CN101952444A - 产量提高的植物(ko nue) - Google Patents
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Abstract
本发明总体而言涉及转化的植物细胞以及植物或其部分，其包含失活或下调的基因，其导致与例如未经转化的野生型细胞相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的生物量产生，本发明还涉及产生这些植物细胞或者植物或其部分的方法。
Description
本发明总体而言涉及转化的植物细胞以及植物或其部分，其包含失活或下调的基因，其导致与例如未经转化的野生型细胞相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的生物量产生，本发明还涉及产生这些植物细胞或者植物或其部分的方法。
具体的，本发明涉及被改造成在氮缺乏条件下生长的植物；和/或植物细胞和/或植物部分，其在非氮缺乏条件下生长时显示出提高的产量。
本发明还涉及对这些植物细胞、植物或植物部分(特别是植物)产生和筛选和育种的方法。
农业生物技术学家还使用指示转基因对作物产量的可能影响的其他参数的测量值。对于饲料作物如苜蓿、青贮饲料玉米和干草而言，植物生物量与总产量相关。然而，对于谷类作物而言，使用其他参数来估计产量，如植物大小，通过植物总干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、花结直径、叶长度、根长度、根质量、分蘖数和叶数来衡量。早期发育阶段的植物大小一般与发育后期阶段的植物大小相关。具有较大叶面积的较大植物通常比较小的植物吸收较多的光和二氧化碳，因此很可能在相同的时间中获得较多的重量。植物大小和生长速率有很强的遗传成分，因此在一种环境条件下的不同基因型植物大小很可能与在其他条件下的大小相关。这样，可以使用标准环境来接近作物在大田中在不同位置和时间遇到的不同的动态环境。已经表征了与植物中胁迫应答、水利用和/或生物量相关的一些基因，但迄今为止在开发产量提高的转基因作物植物方面取得的成功十分有限，没有这样的植物被商品化。因此，需要鉴定能提高作物植物产量的其他基因。
植物营养对于植物的生长和发育十分关键，因此也对植物产品的数量和质量十分关键。由于营养摄入效率和营养利用对植物产量和产品质量有重大影响，因此对土壤使用了大量的肥料来优化植物生长和质量。
植物生长主要受限于三种养分——磷、钾和氮。因此，氮(N)是植物生长所需的主要营养元素之一，通常是植物生长的限速元素。氮是可见于活细胞中的大量重要化合物(如氨基酸、蛋白质(如酶)、核酸和叶绿素)的一部分。植物干物质的1.5％至2％和植物总蛋白的约16％是氮。因此，氮的利用度对氨基酸合成和氨基酸组成、氨基酸累积、蛋白质合成及累积有重大影响，因此是植物生长和产量的重要限制因素(Frink C.R.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 96，1175(1999))。
由于作物植物的高氮需求，氮肥是十分广泛的农业投资，每年施用八千万吨氮肥(硝酸盐和/或铵)(Frink C.R.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 96，1175(1999))。在作物生产中大量使用含氮肥料也有不良的环境后果，因为作物仅保留所施用氮的约三分之二。因此，大量的肥料投入通过淋洗、气体丧失和作物清除而导致了大量输出。接着未吸收的氮可被淋洗到土壤中并污染水源(Frink C.R.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 96，1175(1999))。由于大量氮从农业生态系淋洗到地表水和地下水中，氮也被认为是一种污染物。氮淋洗(即作为硝酸盐从农业田地中淋洗出来)影响饮用水的品质，并导致湖泊和海岸地区的富营养化。大量使用含氮肥料可进一步导致土壤品质最终恶化、环境污染和卫生危险。
由于对于农业产品而言每年的高氮肥费用及其对环境的有害影响，期望开发出这样的方法，以减少氮肥投入和/或优化氮摄入和/或对给定氮利用度的利用，而同时维持光合作用活性生物(优选栽培植物，如作物)的最佳产量、生产力和品质。还期望获得“现有”的作物产量而同时肥料投入较少和/或在类似或甚至较贫瘠的土壤上具有较高的产量。
已经在多种生物(包括酵母和植物)中表征了铵摄入系统。酿酒酵母含有用于铵转运蛋白的三个MEP基因，它们均受氮控制，在存在易于代谢的氮源(如NH4 +)时被抑制(Marini等，Mol.Cell Biol.17，4282(1997))。已经通过酵母突变体的回补、数据库同源性检索和异源杂交克隆了编码铵转运系统的植物基因(von Wiren N.等，Curr.Opin.Plant Biol.，3，254(2000))。NH4 +转运蛋白生理功能的实验性证据主要依赖于铵转运蛋白表达与标记的铵的内向通量之间的相关性。在拟南芥和其他植物中，铵转运蛋白以基因家族存在，其成员具有不同的表达模式和生理特征，这一事实使得情况变得复杂。DE 43 37 597要求保护植物铵转运蛋白的序列及其用于在某些情况下对氮代谢和植物生长进行操作的用途，但并没有通过异位表达植物铵转运蛋白获得的在某些条件下对氮同化或植物生长的正影响的任何证据。因此，改造植物的氮同化的文献证据仍仅限于少数情况，不包括转运蛋白。
然而，仍需要这样的光合作用活性生物(特别是植物)，其具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如能够更有效地利用氮的植物，从而获得相同产量而需要的氮较少或者使用目前的氮利用水平可以获得较高的产量。此外，仍需要显示提高的生物量的光合作用活性生物，特别是植物。
因此，本发明的一个目的是开发光合作用活性生物(特别是植物)的廉价方法，其具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率)，例如能够更有效地利用氮的植物，从而对于相同的产量所需的氮较少或者使用目前的氮利用水平可以获得较高的产量。例如，在本发明方法中包括在光合作用生物中增强氮摄入和/或转运和/或同化和/或利用(其单独或共同反映为提高的氮利用效率(NUE))和/或例如在氮供应有限的条件下提高生物量产生和/或产量的方法。
我们发现，这一目的通过提供本文所述的方法而得以实现。
本发明的另一目的是提供植物细胞和/或植物，其与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞和/或植物相比显示出提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的NUE和/或在有限氮供应条件下显示出提高的生物量产生和/或产量。
我们发现，这一目的通过提供本文所述的植物细胞和/或植物而得以实现。
因此，在一个实施方案中，本发明提供产生与相应野生型植物相比具有提高的产量的植物的方法，包括至少以下步骤：降低、抑制或缺失亚细胞区室和组织中选自本文所述的以下的一种或多种活性：At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白(下文称为“活性”，例如“所述活性”)。
因此，在另一实施方案中，本发明提供在转基因植物中降低、抑制或缺失本文所述亚细胞区室和组织中表I所示分离多核苷酸的方法。本发明的转基因植物与野生型植物变种相比显示出改进的产量或提高的产量。术语“改进”或“提高”或“增强”在本文中可互换使用。
本文使用的术语“产量”一般指来自植物(特别是作物)的可测量的生产。产量和产量提高(与未经转化的起始植物或野生型植物相比)可通过多种方式来测量，应该理解，本领域技术人员能够根据具体的实施方案、相关的具体作物以及特定的目的或相关应用来应用正确的含义。
就本发明的描述而言，增强或提高的“产量”指选自以下的一个或多个产量参数：生物量、干生物量产量、地上部分干生物量产量、地下部分干生物量产量、鲜重生物量产量、地上部分鲜重生物量产量、地下部分鲜重生物量产量；提高的可收获部分产量，其可以是干重或鲜重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有；增加的作物果实产量，其可以是干重或鲜重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有；优选提高的种子产量，其可以是干重或鲜重或二者皆有，地上部分或地下部分或二者皆有。
本文使用的术语“改进的产量”或术语“提高的产量”指任何可测量植物产品(如籽粒、果实或纤维)的产量提高。根据本发明，不同表型性状的改变可以提高产量。例如(但不限于)，诸如以下的参数是提高的产量的合适度量：花器发育、根发生、根生物量、种子数、种子重量、收获指数、对非生物性环境胁迫的耐性、叶形成、向光性、顶端优势和果实发育。任何产量提高都是本发明的改进的产量。例如，产量的改进可包括任何可测量参数提高0.1％，0.5％，1％，3％，5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。例如，来自作物的大豆或玉米(包括表I的核苷酸和多肽为转基因的植物)的蒲式耳/英亩产量与相同条件下培养的未处理大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相比的提高就是本发明的改进产量。提高或改进的产量可在有或无胁迫的条件下实现。
例如，本发明提供产生转基因植物细胞或植物的方法，所述转基因植物细胞或植物可通过提高或产生上述一种或多种所述活性而显示出与相应(例如未经转化的)野生型或起始植物相比提高的产量相关性状，例如提高的环境胁迫耐性和/或提高的固有产量和/或生物量产生。
在一个实施方案中，产量提高指提高或改进的作物产量或可收获产量。
作物产量在本文中定义为每英亩收获的相关农产品(如籽粒、饲料或种子)的蒲式耳数。作物产量受非生物性环境胁迫(如干旱、热、盐和寒冷胁迫)和植物大小(生物量)的影响。传统植物育种策略相对缓慢，并一般不能成功地赋予提高的非生物性环境胁迫抗性。常规育种获得的籽粒产量改进在玉米中已经达到了平台期。
因此，植物的产量可取决于每一种具体情况下具体的目的植物/作物以及预期的目的应用(如食物生产、饲料生产、加工食品生产、生物燃料、沼气或醇生产等)。因此，在一个实施方案中，产量以收获指数(表示为相应可收获部分的重量除以总生物量的比值)、每单位面积(英亩、平方米等)的可收获部分的重量等计算。玉米的收获指数(即收获时产量生物量与总累积生物量的比值)在过去数百年中在对籽粒产量进行的选择性育种中基本保持不变。因此，最近玉米中出现的产量提高是由于每单位土地面积上总生物量产生的提高。这种提高的总生物量是通过提高植物密度实现的，这导致了适应性的表型改变，例如叶角减少(这可减少对下层叶的遮蔽)和花穗大小(这可提高收获指数)。收获指数在许多环境条件下相对稳定，因此植物大小与籽粒产量之间可存在强相关性。植物大小与籽粒产量之间存在固有的联系，因为大部分籽粒生物量取决于植物的叶和茎的当前或存储的光合作用生产力。对于非生物性环境胁迫耐性，在培养箱或温室中的标准条件下测量早期发育阶段的植物大小是测量存在转基因所赋予的潜在产量优势的标准实践。
例如，产量指生物量产量，例如干重生物量产量和/或鲜重生物量产量。生物量产量指植物的地上部分或地下部分，这取决于具体的情况(测试条件、特定的目的作物、目的应用等)。在一个实施方案中，生物量产量指地上部分和地下部分。也可以基于鲜重、干重或水分调整的基础来计算生物量产量。生物量产量可基于每株植物计算，或者相对于特定面积来计算(例如每英亩/平方米的生物量产量等)。
在另一实施方案中，“产量”指种子产量，其可通过以下一种或多种参数来测量：种子数或饱满种子数(每株植物或每单位面积(英亩/平方米等))、种子饱满率(饱满种子数与种子总数的比值)、每植物的花数、种子生物量或种子总重(每株植物或每单位面积(英亩/平方米等))、千粒重(TKW，由计数的饱满种子数及其总重来外推，TKW的提高可由种子大小提高、种子重量提高、胚大小提高和/或胚乳提高所致)。允许测量种子产量的其他参数为本领域已知。种子产量可基于干重或鲜重来计算，或者一般基于经湿度调整的基础(如15.5％湿度)来计算。
在一个实施方案中，术语“提高的产量”指光合作用活性生物(特别是植物)与相应野生型光合作用活性生物相比显示出在非生物性环境胁迫条件下提高的生长速率。
提高的生长速率可反映为(或赋予)提高的完整植物生物量产生，或者提高的植物地上部分生物量产生，或者提高的植物地下部分生物量产生，或者提高的植物部分(如茎、叶、花、果实和/或种子)生物量产生。
在一个实施方案中，提高的产量包括较高的果实产量、较高的种子产量、较高的鲜物质产生和/或较高的干物质产生。
在另一实施方案中，术语“提高的产量”指该光合作用活性生物(优选植物)与相应(例如未经转化的)野生型光合作用活性生物相比，显示出在非生物性环境胁迫条件下延长的生长。延长的生长包括在未经转化的野生型光合作用活性生物显示可见的缺乏症状和/或死亡时，该光合作用活性生物(优选植物)存活和/或继续生长。
例如，在一个实施方案中，用于本发明方法中的植物是玉米植物。在一个实施方案中，提高的玉米植物产量指提高的种子产量，特别是对于用于饲料或食品的玉米品种而言。在一个实施方案中，提高的玉米种子产量指提高的籽粒大小或重量、提高的每荚籽粒数或提高的每株植物荚数。此外，在一个实施方案中，提高了穗轴产量，这在用于育种的玉米植物品种中特别有用。此外，例如提高穗轴的长度或大小。在一个实施方案中，提高的玉米植物产量涉及提高穗轴与籽粒的比值。
例如，在一个实施方案中，用于本发明方法的植物是大豆植物。在一个实施方案中，提高的大豆植物产量指提高的种子产量，特别是对于用于饲料或食品的大豆品种而言。在一个实施方案中，提高的大豆种子产量指提高的籽粒大小或重量、提高的每荚籽粒数或提高的每株植物荚数。
例如，在一个实施方案中，用于本发明方法的植物是油菜(oil seedrape，OSR)植物。在一个实施方案中，提高的OSR植物产量指提高的种子产量，特别是对于用于饲料或食品的OSR品种而言。在一个实施方案中，提高的OSR种子产量指提高的籽粒大小或重量、提高的每荚籽粒数或提高的每株植物荚数。
例如，在一个实施方案中，用于本发明方法的植物是棉花植物。在一个实施方案中，提高的棉花植物产量指提高的棉绒产量。在一个实施方案中，提高的棉花产量指提高的棉绒长度。
在一个实施方案中，提高的玉米种子产量指提高的籽粒大小或重量、提高的每荚籽粒数或提高的每株植物荚数。
所述本发明提高的产量通常可通过与原始或野生型植物相比增强或改进植物的一种或多种产量相关性状来实现。这些植物的产量相关性状(其改进导致产量的提高)，包括但不仅限于提高的植物固有生产能力、改进的营养利用效率和/或提高的胁迫耐性，特别是提高的非生物性环境胁迫耐性。
根据本发明，通过改进本文所述一种或多种产量相关性状来提高产量：
植物的固有生产能力可表现为例如改进特定(固有)种子产量(例如提高种子/籽粒大小、提高穗数、提高每穗种子数、改进种子饱满率、改进种子组成、胚和/或胚乳改进等)；修饰和改进植物的固有生长和发育机制(如植物高度、植物生长速率、荚数、荚在植物上的位置、节间数、荚破裂率、结瘤和氮固定的效率、碳同化的效率、苗萌发势/早期萌发势的改进、增强的萌发效率(在胁迫或非胁迫条件下)、改进植物结构、细胞周期修饰、光合作用修饰、多种信号途径修饰、转录调节修饰、翻译调节修饰、酶活性修饰等)；等等。
植物胁迫耐性的改进或提高可以表现为例如改进或提高植物针对胁迫(特别是非生物性环境胁迫)的耐性。在本申请中，非生物性环境胁迫一般指植物通常会面对的非生物性环境条件，包括通常称为“非生物性环境胁迫”条件的条件，包括但不仅限于干旱(对干旱的耐性可通过改进水利用效率而获得)、热、低温和寒冷条件(例如严寒和冰冻条件)、盐度、渗透压、遮蔽、高植物密度、机械胁迫、氧化胁迫等。
提高的植物产量还可通过提高“植物的养分利用效率”来介导，例如改进养分(包括但不仅限于磷、钾和氮)利用效率。例如，需要能更有效地利用氮的植物，以使得生长所需的氮较少，从而导致在氮缺乏条件下改进的产量水平。此外，可通过当前或标准的氮利用水平来获得较高的产量。
在本发明的一个实施方案中，通过与相应(例如未经转化的)野生型植物相比增强植物中的氮利用(＝氮利用效率(NUE))的方法来获得这些性状。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型光合植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地上干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地下干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地上部分鲜重生物量产量。
在其另一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)地下部分鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物干可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地上部分干可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地下部分干可收获部分产量。
在其另一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物鲜重可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地上部分鲜重可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)植物地下部分鲜重可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)鲜作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)干作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物(类似于Reynolds，M.P.，Ortiz-Monasterio J.J.和McNab A.(eds.)，2001，“Application of Physiology in Whaet Breeding，Mexico，D.E.：CIMMYT，其通过引用并入本文)相比，显示出增强的每单位提供的氮籽粒干重产量。
在其另一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)种子产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)鲜重种子产量。
在其一个实施方案中，术语“增强的NUE”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出增强的每单位氮(来自该植物所生长的周围培养基、土壤或环境，包括氮肥)干种子产量。
在本发明的另一实施方案中，这些性状通过与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，在植物中提高在氮供应有限条件下的生物量产生和/或产量的方法来实现。
在其一个实施方案中，术语“提高的生物量产生”指该植物与相应的野生型植物相比，显示出在氮供应有限条件下提高的生长速率。提高的生长速率可特别反映为提高的完整植物生物量产生，或者提高的植物地上部分生物量产生，或者提高的植物地下部分生物量产生，或者提高的植物部分(如茎、叶、花、果实、种子)生物量产生。
在其一个实施方案中，提高的生物量产生包括较高的果实产量、较高的种子产量、较高的鲜物质产生和/或较高的干物质产生。
在另一实施方案中，术语“提高的生物量产生”指该植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比，显示出在氮供应有限条件下延长的生长。延长的生长包括在未经转化的野生型植物显示可见的缺乏症状和/或死亡时，该植物存活和/或继续生长。
因此，本发明涉及产生与相应(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的转基因植物的方法，包括以下步骤：
(a)降低、抑制或缺失植物细胞、植物或植物部分中选自以下的一种或多种活性：At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含有SET结构域的蛋白，和
(b)产生与相应(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生)的转化植物，并在允许该植物发育的条件下进行培养。
在一个实施方案中，所述转基因植物显示出改进的产量相关性状。
例如，本发明的转基因植物显示出增强的氮利用效率。
在另一实施方案中，转基因植物显示在有限氮供应条件下提高的生物量产生和/或产量。
例如，氮利用效率可通过实施例中所述方法来测定。因此，在一个实施方案中，本发明涉及提高产量的方法，其包括以下步骤：
(a)测量土壤中的氮含量，和
(b)确定该土壤中的氮含量对于原始或野生型植物(如作物)的生长而言是最优的还是并非最优的，和
(c1)如果所述氮含量对于原始或野生型植物的生长而言是并非最优的，则在所述土壤中培养本发明的植物，或者
(c2)如果所述氮含量对于原始或野生型植物而言是最优的，则在所述土壤中培养本发明的植物，并将产量与标准原始或野生型植物的产量进行比较，选择和培养显示出最高产量的植物。
在本发明的又一个实施方案中，通过提高植物的胁迫耐性来提高植物产量。一般地，术语“提高的胁迫耐性”可定义为在胁迫条件下与未经转化的的野生型或起始植物相比，植物的存活和/或较高的产量生产力：例如，本发明的植物或根据本发明的方法生产的植物更好地适应胁迫条件。
在其生活周期中，植物通常要面对多种环境条件。任何可能在某些情况下影响植物产量的这种条件在本文中称为“胁迫”条件。环境胁迫一般可分为生物性及非生物性(环境)胁迫。不利的营养条件有时也称作“环境胁迫”。本发明还涉及对这类环境胁迫的解决方法，例如赋予提高的营养利用效率。
例如，通过提高植物的非生物性环境胁迫耐性来提高植物产量。为了描述本发明，术语“增强的非生物性环境胁迫耐性”、“增强的非生物性环境胁迫抗性”、“增强的环境胁迫耐性”、“对环境胁迫提高的适应”和其他变形和具有相似含义的表述，可互换使用，并表示(但不仅限于)与相应原始或野生型植物或其部分相比，对一种或多种本文所述非生物性环境胁迫的耐性提高。
术语非生物性环境胁迫耐性是指例如低温耐性、干旱耐性或提高的水利用效率(WUE)，热耐性、盐胁迫耐性以及其他。还使用植物对脱水、渗透压休克和极端温度应答的研究来测定植物对非生物性环境胁迫的耐性或抗性。
植物的胁迫耐性(如低温、干旱、热和盐胁迫耐性)对植物生长具有共同的重要主题，即水的利用度。植物通常在其生活周期中接触环境含水量减少的条件。保护策略与寒冷耐性的策略相似。
因此，产量相关性状指本发明植物提高的水利用效率和/或本发明植物提高的干旱条件耐性。水利用效率(WUE)是经常与干旱耐性有关的参数。低供水量条件下生物量的提高可能是由于生长效率相对提高或者水消耗减少。在选择用于改进作物的性状时，降低水利用而不改变生长将在水输入费用较高的农业灌溉系统中特别有益处。生长提高而水利用不相应升高将可适用于所有农业系统。在水供应无限制的许多农业系统中，生长的提高(即便以水利用提高为代价)也提高产量。
当土壤水耗尽或者在干旱期间无水可用时，作物产量受到限制。如果叶的蒸腾作用超过了根的水供应，就会发生植物缺水。可用的水供应与土壤中保持的水量以及植物以其根系获得该水的能力有关。水从叶的蒸腾作用与叶孔通过光合作用固定二氧化碳有关。这两个过程正相关，因此光合作用的高二氧化碳流入与蒸腾作用的失水密切相关。随着水从叶中蒸腾出去，叶的水势降低，叶孔通常在水力过程中关闭，限制光合作用的量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，因此水摄入和蒸腾作用是作物产量的作用因子。在许多农业系统中，能利用较少的水固定等量二氧化碳或者能在较低水势下发挥正常功能的植物有可能进行较多的光合作用，因此产生较多的生物量和经济产量。
干旱胁迫表示导致植物缺水或对植物供水减少的任何环境胁迫，包括低温和/或盐的继发胁迫，和/或干旱或炎热的原发胁迫，如脱水等。
例如，可以根据以下方法来测定和定量提高的干旱条件耐性：将本发明的植物单个培养在培养室(York 
GmbH，Mannheim，德国)中的盆中。诱导萌发。在植物为拟南芥的情况下，将播种后的种子保持在黑暗中于4℃下保持3天，从而诱导萌发。其后将条件改变为20℃/6℃的日夜温度和16/8小时150μE/m2s的昼夜循环，保持3天。然后将植物在标准培养条件下培养。在植物为拟南芥的情况下，标准培养条件为：16小时光照和8小时黑暗的光周期、20℃、60％相对湿度和200μE的光子通量密度。培养并栽培植物直至长出叶。在植物为拟南芥的情况下，每天浇水直至约为3周龄。这时开始通过断水施加干旱。在野生型植物显示可见损伤症状之后，开始进行评估，在连续的5至6天中，根据与野生型和临近植物相比的干旱症状和生物量产生对植物进行评分。在一个实施方案中，根据实施例中所述方法测定干旱耐性，例如对周期性干旱的耐性。
干旱耐性可以是对周期性干旱的耐性。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及提高产量的方法：其包括以下步骤：
(a)测定用于栽种的地区的水供应对于原始或野生型植物(例如作物)的生长来说是否最优或并非最优，和/或测定用于栽种的地区中植物生长的可视损伤症状；以及
(b1)如果水供应对于原始或野生型植物的生长来说并非最优的话，或者，在该地区生长的标准、原始或野生型植物中可发现干旱的可视症状的话，在所述土壤中培育本发明的植物，或者
(b2)如果水供应对于原始或野生型植物来说最优的话，在所述土壤中培育本发明的植物，将产量与标准、原始或野生型植物的产量相比，选择和培育显示最高产量的植物。
可视损伤症状表示下述特征之一或其中两种、三种或更多种的任何组合：
a)萎蔫，
b)叶变成褐色，
c)失去膨压，导致叶或针叶茎和花下垂，
d)叶或针叶下垂和/或脱落，
e)叶为绿色，但叶面角与对照相比稍朝向地面，
f)叶片开始内卷(卷曲)，
g)叶或针叶过早衰老，
h)叶或针叶中丧失叶绿素和/或变黄。
本发明植物的所述产量相关性状可以是所述植物提高的对热条件的耐性。
在本发明的另一个实施方案中，本发明植物的所述产量相关性状是所述植物提高的低温耐性，例如包括严寒耐性和/或冰冻耐性。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，光合活性生物(优选是植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物(如植物)而言展示出增强的干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的地上部分干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的地下部分干生物量产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的地上部分鲜重生物量产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的地下部分鲜重生物量产量。
在其另一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物干可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物地上部分干可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物地下部分干可收获部分产量。
在其另一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物鲜重可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物地上部分鲜重可收获部分产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的植物地下部分鲜重可收获部分产量。
在另一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的鲜作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的干作物果实产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的籽粒干重。
在另一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的种子产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的鲜重种子产量。
在其一个实施方案中，术语在光合活性生物中“增强的非生物性环境胁迫耐性”指当遭遇非生物性环境胁迫条件时，所述光合活性生物(优选植物)较之相应(例如未经转化的)野生型光合活性生物而言展示出增强的干种子产量。然而，例如生物所面对的非生物性环境胁迫条件可以是本文提到的任何非生物性环境胁迫。
在一个实施方案中，提高所产生的玉米的氮利用效率涉及提高玉米种子的蛋白质含量，特别是用作饲料的玉米种子。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒大小或数目。在一个实施方案中，提高所产生玉米的水利用效率涉及提高的籽粒大小和数目。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐性涉及早期萌发势，并允许对本发明方法所产生的玉米植物较早地进行种植和播种。
在一个实施方案中，提高所产生的大豆植物的氮利用效率涉及提高大豆种子的蛋白质含量，特别是用作饲料的大豆种子。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒大小或数目。在一个实施方案中，提高所产生大豆植物的水利用效率涉及提高的籽粒大小和数目。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐性涉及早期萌发势，并允许对本发明方法所产生的大豆植物较早地进行种植和播种。
在一个实施方案中，提高所产生的OSR植物的氮利用效率涉及提高OSR种子的蛋白质含量，特别是用作饲料的OSR种子。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒大小或数目。在一个实施方案中，提高所产生的OSR植物的水利用效率涉及提高的籽粒大小和数目。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐性涉及早期萌发势，并允许对本发明方法所产生的油菜植物较早地进行种植和播种。在一个实施方案中，本发明涉及产生耐寒油菜(具有耐寒性的OSR)的方法，包括在本发明上述方法中使用耐寒油菜植物。
在一个实施方案中，提高所产生的棉花植物的氮利用效率涉及提高棉籽的蛋白质含量，特别是用作饲料的棉籽。在另一实施方案中，提高的氮利用效率涉及提高的籽粒大小或数目。在一个实施方案中，提高所产生的棉花的水利用效率涉及提高的籽粒大小和数目。此外，在一个实施方案中，提高的低温耐性涉及早期萌发势，并允许对本发明方法所产生棉花植物较早地进行种植和播种。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物还可显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的低温耐性，特别是寒冷耐性，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物还可显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的水利用效率，或提高的干旱耐性，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物还可显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)，还显示提高的低温耐性和/或提高的固有产量和/或干旱耐性，特别是寒冷耐性，和干旱耐性，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物还可显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)以及低温耐性或提高的干旱耐性或提高的固有产量，特别是寒冷耐性，和干旱耐性和增加的生物量，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物还可显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的氮利用效率(NUE)和低温耐性，和提高的干旱耐性和提高的固有产量，特别是寒冷耐性，和干旱耐性和增加的生物量，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
此外，在一个实施方案中，本发明提供转基因植物，其与相应的(例如未经转化的)原始或野生型植物细胞或植物相比显示出一种或多种提高的产量相关性状，这通过降低、抑制或缺失所述植物中本文所述亚细胞区室和组织中的一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的低温耐性和氮利用效率(NUE)，这通过降低、抑制或缺失一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的NUE和提高的周期性干旱耐性，这通过降低、抑制或缺失一种或多种所述“活性”来实现。
因此，在本发明的另一实施方案中，提供了用于产生转基因植物、来自这些植物的后代、种子和/或花粉或者用于产生这些植物的方法；每一植物显示出与相应的(例如未经转化的)野生型植物细胞或植物相比提高的NUE和提高的固有产量，这通过降低、抑制或缺失一种或多种所述“活性”来实现。
在一个实施方案中，降低、抑制或缺失细胞的一种或多种特定区室中的所述活性，并赋予提高的产量，例如所述植物显示出提高或改进的所述产量相关性状。例如，在表I或II第6列所示细胞的质体中降低、抑制或缺失所述活性，并提高相应植物的产量。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，所述方法包括以下步骤：
(a)降低、抑制或缺失植物细胞、植物或植物部分中的以下活性：
(i)分别包含表II或表IV第5或7列所示多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或
(ii)包含表I第5或7列所示多核苷酸的核酸分子的表达产物，
(iii)或者(i)或(ii)的功能等同物；和
(b)产生转化植物，所述转化植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，并在允许该植物发育的条件下进行培养。
优选地，本发明的方法还包括降低、减少或缺失至少一种核酸分子的表达或活性，所述核酸分子具有或编码表I第5列申请号1所示核酸分子中至少一种核酸分子的活性，并包含选自以下的核酸分子：
(a)编码表II第5或7列申请号1所示多肽的分离的核酸分子；
(b)表I第5或7列申请号1所示分离的核酸分子；
