CN101974089B

CN101974089B - 重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白及其在神经细胞保护方面的应用

Info

Publication number: CN101974089B
Application number: CN2010101977294A
Authority: CN
Inventors: 陈建国; 曾建华; 吴鹏飞; 王芳; 张醉; 杨远坚
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-06-11
Also published as: CN101974089A

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白Trx-TAT-hMsrA的制备方法及其在神经细胞保护方面的应用。融合蛋白Trx-TAT-hMsrA含有TAT蛋白转导结构域和硫氧还原蛋白Trx，以及人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA。本发明的融合蛋白具有还原功能性蛋白蛋氨酸残基氧化、治疗氧化应激损伤、减缓帕金森症相关神经元病变、防治钙离子超载等多种生物学效应，同时其具有很好的透过细胞膜进入神经细胞的能力，是一种成药性好的新型生物技术候选药物。

Description

重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白及其在神经细胞保护方面的应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种融合有TAT蛋白转导结构域和人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA以及硫氧还原蛋白Trx所形成的融合蛋白(重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白)，及其制备方法和在神经细胞保护方面的应用。

背景技术

大量现代神经科学研究表明，氧自由基介导的病理损伤参与多种神经系统重大疾病的发生和发展。脑部丰富的脂质含量和相对缺乏的抗氧化酶水平使其在氧化应激中更易受损。多种因素(如异常折叠蛋白积聚、缺血再灌注损伤等)通过线粒体有氧呼吸等途径诱导神经元产生更多的活性氧(ROS)，如O^2-.、H₂O₂、OH·和¹O₂，而衰老过程中常伴有ROS清除系统(如谷胱甘肽还原系统、超氧化物歧化酶等)的减弱，从而导致氧自由基或氧化产物的异常积累，引发神经系统重大疾病的发生。蛋白质是大多数细胞生理活动的物质基础，氧自由基对于功能性蛋白如离子通道、酶以及受体等的氧化修饰，往往会导致蛋白质功能的失活、异常甚至蛋白质的降解加剧，从而介导细胞生理功能的紊乱。蛋白质分子中最易受到攻击的是含硫氨基酸残基，包括半胱氨酸残基(cysteine，Cys)和蛋氨酸(methionine，Met)残基，Cys的氧化产物包括次磺酸基二硫化物和磺基，通常以二硫化物为主。体内存在硫氧还原蛋白等还原性物质或体外存在DTT时，二硫键易被还原成巯基。半胱氨酸残基氧化形成二硫键，会影响包括L型钙离子通道、谷氨酸受体等神经系统重要蛋白的功能，申请者所在实验室的大量研究表明，使用巯基还原性药物逆转还原这种变化，可以治疗衰老相关的突触功能损伤。蛋氨酸残基氧化是蛋白质功能氧化性损伤另一个关键诱导因素。在弱氧化剂作用下，蛋氨酸易被氧化成MetO，在更强氧化剂如Ch-T的作用下，可进一步氧化成MetO2。MetO可由蛋氨酸还原酶还原成Met，但MetO2非常稳定，生理条件下不能被还原。从结构上看，正常蛋氨酸侧链很长，有弹性，无极性。氧化成MetO后，侧链变得僵硬，极性变大，从而使整个蛋白质功能改变。国外大量实验室的研究表明，关键蛋白质的蛋氨酸残基氧化，和多种神经系统重大疾病的发生发展密切相关。申请者所在实验室的大量研究表明，蛋白质蛋氨酸残基的氧化修饰和离子通道功能异常、突触可塑性损伤以及细胞钙稳态失衡都有着密切关系。因此，调节蛋白质蛋氨酸残基的氧化，可能成为治疗神经系统重大疾病的新策略。

