为解决上述问题，本发明所述的一种多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，其特征在于：该基因为Sty8.1编码基因，来源于多叶老芒麦，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位所示的核苷酸序列。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；所述由SEQ IDNO.2衍生的蛋白质的序列与所述等位基因的序列相对应。

如上所述的多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因在培育改良小麦方面的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过分别测定多叶老芒麦，普通小麦品种宁春4号(1Ax1，1Bx17+1By18，1Dx5+1Dy10)(优质小麦)的谷蛋白膨胀指数(SIG)后发现多叶老芒麦谷蛋白膨胀指数(SIG)为5.35，而宁春4号谷蛋白膨胀指数(SIG)为4.23，从而表明多叶老芒麦极有可能含有优质亚基。而本发明通过SDS-PAGE电泳，结合PCR技术，在多叶老芒麦中分离到一个新的高分子量谷蛋白Sty8.1亚基及其编码基因Sty8.1。用Antheprot 6.0GOR方法对Sty8.1和1Dy10蛋白质二级结构进行预测比较(如图3所示)，结果显示Sty8.1的β转角含量为34％，而Dy10的β转角含量为28％，说明Sty8.1为优质亚基，具有比优质高分子量谷蛋白亚基1Dy10更优良的二级结构，因此，可在小麦品种改良中发挥重要作用。

其中：β转角是决定高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)弹性区域的结构单元，并赋予其蛋白显著抗变形的能力，β转角含量高的HMW-GS，通常为优质亚基(Tatham，et al.，1985；Flavell，et al.，1989)。

2、通过对本发明中的多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳(如图1a所示)，可以看到多叶老芒麦具有两条高分子量蛋白质条带，因此，表明在多叶老芒麦中有两个高分子量谷蛋白亚基基因表达。

3、本发明的基因结构特征：

根据蛋白质N-端和C-端保守序列及已发表的基因序列设计PCR引物，其中引物P1+P2用于扩增Sty8.1基因的编码区(图2)，引物P3+P4用于扩增编码去除信号肽的成熟蛋白质的核苷酸序列，用于原核表达鉴定克隆基因的功能活性。

用引物P1+P2，多叶老芒麦基因组DNA为模板进行扩增，得到1300bp和1800bp的两条带。测序后获得Sty8.1基因1824bp如序列表SEQ ID NO.1所示的编码区全序列，以及在第1029-1031位有TAG终止突变的1326bp序列。由SEQ ID NO.1序列推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该氨基酸序列显示，Sty8.1亚基与其它y-型高分子量谷蛋白亚基结构相似，N-末端是21个信号肽序列，其后与其它高分子量谷蛋白亚基一样，有三个明显的结构区域：99个氨基酸残基的非重复N-端区、444个氨基酸残基的中央重复区和42个氨基酸残基的非重复C-端区。Sty8.1亚基含有有6个半胱氨酸残基，其中N-端5个，C-端1个。重复区主要由六肽(主要为PGQGQQ)和九肽(主要为GYYPTSPQQ)组成，无x-型亚基的三肽重复。

4、由于本发明高分子量谷蛋白亚基Sty8.1的基因具有的优良二级结构，因此，利用此基因，通过远缘杂交、基因工程等技术，可培育优质小麦，从而改善小麦品质。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE分析及Sty8.1基因在大肠杆菌E.coli中的表达；其中a为多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE分析(图中1-宁春4号，2-中国春，3-、4-多叶老芒麦)，b为Sty8.1基因在大肠杆菌E.coli中的表达(图中1-宁春4号，2-中国春，3-多叶老芒麦，4-IPTG诱导表达4h后菌体总蛋白，5-IPTG诱导表达前菌体总蛋白)。

图2为本发明多叶老芒麦高分量谷蛋白亚基基因编码区的PCR扩增；其中1-1kb DNA ladder marker(上海生工产品)，2-多叶老芒麦高分量谷蛋白亚基基因编码区的PCR扩增。

图3为本发明Sty8.1亚基和1Dy10亚基蛋白质二级结构分析(GOR法)；其中a.Sty8.1亚基蛋白质二级结构分析，b.1Dy10亚基蛋白质二级结构分析。

具体实施方式

实施例1多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，该基因为Sty8.1编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位所示的核苷酸序列。