(c)分离的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而衍生自表II第5或7列申请号1所示多肽序列；
(d)分离的核酸分子，其与包含表I第5或7列申请号1所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；
(e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有包含表I第5列申请号1所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)至(e)的核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有包含表I第5列申请号1所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列申请号1所示共有序列或者一种或多种多肽基序，并优选具有包含表II或IV第5列申请号1所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有表II第5列申请号1所示蛋白质的活性；
(i)包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸通过用表III第7列申请号1所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得(不从核苷酸5’端的ATA开始)，并优选具有包含表II或表IV第5列申请号1所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(j)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过在(a)至(d)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而产生；和
(k)分离的核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，其具有与(a)至(d)中所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt、500nt、750nt或1000nt，并编码多肽，所述多肽具有包含表II第5列申请号1所示多肽的蛋白质的活性；
或者包含与其互补的序列。
优选地，本发明的方法还包括降低、抑制、减少或缺失包含上文(a)至(j)所示核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含表II第5或7列申请号1所示多肽的多肽，或者所述核酸分子所编码的蛋白质。
优选地，本发明方法还包括降低植物或其部分中多肽的活性或表达，所述多肽包含上文表征核酸分子所编码的多肽。
优选地，本发明的方法还包括选自以下的至少一个步骤：
(a)引入编码核糖核酸序列的核酸分子，所述核糖核酸序列能形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与选自以下的核酸分子具有至少50％、优选60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％的同源性：
(i)上文表征的分离的核酸分子；
(ii)分离的核酸分子，其如表I第5或7列申请号1所示，或者编码如表II第5或7列申请号1所示的多肽，和
(iii)分离的核酸分子，其编码具有表II第5列申请号1所示多肽之活性的多肽，或者编码包含表I第5或7列申请号1所示核酸分子之多核苷酸的表达产物；
(b)引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子包含与选自本段(a)部分所定义组的核酸分子具有至少50％、优选60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同源性的至少17nt的片段；
(c)引入核酶，其特异性切割选自本段(a)部分所定义组的核酸分子；
(d)引入(b)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子以及(c)中表征的核酶；
(e)引入有义核酸分子，以诱导内源表达产物的共阻抑，所述有义核酸分子赋予核酸分子表达，其包含选自本文上文所定义的组或者上文(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的组的核酸分子，或者编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)部分所述核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性，并具有包含表II第5列申请号1所示多肽之蛋白质的活性，
(f)引入赋予蛋白质显性负突变体表达的核酸分子，所述蛋白质具有表II第5或7列申请号1所示蛋白质的活性，或者包含由本文上文所表征核酸分子编码的多肽；
(g)引入编码因子的核酸分子，所述因子与这样的核酸分子结合，该核酸分子包含选自本文上文所定义的组或者本段(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的组的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质具有本文上文所表征核酸分子所编码蛋白质的活性；
(h)引入赋予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子包含选自本文上文所定义的组或者本段(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的组的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质由本文上文所表征核酸分子所编码；
(i)引入能与内源基因重组并使其活性沉默、失活、抑制或降低的核酸构建体，所述内源基因包含选自本文上文所定义的组或者本段(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的组的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质由本文上文所表征核酸分子所编码；
(j)在内源基因中引入非沉默突变，所述内源基因包含选自本文上文所定义的组或者本段(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的组的核酸分子；
(k)引入表达构建体，其赋予(a)至(i)中任一项所表征核酸分子的表达。
优选地，在本发明方法中，包含选自本文上文所定义的组或者上文(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义组之核酸分子的序列的至少17bp的3’或5’核酸序列片段(其具有至少50％、优选60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的同一性)被用于降低上文所表征核酸分子或所述核酸分子所编码的多肽。
优选地，在本发明方法中，所述降低或缺失是由于应用非人生物的化合物而导致的。
优选地，在本发明的方法中，植物选自漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Gentianaceae)、禾本科(Gramineae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、多年生草本、饲用作物、蔬菜和观赏植物。
优选地，本发明的方法还包括引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体和/或反义核酸的步骤，其被设计成靶向基因的表达产物(所述基因包含本文上文所表征的核酸分子)，以诱导所述目的基因的mRNA断裂，由此使基因表达沉默，或者引入确保前者表达的表达盒。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
(a)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表II B第5或7列申请号1所示多肽；
(b)分离的核酸分子，其包含表I B第5或7列，申请号1所示的多核苷酸；
(c)包含核酸序列的分离的核酸分子，所述核酸序列由于遗传密码的简并性而衍生自表II B第5或7列所示多肽序列，并具有表II第5列申请号1所示蛋白质的活性；
(d)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与(a)或(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有表II第5列申请号1所示多蛋白质的活性；
(e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)至(c)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体来分离，并具有表II第5列申请号1所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或多肽基序，并具有表II第5列所示蛋白质的生物活性；
(g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有表II第5列申请号1所示蛋白质的活性；
(h)包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸可通过使用表III第7列申请号1所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得(不从核苷酸5’端的ATA开始)；和
(i)分离的核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的文库而获得，其中使用包含(a)至(c)核酸分子序列之一的探针或，或使用具有(a)至(h)任一项所表征核酸分子的至少17nt的片段，并编码多肽，所述多肽具有表II第5列申请号1所示蛋白质的活性；
或者包含与其互补的序列；
其中(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与表I A第5或7列，申请号1所示序列不同，并优选地编码至少在一个或多个氨基酸上与表II A第5或7列，申请号1所示蛋白质序列不同的蛋白质。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或反义核酸分子，其用于降低上文表征的活性，或者降低本文上文所表征核酸分子或所述核酸分子所编码多肽的活性或表达。
优选地，本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子包含本文上文所定义核酸分子的至少17nt的片段。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及双链RNA(dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、反义或ta-siRNA或核酶，其能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt片段与选自以下的核酸分子具有至少50％，优选60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的同源性：
(aa)上文表征的分离的核酸分子；
(ab)分离的核酸分子，其如表I第5或7列，申请号1所示，或者编码如表II第5或7列申请号1所示的多肽，和
(ac)分离的核酸分子，其编码具有表II第5或7列，申请号1所示多肽之活性的多肽，或者编码包含表I第5或7列申请号1所示核酸分子之多核苷酸的表达产物；
优选地，在本发明的dsRNA分子中，有义链和反义链彼此共价结合，并且反义链与“有义”RNA链基本互补。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及赋予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子赋予具有上文所表征活性的蛋白质表达，或者本文所表征核酸分子的活性或表达，或者所述核酸分子所编码多肽的活性或表达。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及用于鉴定基因敲除的TILLING引物，所述基因包含表I第5或7列申请号1中任一项所示核酸分子的核酸序列。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及多肽的显性负突变体，所述多肽包含表II第5或7列，申请号1所示多肽。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及编码上文所定义显性负突变体的核酸分子。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及赋予以下表达的核酸构建体：本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或反义核酸分子，本发明的病毒核酸分子或者本发明的核酸分子。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及核酸构建体，其包含本发明的分离的核酸分子或者本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子或者本发明的病毒核酸分子其中所示核酸分子与一个或多个调节信号功能性连接。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及载体，其包含本发明的核酸分子或者本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子或者本发明的病毒核酸分子或者本发明的核酸构建体。
优选地，在本发明载体中，所述核酸分子与用于在植物宿主中表达的调节序列有效连接。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及转基因植物宿主细胞，其稳定转染或瞬时转染了本发明的载体或者本发明的核酸分子或者本发明的核酸构建体。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及植物细胞、植物或其部分，其中包含表II申请号1(优选表II B申请号1或者表IV申请号1)第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质的活性被降低，或者包含表I申请号1(优选表I B申请号1)第5或7列所示核酸分子的核酸分子被降低。
此外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生本发明核酸序列所编码多肽的方法，所述多肽在本发明植物细胞、植物或其部分中表达。
优选地，在用于生产本发明多肽的方法中或在本发明的宿主细胞中，宿主细胞是选自以下的植物细胞：漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、胡桃科、樟科、豆科、亚麻科、多年生草本、饲用作物、蔬菜和观赏植物，或者是上文定义的微生物。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其由本发明核酸分子编码，或者包含表II B第7列申请号1所示多肽。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及与本发明多肽特异性结合的抗体。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物组织、植物、可收获植物材料或植物繁殖材料。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及筛选本发明上述方法中所表征活性或本发明上述方法所表征核酸分子所编码多肽之活性的拮抗剂的方法：
(a)将表达该多肽的生物、其细胞、组织或部分与化合物或含有多种化合物的样品在允许降低或缺失编码该蛋白之活性的核酸分子的表达或者在允许降低或缺失该蛋白质之活性的条件下相接触；
(b)测定所述植物、其细胞、组织或部分中蛋白质的活性水平或者多肽的表达水平，其中所述植物、其细胞、组织或部分被培养或维持；和
(c)通过将测得的蛋白质活性水平或多肽表达水平与不存在所述化合物或包含所述多种化合物的样品的情况下的标准蛋白质活性水平或多肽表达水平进行比较而鉴定拮抗剂，其中与标准相比降低的水平表示所述化合物或者包含所述多种化合物的样品是拮抗剂。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及鉴定在植物中赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的化合物的方法，其包括以下步骤：
(a)培养或维持植物、植物细胞或其组织或其部分，其表达具有上文本发明方法所表征活性的多肽，或者由上文本发明方法所表征核酸分子所编码的多肽，或者编码所述多肽的多核苷酸，以及能与所述多肽在合适条件下相互作用的读出系统，所述条件允许该多肽与此读出系统在化合物或含有多种化合物的样品存在下相互作用，并且所述读出系统能够应答于化合物与所述多肽在允许抑制所述读出系统及所述多肽的条件下的结合而提供可检测信号；和
(b)通过检测所述读出系统所产生的信号的存在与否或者下降或提高来鉴定该化合物是否是有效的拮抗剂。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及用于产生农用组合物的方法，其包括鉴定在植物、植物细胞或其部分中赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)之化合物的方法的步骤，以及将所述化合物配制成可用于农业应用的形式。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及组合物，其包含本发明蛋白质、本发明核酸分子、本发明核酸构建体、本发明载体、根据用于鉴定本发明拮抗剂的本发明方法所鉴定的拮抗剂、本发明抗体、本发明宿主细胞、本发明方法所表征核酸分子、本发明RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子以及任选的农业可接受载体。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及食品或饲料，其包含本发明蛋白质、本发明核酸分子、本发明核酸构建体、本发明载体、根据本发明用于鉴定拮抗剂的方法所鉴定的拮抗剂、本发明抗体、本发明宿主细胞、本发明方法所表征核酸分子、本发明RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子、本发明植物、植物组织、可收获植物材料或植物繁殖材料。
此外，在另一实施方案中，本发明涉及本发明蛋白质、本发明核酸分子、本发明核酸构建体、本发明载体、根据本发明用于鉴定拮抗剂的方法所鉴定的拮抗剂、本发明抗体、本发明宿主细胞、本发明方法所表征核酸分子、本发明RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子用于产生转基因植物的用途，所述转基因植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生
表I显示相关多核苷酸的SEQ ID NO。表II显示相关多肽的SEQ IDNO。表IV显示相关共有序列和相关多肽基序的SEQ ID NO。在所有这些表格中，均使用缩写“A.th.”来代表“拟南芥”生物。
在下文中，术语“表II或表IV所示多肽”还涉及包含表IV所示共有序列或至少一个多肽基序的多肽。
要在本发明方法中降低活性以提供与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的分子(例如下文I、II和/或III的分子)在下文中为“要在本发明方法中降低活性的分子”。所述分子可以为例如多肽或核酸分子。
因此，换言之，本发明涉及产生转基因植物的方法，所述转基因植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，该方法包括以下步骤：
(a)在植物或其部分中降低、抑制或缺失以下的活性：
(I)至少一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：28、61、95、133和172或表II第7列申请号1所示(优选如表II B申请号1所示)其同源物的多肽，或者包含表IV申请号1的共有序列或至少一个多肽基序，或者
(II)至少一种核酸分子的表达产物，所述核酸分子包含选自SEQ IDNO：27、60、94、132和171或表I第7列申请号1所示(优选如表I B第5或7列，申请号1所示)其同源物的多核苷酸，
(III)或者(I)或(II)的功能等同物；和
(b)产生与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的转化植物，并在允许该植物发育的条件下进行培养。
在一个实施方案中，本发明涉及产生与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的转基因植物的方法，其包括以下步骤：
(a)在植物或其部分中降低、抑制或缺失以下的活性：
(I)至少一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：28、61、95、133和172或表II第7列申请号1所示(优选如表II B申请号1所示)其同源物的多肽，或者包含表IV申请号1的共有序列或至少一个多肽基序，或者
(II)至少一种核酸分子的表达产物，所述核酸分子包含选自SEQ IDNO：27、60、94、132和171或表I第7列申请号1所示(优选如表I B第5或7列，申请号1所示)其同源物的多核苷酸，
(III)或者(I)或(II)的功能等同物；和
(b)产生与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的转化植物，并在允许该植物发育的条件下进行培养；
(c)在有限氮供应的条件下，(d)在未经转化的野生型显示可见缺乏症状和/或死亡后，选择与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的植物。
意想不到的是，观察到在拟南芥中敲除以下至少一种基因赋予了经转化的植物与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增强的NUE和/或提高的生物量产生：赋予选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域之蛋白的活性的基因，以及包含表I第5列申请号1所述核酸序列的基因。
具体地，观察到在拟南芥中敲除包含SEQ ID NO.27核酸序列的基因赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
还观察到在拟南芥中缺失、抑制或降低具有“At1g74730蛋白”(由包含SEQ ID NO.27核酸序列的基因编码)的活性的基因产物的活性赋予了与野生型对照相比增加的产量，例如NUE和/或提高的生物量产生，特别是提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量。
具体地，观察到在拟南芥中敲除包含SEQ ID NO.60核酸序列的基因赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
还观察到在拟南芥中缺失、抑制或降低具有“含有SET结构域的蛋白”(由包含SEQ ID NO.60核酸序列的基因编码)之活性的基因产物的活性赋予了与野生型对照相比增加的产量，例如NUE和/或提高的生物量产生，特别是提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量。
具体地，观察到在拟南芥中敲除包含SEQ ID NO.94核酸序列的基因赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
还观察到在拟南芥中缺失、抑制或降低具有“At3g63270蛋白”(由包含SEQ ID NO.94核酸序列的基因编码)之活性的基因产物的活性赋予了与野生型对照相比增加的产量，例如NUE和/或提高的生物量产生，特别是提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量。
具体地，观察到在拟南芥中敲除包含SEQ ID NO.132核酸序列的基因赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
还观察到在拟南芥中缺失、抑制或降低具有(由包含SEQ ID NO.132核酸序列的基因编码的)“蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶”之活性的基因产物的活性赋予了与野生型对照相比增加的产量，例如NUE和/或提高的生物量产生，特别是提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量。
具体地，观察到在拟南芥中敲除包含SEQ ID NO.171核酸序列的基因赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
还观察到在拟南芥中缺失、抑制或降低具有(由包含SEQ ID NO.171核酸序列的基因编码的)“蛋白激酶”之活性的基因产物的活性赋予了与野生型对照相比增加的产量，例如NUE和/或提高的生物量产生，特别是提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量。
因此，根据本发明用于提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的方法，可以在植物细胞、植物或者其部分中获得与对照或者野生型相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，对于降低分别包含核酸SEQ ID NO.27或多肽SEQ ID NO.28的拟南芥核酸分子或多肽之活性的情况，或者对于在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情况，例如，如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含在表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.27或多肽SEQID NO.28同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“At1g74730蛋白”的活性，则优选在所述植物细胞、植物或其部分中赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者提高的生物量产生，或者增强的NUE和提高的生物量产生。
如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.27或多肽SEQ ID NO.28的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.27或多肽SEQ ID NO.28同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“At1g74730蛋白”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予了提高的氮利用效率。
例如，在氮缺乏的条件下，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高为1.05倍至1.20倍的产量，例如加上其至少100％的产量提高。
因此，在一个实施方案中，对于降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.60或多肽SEQ ID NO.61的拟南芥核酸分子或多肽之活性的情况，或者对于在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情况，例如，如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.60或多肽SEQID NO.61同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“含有SET结构域的蛋白”的活性，则优选在所述植物细胞、植物或其部分中赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者提高的生物量产生，或者增强的NUE和提高的生物量产生。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.60或多肽SEQ ID NO.61的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.60或多肽SEQ ID NO.61同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“含有SET结构域的蛋白”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予了提高的氮利用效率。
例如，在氮缺乏的条件下，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高为1.05倍至1.11倍的产量，例如加上其至少100％的产量提高。
因此，在一个实施方案中，对于降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.94或多肽SEQ ID NO.95的拟南芥核酸分子或多肽之活性的情况，或者对于在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情况，例如，如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.94或多肽SEQID NO.95同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“At3g63270蛋白”的活性，则优选在所述植物细胞、植物或其部分中赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者提高的生物量产生，或者增强的NUE和提高的生物量产生。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.94或多肽SEQ ID NO.95的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.94或多肽SEQ ID NO.95同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“At3g63270蛋白”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予了提高的氮利用效率。
例如，在氮缺乏的条件下，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高为1.05倍至1.23倍的产量，例如加上其至少100％的产量提高。
因此，在一个实施方案中，对于降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.132或多肽SEQ ID NO.133的拟南芥核酸分子或多肽之活性的情况，或者对于在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情况，例如，如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.132或多肽SEQ ID NO.133同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶”的活性，则优选在所述植物细胞、植物或其部分中赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者提高的生物量产生，或者增强的NUE和提高的生物量产生。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.132或多肽SEQ ID NO.133的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.132或多肽SEQ ID NO.133同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予了提高的氮利用效率。
例如，在氮缺乏的条件下，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高为1.05倍至1.10倍的产量，例如加上其至少100％的产量提高。
因此，在一个实施方案中，对于降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172的拟南芥核酸分子或多肽之活性的情况，或者对于在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物之活性的情况，例如，如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶”的活性，则优选在所述植物细胞、植物或其部分中赋予了与野生型对照相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(例如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者提高的生物量产生，或者增强的NUE和提高的生物量产生。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的养分利用效率。在一个实施方案中，赋予了提高的氮利用效率。
例如，在氮缺乏的条件下，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高为1.05倍至1.30倍的产量，例如加上其至少100％的产量提高。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比提高的非生物环境胁迫耐性，特别是提高的低温耐性。
例如，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比在低温条件下提高为1.1倍至1.15倍，或者例如加上其至少20％或至少100％的产量提高。
在另一实施方案中，如果降低分别包含核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172的拟南芥核酸分子或多肽的活性，或者在其他生物中缺失、抑制或降低所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性，例如如果在植物细胞、植物或其部分中降低分别包含表I、II或IV第7列申请号1中所示分别与核酸分子SEQ ID NO.171或多肽SEQ ID NO.172同一行的核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性，或者降低“蛋白激酶”的活性，则赋予了与相应的未修饰(如未经转化的)的野生型植物细胞、植物或其部分相比提高的固有产量。