蛋氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A，MsrA)是目前发现的可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。MsrA在很多生物体中，从进化上非常古老的古细菌大肠杆菌到植物和哺乳动物中均有发现，其抗氧化作用对于生物体的生存具有特别重要的意义。大量研究表明，MsrA是一种存在于生物体中的抗氧化修复因子。过表达MsrA基因可以显著减轻氧化应激引起的人T细胞、人Lens细胞、PC12细胞和WI-38SV40等细胞的损伤和凋亡。有研究认为，MsrA与衰老及哺乳动物寿命密切相关。因此，调节MsrA的基因表达，为治疗多种氧化相关的病理疾病提供了全新的视角和技术手段。而硫氧还原蛋白(Trx)是一种低分子量、进化上高度保守的有还原二硫键氧化产物活性的蛋白质，主要功能是调节细胞胞内氧化还原平衡，参与氧应激诱导的细胞凋亡。它既是MsrA系统在体内发挥功能最重要的伴侣分子，同时也是还原体内半胱氨酸残基氧化最重要的功能分子，我们设想，通过基因重组的方法，制备一种MsrA和Trx的融合蛋白。在神经系统重大疾病中，许多疾病和氧化损伤及细胞凋亡密切相关，包括帕金森综合症、缺血性脑损伤、老年痴呆症、血管性痴呆等。应用这种融合蛋白，在这些疾病的治疗中可能起到重要的作用。

蛋氨酸亚砜还原酶A(MsrA)和硫氧还原蛋白(Trx)从本质上讲都是功能性蛋白，可以按照基因工程的方法进行制备。但是，蛋白质类生物技术药物很难进入细胞，外周给药也很难透过血脑屏障。为了克服蛋白质药物的这些成药性差的缺点，研制能够用于中枢神经系统疾病的新型生物技术药物，我们设想通过基因重组改造作为功能性蛋白的MsrA和Trx。HIV-1病毒是一种具有很强穿透细胞和进入中枢神经系统能力的蛋白质颗粒，其进入细胞和进入中枢神经系统的关键结构域是其Tat蛋白第49-57位氨基酸。这种Tat蛋白来源的穿膜结构域小肽，在运载蛋白质进入细胞方面已经表现出极强的应用前景。我们设想通过基因工程方法，将Tat蛋白来源的穿膜结构域小肽、人源性蛋氨酸亚砜还原酶A蛋白以及硫氧还原蛋白构建成融合蛋白，从而将来用于制备治疗神经系统重大疾病相关药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白，使其具有神经细胞保护作用。

本发明的另一个任务是提供该融合蛋白的制备方法和应用。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种融合蛋白由硫氧还原蛋白Trx和TAT蛋白转导结构域以及人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA组成，本发明专利申请将该融合蛋白称为重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白。

本发明提供的重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白，一共416个氨基酸，其中1-109位氨基酸是Trx蛋白，110-165位氨基酸是连接区，166-179位氨基酸是TAT蛋白，180-416位氨基酸是hMsrA蛋白。本发明提供的重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，分子量为45KD。

重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白包含三个功能区，每个功能区的功能如下：Trx主要功能是调节细胞胞内氧化还原平衡；TAT蛋白是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，主要功能是引导重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白穿透细胞膜；人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA是体内唯一可以还原蛋白质蛋氨酸残基氧化的还原酶，主要功能是修复蛋白质氧化性损伤。由于许多疾病和氧化损伤密切相关，包括帕金森综合症、缺血性脑损伤、老年痴呆症、血管性痴呆等，本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白可用于这些疾病的治疗。

实验资料一：

本发明专利申请实施例1提供了本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的制备方法。实验资料一提供本发明重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白鉴定资料。

1.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的Western blot鉴定

融合蛋白做Western blot检测鉴定试验。电泳条件和实施例二保持一致。按表三配制转移缓冲液。按表四配制TBST缓冲液。电泳结束后，根据蛋白market切出目的蛋白位置(45KD)左右的胶，与NC膜、滤纸一起浸入转膜液中平衡至少15分钟。按着负极，海绵，滤纸，胶，NC膜，滤纸，海绵，正极的顺序将其放入转膜盒中，恒流湿转法将蛋白从胶转移至NC膜上。转膜结束后，将NC膜浸没在封闭液中(5％去脂奶粉溶于TBST)中封闭1小时，将NC膜置于适当浓度的一抗(1％去脂奶粉溶于TBST配制)中，4℃振荡孵育过夜。TBST充分漂洗后，加入HRP标记的二抗，室温下振荡孵育1小时.TBST充分漂洗后，ECL荧光剂，5分钟，根据荧光强度，适当曝光压片显影.胶片扫描后，用Image J软件分析显影的密度。