一、多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基Sty8.1基因的克隆。

1、引物设计：

根据蛋白质N-端和C-端保守序列及已发表的基因序列设计PCR引物，具体如下：

P15′-ATGGCTAAGCGG(C/T)T(A/G)GTCCTCTTG-3′

P25′-CTATCACTGGCT(A/G)GCCGACAATGCG-3′

2、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA：

(1)取50mg新鲜多叶老芒麦叶片，用液氮和石英砂研磨至粉末状。

(2)将粉末放入离心管中，加500μl 2×CTAB提取液(2％CTAB：1.4mol/LNaCl；0.1mol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA，pH＝8.0；)和1μl β-巯基乙醇，混匀。

(3)将离心管在65℃水浴中加热2h，其间每隔10min摇1次。

(4)将离心管冷却至室温，加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1体积比)，上下颠倒混匀，直至上清呈现乳状。

(5)将离心管以10000rpm的速率离心10min，取上层水相于另一干净离心管中，加入与水相等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1体积比)，上下颠倒混匀，直至上清呈乳状。

(6)将装有水相的离心管以10000rpm的速率离心10min，吸取上层水相，加入与该水相等体积的异丙醇，上下颠倒7～8次后，在-20℃放置1～2h；然后再以10000rpm的速率离心3min，弃上清液，用质量浓度为70％的酒精洗沉淀2次，室温风干。

(7)将DNA溶于30μl TE缓冲液中。

3、Sty8.1编码区的PCR扩增：

PCR反应体系由12.5μl 2×LA Buffer II、4μl dNTP、1μl P1、1μl P2、0.2μlLATaq酶(Takara产品)、1μl模板DNA组成，并用ddH₂O(重蒸水)加至终体积为25μl。

其中dNTP由dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dTTP(脱氧胸苷三磷酸)、dGTP(脱氧鸟苷三磷酸三钠)和dCTP(脱氧胞苷三磷酸)组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2.5mM。

PCR反应体系按下列程序进行：

反应结束后，用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶检测PCR产物，得到如图2所示的1300bp和1800bp两条带。

4、PCR产物的回收：

用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工产品)回收。

5、目的DNA片段的克隆：

(1)连接体系：

连接体系总量为5μl，由0.5μl pMD19-T载体(Takara产品)、2μl目的DNA片段和2.5μl连接缓冲液I组成。其中连接缓冲液I来源于pMD19-T载体试剂盒。

(2)将5μl连接体系在4℃下连接过夜。

(3)将5μl连接体系全部加入至50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后，冰浴30min。

(4)将步骤(3)所得的混合体系在42℃水浴中热激90s后，立刻置于冰浴中2min。

(5)在步骤(4)所得的混合体系中加入400μl LB培养基，于37℃下以130rpm的速率振荡1h，得到活化后的DH5α菌液。

(6)取100μl活化后的DH5α菌液，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB(100μg/ml)平板培养基上涂板，于37℃下培养12～16h，即得目的DNA片段菌落。

6、阳性克隆的鉴定与测序：

(1)用牙签挑取LB平板培养基上长出的抗氨苄青霉素阳性菌落，于另一含有Amp(100μg/ml)的LB平板培养基上划线培养8～14h，得到单菌落。

(2)用牙签挑取画线培养的单菌落，涂于一干净PCR管的底部。

(3)PCR反应体系：

PCR反应体系由1.6μl dNTP、2μl 10×PCR Buffer、0.4μl P1、0.4μl P2、0.1μl Taq酶(Takara产品)组成，并用ddH₂O加至终体积为20μl。

其中dNTP由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2.5mM。

PCR反应体系按下列程序进行：

反应结束后，用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶检测，确定目的基因片段已经插入到pMD19-T载体中。

(4)用牙签挑取步骤(3)鉴定获得的单菌落，于含有Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中摇菌过夜。

(5)吸取700μl菌液于干净的1.5ml离心管中，加入300μl 50％甘油，混匀，送生工生物工程(上海)有限公司测序。

测序后获得Sty8.1基因1824bp的如序列表SEQ ID NO.1所示的编码区全序列，以及在第1029-1031位有TAG终止突变的1326bp序列。

二、多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基Sty8.1基因的原核表达。

1、原核表达引物设计：

根据测序结果设计引物P3和P4，用以扩增编码不含信号肽的成熟蛋白的DNA序列，并分别在DNA序列5’-端和3’-端引入Nde I和EcoR I两个酶切位点。

P3：5′-GTGCATATGGCCTTTGGGCAACTACAGTG-3′

P4：5′-CTAGAATTCTCACTGGCTAGCCGACAATG-3′

2、用质粒小提试剂盒(TIANGEN产品)提取重组质粒和表达载体PET-30a质粒(Novagen产品)。

3、目的基因序列PCR扩增：

PCR反应体系由12.5μl 2×LA Buffer II、4μl dNTP、1μl P3、1μl P4、0.2μlLATaq、1μl重组质粒(稀释1000倍)组成，并用ddH₂O加至终体积为25μl。