在一个实施方案中，赋予了在标准条件下，例如无氮缺乏和无胁迫条件下提高的产量。
例如，赋予了与相应未修饰(如未经转化的)的野生型植物相比在标准条件下(如无氮缺乏和无胁迫条件下)提高为1.05倍至1.19倍，例如加上其至少20％或至少100％的产量提高。
上述比值具体指实际以提高的生物量(特别是地上部分鲜重生物量)衡量的提高的产量。
在一个实施方案中，在本发明方法中利用对由表Va所示核酸分子或表I所示其同源物或包含所述核酸分子之基因的表达产物所赋予的活性进行降低或缺失来提高与野生型对照相比的养分利用效率，例如提高氮利用效率。
在一个实施方案中，在本发明方法中利用对由表Vb所示核酸分子或表I所示其同源物或包含所示核酸分子之基因的表达产物所赋予的活性进行降低或缺失来提高与野生型对照相比的胁迫耐性，例如提高低温耐性。
核对无CD数据提供
在一个实施方案中，在本发明方法中利用对由表Vd所示核酸分子或表I所示其同源物或包含所示核酸分子之基因的表达产物所赋予的活性进行降低或缺失来提高与野生型对照相比植物的固有产量，例如提高在标准条件下的产量，例如提高在无缺乏或无胁迫条件下的生物量。
就本发明的目的而言，原则上复数指代也表示包括单数指代，反之亦然。
除非另外指明，否则术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用。除非另外指明，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。
术语“序列”可涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于使用术语“序列”的上下文。本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)聚合形式。该术语仅涉及分子的一级结构。
因此，本文使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链或单链的DNA和/或RNA。它们还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、将一个或多个天然核苷酸取代为类似物。优选地，所述DNA或RNA序列包含编码本文所述多肽的编码序列。
“编码序列”是核苷酸序列，其转录成RNA，例如调节性RNA(例如miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、RNAi、核酶等)，或者转录成mRNA，其在置于适当调节序列控制下时翻译成多肽。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不仅限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，在某些情况下也可存在内含子。
本文使用的“核酸分子”还可包括位于编码基因区3’和5’末端的非翻译序列，例如编码区5’末端上游的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸的序列，以及编码基因区3’末端下游至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸的序列。对于例如使用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶等技术的情况，可以有利地使用编码区以及5’和/或3’区。
然而，仅选择编码区用于克隆和表达目的经常是有利的。
“多肽”指氨基酸的多聚体(氨基酸序列)，不涉及该分子的具体长度。因此，肽和寡肽包括在多肽的定义之内。该术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该定义包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括如非天然氨基酸)的多肽、具有取代键以及本领域已知的其他修饰(天然或非天然的)的多肽。
本申请文件中使用术语“表I”用来指代表I A和表I B的内容。术语“表II”在本申请文件中用来指代表II A和表II B的内容。术语“表I A”在本申请文件中用来指代表I A的内容。术语“表I B”在本申请文件中用来指代表I B的内容。术语“表II A”在本申请文件中用来指代表II A的内容。术语“表II B”在本申请文件中用来指代表II B的内容。在一种优选的实施方案中，术语“表I”指表I B。在一种优选的实施方案中，术语“表II”指表II B。
在本说明书中使用时，术语“包含”或“包括”和其语法变化应理解为指存在所述特征、整数、步骤或组分或其组，但不排除存在或添加一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组。
根据本发明，术语“生物”在本文中理解为总是指非人生物，尤其是植物生物，其整个生物、组织、器官或细胞。
三联体taa、tga和tag代表可互换的(常见)终止密码子。
术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”是指生物、生物部分(例如组织、种子、根、块茎、果实、叶、花等)或细胞中相应的特性改变。“特性的改变”应理解为特定体积中或者特定蛋白质量中基因产物或代谢内容物的活性、表达水平或量相对于相应体积或量的对照、参照或野生型的蛋白质发生改变。优选地，在减少、降低或缺失与基因产物活性的减少、降低或缺失相关的情况下，体积中的总活性是减少、降低或缺失的，无论基因产物的量或者基因产物的比活性或二者同时是否减少、降低或缺失，或者编码该基因产物的核酸序列或基因的量、稳定性或翻译效率是否减少、降低或缺失。
术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”包括所述特性仅在本发明受试者的一部分中改变，例如，修饰可见于细胞区室(如细胞器)中或植物的一部分(包括但不限于组织、种子、根、叶、块茎、果实、花等)中，但在测试整体受试者(即完整的细胞或植物)时则检测不到。优选地，发现“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”是细胞性的，因此术语“活性的减少、降低或缺失”或“代谢内容物的减少、降低或缺失”涉及与野生型细胞相比的细胞减少、降低或缺失。另外，术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”包括所述特性仅在本发明方法使用的生物的不同生长时期期间改变，例如减少、抑制、降低或缺失仅在种子生长期间或开花期间发生。另外，所述术语包括瞬时的减少、降低或缺失，例如因为使用的方法(例如反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶未被稳定整合在生物的基因组中)，或者所述减少、降低、抑制或缺失处于调节元件或诱导元件(例如化学或其他诱导型启动子)的控制下，因此仅具有瞬时效应。
因此，术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”表示特定体积中基因产物、酶或其他蛋白质或调节RNA的比活性以及化合物或(例如多肽、核酸分子或编码mRNA或DNA的)代谢产物的量可以被减少、降低或缺失。术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”包括所述“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”的原因可以是被施用给生物或其部分的化合物。
在本申请文件通篇中，表达产物(例如表II中所示蛋白质)活性或表达的缺失表示活性的完全丧失。术语“减少”、“抑制”或“降低”是可互换的。除非另有说明，术语“减少”应当包括术语“抑制”、“降低”或“缺失”。
本文使用的术语“减少”、“抑制”、“降低”或“缺失”也包括术语“贬低”、“缺乏”、“消除”或“使......降低”。
减少还理解为表示可以例如通过kcat/Km值表述的底物特异性的修饰。在本文中，功能或活性(例如酶活性或“生物活性”)与对照、参照或野生型相比被减少至少10％，有利地减少20％，优选30％，特别优选40％、50％或60％，更特别70％、80％、85％或90％或更多，非常特别优选95％，更优选99％或更多。最优选活性量的减少、降低或缺失基本为100％。因此，一个尤其有利的实施方式是化合物(例如多肽或核酸分子)功能的失活。
表达水平或活性的减少、抑制或缺失导致在转基因植物与参照或野生型相比显示提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或生物量产生时，所表达的与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％或200％或更多，优选250％或300％或更多，特别优选350％或400％或更多，最特别优选500％或600％w/w的提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或生物量产生。
术语化合物的“活性”是指化合物在生物系统例如细胞、器官或生物中的功能。例如，术语化合物的“活性”是指酶功能、调节功能或其作为化合物的结合配偶体、转运蛋白、调节子或运载体等等的功能。
在一个实施方案中，根据相应的上下文，术语“生物活性”是指选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白的活性。
术语“增强”、“提高”、“降低”、“抑制”或“减少”或类似的术语包括仅在本发明受试者的一个或一些部分中以及所有部分中所述特性的改变或调节。例如，修饰可见于细胞区室(如细胞器)中或优选植物的一部分(如组织、种子、根、叶、果实、块茎、花等)中，但在测试整体受试者(即完整的细胞或植物)时则检测不到。
更优选下述发现：所述特性的改变或调节见于生物(特别是植物)的多于一个的部分中。
因此，在一个实施方案中，所述特性的改变或调节见于根据本发明的方法生产植物的的组织、种子、根、果实、块茎、叶和/或花中。
然而，本文使用的术语“增强”、“提高”、“降低”、“抑制”或“减少”或类似的术语还包括所述特性在所提到的整个生物中的改变或调节。
术语“增强的”或“提高”表示与相应(例如未经转化的)野生型植物相比10％、20％、30％、40％或50％或更高，优选至少60％、70％、80％、90％或100％或更高，更优选150％、200％、300％、400％或500％或更高的提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。在一个实施方案中，提高如实施例中所示计算。
在本发明的一个实施方案中，根据以下方法对增强的NUE进行测定和定量：在培养室(
Weibull，
Sweden)中的盆中培养经转化的植物。在植物为拟南芥的情况下，将其种子种在盆中，其中含有营养缺乏土((“Einheitserde Typ 0”，30％粘土，Tantau，Wansdorf德国))和沙子的1∶1(v∶v)混合物。通过黑暗中4℃下的4天时间来诱导萌发。随后将植物在标准培养条件下培养。在植物为拟南芥的情况下，标准培养条件为：16小时光照和8小时黑暗的光周期、20℃、60％相对湿度和200μE的光子通量密度。培养并栽培植物。在植物为拟南芥的情况下，每隔一天用N缺乏的营养液浇水。N缺乏营养液例如在水中含有以下物质，但不含其他含氮的盐：
| 矿物养分 | 终浓度 |
| KCl | 3.00mM |
| MgSO4×7H2O | 0.5mM |
| CaCl2×6H2O | 1.5mM |
| K2SO4 | 1.5mM |
| NaH2PO4 | 1.5mM |
| Fe-EDTA | 40μM |
| H3BO3 | 25μM |
| MnSO4×H2O | 1μM |
| ZnSO4×7H2O | 0.5μM |
| Cu2SO4×5H2O | 0.3μM |
| Na2MoO4×2H2O | 0.05μM |
9至10天后将植物单独培养。总共29至31天后，收获植物并通过植物地上部分(优选莲座叶(rosettes))的鲜重进行评估。
术语“参照”、“对照”或“野生型”表示对以下未进行上述修饰的生物：包含表I第5或7列中所示多核苷酸的核酸分子的表达产物的表达或活性，或具有包含表II或IV第5或7列中所示多肽的多肽活性的蛋白质的活性，或由包含表I第5或7列中所示核酸分子的核酸分子编码的蛋白质的活性。
换句话说，野生型表示：(a)带有未经改变(通常为“正常的”)的基因或等位基因形式的生物；(b)突变体来自其中的实验室储备物。形容词“野生型”可以表示表型或基因型。
“参照”、“对照”或“野生型”特别地是细胞、组织、器官、植物或其部分，其不由本发明的方法产生。
因此，术语“参照”、“对照”或“野生型”可互换，并可以是未根据本发明所述方法进行修饰或处理的细胞或生物部分(例如细胞器)或组织或生物，特别是植物。因此，用作野生型、对照或参照的细胞或生物部分(例如细胞器)或组织或生物(特别是植物)尽可能多地与该细胞、生物或其部分一致，并且在除本发明方法之结果以外的任何其他方面均尽可能地与本发明的受试者相同。因此，相同或尽可能相同地处理所述野生型、对照或参照，即，仅有不影响测试特性的品质的条件或特性可以不同。
优选地，在类似条件下进行任何比较。术语“类似条件”指所有条件在待比较的实验之间均保持一致，所述条件例如培养条件或生长条件、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原体菌株、浓度等)。
“参照”、“对照”或“野生型”优选为这样的受试者，例如细胞器、细胞、组织、生物，特别是植物：其未以本发明方法进行修饰或处理，并且任何其他特性均尽可能地与本发明的受试者相似。参照、对照或野生型在其基因组、转录物组、蛋白组或代谢物组方面与本发明的受试者尽可能地相似。优选地，术语“参照”、“对照”或“野生型”细胞器、细胞、组织或生物(特别是植物)指这样的细胞器、细胞、组织或生物(特别是植物)：其与本发明的细胞器、细胞、组织或生物(特别是植物)或其部分在遗传上近乎相同，优选95％，更优选98％，甚至更优选99.00％，特别是99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更高。最优选地，“参照”、“对照”或“野生型”优选地是与本发明方法中所用生物、细胞器在遗传上相同的受试者(例如细胞器、细胞、组织、生物)，只是核酸分子或它们编码的产物根据本发明的方法被改变或修改。
在无法提供与本发明受试者的差异仅为不是本发明方法之受试者的对照、参照或野生型的情况下，对照、参照或野生型可以是这样的生物，其中赋予本文所述提高的产量，特别是提高的产量相关性状(例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或提高的生物量生产)的活性调节的原因已被调回或关闭，例如通过对负责减少的基因产物的互补，例如通过稳定或瞬时(过)表达，通过激活剂或激动剂的活化，通过抑制剂或拮抗剂的失活，通过加入活性化合物例如激素，通过引入增强子等等。
因此，优选的参照受试者是本发明方法的起始受试者。
优选地，本发明的参照和主题在标准化和归一化后进行比较，例如以总RNA、DNA或蛋白质的量或者参照基因(如持家基因，如某些肌动蛋白或泛素基因)的活性或表达进行标准化和归一化。
优选地，参照、对照或野生型与本发明受试者的差异仅在于本发明方法使用的多肽或RNA的细胞活性，例如由于本发明核酸分子水平的减少、降低或缺失导致，或本发明方法使用的多肽或RNA比活性的减少、降低或缺失导致，例如通过蛋白质或RNA的表达水平或活性来实现，这表示通过减少或抑制其生物活性和/或其生物化学或遗传原因来实现。
术语“表达”指编码基因区段或基因的转录和/或翻译。通常，所得产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物还可包括功能性RNA，例如反义、tRNA、snRNA、rRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等。表达可以是全身性的，局部的或时间性的，例如局限于某些细胞类型、组织器官或时间段。
术语“表达”表示将基因转录称为RNA(rRNA、tRNA、miRNA、dsRNA、snRNA、ta-siRNA、siRNA)或信使RNA(mRNA)。因此，术语“表达”表示基因的表达，包括或不包括随后成为蛋白质的翻译。就实验而言，RNA水平上的表达可以通过公知的方法例如Northern印迹、阵列杂交、qRT PCR、转录连缀(run-on)检验来检测。另外，就实验而言，多肽水平上的表达可以通过公知的方法例如Western印迹或其他免疫实验检测。
术语如表II第5或7列中所示多肽的“功能等同物”是基本赋予表II第5列中所示多肽活性的多肽。
术语表I第5或7列中所示核酸分子的“功能等同物”是基本赋予表I第5列中所示核酸分子活性的多核苷酸。
根据本发明，如果蛋白质或多肽活性的减少、抑制、降低或缺失介导了与相应(例如未经转化的)野生型植物细胞相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，则该蛋白质或多肽具有表II第5列所示多肽的活性。
特别地，如果蛋白质或多肽活性的减少、抑制、降低或缺失介导了与相应(例如未经转化的)野生型植物细胞相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，则该蛋白质或多肽具有表II第5列所示多肽的活性。
根据本发明，如果核酸分子或多核苷酸表达的减少、抑制、降低或缺失介导了与相应(例如未经转化的)野生型植物细胞相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，则该核酸分子或多核苷酸具有表I第5列所示核酸分子的活性。
这表示表达(例如基因产物的表达)或活性(如酶活性)的减少、抑制或缺失以某种方式和与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)相关。
在本申请文件通篇中，上述蛋白质或多肽或上述核酸分子或序列的表达产物活性的减少、抑制或缺失表示基因产物或多肽的翻译、转录或表达水平或活性(例如多肽的酶活性或生物活性)与表达产物的原始内源表达水平或与表达产物或多肽的原始内源活性相比，减少至少10％，优选20％、30％、40％或50％，特别优选60％、70％或80％，最特别优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，所述表达产物或多肽包含表I第5或7列中所示核酸分子或由其编码，或包含表II或IV第5或7列中所示多肽或其内源同源物或等同物。
另外，本领域技术人员能够在互补检验中测定多肽是否具有“表II第5列中所示多肽的活性”。
另外，本领域技术人员能够在互补检验中测定核酸分子是否具有“表I第5列中所示核酸分子的活性”。
本文所述用于本发明方法中的多肽或核酸分子的比活性可如实施例或本领域中所述进行测试。具体地，测定植物细胞中考虑的多核苷酸或多肽的表达是否被减少、降低或缺失和测定与相应(例如未经转化的)野生型植物相比是否有提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)是简单的测试，并可如实施例和本领域所述进行。
为了测试核酸分子(例如基因)是否是第5或7列中、特别是第5列中所示核酸分子的功能同源物，可以在微生物或植物中进行互补检验。例如，可以用处于合适启动子控制下(例如合适载体中)的考虑的各个核酸分子(例如基因或同源物)来转化缺乏基因活性的植物，例如其中包含所述核酸分子的核酸分子被敲除(特别是缺失或破坏)的拟南芥。启动子可赋予组成型或瞬时或组织或发育特异性或诱导型表达之任一。优选启动子可与被敲除、缺失或破坏的基因启动子的空间和时间活性相似或相同。考虑的核酸分子(例如要测试的基因或同源物)优选地包含含有或不含有内含子的完整编码区。另外，可优选对序列添加5’和3’UTR或其他特征，从而提高转录本的稳定性或翻译。
针对各个构建体的存在和考虑的核酸分子(例如基因或同源物)或其表达产物的表达来分析转化的植物。将展示基因或同源物表达的植物与野生型植物比较。包含敲除突变并且表达各个基因或同源物的转基因植物在与相应例如未经转化的野生型植物相比NUE增强和/或生物量产生提高的改变方面与野生型对照基本相同。
定量互补检验例如描述于Iba K.，Journal of Biological Chemistry 268(32)，24099(1993)，Bonaventure G.等人，Plant Growth.Plant Cell 15，1020(2003)或Gachotte D.等人，Plant Journal 8(3)，407(1995)中。
来自拟南芥的At1g74730的序列(例如如表I第5列申请号1中所示)已在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.29(1)，102(2001))中公开，并且其活性被描述为At1g74730蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括降低或抑制具有来自拟南芥的“At1g74730蛋白”或其功能等同物或其同源物之活性的基因产物，例如降低本文所述
(a)基因的基因产物，所述基因包含表I申请号1第5列所示核酸分子，并如分别与t1g74730或表I申请号1第7列所述的t1g74730功能等同物或同源物相同的行所示，优选表I B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如分别与所述At1g74730相同的行所示；或者
(b)多肽，其分别包含表II申请号1第5列所示多肽、共有序列或多肽基序，并如分别与At1g74730或表II或表IV申请号1第7列所述At1g74730功能等同物或同源物相同的行所示，优选表II B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如分别与所述At1g74730相同的行所示，以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低或抑制其活性的分子是具有活性描述为“At1g74730蛋白”的基因产物，优选为本段(a)或(b)部分的分子。
来自拟南芥的At3g07670的序列(例如如表I申请号1第5列中所示)已在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.29(1)，102(2001))中公开，并且其活性被描述为含有SET结构域的蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括降低或抑制具有来自拟南芥的“含有SET结构域的蛋白”或其功能等同物或其同源物之活性的基因产物，例如降低本文所述
(a)基因的基因产物，所述基因包含表I申请号1第5列所示核酸分子，并如分别与At3g07670或表I申请号1第7列所述At3g07670功能等同物或同源物相同的行所示，优选表I B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At3g07670相同的行所示；或者
(b)多肽，其包含表II申请号1第5列所示多肽、共有序列或多肽基序，并如分别与At3g07670或表II或表IV申请号1第7列所述At3g07670功能等同物或同源物相同的行所示，优选表II B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At3g07670相同的行所示，以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低或抑制其活性的分子是具有描述为“含有SET结构域的蛋白”之活性的基因产物，优选为本段(a)或(b)部分的分子。
来自拟南芥的At3g63270的序列(例如如表I申请号1第5列中所示)已在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.29(1)，102(2001))中公开，并且其活性被描述为At3g63270蛋白。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括降低或抑制具有来自拟南芥的“At3g63270蛋白”或其功能等同物或其同源物之活性的基因产物，例如降低本文所述
(a)基因的基因产物，所述基因包含表I申请号1第5列所示核酸分子，并如分别与At3g63270或表I申请号1第7列所述At3g63270功能等同物或同源物相同的行所示，优选表I B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At3g63270相同的行所示；或者
(b)多肽，其包含表II申请号1第5列所示多肽、共有序列或多肽基序，并如分别与At3g63270或表II或表IV申请号1第7列所述At3g63270功能等同物或同源物相同的行所示，优选表II B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At3g63270相同的行所示，以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低或抑制其活性的分子是具有描述为“At3g63270蛋白”之活性的基因产物，优选为本段(a)或(b)部分的分子。
来自拟南芥的At4g03080的序列(例如如表I申请号1第5列中所示)已在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.29(1)，102(2001))中公开，并且其活性被描述为蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括降低或抑制具有来自拟南芥的“蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶”或其功能等同物或其同源物之活性的基因产物，例如降低本文所述
(a)基因的基因产物，所述基因包含表I申请号1第5列所示核酸分子，并如分别与At4g03080或表I申请号1第7列所述At4g03080功能等同物或同源物相同的行所示，优选表I B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At4g03080相同的行所示；或者
(b)多肽，其包含表II申请号1第5列所示多肽、共有序列或多肽基序，并如分别与At4g03080或表II或表IV申请号1第7列所述At4g03080功能等同物或同源物相同的行所示，优选表II B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At4g03080相同的行所示，以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低或抑制其活性的分子是具有描述为“蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶”之活性的基因产物，优选为本段(a)或(b)部分的分子。
来自拟南芥的At5g65240的序列(例如如表I申请号1第5列中所示)已在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.29(1)，102(2001))中公开，并且其活性被描述为蛋白激酶。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括降低或抑制具有来自拟南芥的“蛋白激酶”或其功能等同物或其同源物之活性的基因产物，例如降低本文所述
(a)基因的基因产物，所述基因包含表I申请号1第5列所示核酸分子，并如分别与At5g65240或表I申请号1第7列所述At5g65240功能等同物或同源物相同的行所示，优选表I B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At5g65240相同的行所示；或者
(b)多肽，其包含表II申请号1第5列所示多肽、共有序列或多肽基序，并如分别与At5g65240或表II或表IV申请号1第7列所述At5g65240功能等同物或同源物相同的行所示，优选表II B申请号1第7列所示同源物或功能等同物，并如与所述At5g65240相同的行所示，以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低或抑制其活性的分子是具有描述为“蛋白激酶”之活性的基因产物，优选为本段(a)或(b)部分的分子。
本发明基因产物的同源物(特别是由申表I请号1第7列所示核酸分子编码或包含所述核酸分子的基因产物同源物)，或者是包含如表II或IV申请号1第7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽的同源物可来自任何生物，只要该同源物赋予本文所述活性(即，是所述分子的功能等同物)即可。具体地，所述同源物在被降低、抑制和/或缺失后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
此外，根据本发明，术语“同源物”指这样的生物序列，其优选在所述生物表达的所有序列中与本文描述或列出的序列具有最高或基本最高的序列同源性。
本领域技术人员了解如何寻找、鉴定和确认优选地具有例如如本文所述“产量提高活性”、“胁迫耐性提高活性”、“增强的NUE活性”和/或“生物量产生提高活性”的推定同源物。如果已知，则生物中的生物功能或活性基本上与上文所述基因描述的活性或功能相关或相对应，例如与表II申请号1第5列所示蛋白质中至少一种相关或相对应。
因此，在一个实施方案中，同源物或功能等同物包含由含有表I申请号1第7列所示序列之核酸分子所编码多肽的序列，或者包含表II或表IV申请号1第7列所示多肽序列、共有序列或多肽基序，或者是包含表I申请号1第7列所示多核苷酸的核酸分子的表达产物。
本文公开的关于序列、活性、共有序列、多肽基序和测试的信息使得本领域技术人员能够获得生物中的相应同源物或功能等同的表达产物。
在一个实施方案中，在说明书全篇中蛋白质或多肽或编码这些蛋白质或多肽之核酸分子或序列的活性(例如选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶或含有SET结构域的蛋白的活性)如果与表II申请号1第5或7列所示(更优选如表II申请号1第5列所示)蛋白质相比具有基本相同的活性或者具有原始酶活性或生物活性的至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％，特别优选60％、70％、80％，最优选90％、95％、98％、99％，则所述活性根据本发明是相同或相似的活性。
在一个实施方案中，表II申请号1第5列所示任何一种多肽的同源物来自真核生物，并且具有至少50％的序列同一性，并优选具有与本文所述基本相同或相似的活性，但其表达或活性的降低、抑制或缺失在生物或其部分中分别赋予了与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，表II申请号1第5列所示任一多肽的同源物来自植物，优选选自漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、胡桃科、樟科、豆科、亚麻科、多年生草本、饲用作物、蔬菜和观赏植物，并且具有至少50％的序列同一性，并优选具有与本文所述基本相同或相似的活性，但至少其表达或活性的降低赋予了与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，表II申请号1第5列所示任何一种多肽的同源物来自作物植物，并且具有至少30％的序列同一性，并优选具有与本文所述基本相同或相似的活性，但至少其表达或活性的降低赋予了与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，待在本发明方法中降低其活性的分子是本文段落中(a)或(b)的分子。
因此，表II申请号1第3列或5列所示多肽的同源物或功能等同物可以是由包含表I申请号1第7列同一行所示多核苷酸的核酸分子所编码的多肽，或者可以是包含表II申请号1第3列或5列所示多肽同一行的表II申请号1第7列所示多肽、表IV申请号1第7列所示一个或多个多肽基序或者表IV申请号1第7列所示共有序列的多肽。
因此，表I申请号1第5列所示核酸分子的同源物或功能等同物可以是包含表I申请号1第7列同一行所示多核苷酸之编码多肽的核酸分子，或者可以是编码包含与表I申请号1第3列或第5列所示核酸分子同一行的表II申请号1第7列所示多肽或表IV申请号1第7列所示共有序列或者多肽基序的核酸分子。
待在本发明方法中降低其活性的所述多肽的其他同源物或功能等同物在下文中描述。
作为减少、抑制、降低或缺失基因的翻译、转录和/或表达的结果，例如作为减少、抑制、降低或缺失基因(特别是本文所述基因(例如包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子))转录的结果，出现了相关的表型性状，例如与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
待在本发明方法中降低其活性之分子的活性降低、抑制或减少表现为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，在涉及与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生的本发明方法中，该方法包括降低、抑制或缺失至少一种核酸分子的表达或活性，所述核酸分子具有至少一种表I申请号1第5列所示核酸分子所编码蛋白质的活性，或者编码具有该活性的多肽，其中所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：
(a)编码表II申请号1第5或7列所示或含有表IV申请号1第7列所示共有序列的多肽的分离的核酸分子；
(b)表I申请号1第5或7列所示分离的核酸分子；
(c)分离的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而衍生自表II申请号1第5或7列所示多肽序列，或者衍生自含有表IV申请号1第7列所示共有序列的多肽；
(d)分离的核酸分子，其与包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性；
(e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％99.5％或99.9％同一性，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)至(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表IV申请号1第7列相应行所示共有序列或者一种或多种多肽基序，并优选具有编码表I申请号1第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(h)包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸通过用表III申请号1第7列所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得(其中所述引物不从核苷酸5’端的ATA开始)，并优选所述分离的核酸分子编码多肽，所述多肽具有由包含表I申请号1第5列所示多核苷酸的核酸分子所编码多肽的活性；