表三

表四

用MsrA抗体(Upstate，USA)进一步证实该融合蛋白就是重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白。参见附图4。

2.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的穿膜活性鉴定

在DMEM培养基中培养CHO细胞株，2-3天传代一次。细胞状态较好时，种于玻片上。使用重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白(5nM)孵育细胞，24小时后固定。使用MsrA抗体(Upstate，USA)进行细胞免疫荧光实验。步骤包括：配制PBS溶液250ml：Na2HPO4：0.725g；NaH2PO4：0.075g；Nacl：2.25g。调节PH到7.2-7.4。将长有细胞的玻片放入24孔板，PBS漂洗三次，每次10min；每孔加500ul的4％的多聚甲醛，20min，进行细胞固定；PBS漂洗三次，每次10min；

每孔加500ul的0.3％的Triton进行透化，30min；每孔加500ul的3％的BSA进行封闭，30min；使用1∶500比例，向含有1％BSA、10％Triton及NGS(羊血清)3％的PBS中加入MsrA抗体，4℃，过夜；PBS漂洗三次，每次10min；使用1∶1000的比例，向含有1％BSA、10％Triton及NGS(羊血清)3％的PBS中加入FITC标记鼠抗兔二抗，室温，2h；PBS漂洗三次，每次10min；30％的甘油封片，细胞面朝下。使用莱卡荧光显微镜拍照。结果显示，重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白可以进入CHO细胞。结论：重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白具有透膜活性。见图5。

3.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的蛋氨酸亚砜还原活性鉴定

蛋氨酸亚砜还原酶活性的测定方法遵循本实验室已经建立的方法：配制含有以下反应试剂的反应液，其终浓度分别为：MgCl₂ 10mM；KCl 30mM；Tris.HCl 25mM；二硫苏糖醇1mM。用盐酸调节PH到7.4。加入蛋氨酸亚砜至终浓度10mM并加入待测样本至该反应液中，37℃反应60分钟后，加入显色液Ellman试剂(5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸)0.01M和NaOH 0.1M，调节PH到8.0-8.5，37℃反应5-10分钟用酶标仪检测412nm处OD值。将不加反应物的背景液OD值和反应结束后的OD值，带入下述公式，计算得到酶活：

酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*1*εTNB*V样品

式中：

OD酶反应为反应结束后反应孔的OD值，OD酶背景为反应结束后背景孔的OD值，V体系为反应总体积，V样品为样品总体积，l为光程厚度(仪器常数)，εTNB：为硫代-2-硝基苯甲酸的消光系数。l*εTNB数值可以通过查找仪器说明书和化学手册方法得到，也可通过标准曲线计算得到。标准曲线的制作方法：用缓冲液(MgCl₂10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4)配置不同浓度二硫苏糖醇(100μM-2000μM)，和DTNB甲醇溶液(0.01M)等体积在37℃反应10分钟，加入NaOH溶液(0.1M)调节PH到8.0-8.5，在412nm处读取OD值，将OD值和二硫苏糖醇浓度进行线性回归分析，可以算出l*εTNB数值。向96孔板中加入缓冲液(MgCl₂10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4)配置的二硫苏糖醇(1mM)和蛋氨酸亚砜溶液(10mM)各50μl作为反应孔；缓冲液配置的二硫苏糖醇和缓冲液各50μl作为背景孔。37℃预热10分钟。向反应孔及对应的背景孔分别加入等蛋白量5μg和10μg的蛋白液。37℃振摇反应60分钟。向反应孔及对应的背景孔分别加入20μl NaOH溶液(0.1M)。37℃振摇5分钟。向反应孔及对应的背景孔分别加入100μl试剂Ellman试剂(0.01M)。37℃振摇5分钟。用酶标仪在412nm处读取数值，按公式：

酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品

计算酶活性。

表五反应体系OD值与蛋白酶活性

酶量(μg) OD背景 OD反应酶活(U/g)

5 0.498 0.355 326

10 0.942 0.634 544

结论：表五说明制备的重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白具有还原蛋氨酸亚砜的活性。

实验资料二：重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对神经细胞损伤的保护作用

1、重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于氧化应激引起神经细胞损伤的保护作用

人源性神经母瘤细胞株SH-SY5Y用含15％胎牛血清的DMEM培养基培养于37摄氏度5％CO2培养箱。每3-5天传代一次。实验前将SH-SY5Y种到96孔板里。使用过氧化氢250μM处理12小时造氧化应激损伤细胞模型。重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白(5nM和0.5nM)于过氧化氢加入前2小时加入培养基，并一直保持到实验结束。实验结束后使用MTT检测细胞活性。各孔吸除孔内培养上清液，加入含有0.5mg/ml MTT的无血清细胞培养液200ul继续孵育4小时，终止培养，吸除孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解后立即进行比色，测定波长为570nm，在酶标仪上测定各孔吸光度即OD值。检测孔OD值减去空白孔调零孔OD值即为检测孔实际OD值。结果参见附图6。结果显示，过氧化氢250μM处理12小时会引起明显的细胞活性下降，Trx-TAT-hMsrA融合蛋白处理可以显著提高过氧化氢处理后的细胞活性。

2、重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于帕金森症相关病理因素MPP引起神经细胞损伤的保护作用

人源性神经母瘤细胞株SH-SY5Y用含15％胎牛血清的DMEM培养基培养于37摄氏度5％CO2培养箱。每3-5天传代一次。实验前将SH-SY5Y种到96孔板里。使用MPP(sigma)2mM处理48小时造PD相关细胞损伤模型。重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白(5nM和0.5nM)于MPP加入前2小时加入培养基，并一直保持到实验结束。实验结束后使用MTT检测细胞活性。各孔吸除孔内培养上清液，加入含有0.5mg/ml MTT的无血清细胞培养液200ul继续孵育4小时，终止培养，吸除孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解后立即进行比色，测定波长为570nm，在酶标仪上测定各孔吸光度即OD值。检测孔OD值减去空白孔调零孔OD值即为检测孔实际OD值。结果参见附图7。结果显示，MPP(2mM)处理24小时会引起明显的细胞活性下降，Trx-TAT-hMsrA融合蛋白处理可以显著提高MPP处理后的细胞活性。

3、重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于氧化引起细胞钙超载的保护作用

在DMEM培养基中培养CHO细胞株，2-3天传代一次。细胞状态较好时，种于玻片上。使用重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白(5nM)孵育细胞，24小时后进行钙离子成像实验。使用Fura-2/AM探针孵育细胞。Fura-2/AM为酯类物质，可以透过细胞膜，又能够被胞内特定的酯酶水解成有活性的Fura-2，然后与胞内游离Ca²⁺结合，结合后产物的激发波长分别为340nm和380nm左右。胞内[Ca²⁺]_i可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算，即双激发波长荧光法。将接种在玻片上的CHO细胞株用细胞外液清洗三次后，加入一定体积终浓度为1μM Fura-2/AM，37℃孵育30min。再清洗两次以除去胞外的Fura-2/AM开始实验。胞内Ca²⁺信号用荧光测钙系统检测(TILL Photpnics GmbH，Germany)。本系统主要部件包括：OLYMPUS倒置显微镜、CCD、光纤冷光源、控制器和计算机Vision处理软件等。将细胞玻片放入固定在倒置显微镜(Olympus IX-70)可移动平台上的细胞槽中，以正常的细胞外液灌流，灌流速度为1.5～4ml/min。显微镜下观察，选择状态好的细胞作为检测对象。对应细胞选择region of interest(ROI)，作为实时监控对象。分别以340nm和380nm的荧光进行激发。每秒记录一幅ROIs的F340/F380荧光比值图像。F340/F380荧光比值代表细胞内钙离子的浓度。实验数据由TILLVISION软件进行记录，最后导入到Excel表格中进行数据分析。结果参见附图8。结果显示，2mM H₂O₂显著升高CHO的[Ca²⁺]_i，但使用重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白处理后的细胞，其[Ca²⁺]_i升高幅度显著低于对照，提示重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白可以减少氧化引起的钙离子超载。