PCR反应体系按下列程序进行：

反应结束后，得到PCR产物。

4、用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收原核表达PCR产物。

5、原核表达PCR产物的克隆与鉴定：

同多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基Sty8.1基因的克隆中的步骤5(目的DNA片段的克隆)和步骤6(阳性克隆的鉴定与测序)。

6、用质粒小提试剂盒(TIANGEN产品)提取原核表达PCR产物阳性克隆重组质粒。

7、原核表达重组质粒和表达载体pET-30a的双酶切：

将提取的原核表达重组质粒和表达载体pET-30a(Novagen产品)用EcoRI(TaKaRa产品)和Nde I(TaKaRa产品)进行双酶切，4h后酶切产物用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶分离，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

8、连接与鉴定：

将待插入片段的双酶切产物和pET-30a的双酶切产物按摩尔数10∶1的比例混合，加入T4DNA连接酶(TaKaRa产品)，在16℃下连接过夜。

取5μl连接产物加入至50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，采用卡那霉素(Kan)抗性筛选，长出的菌落直接用PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆摇菌，提取质粒，再用EcoR I和Nde I进行单/双酶切鉴定。

9、转化及蛋白质表达：

将含目的DNA片段的pET-30a质粒转化大肠杆菌BL 21(DE3plyS)(Novagen产品)感受态细胞，用卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cm)进行抗性筛选。挑取阳性克隆于1ml含卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cm)的LB液体(卡那霉素50mg/L，氯霉素37mg/L)培养基中，于37℃下以250rpm的速率摇菌过夜后，吸取50μl菌液接种于4.45ml含卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cm)的LB液体(卡那霉素50mg/L，氯霉素37mg/L)培养基中，于37℃下以250rpm的速率振荡4～5h，到OD₆₀₀＝0.6时，取出1ml菌液作为对照，然后加入IPTG使其在菌液中的最终浓度为1mmol/ml，于37℃下以250rpm的速率诱导培养4h。

10、表达蛋白提取：

诱导培养结束后，吸取1ml诱导表达的菌液于一干净1.5ml离心管内，连同诱导前的1ml菌液以10000rpm的速率离心，弃上清液，加入200μl ddH₂O，充分涡旋后，以1000rmp的速率离心，弃上清液；加入100μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液(2×SDS-PAGE上样缓冲液：100mmol/L Tris pH6.8，4％(w/v)SDS，0.2％(w/v)溴酚蓝，20％(v/v)甘油，2％(v/v)β-巯基乙醇)，100℃水浴10min后，冷却至室温，再以10000rpm的速率离心10min，取4μl上清液进行SDS-PAGE电泳。如图1b所示，诱导表达出来的目的蛋白和多叶老芒麦中Sty8.1亚基具有相同的迁移率，表明Sty8.1基因可在E.coli中高效表达。

实施例2多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，该基因为Sty8.1编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。

多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基Sty8.1基因的克隆和多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基Sty8.1基因的原核表达同实施例1。

实施例3多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，该基因为Sty8.1编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例4多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，该基因为Sty8.1编码基因，它具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质的序列与等位基因的序列相对应。

实施例5多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因在培育改良小麦方面的应用。

多叶老芒麦谷蛋白膨胀指数(SIG)高于优质小麦宁春4号，Sty8.1亚基的β转角含量高于Dy10，说明Sty8.1亚基为优质亚基，而且Sty8.1基因可在E.coli中高效表达。因此，可通过生物技术(基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法及远源杂交法等)将Sty8.1基因转到普通小麦中去，进而培育出品质优良的小麦品种。

Claims

1.一种多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，其特征在于：所述基因编码的高分子量谷蛋白亚基的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示。

2.如权利要求1所述的多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到1824位所示。

3.一种多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到606位所示。

4.如权利要求1或2所述的多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因在培育改良小麦方面的应用。