(i)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(j)分离的核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，其具有与(a)至(d)所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15、17、19、20、21、22、23、24、25nt或更多，并且所述分离的核酸分子编码多肽，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
或者是包含与其互补的序列；
或者是所述核酸分子所编码的蛋白质。
因此，在一个实施方案中，术语“待在本发明方法中降低其活性的分子”指包含至少一个本段a)至j)所述核酸分子的上述核酸分子。
在一个实施方案中，表I、II或IV申请号1第5或7列所示核酸分子或多肽是如表I B或II B申请号1第5或7列所示的新核酸分子或新多肽。
存在一系列在本发明方法中降低分子活性的机制，例如可对多肽或核酸分子(特别是包含表I申请号1第5或7列所述核酸分子的核酸分子，或者包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽的多肽，或者所述核酸分子或多肽的功能同源物)进行操作，以直接或间接影响与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比的产量，特别是产量相关性状，例如养分利用效率，如氮利用效率和/或环境胁迫耐性和/或生物量和/或生物量产生。
例如，可以减少、降低或缺失待在本发明方法中降低其活性的多肽(或者被待在本发明方法中降低其活性的多肽所加工的多肽)的分子数或比活性，或者减少、降低或缺失被待在本发明方法中降低其活性的核酸分子加工或表达的分子数。
然而，本领域技术人员已知可通过多种方式来减少、降低、抑制或缺失生物中天然存在的基因的表达，例如修饰对基因的调节，或者减少或降低待在本发明方法中减少、抑制、降低或缺失其活性的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子)所编码mRNA或基因产物的稳定性。
例如，术语生物功能的“减少”指蛋白质与生物、组织、细胞或细胞区室中底物的结合能力或结合强度与未应用该方法而其他条件(如培养条件、植物龄等)均相同的同一种属野生型相比的量化减少。
可以以本领域技术人员熟悉的方式(例如酵母双杂交系统)鉴定蛋白质的结合配偶体。
这也类似地适用于表I申请号1第5或7列所示核酸分子之基因或基因产物的表达的减少、抑制、降低或缺失与对其他活性的操作相组合。
在一个实施方案中，本发明的减少、抑制、降低、缺失或调节可通过表达(例如转基因表达)反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或抗体、抑制剂或抑制待在本发明方法中减少、降低或缺失其活性之核酸分子的表达产物的表达或者活性的其他分子来实现。例如，本发明的减少、抑制、降低、缺失或调节可通过表达(例如转基因表达)包含多核苷酸的核酸分子来赋予，所示多核苷酸编码反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或抗体，其抗待在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽。
在另一实施方案中，本发明的减少、抑制、降低、缺失或调节可以是编码待在本发明方法中减少、降低或缺失之核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子)的相应内源基因中的稳定突变。
在另一实施方案中，本发明的减少、抑制、降低、缺失或调节可以是调节基因的表达或行为，所述基因赋予待在本发明方法中减少、降低、抑制或缺失之多肽(例如包含如表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的表达。
所述表达可以是组成型的，例如由于稳定、永久、系统性、局部或瞬时表达，例如局限在某些细胞类型、组织器官或时间段。
例如，本发明的减少、抑制、降低、缺失或调节可以是瞬时的，例如由于瞬时转化、瞬时活性启动子或调节剂(如拮抗剂、抑制剂或诱导物)的暂时添加，例如在转化带有本文所述双链RNA核酸分子(dsRNA)、反义、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体等的诱导型构建体后，例如在诱导型启动子控制下并与施用相应诱导物(如四环素或蜕皮激素)相组合。
在本发明方法中降低其活性的分子之活性的减少、降低或抑制量优选为与对照、参照或野生型相比的至少10％，优选至少30％或至少60％，特别优选至少70％、80％、85％、90％或更高，非常特别优选至少95％，更优选至少99％或更高。最优选地，所述活性量的减少、降低、抑制或缺失为100％。
根据本发明，涵盖了用于减少本发明核酸所编码蛋白质或核酸序列本身的数量、表达、活性或功能的许多策略。本领域技术人员会认识到，有一系列不同方法可用于以期望的方式影响蛋白质的量、活性或功能。
因此，在一个实施方案中，本发明方法包括以下一个或多个步骤：
对合适的化合物
(i)抑制、阻遏、失活或减少其翻译或转录，
(ii)使其转录物稳定性或多肽稳定性失稳，
(III)减少其累积，
(iv)抑制、阻遏、失活或减少其转录物或多肽的活性，和/或
(v)减少其功能性(例如表达的)基因的拷贝数，
所述合适的分子为例如
(a)允许、介导或控制待在本发明方法中减少其活性的核酸分子所编码蛋白质或待在本发明方法中减少其活性的多肽(例如包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由包含表I申请号1第5或7行所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽)表达的蛋白质；
(b)允许、介导或控制待在本发明方法中减少的蛋白质或待在本发明方法中减少其活性的核酸分子编码的蛋白质(例如允许、介导或控制表达包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由包含表I申请号1第5或7行所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽)表达的mRNA分子；
(c)允许、介导或控制表达编码待在本发明方法中减少其活性的多肽的mRNA(例如编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽的mRNA)或允许、介导或控制表达包含待在本发明方法中减少其活性的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7行所示多核苷酸)的mRNA分子；
(d)允许、介导或控制表达包含待在本发明方法中减少其活性的多核苷酸(例如包含表I申请号1第5或7行所示多核苷酸的核酸分子)核酸分子的表达产物的RNA分子；
(e)编码待在本发明方法中减少其活性的多核苷酸或多肽的mRNA，例如包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子，或者允许、介导或控制表达待在本发明方法中减少其活性的多肽的mRNA，所述多肽如表II或IV申请号1第5或7列所示；
(f)编码激活剂的基因，所述激活剂允许激活或提高表达编码由待在本发明方法中减少其活性的核酸分子所编码多肽或待在本发明方法中减少其活性的多肽的核酸分子，例如编码激活剂的基因，所述激活剂允许激活或提高表达包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽或者包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子；或者
(g)编码待在本发明方法中减少其活性的多肽或核酸分子的内源基因，例如编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽或者包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子的内源基因。
相应地，所述
(i)抑制、阻遏、失活或减少其翻译或转录，
(ii)使其转录物稳定性或多肽稳定性失稳，
(III)减少其累积，
(iv)抑制、阻遏、失活或减少其转录物或多肽的活性，和/或
(v)减少其功能性(例如表达的)基因的拷贝数
可例如通过以下来介导：例如添加或表达反义分子、共阻抑分子、抗体、核酶、siRNA、微RNA、ta-siRNA、共阻抑分子或RNAi，诱变或缺失基因序列，表达负表达元件或提高其活性，或者其他本领域技术人员已知或本文所述的方法。例如，可以以反义方向表达待在本发明方法中减少其活性的多核苷酸或其一个或多个片段。在另一实施方案中，表达发夹RNAi构建体。同时表达待在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽的有义及反义RNA分子也是有利的。
例如，在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的功能性(例如表达的)拷贝数被降低。
此外，可以通过如修饰多肽的转录或翻译调节或效率来降低本发明多肽的内源水平。
详细内容具体描述于下文的说明或实施例中。
在一个实施方案中，本发明的方法包括例如以下一个或多个步骤：
(a)稳定蛋白质，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的蛋白质核酸分子或多肽的表达降低；
(b)稳定mRNA或功能性RNA，所述mRNA或功能性RNA赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(c)提高或刺激蛋白质的比活性，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(d)降低蛋白质的比活性，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达提高；
(e)表达编码蛋白质的转基因，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(f)产生或提高抑制蛋白质表达的内源性或人工转录因子的表达，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达提高；
(g)产生或提高介导蛋白质表达的内源性或人工转录因子的表达，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(h)减少、抑制或缺失抑制蛋白质表达的内源性或人工转录因子的表达，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(i)减少、抑制或缺失介导蛋白质表达的内源性或人工转录因子的表达，所述蛋白质赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达提高；
(j)提高基因的功能性拷贝数或表达，所述基因赋予待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达降低；
(k)提高阻遏蛋白或阻遏RNA的活性；
(l)提高导致待在本发明方法中降低其活性之蛋白质的负显性表型的蛋白质或RNA的活性；
(m)表达抗体或适配体，其与待在本发明方法中降低其活性的核酸分子或待在本发明方法中降低其活性的蛋白质结合，从而减少、降低或缺失其活性；
(n)表达阻遏物，所述阻遏物赋予由待在本发明方法中减少其活性的核酸所编码蛋白质或者待在本发明方法中减少其活性的多肽表达减少、抑制、降低或缺失，或者提高对本发明多肽的抑制性调节；
(o)减少或缺失待在本发明方法中减少其活性的核酸分子或待在本发明方法中减少其活性的多肽的表达，这通过向生物或其培养基或其供给(例如生物的供水)中添加一种或多种外源抑制因子(如抑制性化合物)来实现；或
(p)以这样的方式调节生物的生长条件，使得编码待在本发明方法中减少其活性之蛋白质的核酸分子或该蛋白质本身的表达或活性被减少、抑制、降低或缺失。这可以通过例如调节光和/或营养条件来实现，这继而调节在本发明方法中减少其活性的基因或蛋白质的表达。
其他策略和修改以及上述策略的组合为本领域技术人员所熟知，并且也是本发明的实施方案。例如，上文所述可通过例如添加正表达元件或除去负表达元件来实现，例如，可以使用同源重组向植物启动子中引入正或负调节元件(如35S增强子)，或者从调节区中除去阻遏物元件。可以使用其他基因转换方法来破坏元件或者增强阻遏物元件的活性。可以通过T-DNA或转座子诱变向植物中随机引入阻遏物元件。可以鉴定已在编码待在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽的基因邻近区整合了阻遏物元件(从而减少、抑制或缺失其表达)的品系。此外，可以通过不同的诱变方法随机引入突变(如点突变)，并通过特定方法如TILLING进行选择(综述于Slade和Knauf，Transgenic Res.，14(2)，109(2005))。
例如，可以通过下述编码蛋白质的核酸分子的表达来实现蛋白质或7RNA活性的提高，导致在本发明方法中降低其活性的蛋白质的显性负表型，所述核酸分子编码的蛋白质丧失其生物活性但是与多体复合物中的另一蛋白质结合，从而降低、抑制或缺失所述复合物的活性，或者例如作为转录因子与DNA结合，从而降低或缺失翻译的蛋白质的活性。
通常，细胞或生物区室中mRNA、多核苷酸或核酸分子的量与编码的蛋白质的量相关，因此与所述体积内编码的蛋白质的总体活性相关。所述相关性不总是线性的，所述体积内的活性取决于分子的稳定性、分子的降解或激活或抑制辅因子的存在。另外，酶的产物和浸提物(educt)抑制是公知的。
在本发明方法中要减少的核酸分子编码的上述蛋白质和/或多肽的活性可以通过多种方式降低、抑制、减少或缺失。
例如，通过降低或减少基因产物数量来降低、抑制或减少生物或其部分如细胞中的活性，所述基因产物数量的降低或减少例如通过降低、抑制或减少表达速率(例如将天然启动子突变至更低的活性)，或者通过降低、抑制或减少表达的mRNA的稳定性从而降低、抑制或减少翻译速率，和/或降低、抑制或减少基因产物的稳定性从而提高蛋白质衰变来进行。另外，可以通过下述方式影响酶或通道或运载体、转录因子和类似的活性蛋白质的活性或更新，所述方式使得实现反应速率的降低或对与底物结果的亲和力的修饰(降低、抑制、减少或缺失)。
在本发明的方法中降低其活性的多肽或核酸分子(例如酶或催化RNA或调节RNA)的催化中心中的突变能够调控酶周转速率，例如关键氨基酸的敲除能够导致降低或完全敲除的酶活性，或者调节结合位点的缺失能够降低正调节。
可以降低本发明的酶的比活性，使得降低周转速率或减少辅因子的结合。降低编码mRNA或蛋白质的稳定性也可降低基因产物的活性。活性的降低也在术语“降低、抑制、减少或缺失的活性”范围内。除此以外，活性的降低有利地是顺式(in cis)的，例如突变启动子(包括其他顺式调节元件)或者基因被转录的部分或编码部分，抑制也可以反式(in trans)实现，例如通过转录因子如嵌合转录因子、核酶、反义RNA、dsRNA或显性负蛋白质版本，其干扰表达的多个阶段，例如转录、翻译或蛋白质或蛋白质复合物自身的活性。还可以使用后生机制如DNA修饰、DNA甲基化或DNA包装使本发明的核酸或编码的蛋白质失活或下调。
因此，植物细胞、植物或其部分，特别是植物中，与相应(例如未经转化的)野生型植物相比，提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生在一个实施方案中通过下述方法实现：针对这一段中表征的核酸分子使用RNA干扰(dsRNAi)，引入反义核酸、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或与核酶组合的核酶核酸、编码共阻抑物的核酸、编码显性负蛋白质的核酸、靶向所述基因或RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子或抗体、诱导RNA降解的病毒核酸或微RNA分子或其组合。
可以修饰上述核酸序列的调节，从而降低基因表达。这一降低、抑制、减少或缺失(在说明书通篇中减少、抑制、降低、缺失、失活或下调应当作为同义词使用)能够如上所述通过所有技术人员已知的方法实现，优选通过双链RNA干扰(dsRNAi)，引入反义核酸、核酶、与核酶组合的反义核酸、编码共阻抑物的核酸、编码显性负蛋白质的核酸、靶向所述基因或RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子或抗体、诱导RNA降解的病毒核酸和表达系统、用于诱导所述基因同源重组的系统、所述基因中的突变或上述的组合。
通常，可以通过减少生物或其部分中，尤其是植物细胞、植物或植物组织或其部分中，或者微生物中特异性编码mRNA或相应蛋白质的量，来降低所述生物或其部分中基因产物的活性。“蛋白质或mRNA的量”应理解为表示生物、组织、细胞或细胞区室中多肽或mRNA分子的分子数量。蛋白质数量的“减少”表示与野生型、对照或参照相比，生物、组织、细胞或细胞区室或其部分中所述蛋白质分子量的定量减少，例如通过下文所述方法之一实现。
在本文上下文中，“失活”表示生物或细胞例如植物或植物细胞中编码的多肽的活性基本不再可以检出。就本发明的目的而言，下调(＝减少)表示与未经处理的生物的活性相比，其活性例如编码的多肽的酶活性或生物活性部分或基本完全减少。这可以通过不同的细胞-生物学机制实现。在本文上下文中，可以在整个生物中，或者在多细胞生物的情况下在生物的个别部分中，在植物的情况下例如在组织如种子、叶、根或其他部分中下调活性。
修饰，即降低，可以由内源或外源因素引起。例如，生物或其部分中活性的降低可以由对培养基、营养物、植物土壤或植物自身添加化合物(例如拮抗剂)引起。
在一个实施方案中，可以通过分别降低本文所述的内源核酸分子或内源多肽的水平，即根据本发明方法要降低其活性的核酸分子或多肽的水平，尤其是表I申请号1或II第5或7列中相应行中描述的多核苷酸或多肽的水平，实现与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或生物量产生。
因此，在本发明方法的另一个实施方案中，在本发明方法中要减少的蛋白质或核酸分子表现的活性的降低、抑制或缺失通过选自以下的至少一个步骤实现：
(a)引入包含编码核糖核酸序列的多核苷酸的核酸分子，所述核糖核酸序列能够形成双链的核糖核酸分子，其中至少17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸(nt)或更多，优选25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸(nt)或更多，更优选50、60、70、80、90或100个核苷酸(nt)的片段，且其中所述双链核糖核酸分子与下述核酸分子具有50％或更多，优选60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或最优选100％的同一性，所述核酸分子是根据本发明的方法待减少的或者编码根据本发明的方法待减少的多肽的核酸，或者选自：
(i)在本发明方法中降低其活性的核酸分子；
(ii)核酸分子，其包含如表I申请号1第5或7列所示多核苷酸，或编码包含如表II申请号1第5或7列所示多肽的多肽，优选如表I申请号1第5或7列中所示核酸分子，或者编码如表II申请号1第5或7列中所示多肽的核酸分子，优选如表I A申请号1第5或7列中所示核酸分子，或编码如表II B申请号1第5或7列中所示多肽的核酸分子，和
(iii)核酸分子，其编码具有表II申请号1第5列中所示多肽活性的多肽，或编码包含如表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的多核苷酸的表达产物；
和
(b)以下段落中公开的步骤之任一：
(i)引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或反义核酸分子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或反义核酸分子包含17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多个核苷酸(nt)，优选25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40或更多个核苷酸(nt)，更优选50、60、70、80、90或100或更多个核苷酸(nt)的片段，与下述核酸分子具有至少30％或更多，优选40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或最优选100％的同一性，所述核酸分子是要根据本发明的方法减少的，或者是编码要根据本发明的方法减少的多肽的核酸分子，或者是选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；
(ii)引入特异性切割下述核酸分子的核酶，所述核酸分子要根据本发明的方法减少，或者是编码要根据本发明的方法减少的多肽的核酸分子，或者是选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；
(iii)引入在(b)(i)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体、反义核酸分子和在(b)(ii)中表征的核酶；
(iv)引入赋予以下核酸分子表达的有义核酸分子：根据本发明的方法要减少的核酸分子或编码根据本发明的方法要减少的多肽的核酸分子；选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子，其用于诱导根据本发明的方法要减少的核酸分子或编码根据本发明的方法要减少的多肽的核酸分子；或选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子的内源表达产物的共阻抑；
(v)引入包含赋予以下蛋白质的显性负突变体表达的多核苷酸的核酸分子：具有根据本发明方法要减少的蛋白质活性的蛋白质，或根据本发明要减少的核酸分子编码的蛋白质，或选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子编码的蛋白质；
(vi)引入包含下述多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸编码与下述核酸分子结合的因子，所述核酸分子包含根据本发明的方法要减少的核酸分子，或包含编码根据本发明的方法要减少的多肽的核酸分子，或包含选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；
(vii)引入赋予以下RNA分子减少的病毒核酸分子，所述RNA分子包含根据本发明的方法要减少的核酸分子，或包含编码根据本发明方法要减少的多肽的核酸分子，或包含选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；
(viii)引入能够与下述内源基因重组并使其活性沉默、失活、抑制或降低的核酸构建体，所述内源基因包含根据本发明的方法要减少的核酸分子，或包含编码根据本发明的方法要减少的多肽的核酸分子，或包含选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；
(ix)在下述内源基因中引入非沉默的突变，所述内源基因包含根据本发明的方法要减少的核酸分子，或包含编码根据本发明的方法要减少的多肽的核酸分子，或包含选自(a)(i)到(iii)部分中定义的核酸分子；和/或
(x)引入赋予(b)(i)到(ix)任一中表征的核酸分子表达的表达构建体。
因此，在本发明方法的另一个实施方案中，通过选自以下的至少一个步骤实现本发明方法中使用的蛋白质或核酸分子表现的活性的降低或缺失：
(a)引入编码核糖核酸分子的核酸分子，其序列能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的有义链与下述核酸分子具有至少30％，优选60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述核酸分子要根据本发明的方法减少或者编码要根据本发明的方法减少的多肽，或者选自：
(i)核酸分子，其赋予包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质的表达，或赋予包含如表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸的核酸分子的表达；
(ii)核酸分子，其编码具有要根据本发明的方法减少的蛋白质活性的蛋白质，例如包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序，或者赋予包含如表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸的核酸分子的表达，和
(iii)核酸分子，其包含核酸分子至少17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基对的片段与(a)(i)或(ii)的核酸分子具有至少50％，优选60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同源性；
(b)引入反义核酸分子，其中所述反义核酸分子与下述核酸分子具有至少30％或更多，优选40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述核酸分子与要根据本发明的方法减少的核酸分子或编码要根据本发明的方法减少的多肽的核酸分子或选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子反义；
(c)引入核酶，所述核酶特异性切割赋予下述蛋白质表达的核酸分子，蛋白质具有要根据本发明方法减少的蛋白质的活性，例如包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序，或者所述核酶特异性切割赋予以下表达的核酸分子：要根据本发明方法减少的核酸分子，或要根据本发明方法减少的多肽，或编码要根据本发明方法减少的多肽的核酸分子，或选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子；
(d)引入(b)中表征的反义核酸分子和(c)中表征的核酶；
(e)引入赋予以下表达的有义核酸分子：要根据本发明方法减少的核酸分子，或要根据本发明方法减少的多肽，或编码要根据本发明方法减少的多肽的核酸分子，或选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子，来诱导以下的共阻抑：要根据本发明方法减少的内源核酸分子，或编码要根据本发明方法减少的多肽的核酸分子，或选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子；
(f)引入下述核酸分子，所述核酸分子赋予下述蛋白质的显性负突变体的表达，所述蛋白质具有要根据本发明方法减少的蛋白质的活性，例如包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序，或赋予由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码的多肽的显性负突变体的表达，例如表达导致显性负突变体蛋白质的所述序列，由此在本发明方法中使用的蛋白质的活性被降低、减少或缺失；
(g)引入编码因子的核酸分子，所述因子与赋予下述蛋白质表达的核酸分子结合，所述蛋白质具有要根据本发明方法减少的多肽的活性，例如包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序，或者由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码；
(h)引入赋予RNA分子减少的病毒核酸分子，所述RNA分子赋予下述蛋白质的表达，所述蛋白质具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性，特别是包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码；
(i)引入能够与下述内源基因重组并使其突变的核酸构建体，所述内源基因赋予下述蛋白质的表达，所述蛋白质具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性，特别是包含如表II或VI申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码；
(j)在赋予下述蛋白质表达的内源基因中引入非沉默突变，所述蛋白质具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性，特别是包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码；
(k)从本发明方法中使用的经随机诱变的生物种群中，选择编码下述蛋白质的核酸序列中的非沉默突变，所述蛋白质具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性，特别是包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者由选自上文(a)(i)到(iii)的核酸分子编码；和/或
(l)引入下述表达构建体，所述表达构建体赋予在(a)到(k)任一中表征的核酸分子或多肽的表达，或赋予在(a)到(k)任一中表征的核酸分子或多肽的表达。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
向赋予下述多肽表达的内源核酸分子(例如内源基因)中引入表IV申请号1第7列中相同行中所示共有序列的不同氨基酸的突变，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序，或者是选自上文所述(a)(i)到(iii)的核酸分子编码的多肽，
由此所述突变在要在本发明方法中降低其活性的多肽中，尤其是在包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽中，或由选自上文所述(a)(i)到(iii)的核酸分子编码的多肽中赋予非沉默的突变。
表IV申请号1第7列中所示共有序列指出被发现在表II申请号1第5和7列中所示多肽的序列内高度保守的氨基酸。因此，优选通过随机诱变途径或通过向这类氨基酸中或若干个保守氨基酸串中选择性引入突变(例如通过化学、物理或生物诱变剂，例如定点诱变)或引入同源重组，来突变一个或多个不同的保守氨基酸(未被定义为X或Xaa)。
在一个实施方案中，根据上文段落中描述，例如Liu Q等，PlantPhysiology 129，1732(2002)中所述不同的方法步骤，为了减少、抑制、降低或缺失在本发明方法中要降低其活性的核酸序列，使用下述核酸分子的编码序列，所述核酸分子的活性要在本发明方法中降低，尤其是来自于上文的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中提到的核酸分子，优选包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子。
优选使用所述核酸序列编码区的少于1000bp、900bp、800bp或700bp，尤其优选少于600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp。
技术人员知道可能从本文公开的核酸序列开始作为在本发明方法中要降低其活性的核酸分子，来降低或缺失尤其是本文公开的分子的直向同源物的活性。具体地，技术人员已知如何分离完整的基因、编码区(CDR)、表达区(例如作为cDNA)、或所述核酸序列的片段，尤其是如表I申请号1第5或7列中所示分子的所述区域，在本文中尚未公开时，例如从上文的部分(a)到(j)下提到的核酸分子开始，优选从包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的核酸分子开始。
在一个实施方案中，根据上文描述的，例如Ifuku K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67(1)，107(2003)中所述不同的方法步骤(a)到(j)，为了减少、抑制、降低或缺失在本发明方法中要降低其活性的核酸序列，使用下述核酸分子的5’和/或3’序列，所述核酸分子的活性要在本发明方法中降低，尤其是来自于上文(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中提到的核酸分子，优选包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子。
优选使用所述核酸序列5’和/或3’区的少于1000bp、900bp、800bp或700bp，尤其优选少于600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp。
技术人员知道可能从本文公开的核酸序列开始作为在本发明方法中要降低其活性的核酸分子，来分离所述分子的UTR。具体地，技术人员已知如何分离所述核酸序列的5’和/或3’区，尤其是表I申请号1第5或7列中所示分子的5’和/或3’区，在本文中尚未公开时，例如从上文的部分(a)到(j)下提到的核酸分子开始，优选从包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的核酸分子开始。
可以使用不同的方法如RACE(Zang和Frohman，methods Mol Biol 69，61(1997))或基因组行走PCR技术(Mishra等，Biotechniques 33(4)，830(2002)；Spertini等，Biotechniques 27(2)，308(1999))来分离5’和/或3’区。
降低或缺失本发明蛋白质展示的生物活性的上述方法步骤导致与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
活性或功能的降低优选地通过降低编码本发明方法中蛋白质的基因的表达来实现。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，可以例如使用以下方法实现下述基因产物的活性或功能的所述降低，所述基因产物编码要根据本发明方法减少的核酸或多肽，例如由包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的核酸编码的多肽，或包含表II申请号1第5或7列或表IV申请号1第7列中所示氨基酸序列、共有序列或多肽基序的多肽，或包含表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的核酸分子，或编码包含表II或IV申请号1第5或7列中所示氨基酸序列、共有序列或多肽基序的多肽的核酸分子：
(a)引入上述双链RNA核酸序列(dsRNA)或表达盒，或多于一个表达盒，确保后者的表达；