本发明巧妙的将TAT蛋白传送系统和人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA以及硫氧还原蛋白Trx形成融合蛋白，克服了过去这些大分子的酶不能进入细胞内的缺点，赋予了它们新的功能，使它们能够跨过细胞膜的阻挡，到细胞中发挥抗氧化功能。蛋白质中最容易被氧化的半胱氨酸残基(cysteine，Cys)和蛋氨酸(methionine，Met)残基分别可以被硫氧还原蛋白Trx和人源性蛋氨酸亚砜还原酶hMsrA还原，从而抵抗ROS氧自由基对神经细胞造成的损伤。本发明实验证实，本发明提供的融合蛋白对神经细胞损伤具有保护作用，可用于制备治疗神经系统重大疾病(包括帕金森综合症、缺血性脑损伤、老年痴呆症、血管性痴呆等)的药物。

附图说明

图1：重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白表达载体的构建；图1反映的是，Tat-hMsrA插入的位置，在表达载体pet32a的BamHI和XhoI酶切位点之间，Trx蛋白在Tat-hMsrA的前面，之间含有纯化用的his tag标签。

图2：重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白在BL21(DE3)表达菌株中诱导表达后上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果；图2反映的是，重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白在BL21(DE3)表达菌株中诱导表达后，上清液SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的结果。图中，M代表蛋白质分子量Marker；1，3：加了重组蛋白诱导剂IPTG的菌株上清蛋白；2，4：不加重组蛋白诱导剂IPTG的菌株上清蛋白。

图3：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果；图3反映的是，纯化前后的重组蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色的结果。图中，M代表蛋白质分子量Marker；1：代表纯化前的菌株上清总蛋白；2：代表菌株上清总蛋白经过一次纯化后的产物；3：代表菌株上清总蛋白经过两次纯化后的产物；4：代表菌株上清总蛋白经过三次纯化后的产物。

图4：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的Western Blotting结果；图4反映的是，纯化后的重组蛋白Western Blotting检测的结果。图中，1：代表阳性对照脑组织提取蛋白中MsrA的表达；2：代表纯化后重组蛋白的MsrA抗原性。

图5：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的穿膜活性鉴定结果；图5反映的是，纯化后的重组蛋白透过CHO细胞的能力。图中，1：代表未经重组蛋白处理的CHO细胞；2：代表经重组蛋白处理的CHO细胞。

图6：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于氧化应激神经细胞损伤的保护作用；图6反映的是，纯化后的重组蛋白对于氧化应激引起SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。图中，1：代表正常SH-SY5Y神经细胞的细胞存活率；2：代表氧化剂造模处理后模型组的细胞存活率；3：代表高浓度的重组蛋白(5nM)处理后加氧化剂造模后的细胞存活率；4：代表低浓度的重组蛋白(0.5nM)处理后加氧化剂造模后的细胞存活率。

图7：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于帕金森症相关病理因素MPP引起神经细胞损伤的保护作用；图7反映的是，纯化后的重组蛋白对于MPP引起的细胞损伤的保护作用。图中，1：代表正常SH-SY5Y神经细胞的细胞存活率；2：代表MPP处理后模型组的细胞存活率；3：代表高浓度的重组蛋白(5nM)处理后加MPP造模后的细胞存活率；4：代表低浓度的重组蛋白(0.5nM)处理后加MPP造模后的细胞存活率。

图8：纯化后重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白对于氧化引起细胞钙超载的保护作用；图8反映的是，纯化后的重组蛋白对于氧化引起的CHO细胞钙离子超载的保护作用。图中，1：代表氧化引起正常CHO细胞上钙离子超载的结果；2：代表重组蛋白(5nM)处理后氧化引起正常CHO细胞上钙离子超载的结果。340/380的Ratio值代表胞内游离钙离子浓度。

具体实施方式

实施例1制备本发明融合蛋白

1.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白表达载体的构建

构建的载体图谱见附图1。

载体构建的详细步骤：

(1).测序：含有hMsrA基因的Pcmv-XL4载体(北京毅新兴业科技有限公司)，送给北京奥科生物技术有限责任公司进行测序，测序结果与基因库中的人源性的MsrA基因一致，表明此质粒可用。

(2).设计引物：为了把hMsrA基因从Pcmv-XL4载体上提取出来，换到pet32a载体上去，以BamHI和XhoI为限制性酶切位点，设计一对引物，并在设计的引物上加上Tat序列，5’端序列：5-CGCGGATCCGGTTACGGTCGTAAGAAACGTAGACAGCGCAGACGTGGTCGCCCTCCCATGCTCTCGGC-3；

3’端序列：

5-CCGCTCGAGTTATTTTTTAATACCCACTGGGCAGGACACGC-3，

交给上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(3).PCR：引物送来后，由于是粉末状的，容易挥发，先离心13000rpm，1min，让引物沉积下来，按合成报告单上提供的方法加灭菌的ddH2O。使用Bio-Rad的PCR仪器进行扩增，PCR体系包括7样：{模板：0.6ul，0.37ug/ul；引物up：0.5ul；引物down：0.5ul；pfu：1ul；dNTP：4ul；pfu buffer：5ul；H2O：38.4ul}。PCR的程序设置：{初始变性：3min，95℃；变性：30s，94℃；退火：30s，54℃；延伸：1min，72℃；循环：29次；最终延伸：10min，72℃；最后：8℃，forever}。PCR结束后，进行电泳，鉴定PCR是否成功：{第一泳道：DNA ladder；第二泳道：PCR样本。电泳的程序设置：100V，35min，电泳完毕后，用凝胶成像仪观察结果，看有没有很亮的目的条带，目的条带的位置正确，进行下一步}。

(4).PCR产物回收：把正确的目的条带用小刀切下来，按凝胶回收试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司)进行凝胶回收。

(5).酶切：酶切包括目的片段Tat-MsrA酶切和载体pet32a酶切。目的片段酶切体系包括：{目的片段(50ul)：36ul，0.25ug/ul；BamHI：0.5ul；XHOI：0.5ul；BSA：0.5ul；NEbufferIII：5ul；H2O：7.5ul}。载体酶切体系包括：{载体：15ul，0.37ug/ul；BamHI：0.5ul；XHOI：0.5ul；XHOI：0.5ul；BSA：0.5ul；NEbufferIII：5ul；H2O：35.5ul}。酶切条件为37℃，12h。

(6).酶切回收：目的片段做PCR回收，载体做凝胶回收，回收方法按试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司)进行。

(7).连接：{连接体系包括：载体：4ul；目的基因：3ul；T4连接酶：1ul；T4buffer：1ul；H2O：1ul}，16℃放置7小时；4℃放置9小时。

(8).转化：从-70℃冰箱取出感受肽trans 5α(武汉凯胜生物)，用手捂热，使之迅速解冻，大约10min，用移液枪吸取10ul连接质粒加入感受肽，用手指轻弹混匀，放4℃冰箱约30min，取出含Amp⁺的2YT培养板，把感受肽涂在板子上，在超净台上操作，放入37℃的培养箱14h。

(9).摇菌：用镊子夹住小枪头从培养板里挑取12个涨势比较好的菌落于12支15ml的管子里，每支管子有3-4ml的加了Amp+的液体培养基，在37℃，280rpm的摇床里摇14小时。