(b)引入反义核酸序列或表达盒，确保后者的表达。包括在内的是下述方法，其中反义核酸序列指向基因(即基因组DNA序列，包含启动子序列)或基因转录物(即RNA序列，包括5’和3’非翻译区)。还包括在内的是α-端基异构核酸序列；
(c)引入与核酶组合的反义核酸序列或引入确保前者表达的表达盒；
(d)引入用于诱导共阻抑的有义核酸序列或引入确保前者表达的表达盒；
(e)引入编码显性负蛋白质的核酸序列或引入表达盒，确保后者的表达；
(f)引入针对基因、RNA或蛋白质的DNA-、RNA-或蛋白质结合因子或抗体，或引入表达盒，确保后者的表达；
(g)引入导致RNA降解的病毒核酸序列和表达构建体，或者引入确保前者表达的表达盒；
(h)引入用于诱导内源基因同源重组的构建体，例如用于产生敲除突变体；
(i)向内源基因中引入突变，用于产生功能的丧失(例如产生终止密码子、读码框迁移等等)；
(j)引入被设计为靶向目的基因的微RNA或微小-RNA(miRNA)，从而诱导目的基因mRNA的断裂或翻译抑制，使基因表达沉默，或者引入确保前者表达的表达盒；
(k)引入被设计为靶向目的基因的ta-siRNA，从而诱导目的基因mRNA的断裂或翻译抑制，使基因表达沉默，或引入确保前者表达的表达盒；和/或
(l)在(例如根据所谓的TILLING方法)随机诱变的种群中鉴定非沉默的突变，例如产生终止密码子、读码框迁移、倒位(inversion)等等。
就本发明的目的而言，这些方法中的每一种可导致表达、活性或功能的降低。组合使用也是可行的。其他方法是技术人员已知的，并可包括所有可能的基因表达步骤，如阻止或预防蛋白质的加工、蛋白质或其mRNA的转运，抑制核糖体附着，抑制RNA剪接，诱导降解本发明RNA或蛋白质的酶，和/或抑制翻译延伸或终止。
因此，以下段落优选涉及选自以下的活性的抑制、降低、减少或缺失：At1g74730-蛋白、At3g63270-蛋白、蛋白激酶、蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含SET结构域的蛋白质，或要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽显示的活性，尤其是下述核酸分子的活性，所述核酸分子包含表I申请号1第5或7列、优选第5列中所示多核苷酸或编码包含表II或IV申请号1第5或7列、优选第5列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽的核酸。
下文是个别优选的方法的简述
a)引入双链RNA核酸序列(dsRNA)，例如用于以下活性的降低或缺失：要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性，尤其是下述核酸分子的活性，所述核酸分子包含如表I申请号1第5或7列中所示的多核苷酸或编码包含表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
已针对动物、酵母、真菌和植物生物例如脉孢菌(Neurospora)、斑马鱼(Zebrafish)、果蝇(Drosophila)、小鼠、涡虫、人、锥虫(Trypanosoma)、牵牛花(petunia)或拟南芥详尽描述了借助于双链RNA(“双链RNA干扰”；dsRNAi)调节基因的方法(例如Matzke MA等，Plant Mol.Biol.43，401(2000)；Fire A.等，Nature 391，806(1998)；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。另外，RNAi也被例如Tchurikov等(J.Biol.Chem.，275(34)，26523(2000))记载为在细菌例如大肠杆菌中抑制基因的有利工具。Fire等将RNAi现象命名为RNA干扰。上述参考文献中描述的技术和方法明确地引用。也可以在例如由生物射弹转化造成的瞬时表达或瞬时转化的情况下后观察到有效的基因抑制(Schweizer P.等，Plant J 24，895(2000))。dsRNAi方法基于以下现象：同时引入基因转录物的互补链和反向链导致所考虑的基因表达高度有效的阻抑。导致的现象与类似物的敲除突变体非常相似(Waterhouse P.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，13959(1998))。
Tuschl等，Gens Dev.，13(24)，3191(1999)能够显示RNAi方法的效率是双链体长度、3’-端悬突长度和这些悬突中序列的函数。
因此，本发明的另一实施方案是双链RNA分子(dsRNA)，其在合适生物(例如植物)或其部分中引入或表达时，赋予选自以下的活性的减少、抑制、降低或缺失：At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含SET结构域的蛋白。
基于Tuschl等的工作并且假设潜在的原则在不同物种之间保守，可以对技术人员给予以下指南。因此，本发明的或在本发明方法中使用的dsRNA分子优选满足至少一条以下原则：
-为了实现良好的结果，应当通常避免使用的核酸序列的5’和3’非翻译区和接近起始密码子的区域，因为这些区域更富有调节蛋白质结合位点和RNAi序列之间的相互作用，并且这类调节蛋白可导致不期望的相互作用；
-在植物中，使用的核酸序列的5’和3’非翻译区和接近起始密码子(优选在起始密码子上游50到100nt)的区域给出良好的结果，因此不应当避免；
-优选选择使用的mRNA的下述区域，所述区域在AUG起始密码子下游50到100nt(＝核苷酸或碱基)；
-仅来自外显子的dsRNA(＝双链RNA)序列适用于所述方法，因为来自内含子的序列没有作用；
-该区域中的G/C含量应当大于30％并少于70％，理想地在50％左右；
-靶mRNA的可能的二级结构对于RNAi方法的作用来说较不重要。
dsRNA方法可以尤其有效和有利地用于降低要在本发明方法中降低其活性的核酸分子、尤其是下述核酸分子和/或其同源物的表达，所述核酸分子包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸，或编码包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽。特别如WO 99/32619中所述，dsRNAi途径清楚地优于传统的反义途径。
因此，本发明还涉及双链RNA分子(dsRNA分子)，其引入生物、有利地引入植物(或来自其中的细胞、组织、器官或种子)中时，通过要在本发明方法中降低其活性的核酸分子、尤其是下述核酸分子和/或其同源物表达的降低导致改变的代谢活性，所述核酸分子包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸，或编码包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
本发明的双链RNA分子，例如用于降低要在本发明方法中降低其活性的核酸分子编码的蛋白质表达、尤其是包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸的核酸分子表达的dsRNA和/或其同源物中，
i)两条RNA链之一与核酸序列的至少部分基本相同，和
ii)相应的另一条RNA链与核酸序列互补链的至少部分基本相同。
术语“基本相同”表示下述事实：dsRNA序列与靶序列相比也可包括插入、缺失和个别的点突变，但是仍然导致表达的有效降低。优选地，抑制性dsRNA“有义”链和本发明核酸序列的部分区段(在本发明的一个优选的实施方案中包括它们的内源5’和3’非翻译区)之间或“反义链”与核酸序列互补链之间如上文定义的同一性分别总计至少30％，优选至少40％、50％、60％、70％或80％，非常特别优选至少90％，最优选100％。部分区段长度总计至少10个碱基，优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基，特别优选至少40、50、60、70、80或90个碱基，非常特别优选至少100、200、300或400个碱基，最优选至少500、600、700、800、900或更多个碱基或至少1000或2000或更多个碱基。在本发明的另一个优选的实施方案中，部分区段总计17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基，优选总计20、21、22、23、24或25个碱基。这些短序列在动物和植物中是优选的。优选在200和800个碱基之间的更长序列在非哺乳动物动物中，优选无脊椎动物中，在酵母、真菌或细菌中是优选的，但是它们也可用于植物。长的双链RNA在生物中被例如蛋白质Dicer加工成许多siRNA(＝小/短干扰RNA)，所述Dicer是ds-特异性Rnase III酶。或者，“基本相同”的dsRNA也可以被定义为能够与基因转录物部分杂交的核酸序列(例如在400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA中于50℃或70℃下12到16h)。
dsRNA可以由多聚化的核糖核苷酸的一条或多条链组成。还可存在对糖-磷酸主链和核苷二者的修饰。例如，可以通过下述方式修饰天然RNA的磷酸二酯键，所述方式使其包含至少一个氮或硫杂原子。碱基可以下述方式经历修饰，所述方式使得例如腺苷脱氨酶的活性受限制。这些修饰和其他修饰在下文所述用于稳定反义RNA的方法中描述。
dsRNA可以酶促制备；其也可以完全或者部分地化学合成。可以使用大肠杆菌核糖核酸酶III(RNase III)，例如通过长dsRNA模板的部分消化有效地产生有效介导RNA干扰的至多30bp的短dsRNA(Yang，D.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，9942(2002))。
可以从单一的、自身互补的链开始或者从两条互补链开始形成双链结构。在单一的、自身互补的链中，“有义”和“反义”序列可以通过连接序列(“连接子”)连接，并形成例如发夹结构。优选地，连接序列可以采取内含子的形式，其在dsRNA合成后被剪接。编码dsRNA的核酸序列可还含有例如转录终止信号或多聚腺苷酸化信号的元件。如果dsRNA的两条链要在细胞或生物(有利地在植物)中组合，则这可通过多种方式实现：
(a)用包含两种表达盒的载体转化细胞或生物，有利地转化植物；
(b)用两种载体共转化细胞或生物，有利地共转化植物，其中一种载体包含具有“有义”链的表达盒，另一种载体包含具有“反义”链的表达盒；
(c)在已经用包含具有“反义”链的表达盒的载体转化细胞或生物后，用包含具有“有义”链的表达盒的载体超转化(supertransformation)细胞或生物，有利地超转化植物，或反之亦然；
(d)杂交，例如两种生物杂交，有利地植物杂交，每种植物用一种载体转化，所述载体之一包含具有“有义”链的表达盒，而另一包含具有“反义”链的表达盒；
(e)导入包含两种启动子的构建体，所述启动子导致期望的序列从两个方向转录；和/或
(f)用经改造的病毒感染细胞或生物，有利地感染植物，所述经改造的病毒能够生产期望的dsRNA分子。
RNA双链体的形成可以在细胞外或细胞内开始。如果dsRNA在靶细胞或生物外合成，则可以通过注射、显微注射、电穿孔、高速颗粒、通过激光束或通过化合物(DEAE-葡聚糖、磷酸钙、脂质体)介导将其引入生物或生物的细胞中，或者在动物的情况下也可能将被改造为表达双链RNAi的细菌饲喂给动物，所述细菌例如是大肠杆菌菌株。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及dsRNA，其中所述双链RNA核酸分子的有义链与下述核酸分子具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％，优选65％、70％、75％或80％，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述核酸包含如表I申请号1第5或7列所示、优选如表I B申请号1中所示的核酸分子，或者编码包含如表II申请号1第5或7列中所示、优选如表II B申请号1或表IV申请号1中所示多肽的多肽。
本发明的另一实施方案是dsRNA分子，其包含核酸分子至少10个碱基对(＝碱基、nt、核苷酸)，优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，特别优选至少55、60、70、80或90个碱基对，非常特别优选至少100、200、300或400个碱基对，最优选至少500、600、700、800、900或更多个碱基对，或至少1000或2000个碱基对的片段，所述核酸分子片段与表I第5或7列中所示、优选表IB申请号1中所示的核酸分子或编码下述多肽蛋白质的核酸分子具有至少50％、60％、70％、80％或90％，优选95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述多肽蛋白质包含如表II申请号1第5或7列所示、优选如表II B申请号1中所示或表IV中申请号1所示的多肽。
在本发明的另一个优选的实施方案中，dsRNA分子编码的序列或其部分区段总计17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基，优选20、21、22、23、24或25个碱基，其中序列同一性基本为95％、96％、97％、98％，或优选99％或100％。
本发明的dsRNA分子在生物或其部分中的表达赋予与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或提高的生物量产生。
在本发明的一个优选的实施方案中，双链RNA的有义和反义链彼此共价结合或者通过其他例如弱化学键(例如氢键)结合，并且反义链基本是有义-RNA链的互补体。
如WO 99/53050中所示，dsRNA也通过用“连接子”(例如内含子)将“有义”和“反义”链连接来包含发夹结构，并通过参考并入本文。自身互补的dsRNA结构是优选的，因为它们仅需要表达构建体，并且通常以等摩尔比包括互补链。
优选将编码dsRNA的“反义”或“有义”链或dsRNA的自身互补链的表达盒插入载体中，并使用下文所述方法(例如使用选择标记物)稳定地插入植物基因组中，从而确保dsRNA的永久表达。使用细菌或病毒载体的瞬时表达类似地是有用的。
可以使用可能使每个细胞有至少一个拷贝的量引入dsRNA。更大的用量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可带来更有效的降低。
如已经描述的，为了造成表达的有效降低，dsRNA和要根据本发明的方法降低的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列中所示分子或编码下述多肽的分子之一，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序)或其同源物的基因转录本之间100％的序列同一性不是必须要求的。相应地，这一优点是所述方法对可能由于遗传突变、多态性或进化趋异而存在的序列偏离(deviation)是耐受的。因此，例如可以使用一种生物的下述dsRNA或其同源物来阻抑另一生物中相应的表达，所述dsRNA从根据本发明的方法要降低的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列中所示分子或编码下述多肽的分子之一，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或基序)开始产生。
来自多种生物(例如植物)的根据本发明的方法要降低的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列、优选表I B中所示分子或编码下述多肽的分子之一，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列、优选表II B所示多肽、共有序列或多肽基序)之间的高序列同源性或同一性程度允许得出下述结论：这些蛋白质很可能在进化中(例如也在其他植物中)在很高程度上是保守的，因此任选的可能是来自于所公开的要根据本发明方法降低的核酸分子(例如包含表I申请号1第5或7列中所示分子或编码下述多肽的分子之一，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序)之一的dsRNA或其同源物的表达也应当在其他植物物种中具有有利的作用。
dsRNA可以体内或体外合成。为此，可以在至少一种遗传控制元件(例如启动子、增强子、沉默子、剪接供体或剪接受体或多聚腺苷酸化信号)的控制下向表达盒中引入编码dsRNA的DNA序列。合适的有利的构建体在本文下文中描述。多聚腺苷酸化不是必需的，用于起始翻译的元件也不是必须存在的。
dsRNA可以化学合成或酶促合成。为此可以使用细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶，例如T3、T7或SP6RNA聚合酶。用于RNA体外表达的合适方法描述于WO 97/32016；US 5,593,874；US 5,698,425、US5,712,135、US 5,789,214、US 5,804,693。在引入细胞、组织或生物中之前，可以例如通过萃取、沉淀、电泳、层析或这些方法的组合，将已体外化学或酶促合成的dsRNA从反应混合物中分离至较高或较低的程度。可以将dsRNA直接引入细胞，或者细胞外应用(例如进入间质空间)。在本发明的一个实施方案中，RNAi方法仅导致基因功能的部分丧失，因此使得技术人员能够在期望的生物中研究基因剂量效应并且精细调整本发明的方法。在另一个优选的实施方案中，其导致功能的完全丧失和因此与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或生物量产生。另外，其使得本领域技术人员能够研究基因的多个功能。
然而，优选用导致dsRNA表达的表达构建体进行植物的稳定转化。合适的方法在本文下文中描述。
b)引入反义核酸序列，例如用于降低、抑制或缺失要用本发明的方法降低其活性的核酸分子或多肽，尤其是包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸或者编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序。
借助于“反义”技术，通过预防特定蛋白质的mRNA累积来阻抑特定蛋白质的方法可广泛使用，并已详尽描述，包括针对植物描述；Sheehy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8805(1988)；US 4,801,34100；Mol J.N.等，FEBS Lett 268(2)，427(1990)。反义核酸分子与编码要被阻抑的靶蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。这一方法阻抑靶蛋白质的转录和/或翻译。杂交可以通过稳定双链体的形成以常规方式进行，或者在基因组DNA的情况下，由反义核酸分子通过DNA螺旋大沟中的特定相互作用与基因组DNA双链体结合而进行。
在一个实施方案中，“反义”核酸分子包括下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码蛋白质的“有义”核酸分子至少部分互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与编码的mRNA序列互补。因此，反义核酸分子可通过氢键与有义核酸分子结合。反义核酸分子可以与下述核酸分子的整个编码链互补，或仅与其部分互补，所述核酸分子表达在本发明的方法中要减少的多肽，或者包含在本发明的方法中要降低其活性的核酸分子。因此，反义核酸分子可与本发明核酸分子的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。
术语“编码区”是指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。
在另一实施方案中，反义核酸分子与核苷酸序列编码区侧翼的mRNA的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指编码区侧翼不被翻译成多肽的5’和3’序列，即也被称为5’和3’非翻译区(5′-UTR或3′-UTR)。有利地，非编码区是编码区上游和/或下游50bp、100bp、200bp或300bp，优选400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp或1000bp的区域。
给予编码链序列后可以根据Watson和Crick碱基配对原则来设计反义核酸分子，所述编码链序列编码在本发明的方法中要降低的多肽或核酸分子，所述多肽或核酸分子例如具有上述活性，例如具有在本文公开的本发明方法中要降低其活性的蛋白质活性的多肽之活性。
因此，本发明的又一个实施方案是反义核酸分子，其在合适的生物(例如植物)或其部分中表达后赋予下述活性的降低、阻抑或缺失，所述活性选自At1g74730-蛋白、At3g63270-蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含SET结构域的蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及反义核酸分子，其中所述反义核酸分子与对下述核酸分子或本文所述其同源物反义的核酸分子具有至少30％、优选至少40％、50％、60％、特别是70％、80％、85％、90％、95％的同一性，并且在其各自表达后赋予与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或生物量产生，所述核酸分子编码表II申请号1第5或7列所示、优选申请号1表II B中所示蛋白质，或编码包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序的蛋白质，或由包含表I申请号1第5或7列、优选表IB申请号1中所示多核苷酸的核酸分子编码。
因此在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子包含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个，特别优选至少60、70、80或90个碱基对，非常特别优选至少100、200、300或400个碱基对，最优选至少500、600、700、800、900或更多个碱基对或至少核酸分子的整个序列与下述核酸分子的反义核酸分子或本文所述其同源物具有至少50％、60％、70％、80％或90％，优选100％的同一性，所述反义核酸分子在其表达后赋予与相应(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如NUE和/或提高的生物量产生，所述核酸分子赋予如表II申请号1第5或7列中所示、优选如表II B申请号1中所示蛋白质的表达或者编码下述蛋白质，所述蛋白质包含如表IV申请号1所示共有序列或多肽基序，或者由包含如表I申请号1第5或7列所示、优选如表IB申请号1中所示多核苷酸的核酸分子编码。
适用于降低蛋白质活性的反义核酸可以通过应用Watson和Crick碱基配对原则，使用编码该蛋白质的核酸序列推出，所述核酸序列例如是在本发明的方法中要降低其活性的核酸序列，例如包含如表I申请号1第5或7列中所示核酸分子或者编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含如表II或表IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽(或其同源物、类似物、旁系同源物、直向同源物)。反义核酸序列可以与蛋白质的被转录的mRNA的全部互补；其可以限于编码区，或其可仅由与mRNA编码序列或非编码序列部分互补的一个寡核苷酸组成。因此，例如，寡核苷酸可与包含蛋白质翻译起点的核酸区域互补。反义核酸序列可具有例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的有利长度，但是它们也可以更长，并且包含至少100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。尤其优选的长度在15和30个核苷酸之间，例如15、20、25或30个核苷酸。反义核酸序列可使用技术人员已知的方法重组表达或化学或酶促合成。例如，可以使用天然存在的核苷酸或经多种修饰的核苷酸化学合成反义核酸分子(例如反义寡核苷酸)，所述经多种修饰的核苷酸被设计为提高分子的生物稳定性或者提高在反义和有义核酸之间形成的双链体的生理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和经吖啶取代的核苷酸。可以使用的物质的例子是硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸，例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)-尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，可以使用已经将核酸以反义方向亚克隆(即，从所插入核酸转录的RNA将为目的靶核酸的反义取向，以下章节中进一步描述)的表达载体通过生物方法产生反义核酸。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中要降低其活性的下述蛋白质或其同源物、类似物、旁系同源物、直向同源物的表达可以被下述核苷酸序列抑制，所述蛋白质例如由包含如表I申请号1第5或7列中所示核酸分子的核酸分子编码，或者是包含如表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，所述核苷酸序列与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补并且可与这一区域中的DNA双螺旋形成三联体结构，从而降低基因的转录。这类方法已描述Helene C.，Anticancer Drug Res.6(6)，569(1991)；Helene C.等，Ann.NY Acad.Sci.660，27(1992)；Maher L.J.，Bioassays 14(12)，807(1992))。
在另一实施方案中，反义核酸分子可以是α-端基异构核酸。这类α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂交体，其中与通常的b-核酸相反，两条链彼此平行排列(Gaultier等，Nucleic Acids.Res.15，6625(1987))。另外，反义核酸分子还可包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucleic Acids Res.15，6131(1987))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS Lett.215，327(1987))。
本发明的反义核酸分子一般对细胞施用或者原位产生，以使其与编码下述多肽或编码下述核酸分子的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达，导致与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比上述提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的对环境胁迫的耐性和/或生物量产生，其中所述多肽具有在本发明方法中要降低其活性的蛋白质的活性，所述核酸分子具有在本发明方法中要降低其活性的核酸分子的活性。
本发明的反义核酸分子还包括核酸分子，其包含与编码本发明天然多肽(例如序列表所示多肽序列或者根据本文所述方法鉴定的多肽)之核苷酸序列的调节区(例如其启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，例如从而形成阻止该基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。一般参阅Helene C.，(1991)Anticancer Drug Des.6(6)，569(1991)；Helene C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27(1992)；以及Maher L.J.，Bioassays 14(12)，807(1992)。
c)引入与核酶组合的反义核酸序列，例如用于减少或缺失要在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽(特别是包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子，或者编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽之多肽的核酸分子)。
本发明的另一实施方案为核酶，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制、降低或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含有SET结构域的蛋白。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及核酶，其特异性切割赋予蛋白质表达的核酸分子，并且在表达后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量生产的提高，所述蛋白质如表II申请号1第5或7列所示，优选如表IIB申请号1所示，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序，或者由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码，或者是其本文所述的同源物。
将上述反义策略与核酶法相组合是有利的。催化性RNA分子或核酶可适用于任何靶RNA并在特定位置切割磷酸二酯骨架，从而使靶RNA功能性失活(Tanner N.K.，FEMS Microbiol.Rev.23(3)，257(1999))。核酶本身不会由此被修饰，而是能够以类似方式进一步切割靶RNA分子，从而获得酶的特性。向“反义”RNA中掺入核酶序列准确地向这些“反义”RNA传递了这种酶样RNA切割特性，从而提高其失活靶RNA的效力。合适的核酶“反义”RNA分子的制备和使用描述于例如Haseloff等，(1988)Nature 33410，585(1988)。
此外，本发明的反义核酸分子也可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割与其具有互补区的单链核酸，例如mRNA。以这种方式，核酶(例如“锤头状核酶”；Haselhoff和Gerlach，Nature 33410，585(1988))可用于催化性切割待抑制和阻止其反义的酶的mRNA。核酶技术可提高反义策略的效力。表达用于减少特定蛋白质的核酶的方法描述于(EP 0 291 533，EP 0 321 201，EP 0 360 257)。还针对植物细胞描述了核酶的表达(Steinecke P.等，EMBO J.11(4)，1525(1992)；deFeyter R.等，Mol.Gen.Genet.250(3)，329(1996))。合适的靶序列和核酶可以如Steinecke P.，Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，Galbraith等编辑，Academic Press，Inc.(1995)，449-460页所述通过计算核酶RNA和靶RNA的二级结构及其相互作用来鉴定(Bayley C.C.等，Plant Mol.Biol.18(2)，353(1992)；Lloyd A.M.和Davis R.W.等，Mol.Gen.Genet.242(6)，653(1994))。例如，可以构建与待抑制蛋白质的mRNA具有互补区的四膜虫L-19IVS RNA的衍生物(还参见US 4,987,071和US 5,116,742)。或者，也可以通过选择方法从多种酶的文库中鉴定这样的核酶(Bartel D.和Szostak J.W.，Science 261，1411(1993))。
d)引入(有义)核酸序列，用于诱导共阻抑，例如用于降低、阻抑或缺失要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸或者编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序)的活性。
因此，本发明的另一实施方案为共表达构建体，其在合适的生物(例如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含有SET结构域的蛋白。
因此，本发明另一实施方案为共表达构建体，其使赋予蛋白质表达的分子降低或失活，所述蛋白质如表II申请号1第5或7列所示，优选如表IIB申请号1所示，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序，或者由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码，或者是其本文所述的同源物，例如，其使本发明核酸分子或多肽降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高了产量，特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量生产。
以有义方向表达核酸序列可导致相应同源内源基因的共阻抑。表达与内源基因具有同源性的有义RNA可以以与以下针对反义方法所述相似的方式减少或事实上消除该内源基因的表达：Jorgensen等，Plant Mol.Biol.31(5)，957(1996)，Goring等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，1770(1991)，Smith等，Mol.Gen.Genet.224，447(1990)，Napoli等，Plant Cell 2，279(1990)或Van der Krol等，Plant Cell 2，291(1990)。在这种情况下，所引入的构建体可代表全部或部分的要减少的同源基因。对植物应用这一技术已经描述于例如Napoli等，The Plant Cell 2，(1990)和US 5,03410,323。此外，所述共阻抑策略可以有利地与Brummell等，Plant J.33，793(2003)所述RNAi法相结合。在共抑制方法中使用强或极强的启动子，这至少在一些植物中是有利的。近期的工作如Schubert等，(Plant Journal 16，2561(2004))表明，共抑制效应取决于基因特定的阈值水平，高于这一水平则发生共抑制。