(10).质粒小量提取：按质粒小量提取试剂盒的操作说明进行操作，提取质粒后跑琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：108V，55min，初步鉴定目的基因有没有连接上去。

(11).酶切鉴定：从质粒小量提取的电泳结果里挑3个条带位置正确的做酶切鉴定，37℃，3h酶切，然后电泳，观察有没有目的条带，如果有大小、位置正确的目的条带，表明连接可能成功。

(12).测序：从酶切鉴定的结果里挑取正确的测序，正向使用测序引物T7，反向使用T7ter，测序结果出来，使用软件DNAssist进行序列拼接后，序列正确，分子构建成功。编码重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白基因在BL21表达菌株中的整合及诱导表达

用含有Trx-TAT-hMsrA蛋白的重组质粒转化大肠杆菌BL21(武汉生命技术有限公司)表达菌株，涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃恒温培养过夜，平板上长出较好菌落。挑取阳性菌落接种在10ml含氨苄青霉素抗性的LB试管中，37℃，280r·min，剧烈振荡培养过夜。次日按1∶100的比例接种过夜，培养物于200mL含氨苄青霉素(含终质量浓度为50mg·L)抗性的LB试管中，于37℃剧烈振荡培养至OD600nm为0.6-0.8，均分该培养物为两部分，一部分加入异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol·L以诱导表达，另一部分不加IPTG作对照，继续培养4h，4℃，12000r·min。离心15min收获菌体，1L加50mL结合缓冲液(5mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LTris.HCl，pH 7.9)重悬菌体，1∶1000加PMSF，然后冰浴状态下超声破菌(pulse：10s，10s；Amp：60％；timer：16min)，超声波充分破碎后，4℃，12000r/min离心20min后，则融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。定蛋白浓度，收集各组样本，按4∶1体积(样本：上样缓冲液)与5×上样缓冲液充分混匀后，沸水中加热灭活5min。取相同蛋白量(20μg)的各样本进行SDS-PAGE电泳分析。按照表一中配方，配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。按照表二中配方，配制电泳缓冲液。

表一

	分离胶(10％)	浓缩胶(4％)
			超纯水(ml)	3.2	2.4
1.5M Tris(8.8)(ml)	2.7	0.615
			30％Acry/bis(ml)	2	0.5
10％SDS(μl)	80	40
			TEMED(μl)	80	40
10％APS(μl)	3.2	4
			总体积：	8(ml)	4(ml)

表二

试剂	浓度	配置(500ml)
			Tris-base	25mM(pH8.3)
甘氨酸	200mM
			SDS	0.1％
超纯水		溶解后定容至500ml

每泳道加入等量蛋白(一般约20μg)，100V电压，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳分离120min。电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色40min后，用含10％冰醋酸和10％甲醇的脱色液脱色至本底无色为止，经蛋白marker对照，与未加IPTG诱导的对照相比，发现在45KD附近，有大量Trx-TAT-hMsrA融合蛋白表达。参见附图2。

3.重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白的纯化

将上清转入装有Ni²⁺-NTA树脂的层析柱(qiagen公司)中，上样完毕后静置2h，以便6个组氨酸的标签与填料中Ni²⁺充分结合，收集。严格按照QIAGEN公司的Ni-NTA fast startkit说明书加wash buffer，收集。加Elute buffer，收集。做好标记，所有的收集液行SDS-PAGE电泳(方法同实施例2)，电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色40min后，用含10％冰醋酸和10％甲醇的脱色液脱色至本底无色为止，经蛋白marker对照，可得出目的蛋白的相对分子质量。结果参见附图3。可见纯化后明显消除了几乎所有杂蛋白。用Millipore的蛋白浓缩管进行离心浓缩(2000rpm，15min)，纯化的融合蛋白用0.22μm的滤膜除菌后，-20℃保存备用。

以下是本发明涉及的氨基酸序列表。

SEQ ID NO：1的序列特征：

(A)长度：416个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

SEQ ID NO：2的序列特征：

(A)长度：1248个碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 重组Trx-TAT-hMsrA融合蛋白及其在神经细胞保护方面的应用