e)引入编码显性负蛋白的核酸序列，用于降低或缺失要在本发明方法中降低其活性的多肽(尤其是由包含表I申请号1第5或7列中所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽，或包含表II或IV申请号1第5或7列中所示多肽、或共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是显性负突变体，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使多肽降低或失活的显性负突变体，所述多肽赋予下述蛋白质的表达：如表II申请号1第5或7列所示(优选如表IIB申请号1所示)蛋白质，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序的多肽，或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽，或为其本文所述同源物，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量产生)提高。
蛋白质的功能或活性也可以通过表达所述蛋白质的显性负变体来有效地降低。本领域技术人员熟悉通过共表达其显性负形式来降低蛋白质的功能或活性的方法(Lagna G.和Hemmati-Brivanlou A.，Current Topics inDevelopmental Biology 36，75(1998)；Perlmutter R.M.和Alberola-Ila J.，Current Opinion in Immunology 8(2)，285(1996)；Sheppard D.，AmericanJournal of Respiratory Cell & Molecular Biology 11(1)，1(1994)；Herskowitz I.，Nature 329(6136)，219(1987))。
显性负变体可通过如改变多肽或其同源物的氨基酸来实现，所述多肽由包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子编码，或者包含表II或IV申请号1第5或7行所示多肽或共有序列或多肽基序。
这种改变可通过例如计算机辅助的比较(“比对”)来确定。用于获得显性负变体的这些突变优选在核酸序列水平上进行。相应的突变可通过例如使用合适寡核苷酸引物的PCR介导的体外诱变来进行，其中借助所述引物来引入期望的突变。为此，使用本领域技术人员所熟悉的方法。例如，可将“LA PCR体外诱变试剂盒”(Takara Shuzo，Kyoto)用于这一目的。本领域技术人员也可以(并且了解)缺失或改变功能性结构域(如TF或其他结合但不激活的信号组分)来获得蛋白质活性的降低。
f)引入针对基因RNA或蛋白质的DNA或蛋白质结合因子，例如用于减少、抑制或缺失在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽(特别是包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子，或者编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽或共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是针对基因RNA或蛋白质的DNA或蛋白质结合因子，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使分子降低或失活的针对基因RNA或蛋白质的DNA或蛋白质结合因子，所述分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表IIB申请号1所示)的蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量产生)提高。
还可以用特异性DNA结合因子(例如锌指蛋白转录因子型因子)来实现基因表达的减少，所述基因编码在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽，特别是包含含有表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子，或编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽的核酸分子，或其本发明的同源物。这些因子与内源靶基因的基因组序列结合，优选在调节区中结合，并引起该内源基因的抑制。利用这类方法使得可以减少内源基因的表达，而无需对后者的序列进行重组操作。这些制备相关因子的方法描述于Dreier B.等，J.Biol.Chem.276(31)，29466(2001)以及J.Mol.Biol.303(4)，489(2000)，Beerli R.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9525)，14628(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)，1495(2000)以及J.Biol.Chem.275(42)，32617(2000)，Segal D.J.和BarbasC.F.，第三版，Curr.Opin.Chem.Biol.4(1)，3410(2000)，Kang J.S.和KimJ.S.，J.Biol.Chem.275(12)，8742(2000)，Kim J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(8)，3616(1997)，Klug A.，J.Mol.Biol.293(2)，215(1999)，Tsai S.Y.等Adv.Drug Deliv.Rev.30(1-3)，23(1998)，Mapp A.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(8)，3930(2000)，Sharrocks A.D.等，Int.J.Biochem.CellBiol.29(12)，1371(1997)以及Zhang L.等，J.Biol.Chem.27543)，33850(2000)。在植物中应用这些技术的实例描述于WO 01/52620，Ordiz M.I，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(20)，13290(2002))或Guan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(20)，13296(2002))。
这些因子可以使用基因的任何部分来选择。这一区段优选位于启动子区中。然而，为了进行基因抑制，它也可以位于编码外显子或内含子的区段中。本领域技术人员能够通过数据库检索从Genbank中获得相关区段，或者对于Genbank中不存在其基因的情况，从cDNA开始，在基因组文库中筛选相应的基因组克隆。
还可以先鉴定靶作物中的序列，其包含在本发明方法中减少其活性的核酸分子或者编码在本发明方法中减少其活性的多肽，特别是包含表IB申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子，或者编码包含表IIB申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或其同源物，然后找到启动子，并使用上述因子减少表达。
本领域技术人员熟悉为此所需的方法。
此外，引入细胞中的因子也可以是本身抑制靶蛋白的因子。例如，所述蛋白质结合因子可以是适配体(Famulok M.和Mayer G.，Curr.TopMicrobiol.Immunol.243，123(1999))或抗体或抗体片段或者单链抗体。这些因子的获得已有描述，也为本领域技术人员所熟悉。例如，已经使用胞质scFv抗体来调节遗传修饰烟草植物中植物光敏素A蛋白的活性(OwenM.等，Biotechnology(NY)10(7)，790(1992)；Franken E.等Curr.Opin.Biotechnol.8(4)，411(1997)；Whitelam，Trend Plant Sci.1，286(1996))。
还可以通过定制的低分子量合成化合物来抑制基因表达，例如聚酰胺型Dervan P.B.和Bürli R.W.，Current Opinion in Chemical Biology 3，688(1999)；Gottesfeld J.M.等，Gene Expr.9(1-2)，77(2000)。这些低聚物由单元3-(二甲氨基)丙胺、N-甲基-3-羟基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基吡咯组成，它们可以这种方式适用于双链DNA的每个部分，即它们与大沟序列特异性结合并阻断位于此位置的基因序列的表达。合适的方面描述于BremerR.E.等，Bioorg.Med.Chem.9(8)，2093(2001)，Ansari A.Z.等，)Chem.Biol.8(6)，583(2001)，Gottesfeld J.M.等J.Mol.Biol.309(3)，615(2001)，WurtzN.R.等，Org.Lett 3(8)，1201(2001)，Wang C.C.等，Bioorg.Med.Chem.9(3)，653(2001)，Urbach A.R.和Dervan P.B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(8)，434103(2001)以及Chiang S.Y.等，J.Biol.Chem.275(32)，24246(2000)。
g)引入病毒核酸序列和表达构建体，其导致RNA的降解，例如用于降低、阻抑或缺失要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是病毒核酸分子，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使RNA分子降低或失活的病毒核酸分子，所述RNA分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表IIB申请号1所示)的蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量产生)提高。
还可以通过诱导生物(有利地为植物)的特异性RNA降解来实现抑制或下调，其中借助于病毒表达系统(Amplikon)(Angell S.M.等，Plant J.20(3)，357(1999))。借助于病毒载体，通过这些系统(也称为VIGS(病毒诱导的基因沉默)将与待抑制转录物具有同源性的核酸序列引入植物中。然后，转录被关闭，这推测是由植物针对病毒的植物防御机制介导的。合适的技术和方法描述于Ratcliff F.等，Plant J.25(2)，237(2001)，Fagard M.和Vaucheret H.，Plant Mol.Biol.43(2-3)，285(2000)，Anandalakshmi R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(22)，13079(1998)以及Ruiz M.T.Plant Cell10(6)，937(1998)。
h)引入用于在内源基因上诱导同源重组的构建体，例如用于产生敲除突变体，例如用于降低、阻抑或缺失要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是诱导内源基因同源重组的构建体，当被引入合适的生物(如植物)或其部分中后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使分子降低或失活的用于诱导内源基因的同源重组的构建体，所述分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表II B申请号1所示)蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量产生)提高。
为了产生活性减少的同源重组生物，使用核酸构建体，例如，其包含内源基因的至少一部分，所述内源基因通过以这样的方式缺失、添加或取代至少一个核苷酸而进行修饰，即其功能被减少或完全消除。所述修饰还可影响基因的调节元件(例如启动子)，以使得编码序列保持不被修饰，但表达(转录和/或翻译)不发生或被减少。
对于常规同源重组的情况，修饰区域5’和3’端的侧翼为其他核酸序列，其必须长至足以发生重组。其长度通常为一百个碱基至多达数千个碱基(Thomas K.R.和Capecchi M.R.，Cell 51，503(1987)；Strepp等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(8)，4368(1998))。对于同源重组的情况，使用下文所述方法用重组构建体转化宿主生物(如植物)，然后使用例如对抗生素或除草剂的抗性来选择成功发生了重组的克隆。使用共转化技术，可以其后有利地通过进行杂交来重新消除对抗生素或除草剂的抗性。植物中高效同源重组系统的实例由Terada R等公开于Nat.Biotechnol.20(10)，1030(2002)。
同源重组在高等真核生物(特别是植物)中是相对稀少的事件。主要是随机整合进宿主基因组中。除去随机整合序列并因而提高具有正确同源重组的细胞克隆数的一种可能性是使用如US 6,110,736所述的序列特异性重组系统，由此可以使非特异性整合的序列再次缺失，这简化了对通过同源重组成功整合的事件进行的选择。可以使用多种序列特异性重组系统，可以提到的实例为噬菌体P1的Cre/lox系统、来自酵母的FLP/FRT系统、噬菌体μ的Gin重组酶、来自大肠杆菌的Pin重组酶以及pSR1质粒的R/RS系统。优选噬菌体P1Cre/lox系统和酵母FLP/FRT系统。FLP/FRT和cre/lox重组酶系统已经被应用于植物系统(Odell等，Mol.Gen.Genet.223，369(1990))。
i)向内源基因中引入突变以导致功能缺失(例如产生终止密码子、读码框迁移等等)，例如用于降低、阻抑或缺失要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是在本发明方法中减少其活性的核酸分子的突变同源物，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
减少活性的其他合适方法是在内源基因中引入无义、缺失或整合突变，例如通过向植物中引入RNA/DNA寡核苷酸(Zhu等，Nat.Biotechnol.18(5)，555(2000))，以及借助于例如T-DNA诱变(Koncz等，Plant Mol.Biol.20(5)，963(1992))、ENU-(N-乙基-N-亚硝基脲)诱变或同源重组产生敲除突变体(Hohn B.和Puchta H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8321(1999))。还可以通过DNA-RNA杂交体产生点突变(也称为“嵌合修复术(chimeraplasty)”)(Cole-Strauss等，Nucl.Acids Res.27(5)，1323(1999)；Kmiec，Gene Therapy American Scientist 87(3)，240(1999))。诱变位点可以特异性靶向，或者可以随机选择。如果随机产生突变，例如通过转座子标记或化学诱变，则本领域技术人员能够特异性地富集本发明核酸中选择的突变事件，特是通过本领域技术人员所知的不同PCR方法。突变还可以通过引入所谓的“归巢内切核酸酶”来产生，其被设计成在基因组中的特定序列中产生双链断裂。对所述双链断裂的修复常导致期望的非功能性突变(Arnould等，Journal of Molecular Biology 355(3)，443(2006))。
j)引入微RNA(微小-RNA)或确保前者表达的表达盒，所述微RNA被设计为靶向目的基因，从而诱导目的基因mRNA的断裂或翻译抑制，使得基因表达沉默，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是miRNA分子，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使分子降低或失活的miRNA，所述分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表II B申请号1所示)的蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如NUE和/或生物量产生)提高。
微RNA(miRNA)作为一种植物和动物中进化保守的基于RNA的基因表达调节剂而出现。miRNA(约21至25nt)来自于转录自非蛋白编码基因的带有茎环结构的较大前体。miRNA靶向特定的mRNA，以在转录后水平(即降解mRNA)或翻译水平(即抑制蛋白质合成)抑制基因表达(Bartel D.，Cell 116，281(2004))。miRNA可以有效地设计成特异性靶向并下调选定的基因。Schwab及其同事已经分析了天然植物miRNA的靶标选择决定簇(Schwab等，Dev.Cell 8，517(2005))。这一工作已经拓展至设计并使用人工miRNA(amiRNA)来有效下调靶基因，产生了设计有效用于基因导向性沉默的amiRNA的构思和原则(Highly Specific Gene Silencing byArtificial microRNAs in Arabidopsis，Schwab等，Plant Cell 18(4)，(2006))以及用于有效amiRNA设计的基于网络的工具(http://wmd.weigelworld.org)。
k)引入反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)或确保前者表达的表达盒，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是ta-siRNA分子，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是使分子降低或失活的ta-siRNA，所述分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表II B申请号1所示)的蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)提高。
可将反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)设计成靶向目的基因，以诱导目的基因mRNA的降解，从而使基因表达沉默。
可用于根据本发明方法使基因产物抑制或失活的利用ta-siRNA的方法描述于US 60/672,976和60/718,645。
b)至k)项所述核酸序列可以通过转化/转染细胞或生物而在该细胞或生物中表达，或者通过已知方法(如a)项所述)引入细胞或生物中。
l)根据不同方法如反向筛选(reverse screening)或所谓的TILLING(基因组中靶向诱导的局部损害)方法在随机诱变的种群中鉴定非沉默突变体，例如终止密码子、读码框迁移、整合、倒位的产生等等，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽(尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸，或编码包含表II或IV申请号1第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽)的活性。
因此，本发明的另一实施方案是TLLING或反向筛选引物或者突变DNA与野生型DNA的异源双链体，其在合适的生物(如植物)或其部分中表达后赋予活性的减少、抑制或缺失，所述活性选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
本发明的另一实施方案是用于鉴定使分子降低或失活的的突变体的TLLING或反向筛选引物，所述分子赋予如表II申请号1第5或7列所示(优选如表II B申请号1所示)的蛋白质的表达，或者包含表IV申请号1所示共有序列或多肽基序或由包含表I申请号1第5或7列所示(优选如表IB申请号1所示)多核苷酸的核酸分子编码的多肽的表达，或其本文所述同源物的表达，例如赋予本发明核酸分子或多肽的降低或失活，结果为与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)提高。
特别优选的是TILLING或反向筛选引物，其用于鉴定核酸分子中的突变，所述核酸分子是表I申请号1第5或7列所示(优选表IB申请号1所示)核酸分子的同源物，例如包含表I申请号1第5或7列所示(优选表IB申请号1所示)核酸分子的核酸分子，但在一个或多个核苷酸中含有突变。
在一个实施方案中，所述TILLING或反向筛选引物包含表I申请号1第5或7列所示(优选表IB申请号1所示)核酸分子的至少17个核苷酸(nt)，优选18、19、20、21、22、23、24、25、27、30nt。
在一个实施方案中，所述TILLING或反向筛选引物包含与表I申请号1第5或7列所示(优选表IB申请号1所示)核酸分子有至少70％、75％、80％、90％、更优选至少95％、最优选100％同源，至少17个核苷酸(nt)，优选18、19、20、21、22、23、24、25、27、30nt的片段。
就TILLING而言，通过用化学诱变剂(EMS)处理来诱导突变。从个体制备DNA并排列在库中用于最初的筛选。这些库成为用扩增目的区的引物进行PCR的模板。通过使PCR产物变性并退火而在库中的野生型和突变体片段之间形成异源双链体。这些异源双链体是通过核酸酶CEL I切割的底物。消化后，使用标准荧光测序平板凝胶电泳来可视化所得产物。然后对阳性库逐个DNA进行再次筛选，从而鉴定突变体植物和序列中突变的大致位置。这一位置信息提高了序列分析的效率，因为否则将难以鉴定杂合突变。
高通量TILLING描述于例如Colbert等，Plant Physiology 126，480(2001)，并且最近已经应用于作物中(综述于Slade和Knauf，Transgenic Res.14(2)，109(2005))。
用于在群体中鉴定通过核酸随机整合(如转座子或T-DNA)而突变的个体的其他反向筛选法描述于例如Krysan等，Plant Cell 11，2283(1999)；Sessions等，Plant Cell 14，2985(2002)；Young等，Plant Physiol.125，513(2001)；Koprek等，Plant J.24，253(2000，)；Jeon等，Plant J.22，561(2000)；Tissier等，Plant Cell 11，1841(1999)；Speulmann等，Plant Cell 11，1853(1999)。
在本发明方法的另一实施方案中，使用这样的生物，其中上述基因之一或上述核酸之一以这样的方式发生突变，即与未突变蛋白相比，所编码基因产物的活性受细胞因子影响的程度大于参照生物。这类突变可导致生物的代谢活性改变，这可导致与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或更高的生物量产生。这种更高生产力的原因可以是由于酶活性调节机制(例如底物抑制或反馈调节)中的改变。在本发明方法的另一实施方案中，将生物在这种条件下培养，即本发明核酸的表达被减少或抑制，导致与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或更高的生物量产生。
在一个实施方案中，所述与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或更高的生物量产生可通过内源基因的靶向或随机诱变来提高，所述内源基因包含或编码要在本发明方法中减少其活性的分子，例如包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸，或者编码包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
例如，可以使用同源重组以引入负调节元件，或者除去、破坏或缺失增强子元件形成调节区。此外，可以修改基因转换(如Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.132(1)，174(2003))及其参考文献所述方法)，以破坏增强子元件或者增强负调节元件的活性。此外，可以通过T-DNA或转座子诱变在(植物)基因组中随机引入突变或抑制元件，并可筛选这样的品系，其中抑制或破坏元件已被整合到本发明基因附近，该基因的表达由此被抑制、减少或缺失。已经描述了通过随机整合增强子元件使植物基因失活。
已经在多种情况中描述了用于鉴定目的基因附近的插入(其最终带有失活元件)的反向遗传策略，例如Krysan等，Plant Cell 11，2283(1999)；Sessions等Plant Cell 14，2985(2002)；Young等，Plant Physiol.125，513(2001)；Koprek等，Plant J.24，253(2000)；Jeon等，Plant J.22，561(2000)；Tissier等，Plant Cell 11，1841(1999)；Speulmann等，Plant Cell 11，1853(1999)。
负调节元件的增强或者增强或激活性调节元件的破坏或弱化还可以通过常用的诱变技术来实现：产生化学或放射诱变种群是常用的技术，并为本领域技术人员所知。
因此，如果编码赋予本文所述活性之多肽或核酸分子的内源基因(特别是包含本发明核酸分子的基因)通过同源重组被诱变方法所修饰并任选地通过TILLING或其他反向筛选法或基因转换而鉴定，则可提高表达水平。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法中的本文所述核酸分子的适用修饰(即减少、抑制或缺失其活性并且其本身由宿主生物编码)可通过例如以化学、放射或UV光随机诱变或定点诱变以这样的方式进行来实现，即与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)被提高。本发明的这一实施方案应认为是本发明的转基因。
使用本文所述克隆载体和转换方法(如Plant Molecular Biologyand Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，6/7章，71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；出自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，出自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205-225(1991)中公开和引用的以及下文引用的)，来自用于本发明方法的本文所述多核苷酸的核酸分子可用于多种生物(特别是植物)中的重组修饰，以使其变得更好更有效，这是因为缺失或减少了包含本发明核酸分子的基因的活性，或者本发明方法所述基因的表达产物的活性。
所述与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量(特别是产量相关性状，例如氮利用效率)的增强和/或生物量产生的提高可以通过该操作的直接作用或该操作的间接作用来实现。
为了改进核酸分子(其用于在生物中降低、抑制、减少或缺失要在本发明方法中降低的分子的表达或活性)的引入，可以将本文公开的核酸分子或其衍生物以使得它们被引入生物(例如细胞)中的方式整合进核酸构建体和/或载体中，在核酸序列表达水平或所述序列编码的多肽的水平上赋予降低或缺失的内源活性或细胞活性。
因此，为了改进核酸分子的引入并赋予或改进生物(例如转基因植物或微生物)中要在本发明方法中降低的分子的表达或活性的降低、抑制、减少或缺失，可以向核酸构建体和/或载体中整合下述核酸分子，其编码本文公开的反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或抑制要在本发明方法中降低、抑制或缺失的核酸分子表达产物的表达或活性的其他分子。
在上述减少、抑制、降低或缺失(在上文中定义为也包括在生物中产生活性，即重新活性)后，例如在如根据本发明的方法或过程中所述引入和表达RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或反义分子或核酶或其他抑制表达或活性的分子后，培养并随后收集根据本发明的生物(有利地为植物、植物组织或植物细胞)。
例子可以是转基因植物或非转基因植物、其细胞或原生质体。优选的合适生物的例子描述于以下段落中。
用于产生根据本发明使用或用于本发明方法中的核酸分子的合适宿主生物(转基因生物)原则上是适用于抑制、降低或缺失基因的所有植物，所述宿主生物例如要用本发明的核酸构建体或载体(均如下文所述)转化，从而例如赋予RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、核酶或反义分子或核酶或抑制表达或活性的其他分子的表达，所述基因尤其是下述核酸分子，其包含表I申请号1的第5列或第7列中所示多核苷酸或者编码包含表II或IV申请号1的第5或7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
在(转基因)宿主生物是植物、植物组织或植物细胞的情况下，这类植物选自漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、胡桃科、樟科、豆科、亚麻科或多年生草本、饲用作物、蔬菜、观赏植物和拟南芥(Arabidopsis thaliana)，该植物例如在固体培养基上培养，或者作为细胞在例如液体培养基中培养，所述培养基是本领域技术人员已知并且适合所述生物的。另外，这类植物可以在土壤等等中培养。
在一个实施方案中，本发明的方法中使用的核酸分子，尤其是本发明的核酸分子，或生产生物或来源生物是植物或来源于植物，例如选自以下的植物：槭树科(Aceraceae)、漆树科、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、牻牛儿苗科(Gentianaceae)、Labiaceae、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)，并优选地来自选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。
优选的植物选自：漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardiumoccidentale)[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、Locusta、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花[Marigold]、红花[safflower]、矢车菊(Centaureacyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[blue daisy]、洋蓟[Artichoke]、向日葵[sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactucacrispa)、Lactuca esculenta、Lactuca scariola L.ssp.sativa、Lactuca scariolaL.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、Lactuca sativa subsp.romana、Locusta communis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[lettuce]、香叶万寿菊、万寿菊或细叶万寿菊[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛或土耳其榛[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borage)例如物种琉璃苣[borage]；十字花科如芸苔属、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥属例如物种欧洲油菜、芜青[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、甘蓝型油菜]、野欧白芥、芥菜、芥菜(原变种)、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapis communis)[mustard]、甘蓝[fodder beet]或拟南芥；凤梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属例如物种番木瓜[papaya]；大麻科(Cannabaceae)如大麻属例如物种大麻[hemp]、旋花科(Convolvulaceae)如番薯属、旋花属例如物种甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoeafastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯或Convolvulus panduratus[sweetpotato、Man of the Earth、wild potato]、藜科(Chenopodiaceae)如甜菜属即物种甜菜、甜萝卜、甜菜(原变种)、沿海甜菜、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[sugar beet]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种笋瓜、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦或南瓜[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属例如物种油橄榄[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistuschamaerhodendros或Kalmia lucida[American laurel、阔叶月桂、calicobush、spoon wood、sheep laurel、alpine laurel、bog laurel、westernbog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)例如物种木薯、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta[Manihot、arrowroot、tapioca、cassava]或蓖麻[castorbean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja例如物种豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆[pea]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormionberteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobiumberterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleealebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East Indian Walnut]、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿[苜蓿]、大豆、Dolichossoja、宽叶蔓豆、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或Sojamax[大豆]；牻牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子、茶簏子天竺葵或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；胡桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃Juglanssieboldiana、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglansintermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglansmicrocarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[胡桃、黑胡桃、commonwalnut、Persian walnut、白胡桃、灰胡桃、黑胡桃]；樟科如鳄梨属、月桂属例如物种月桂[bay、laurel、bay laurel、sweet bay]、鳄梨、鳄梨(Perseagratissima)或鳄梨(Persea persea)[avocado]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种花生[peanut]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linumaustriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linumcatharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linumnarbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perennevar.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻属、胡麻]；Lythrarieae如石榴属(Punica)例如物种石榴[pomegranate]；锦葵科如棉花属(Gossypium)例如物种陆地棉、树棉、海岛棉、草棉或瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)[棉花]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉、大蕉、芭蕉[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissoniabrevipes[primose、evening primose]；棕榈科如油棕属(Elacis)例如物种油棕(Elaeis guineensis)[oil plam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟、虞美人、长果罂粟(Papaver dubium)[poppy、oriental poppy、cornpoppy、field poppy、shirley poppies、field poppy、long-headed poppy、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属例如物种胡麻[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒、Piper amalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayennepepper、wild pepper]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属、小麦属(Triticum)例如物种大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草[barley、pearl barley、foxtail barley、wall barley、meadow barley]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦(原变种)、杂种野燕麦、双色高粱、石茅高粱(Sorghumhalepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱、垂穗高粱草、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草、Sorghumguineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草、甜高粱、Sorghumsubglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱、石茅高粱(Holcushalepensis)、黍(Sorghum miliaceum millet)、稷(Panicummilitaceum)[Sorghum、millet]、稻、玉米[corn、maize]、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticum hybernum、马卡小麦、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[wheat、breadwheat、common wheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属例如物种咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[coffee]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascumthapsus)[mullein、white moth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花、white mullein、darkmullein、希腊毛蕊花(greek mullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoary mullein、great mullein]；茄科如辣椒属、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒[辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、烟草、花烟草(Nicotiana alata)、Nicotiana attenuate、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotianaquadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯[potato]、茄[egg-plant]、番茄、番茄、梨形番茄、红茄或番茄[番茄]；梧桐科(Ste rculiaceae)如可可属例如物种可可树[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种茶(Camelliasinensis)[茶]。
所有上述的宿主生物也可用作本发明方法中使用的核酸分子、例如本发明的核酸分子的来源生物。
优选作物植物并且特别是本文中以上提到的作为宿主植物的植物，如以上提到的科和属，例如优选的物种是腰果(Anacardium occidentale)、金盏花(Calendula officinalis)、红花(Carthamus tinctorius)、菊芋(Cichoriumintybus)、洋蓟(Cynara scolymus)、向日葵(Helianthus annus)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)、细叶万寿菊(Tagetestenuifolia)；胡萝卜(Daucus carota)；欧洲榛(Corylus avellana)、土耳其榛(Corylus colurna)、琉璃苣(Borago officinalis)；欧洲油菜、芜青(Brassicarapa ssp.)、野欧白芥(Smapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra、Brassicasinapioides、Melanosinapis communis)、甘蓝(Brassica oleracea)、拟南芥、凤梨(Anana comosus)、Ananas ananas、Bromelia comosa、番木瓜(Caricapapaya)、大麻(Cannabis sative)、甘薯(lpomoea batatus)、提琴叶牵牛花(lpomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)、Convolvulus panduratus、甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Beta vulgaris var.vulgaris)、沿海甜菜(Betamaritima)、Beta vulgaris var.perennis、Beta vulgaris var.conditiva、Betavulgaris var.esculenta、笋瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbitamixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、油橄榄(Oleaeuropaea)、木薯(Manihot utilissima)、Janipha Manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、豌豆(Pisumsativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicagovaria)、大豆、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子(Cocos nucifera)、茶簏子天竺葵(Pelargonium grossularioides)、Oleum cocoas、月桂(Laurus nobilis)、鳄梨(Persea americana)、花生(Arachis hypogaea)、亚麻(linumusitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linumbienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinumgrandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perenne var.lewisii)、linum pratense、linum trigynum、石榴(Punica granatum)、陆地棉Gossypium hirsutum、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)、瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)、香蕉(Musa nana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musaparadisiaca)、芭蕉(Musa spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、东方罂粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、Papaver dubium、胡麻(Sesamumindicum)、树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piperangustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper retrofractum)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piperelongatum、Steffensia elongata、大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon.、Hordeumhexastichum)、Hordeum irregulare、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦(原变种)(Avena fatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghumhalepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghumdrummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghummiliaceum)(谷子(millet))、稷(Panicum militaceum)、水稻(Oryza sativa)、Oryza latifolia、玉米、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticumvulgare)、咖啡(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffeacanephora)、大果咖啡(Coffea liberica)、辣椒(Capsicum annuum)、Capsicum annuum var.glabriusculum、小米椒(Capsicum frutescens)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、茄(Solanum melongena)、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum.)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)、番茄(Solanum lycopersicum)、可可树(Theobroma cacao)或大叶茶(Camellia sinensis)。
尤其优选的植物是选自玉米、大豆、芸苔、小麦、大麦、黑小麦、稻、亚麻子、向日葵、大麻、琉璃苣、油棕、椰子、月见草、花生、向日葵、马铃薯和拟南芥。
其他优选的植物是选自以下的未经转化的植物：黑麦、燕麦、大豆、棉花、油菜、木薯、胡椒、甘蔗、向日葵、亚麻、红花、报春花、油菜、芜青、万寿菊、茄科植物、烟草、茄子、西红柿、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、多年生草本植物和饲料作物。
更优选的植物是未经转化的亚麻植物细胞，优选为亚麻(Linumusitatissimum)，更优选的品种为Brigitta、Golda、Gold Merchant、Helle、Juliel、Olpina、Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola，未转化的向日葵属(Helianthus)植物细胞，优选向日葵(Helianthus annuus)，更优选的品种为Aurasol、Capella、Flavia、Flores、Jazzy、Palulo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd，或未转化的芸苔属植物细胞，优选欧洲油菜(Brassica napus)，更优选品种为Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、Star、Caviar、Hybrido、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja、Mendel、Mica、Mohican、Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart。
在本发明的一个实施方案中，转基因植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
所有上述宿主植物还可用作来源生物，用于分离和鉴定要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽，或其功能等同物。玉米、大豆(soja)、芸苔、大麻、琉璃苣、油棕(oil palm)、椰子、月见草、花生、红花、小麦、大麦、黑小麦、稻、亚麻子、向日葵、马铃薯和拟南芥是优选的来源植物。
根据本发明的方法，与相应的野生型、对照或参照相比，可以将在本发明方法中使用的相应(例如未经转化的)的野生型植物的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生提高至少1.05、1.1的倍数，优选提高至少1.5、2、3、4或5的倍数，特别优选提高至少10、15、20或30的倍数，非常特别优选提高至少50的倍数。
在一个优选实施方案中，本发明涉及与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增强产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高生物量产生的方法，其包括减少、抑制、降低或缺失包含具有表I申请号1第5或7列所示核苷酸序列的多核苷酸的核酸分子或其同源物的活性，或者包括减少、抑制、降低或缺失多肽的活性，所述多肽包含具有表II申请号1第5或7列所示氨基酸序列的多肽，或者包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽或其同源物。
因此，在另一优选实施方案中，本发明涉及与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增强产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高生物量产生的方法，其包括减少、抑制、降低或缺失至少一种核酸分子的活性或表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子或者包含与其互补的核酸分子：
(a)分离的核酸分子，其编码如表II申请号1第5或7列所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序的多肽；
(b)表I申请号1第5或7列所示分离的核酸分子；
(c)分离的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而衍生自如表II申请号1第5或7列所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序的多肽；
(d)分离的核酸分子，其与包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；
(e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与(a)、(b)、(c)或(d)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)、(b)、(c)、(d)或(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或多肽基序，并优选具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(i)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(i)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而产生；和
(j)分离的核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库(例如来自cDNA的文库或基因组文库)而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，其具有与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)、(h)或(i)所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt，30nt，50nt，100nt，200nt或500nt，并编码多肽，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
或者减少、抑制、降低或缺失包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)所示核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含表II申请号1第5或7列所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽；
其中在一个优选的实施方案中，所述核酸分子或多肽赋予第52页倒数第一段所示的至少一种活性。
在一个实施方案中，用于该方法的核酸分子与表IA或B申请号1第5或7列所示序列存在至少一个或多个核苷酸的差异，或者不由表IA或B申请号1第5或7列所示序列组成。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子与表IA或B申请号1第5或7列所示序列具有小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％的同一性。
在另一实施方案中，所述核酸分子不由表IA或B申请号1第5或7列所示序列组成。
可以从通常可进入的数据库中确定核酸分子，其在本发明方法中有利并编码具有下述活性的核酸分子，该活性为包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子的核酸分子之表达产物的活性，优选表IB申请号1第5或7列所示蛋白质的活性，更优选表IB申请号1第5列所示蛋白质的活性，并在降低或者缺失其活性后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生。
也可以从通常可进入的数据库中确定核酸分子，其在本发明方法中有利并编码多肽，所述多肽具有包含表II申请号1第5或7列所示多肽或表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序的蛋白质的活性，优选如表IIB申请号1第5或7列所示或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的蛋白质的活性，更优选表IB申请号1第5列所示蛋白质的活性，并赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是增加的产量相关性状，例如增加的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
必须提到(特别是在本文情况下)的那些数据库为一般性基因数据库，例如EMBL数据库(Stoesser G.等，Nucleic Acids Res.29，17(2001))、GenBank数据库(Benson D.A.等，Nucleic Acids Res.28，15(2000))或PIR数据库(Barker W.C.等，Nucleic Acids Res.27，39(1999))。还可以使用生物特异性基因数据库来确定有利的序列，对于酵母的情况例如为SGD数据库(Cherry J.M.等，Nucleic Acids Res.26，73(1998))或MIPS数据库(MewesH.W.等，Nucleic Acids Res.27，44(1999))，对于大肠杆菌的情况为GenProtEC数据库(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)，对于拟南芥的情况为TAIR数据库(Huala，E.等，Nucleic Acids Res.29(1)，102(2001))或MIPS数据库。
此外，在本发明的另一实施方案中，要在本发明方法中减少的分子是新的。因此，本发明还涉及新的核酸分子、“本发明的核酸分子”或“本发明的多核苷酸”。
用于本发明方法的核酸分子为分离的核酸序列的形式，其编码多肽，所述多肽具有表II A或B申请号1第5或7列所示蛋白质的活性，优选如表II B申请号1第7列所示新蛋白质的活性，并通过降低、抑制、减少或者缺失其活性后使得可以赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及赋予产物表达的分离的核酸分子，所述产物的减少、抑制或缺失导致与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生，特别是增加的产量，尤其是产量相关性状，如氮利用效率，或者特别是提高的生物量，或者特别是NUE的增强和生物量的提高，并包含选自以下的核酸分子：
(a)分离的核酸分子，其编码如表II申请号1第5或7列所示，优选表II B，或者包含表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序的多肽；
(b)表I申请号1第5或7列，优选表I B，所示分离的核酸分子；
(c)分离的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而衍生自如表II申请号1第5或7列，优选表II B，所示多肽或者包含表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序的多肽；
(d)分离的核酸分子，其与包含表I申请号1第5或7列(优选表IB)所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性；
(e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与(a)、(b)、(c)或(d)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)、(b)、(c)、(d)或(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序；
(h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(i)包含多核苷酸的分离的核酸分子，其可通过用如表III申请号1第7列所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得，其在5’端不从ATA核苷酸开始；
(j)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而产生；和
(k)分离的核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，其具有与(a)至(d)所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt，30nt，50nt，100nt，200nt，500nt，750nt或1000nt，并编码多肽，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
或者包含与其互补的序列；
其中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)和(k)的核酸分子与表IA申请号1第5或7列所示序列存在至少1个、5个、10个、20个、50个、100个或更多核苷酸的差异，和/或编码与表II A申请号1第5或7列所示多肽序列存在至少1个、5个、10个、20个、30个、50个或更多氨基酸的差异。
因此，在另一实施方案中，本发明的核酸分子不由表IA申请号1第5或7列所示序列组成。
在另一实施方案中，本发明的核酸分子与表I A或B申请号1第5或7列所示核酸序列具有至少30％同一性，并与表IA申请号1第5或7列所示序列具有少于100％，优选小于99.999％、99.99％或99.9％，更优选小于99％、98％、97％、96％或95％同一性。
本文使用的术语“本发明的核酸分子”指本段中所述的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明还涉及新的多肽，因此涉及“本发明的多肽”或“本发明的蛋白质”。
优选地，所述多肽不包含表II A申请号1第5或7列所示多肽。优选地，本发明的多肽与表II A申请号1第5或7列所示多肽序列存在至少1个、5个、10个、20个、30个、50个或更多氨基酸的差异。
在另一实施方案中，本发明的多肽与表II A或B申请号1第5或7列所示蛋白质序列具有至少30％同一性，并与表II A申请号1第5或7列所示序列具有少于100％、优选少于99.999％、99.99％或99.9％、更优选少于99％、98％、97％、96％或95％同一性。
本文使用的术语“要在本发明方法中减少的分子”、“要在本发明方法中减少的核酸分子或“要在本发明方法中减少的多肽”分别包括术语“本发明的核酸分子”或“本发明的多肽”。
在一个实施方案中，所述核酸分子有利地来源于植物。
在一个实施方案中，如上文所述，优选作物植物，例如上述宿主植物。
然而，也可以使用人工序列来实施本发明，其优选与生物中的核酸序列存在一个或多个碱基的差异，或者与生物中的多肽序列存在一个或多个氨基酸分子的差异，例如抑制、失活或下调选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含有SET结构域的蛋白的活性，例如抑制、失活、或下调核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽在减少、抑制、降低或缺失其表达或活性后赋予上述活性，例如赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，例如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，特别是增强的NUE，或者特别是提高的生物量产生，或者特别是增强的NUE和/或提高的生物量产生。
在本发明的方法中，可以使用适当时含有可掺入DNA或RNA中的合成非天然或修饰核苷酸碱基的核酸分子。所述合成非天然或修饰碱基可以例如提高细胞外或细胞内的核酸分子的稳定性。用于本发明方法中的核酸分子可含有与上述相同的修饰。
如在本文中使用的，所述核酸分子还可包括位于基因编码区3’端和5’端的非翻译序列，例如编码区5’端上游序列的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸，以及基因编码区3’端下游序列的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸。在例如RNAi或反义技术的事件中，可以有利地使用5’和/或3’区。
在一个实施方案中，有利的是选择编码区用于克隆和表达抑制构建体，如反义、RNAi或共抑制构建体，从而靶向一些或全部直向同源基因，否则它们会彼此代偿。
在另一实施方案中，有利的是使用来源于3’或5’区的高度基因特异性序列来构建抑制构建体，目的是仅特异性降低靶基因的活性或表达水平，从而避免抑制其他非靶基因(称为脱靶)的副作用。
本领域技术人员熟悉分析其靶生物中的实际基因组情况。可如下获得必要的信息：检索相关序列数据库或进行基因组southern印迹，揭示靶生物的基因组结构，并最终将这些结果与关于本文公开的靶基因表达水平的信息(例如通过阵列实验、northern印迹或RT qPCR实验获得)相结合。
优选地，用于本发明方法的核酸分子或者本发明的核酸分子是分离的核酸分子。
“分离的”多核苷酸或核酸分子与该核酸分子天然来源中存在的其他多核苷酸或核酸分子分离。分离的核酸分子可以是数kb的染色体片段，或者优选地是仅含有基因编码区的分子。因此，分离的核酸分子可包含5’和3’附近的染色体区或其他附近的染色体区，但优选不包含该核酸分子来源生物的基因组或染色体环境中天然位于该核酸分子序列侧翼的这些序列(例如编码核酸分子5’和3’UTR的区域附近的序列)。例如，在多个实施方案中，用于本发明方法的分离的核酸分子可包含该核酸分子来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。
用于本发明方法的核酸分子或其部分可以使用分子生物学标准技术和本文提供的序列信息来分离。也可以例如借助比较算法来鉴定DNA或氨基酸水平的同源序列或同源保守序列区。前者可在标准杂交技术(例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所述)中用作杂交探针，用于分离用于该方法中的其他核酸序列。
也可以通过聚合酶链式反应，使用基于所用序列或其部分的寡核苷酸引物来分离包含要在本发明方法中减少其活性的分子(例如表I申请号1第5或7列所述)的完整序列或其一部分的核酸分子。例如，可以通过聚合酶链式反应，使用基于所公开序列产生的寡核苷酸引物来分离包含完整序列或其部分的核酸分子。例如，可以从细胞中分离mRNA，例如通过Chirgwin等，Biochemistry 18，5294(1979)的硫氰酸胍提取法来分离，然后通过逆转录酶(例如Moloney MLV逆转录酶，可得自Gibco/BRL，Bethesda，MD，或者AMV逆转录酶，可得自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL)产生cDNA。
用于通过聚合酶链式反应进行扩增的合成寡核苷酸引物可以基于本文所示序列来产生，例如包含表I申请号1第5或7列所示分子的分子，或者产生自表I或II申请号1第5或7列所示分子。这些引物可用于扩增核酸序列(例如从cDNA文库或从基因组文库中扩增)和鉴定可用于本发明方法的核酸分子。例如，使用表III申请号1第7列所示引物，其不从5’端的ATA核苷酸开始。
此外，可以通过与要在本发明方法中减少的核酸分子所编码多肽(特别是与表II申请号1第5或7列所示核酸分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对而从多种生物中鉴定保守区，并进而从该保守序列产生简并引物。
保守区是在不同来源的若干同源物中在一个特定位置的氨基酸极少存在变异的区域。表IV申请号1第7列所示共有序列和多肽基序产生自所述比对。此外，可以通过与要在本发明方法中减少的核酸分子所编码多肽(特别是与表II申请号1第5或7列所示多肽分子所编码的序列)进行蛋白质序列比对而从多种生物中鉴定保守区，并进而从该保守序列产生简并引物。