<140> 201010197729.4

<141> 2010－06－11

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工

<400> 1

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

165 170 175

Arg Gly Arg Pro Pro Met Leu Ser Ala Thr Arg Arg Ala Cys Gln Leu

180 185 190

Leu Leu Leu His Ser Leu Phe Pro Val Pro Arg Met Gly Asn Ser Ala

195 200 205

Ser Asn Ile Val Ser Pro Gln Glu Ala Leu Pro Gly Arg Lys Glu Gln

210 215 220

Thr Pro Val Ala Ala Lys His His Val Asn Gly Asn Arg Thr Val Glu

225 230 235 240

Pro Phe Pro Glu Gly Thr Gln Met Ala Val Phe Gly Met Gly Cys Phe

245 250 255

Trp Gly Ala Glu Arg Lys Phe Trp Val Leu Lys Gly Val Tyr Ser Thr

260 265 270

Gln Val Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Thr Ser Asn Pro Thr Tyr Lys Glu

275 280 285

Val Cys Ser Glu Lys Thr Gly His Ala Glu Val Val Arg Val Val Tyr

290 295 300

Gln Pro Glu His Met Ser Phe Glu Glu Leu Leu Lys Val Phe Trp Glu

305 310 315 320

Asn His Asp Pro Thr Gln Gly Met Arg Gln Gly Asn Asp His Gly Thr

325 330 335

Gln Tyr Arg Ser Ala Ile Tyr Pro Thr Ser Ala Lys Gln Met Glu Ala

340 345 350

Ala Leu Ser Ser Lys Glu Asn Tyr Gln Lys Val Leu Ser Glu His Gly

355 360 365

Phe Gly Pro Ile Thr Thr Asp Ile Arg Glu Gly Gln Thr Phe Tyr Tyr

370 375 380

Ala Glu Asp Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ser Lys Asn Pro Asn Gly Tyr

385 390 395 400

Cys Gly Leu Gly Gly Thr Gly Val Ser Cys Pro Val Gly Ile Lys Lys

405 410 415

<210> 2

<211> 1248

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccggtta cggtcgtaag aaacgtagac agcgcagacg tggtcgccct 540

cccatgctct cggccacccg gagggcttgc cagctcctcc tcctccacag cctctttccc 600

gtcccgagga tgggcaactc ggcctcgaac atcgtcagcc cccaggaggc cttgccgggc 660

cggaaggaac agacccctgt agcggccaaa catcatgtca atggcaacag aacagtcgaa 720

cctttcccag agggaacaca gatggctgta tttggaatgg gatgtttctg gggagctgaa 780

aggaaattct gggtcttgaa aggagtgtat tcaactcaag ttggttttgc aggaggctat 840

acttcaaatc ctacttataa agaagtctgc tcagaaaaaa ctggccatgc agaagtcgtc 900

cgagtggtgt accagccaga acacatgagt tttgaggaac tgctcaaggt cttctgggag 960

aatcacgacc cgacccaagg tatgcgccag gggaacgacc atggcactca gtaccgctcg 1020

gccatctacc cgacctctgc caagcaaatg gaggcagccc tgagctccaa agagaactac 1080

caaaaggttc tttcagagca cggcttcggc cccatcacta ccgacatccg ggagggacag 1140

actttctact atgcggaaga ctaccaccag cagtacctga gcaagaaccc caatggctac 1200

tgcggccttg ggggcaccgg cgtgtcctgc ccagtgggta ttaaaaaa 1248

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

cgcggatccg gttacggtcg taagaaacgt agacagcgca gacgtggtcg ccctcccatg 60

ctctcggc 68

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

ccgctcgagt tattttttaa tacccactgg gcaggacacg c 41

Claims

1. 一种重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白，其特征在于：序列如SEQ ID NO:1 所示。

2.编码权利要求1所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO:2 所示。

3.权利要求1所述的重组Trx-Tat-hMsrA融合蛋白在制备防治氧化应激损伤的药物中的应用。