保守区是在不同来源的若干同源物中在一个特定位置的氨基酸极少存在变异的区域。表IV申请号1第7列所示共有序列和多肽基序产生自所述比对。在一个有利的实施方案中，在本发明方法中，降低多肽的活性，所述多肽包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序，或由其组成。在另一实施方案中，本发明涉及多肽，其包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序，或由其组成，其中所标明的氨基酸位置的20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个可取代为任何氨基酸。在一个实施方案中，以字母标明的氨基酸位置中的不超过15％、优选10％、甚至更优选5％、4％、3％或2％、最优选1％或0％被取代为其他氨基酸。在一个实施方案中，20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个氨基酸被插入共有序列或蛋白基序中。
所述共有序列来自于表II所列序列的多重比对。字母代表单字母氨基酸代码，表示在所有比对蛋白中保守的氨基酸。字母X代表不在所有序列中保守的氨基酸。在一个实例中，对于某位置仅可能存在少数选定的氨基酸亚组的情况，这些氨基酸在括号中给出。给定X的数字表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F表示保守的酪氨酸和苯丙氨酸残基在所有研究的序列中相隔最少21个最多23个氨基酸残基。
从所有序列中鉴定保守结构域，并使用标准Prosite标注法的子集进行描述，例如模式Y-x(21，23)-[FW]表示保守的酪氨酸与苯丙氨酸或色氨酸相隔最少21个最多23个氨基酸残基。
使用软件工具MEME 3.5.1版或者手动地鉴定的保守模式。MEME由美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校计算机科学与工程学院的Timothy L.Bailey和Charles Elkan开发，并由Timothy L.Bailey和Charles Elkan(Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers，Proceedings of the Second International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology，28-36页，AAAI Press，MenloPark，California，1994]描述。独立程序的源代码可公开获得自San DiegoSupercomputer center(http://meme.sdsc.edu)。
为了使用软件工具MEME鉴定在所有序列中共有的基序，使用以下设置：-maxsize 500000，-nmotifs 15，-evt 0.001，-maxw 60，-distance 1e-3，-minsites为用于分析的序列数。MEME的输入序列为Fasta格式的非比对序列。其他参数使用该软件版本的默认设置。
保守结构域的Prosite图谱使用软件工具Pratt 2.1版产生或手动产生。Pratt由挪威Bergen大学信息学院的(Dept.of Informatics，University ofBergen，Norway)Inge Jonassen开发，并由Jonassen等(Jonassen I.，CollinsJ.F.和Higgins D.G.，Protein Science 4，1587(1995)；Jonassen I.，Efficientdiscovery of conserved patterns using a pattern graph，Submitted toCABIOS Febr.1997]描述。独立程序的源代码(ANSI C)可公开获得自例如已建立的生物信息学中心，如EBI(European Bioinformatics Institute)。
为了使用软件工具Pratt产生图谱，使用以下设置：PL(最大图谱长度)：100，PN(最大图谱符号数)：100，PX(最大连续x数)：30，FN(最大柔性间隔区数)：5，FL(最高柔性)：30，FP(最高柔性产物)：10，ON(最大图谱数)：50。Pratt的输入序列是软件工具MEME鉴定为显示高相似性的蛋白质序列的不同区域。与所产生图谱必须匹配的最小序列数(CM，最小匹配序列数)设置为所提供序列的至少80％。此处未提到的参数以其默认设置使用。
保守结构域的Prosite图谱可用于检索与该图谱匹配的蛋白质序列。多个已建立的生物信息学中心提供在数据库检索中使用这些图谱的公共互联网端口(例如PIR(Protein Information Resource，位于乔治城大学医学中心(Georgetown University Medical Center))或ExPASy(Expert ProteinAnalysis System))。或者，有独立程序可用，例如Fuzzpro程序，它是EMBOSS软件包的一部分。例如，Fuzzpro程序不仅允许检索准确的图谱-蛋白质匹配，还允许在进行的检索中设置多种模糊度。
所述比对用软件ClustalW(1.83版)进行，描述于Thompson等[Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.Nucleic Acids Research，22，4673(1994)]。独立程序的源代码可公开获得自European MolecularBiology Laboratory；Heidelberg，德国。该分析使用ClustalW v1.83的默认参数进行(缺口打开罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.2；蛋白矩阵：Gonnet；pprotein/DNA endgap：-1；蛋白/DNA gapdist：4)。
如上述设计的简并引物然后可用于通过PCR扩增新编码区的片段，其编码具有上述活性的蛋白质，例如在减少、抑制、降低或缺失相应核酸序列或所述序列所编码蛋白的表达或活性后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生，例如具有要在本发明方法中减少或缺失其活性的核酸所编码蛋白质的活性的蛋白质，或者来自其他生物的其他功能等同物或同源物。
接着，这些片段可作为杂交探针用于分离完整基因序列。或者，可以通过RACE-PCR分离缺少的5’和3’序列。可以使用cDNA或基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸分子可克隆进合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。可以通过标准合成法(例如使用自动化DNA合成仪)产生对应于本方法所用核酸分子之一的寡核苷酸。
有利地用于本发明方法的核酸分子可基于其与本文所述核酸分子的同源性来分离，其中使用该序列或其部分作为探针，并遵循标准杂交技术在严格杂交条件下进行。
在这种情况下，可以使用例如在严格条件下与上述核酸分子(特别是包含表I申请号1第5列或第7列中所示核苷酸序列的那些核酸分子)杂交的长度为至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸(优选至少15、20或25个核苷酸)的分离的核酸分子。还可以使用含有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。
术语“同源性”指各个核酸分子或所编码的蛋白质在功能和/或结构上是等同的。例如，与上述核酸分子同源或者作为所述核酸分子之衍生物的核酸分子是例如所述核酸分子的变异，其代表具有相同生物功能(特别是编码具有相同或基本相同的生物功能的蛋白质)的修饰。它们可以是天然的变异，例如来自其他植物变种或物种的序列，或者是突变。这些突变可天然发生，或者可通过诱变技术获得。等位基因变异可以是天然的等位基因变体以及合成产生的或遗传工程产生的变体。例如，结构等同物可通过测试所述多肽与抗体的结合或者通过基于计算机的预测来鉴定。结构等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
“杂交”指这些核酸分子在常规杂交条件下杂交，优选在严格条件下杂交，如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6所述。
根据本发明，可使用本发明核酸的DNA和RNA分子作为探针。此外，作为用于鉴定功能同源物的模板，可以进行Northern印迹测定和Southern印迹测定。Northern印迹测定有利地提供了关于所表达基因产物的进一步信息：例如表达谱、加工步骤(如剪接和加帽)的存在情况等。Southern印迹测定提供了关于编码本发明核酸分子之基因的染色体定位和组织的进一步信息。
严格Southern印迹杂交条件的一个优选的非限制性实例为在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，然后在50至65℃(例如50℃、55℃或60℃)下在0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤步骤。本领域技术人员了解，这些杂交条件作为核酸类型的函数而变化，并且例如在存在有机溶剂时随温度和缓冲液浓度而变化。例如，“标准杂交条件”下的温度作为核酸类型的函数在0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4或5×SSC(pH7.2)浓度的水性缓冲液中可为42℃至58℃不等，优选45℃至50℃不等。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度约为40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂交分子的杂交条件优选为0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选30℃至45℃。DNA:RNA杂交分子的杂交条件优选为例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选45℃到55℃。上述杂交温度是在例如不存在甲酰胺的情况下对长度约100bp(＝碱基对)且G+C含量为50％的核酸确定的。本领域技术人员了解借助于教科书来确定需要的杂交条件，所述教科书为例如上文提到的那些，或者以下教科书：Sambrook等，”Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins编辑1985，“Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach”，IRL Press atOxford University Press，Oxford；Brown编辑1991，“Essential MolecularBiology：A Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
一个这种严格杂交条件的另一实例是在65℃下在4×SSC中杂交，其后在65℃下以0.1×SSC洗涤1小时。或者，一个示例性严格杂交条件为50％甲酰胺、4×SSC，42℃。此外，洗涤步骤过程中的条件可以在划分为低严格条件(约2×SSC，50℃)至高严格条件(约0.2×SSC，50℃，优选65℃)的范围内选择(20×SSC：0.3M柠檬酸钠、3M NaCl，pH7.0)。此外，洗涤步骤过程中的温度可从室温(约22℃)下的低严格条件提高至约65℃的高严格条件。
盐浓度和温度这两个参数可同时改变，或者可将这两个参数之一保持恒定而改变另一个。杂交过程中还可以使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选在42℃下进行。可在各个情况下组合相关的因素例如1)处理的长度、2)盐条件、3)洗涤剂条件、4)竞争DNA、5)温度和6)探针的选择，因此本文无法提及所有的可能性。
用于DNA杂交(Southern印迹测定)和洗涤步骤的一些条件实例在下文给出：
(1)杂交条件可选自例如以下条件：
a)4×SSC，65℃，
b)6×SSC，45℃，
c)6×SSC，100mg/ml变性的片段化鱼精DNA，68℃，
d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的鲑精DNA，68℃，
e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性的片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，42℃，
f)50％甲酰胺，4×SSC，42℃，
g)50％(体积/体积)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃，
h)2×或4×SSC，50℃(低严格条件)，或
i)30到40％甲酰胺，2×或4×SSC，42℃(低严格条件)。
(2)洗涤步骤可选自例如以下条件：
a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，50℃。
b)0.1×SSC，65℃。
c)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃。
d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，42℃。
e)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃。
f)2×SSC，65℃(低严格条件)。
g)60℃下0.2X SSC，0.1％SDS(中-高严格条件)，或
h)60℃下0.1X SSC，0.1％SDS(中-高严格条件)，或
i)65℃下0.2X SSC，0.1％SDS(高严格条件)，或
j)65℃下0.1X SSC，0.1％SDS(高严格条件)。
来自其他生物的具有上述活性(例如赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的多肽或核酸分子可以由其他DNA分子编码，所述其他DNA分子在松弛的杂交条件下与表I第5列或第7列中所示分子杂交或者包含所示分子，并且在表达后编码下述肽或核酸，所述肽或核酸需要降低或缺失其活性来赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生。
优选地，多肽或多核苷酸具有下述蛋白质或核酸分子的其他生物活性，所述蛋白质或核酸分子分别包含表I、II或IV申请号1第5列或第7列中所示分子。
在Southern印迹实验中可例如使用松弛的杂交条件。
一些应用必须在低严格杂交条件下进行，而对杂交特异性无任何影响。例如，可以用本发明核酸分子检测总DNA的Southern印迹分析，并在低严格条件下洗涤(55℃下，2×SSPE、0.1％SDS)。杂交分析可仅显示出编码本发明多肽(例如具有上述活性)的基因的简单图谱。这些低严格杂交条件的另一实例是4×SSC，50℃，或者在42℃下用30至40％甲酰胺进行杂交。这些分子包括这样的分子的片段、类似物或衍生物：其为要在本发明方法中减少的核酸分子或者编码要在本发明方法中减少的多肽的的核酸分子，并且例如与上述氨基酸序列或所述(潜在的)核苷酸序列的差异在于例如单独或者组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、取代、添加和/或重组或本领域已知的任何其他修饰。
然而，优选使用高严格杂交条件。
杂交应有利地以至少5、10、15、20、25、30、35或40bp的片段进行，有利地为至少50、60、70或80bp，优选至少90、100或110bp。最优选至少15、20、25或30bp的片段。还优选至少100bp或200bp、更特别优选至少400bp长度的杂交。在一个特别优选的实施方案中，杂交应以上述条件用整个核酸序列进行。
术语“片段”、“序列片段”或“序列部分”表示所指代原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)的长度可广泛变化；最小尺寸是这样的序列，其大小足以为提供长度至少15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30bp的序列具有与本发明方法中使用的本文所述核酸分子的片段(例如要在本发明方法中降低其活性的核酸分子的片段)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，优选100％的同一性。所述截短序列的长度可如所述从15bp广泛变化到至多2kb或更多，有利地，所述序列具有15、20、25、30、35或40bp的最小长度，而最大尺寸则不是关键性的。可以使用100、200、300、400、500或更多个碱基对片段。在一些申请中，最大尺寸通常不大幅地大于提供核酸序列完整基因功能所需的尺寸。这类序列可有利地用于通过例如反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶等技术来阻抑、减少、降低或缺失在本发明方法中要减少的活性。
为了降低、减少或缺失下述核酸分子或多肽的活性，也可以使用公开的核酸序列的启动子区，所述核酸分子包含表I第5列或第7列中所示核酸分子，和/或所述多肽包含表II第5列或第7列中所示多肽或表IV第7列中所示共有序列或多肽基序。技术人员已知如何克隆所述启动子区域。
截短的氨基酸分子的长度一般为约5至约310个氨基酸。然而，更一般地，序列长度最高将约为250个氨基酸，优选最高约200或100个氨基酸。经常期望选择至少约10、12或15个氨基酸上至最高约20或25个氨基酸的序列。
术语“一个或多个氨基酸”指至少一个氨基酸，但不多于将导致同源性低于50％同一性的氨基酸数。优选地，同一性高于70％或80％，更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选96％、97％、98％或99％的同一性。
此外，本发明方法中使用的核酸分子包括作为上述核酸分子的核苷酸序列之一或其部分之互补体的核酸分子。与表I申请号1第5列或第7列中所示核苷酸序列或包含所述序列的核酸分子之一互补的核酸分子是这样的核酸分子，其与所述核苷酸序列充分互补，以使其能与所述核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。
优选地，所述杂交在严格杂交条件下进行。然而，本文所述序列之一的互补体优选是根据本领域技术人员熟知的核酸分子碱基配对与其互补的序列。例如，碱基A和G分别与碱基T以及U或C碱基配对，反之亦然。对碱基的修饰可能影响碱基配对的配偶体。
要在本发明方法中降低其活性的核酸分子(尤其是本发明的核酸分子)包含下述核苷酸序列，和/或具有表II申请号1第5列中相同行中所述蛋白质的活性，或是具有编码所述蛋白质的核酸分子的活性，所述核苷酸序列与包含表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子或其部分的核苷酸序列至少约30％、35％、40％或45％，优选至少约50％、55％、60％或65％，更优选至少约70％、80％或90％，甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更高同源性。
要在本发明方法中降低其活性的核酸分子(例如本发明的核酸分子)包含与表I第5列或第7列中所示核苷酸序列之一或其部分杂交，优选在本文定义的严格条件下杂交的核苷酸序列，并编码具有上述活性的蛋白质，例如在其活性(以及例如蛋白质的活性)被降低或缺失后赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
另外，在本发明方法中降低其活性的核酸分子，尤其是本发明的核酸分子可仅包含表I申请号1第5列或第7列中所示序列之一的编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片段，或编码要在本发明中减少的核酸分子或多肽的生物活性部分的片段，或编码在本发明方法中减少其活性的核酸分子或多肽的非活性部分的片段，但是如果其表达或活性被降低或缺失时赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量生产。
在克隆编码要在本发明方法中降低其活性的分子的基因时测定的核苷酸序列允许产生下述探针和引物，所述探针和引物被设计为用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆其同源物。所述探针/引物一般包含基本纯化的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列的区域，其在严格条件下与公开的用于本发明方法中(例如包含表I的5列或第7列中所示分子)的序列之一的有义链、所述序列之一的反义序列或其天然存在的变体的至少约12、15个、优选至少约20或25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸的引物可用于PCR反应中来克隆要根据本发明方法降低其活性的核酸分子的同源物，例如如本发明实施例中所述的引物对，例如表III第7列中所示引物，其5’末端不以核苷酸ATA开始。所述核酸分子，其为要在本发明方法中降低其活性的核酸分子的同源物，或是本发明核酸分子自身，可以被用于降低、减少或缺失要根据本发明方法降低的活性。
引物组可互换。本领域技术人员了解组合所述引物来产生期望的产物，例如全长克隆或部分序列。基于本发明方法中所用核酸分子的探针可用于检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。探针还可包含附着于其上的标记基团，例如所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这些探针可作为基因组标志物试剂盒的一部分，用于鉴定含有或表达，或不含有或表达要在本发明方法中降低其活性的核酸分子的细胞，例如通过测量细胞样品中编码核酸分子的水平(例如检测mRNA水平)，或者用于确定包含多核苷酸序列的基因组基因是否已突变或缺失。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子，优选本发明的多核苷酸，编码包含下述氨基酸序列的多肽或其部分，所述氨基酸序列与表II申请号1第5列或第7列中所示氨基酸序列充分同源，或者与包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽充分同源。
本文使用的术语“充分同源”指多肽或其部分具有这样的氨基酸序列，其包括与要在本发明方法中减少其活性的多肽的氨基酸序列相比尽可能少的相同或等同氨基酸残基(例如具有与被比较氨基酸相似的侧链的氨基酸残基)数，特别地，所述多肽与包含表II或IV第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽或其功能等同物充分同源。
上述氨基酸序列的部分为至少3、5、10、20、30、40、50或更多个氨基酸长。
在一个实施方案中，用于本发明方法中的核酸分子包括编码在本发明方法中减少其活性的多肽(例如，表II A或B申请号1第5或7列所示多肽或其同源物)的至少一部分的核酸分子。
在另一实施方案中，要在本发明方法中减少其活性的多肽(特别是本发明的多肽)与表II申请号1第5或7列所示多肽的完整氨基酸序列或者包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽具有至少约30％、35％、40％、45％或50％、优选至少约55％、60％、65％或70％、更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％、最优选至少约95％、97％、98％、99％或更高的同源性，并且具有上文所述活性，例如在减少、抑制或缺失其活性后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比优选提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
蛋白质的部分优选以这种方式具有生物活性，即它们在减少、抑制、降低或缺失其活性后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如提高的氮利用效率和/或提高的生物量产生。
本文提到的术语“生物活性部分”旨在包括这样的部分，例如结构域/基序或表位，其通过将所述部分或编码多核苷酸引入生物或其部分(特别是细胞)中而显示出与其表II或IV第5或7列所示同源物相同的活性。
在一个实施方案中，如果能对本文所述敲除突变体进行回补，则多肽的部分具有作为其同源物的如表II申请号1第5或7列所示多肽的活性，
本发明还涉及核酸分子，其由于遗传密码的简并性而可产生自表II申请号1第5或7列所示多肽，或产生自包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽，并且因此编码要在本发明方法中减少的多肽，特别是通过减少、抑制、降低或缺失其活性而导致与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或提高的生物量产生。
有利地，在本发明方法中减少其活性的核酸分子包含或具有编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包含或具有表II或IV申请号1第5或7列所示氨基酸分子、共有序列或多肽基序，并与表II A申请号1第5或7列所示氨基酸分子的序列存在差异，优选存在至少一个或多个氨基酸的差异。
上文所述核酸分子(例如由于遗传密码的简并性而可产生自所述多肽序列的核酸分子)可用于产生用于本发明方法中的核酸分子，例如反义分子、tRNA、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶分子或病毒核酸分子，或者如本文所述的其它抑制性或降低活性的分子，例如用于抑制、降低或缺失用于本文所述本发明方法中的多肽或核酸分子的活性。
此外，本领域技术人员会认识到，在种群中可存在导致氨基酸序列变化的DNA序列多态性。这些基因(例如编码本发明多肽或包含本发明核酸分子)中的遗传多态性可由于自然变异而存在于种群中的个体中。
本文使用的术语“基因”和“重组基因”指包含编码包含在本发明方法中减少其活性之多肽的多肽的开放读码框的核酸分子，或者编码在本发明方法中减少其活性的多肽分子的核酸分子。例如，所述基因包含开放读码框，所述开放读码框编码包含表II或IV第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽(如本发明多肽)，或者编码包含表I第5或7列所示多核苷酸的核酸分子(如本发明核酸分子)，并且优选地来自作物植物。
基因还可以是所述基因的自然变异。
这些自然变异通常在本发明方法所用基因的核苷酸序列中导致1-5％的变异。
对应于包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸之核酸分子(如本发明核酸分子，也可以是cDNA)的天然变体同源物的核酸分子可基于其与本文所述核酸分子的同源性，使用如表I申请号1第5或7列所示核酸分子(如本发明核酸分子)或其片段作为杂交探针，在严格杂交条件下根据标准杂交技术来分离。
因此，在另一实施方案中，要在本发明方法中减少其活性的核酸分子(例如本发明核酸分子)的长度至少为15、20、25或30个核苷酸。优选地，其在严格杂交条件下与包含本发明核酸分子之核苷酸序列(例如包含表I申请号1第5或7列所示序列)的核酸分子杂交。所述核酸分子的长度优选至少为20、30、50、100、250或更多个核苷酸。
术语“在严格条件下杂交”如上文所定义。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”旨在描述杂交和洗涤条件，在所述条件下彼此具有至少30％、40％、50％或65％同一性的核苷酸序列通常保持彼此杂交。优选地，所述条件使得彼此具有至少约70％、更优选至少约75％或80％、甚至更优选至少约85％、90％或95％或更高同一性的核苷酸序列通常保持彼此杂交。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子在严格条件下与表I B申请号1第7列序列杂交，并对应于天然核酸分子。本文使用的术语“天然”核酸分子指具有在自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白)。优选地，该核酸分子编码在减少、降低或缺失其表达或活性后赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或生物量产生的天然蛋白。
除了种群中可存在的核酸或蛋白序列天然变体以外，本领域技术人员还会认识到，所述改变可通过突变引入编码多肽的核酸分子的核苷酸序列中，由此导致所编码多肽的氨基酸序列发生改变，并由此改变多肽的功能能力，优选为所述活性的减少、降低或缺失。例如可以在要在本发明方法中减少的核酸分子(例如，包含表I申请号1第5或7列所示的相应核酸分子)的序列中产生导致“必需”氨基酸残基处发生氨基酸取代的核苷酸取代。“必需”氨基酸是如果在多肽之一的野生型序列中发生改变则会改变所述多肽的活性的残基，而“非必需”氨基酸残基不是蛋白质的活性(例如酶活性)所必需的。“必需”氨基酸的改变经常导致多肽的活性减少、降低或缺失。优选地，以减少、降低或缺失活性的方式改变多肽的氨基酸，是指优选改变必需氨基酸残基和/或较不必需的氨基酸残基并由此减少活性，从而在降低所述多肽的表达或活性后导致上文所述与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或提高的生物量产生。然而，其他氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守或仅半保守的)对活性可能不是必需的，因此很可能可以进行改变而不改变所述活性，因此较不优选。
本发明的另一实施方案涉及在种群中(例如天然或人工产生的种群中)具体检索或选择赋予活性减少、抑制或缺失的核酸序列中的改变。由于分析过程很复杂，因此在种群中检索与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或提高的生物量产生经常是复杂且昂贵的。因此，有利的是，在所述种群中检索赋予表达产物活性的减少、抑制或缺失的核酸序列改变，由此鉴定带来与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比期望的产量的增加，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或生物量产生提高的候选。下调会导致期望性状的天然基因的一个典型实例是mlo基因座(Pifanelli等，Nature 430(7002)，887(2004))。带有Mlo基因座无功能等位变体(mlo)的大麦植物对所有已知的分布广泛的白粉病真菌隔离群都有抗性。迄今为止从天然生境中回收的惟一mlo抗性等位基因(mlo-11)最初获得自Ethiopian landraces，现在在大多数栽培欧洲春大麦良种中控制霉菌抗性。因此，可以检索导致期望的核酸分子功能减少、抑制、缺失或降低的天然等位基因，并可通过杂交和标记辅助的选择或相关方法将这些等位基因引入具有农业重要性的作物品种中。
此外，本领域技术人员了解，生物之间的密码子使用可以不同。因此，他们可使本发明核酸分子的密码子使用适应于表达所述多核苷酸或多肽的生物的使用，使得核酸分子或编码蛋白的表达更有可能降低。
因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子的同源核酸分子，所述多肽在被减少、降低、抑制或缺失后在植物或其部分中具有上述活性，所述多肽在其活性所必需的氨基酸残基中含有改变，因此减少、降低、抑制或缺失其活性。
这些多肽的氨基酸序列与表II申请号1第5或7列所示序列或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的序列不同，并赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，如氮利用效率和/或生物量产生的提高。该核酸分子可包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与如表II申请号1第5或7列所示或包含表IV第7列所示共有序列或多肽基序的氨基酸序列具有至少约50％同一性，并能在降低其表达或其生物功能后参与与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比产量的增加，例如产量相关性状，如氮利用效率和/或生物量产生的提高。
优选地，该核酸分子所编码的蛋白质与表II申请号1第5或7列所示序列或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的序列具有至少60％、70％或80％的同一性，更优选与表II申请号1第5或7列所示序列之一或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的序列具有至少约85％同一性，甚至更优选与表II申请号1第5或7列所示序列或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％同源性，最优选与表II申请号1第5或7列所示序列或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的序列具有至少约96％、97％、98％或99％同一性。
为了测定(例如表II第7列的)两条氨基酸序列或(例如表I第5列的)两条核酸分子之间的百分比同源性(＝同一性)，将序列一个写在另一个下方用于最佳比较。可以向蛋白质或核酸分子的序列中插入缺口，以产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对。接着在两个多聚体之间比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。如果一个序列中的位置被与另一序列中相应位置上相同的氨基酸残基或相同的核苷酸占据，则所述分子在此位置上是相同的。本文中使用的氨基酸或核苷酸“同一性”对应于氨基酸或核酸“同源性”。通常，两条序列间的百分比同源性是所述序列共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。因此，术语“同源性”和“同一性”对本说明书而言应认为是同义的。
为了确定两个或更多个氨基酸序列或者两个或更多个核苷酸序列之间的百分比同源性(＝同一性)，已经开发了若干计算机软件程序。两个或更多个序列的同一性可以使用例如fasta软件来计算，该软件目前使用的版本是fasta3(Pearson W.R.和Lipman D.J.，PNAS 85，2444(1988)；Pearson W.R.，Methods in Enzymology 183，63(1990))。另一种可用于计算不同序列间同源性的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件中(Biomax，Munich，Federal Republic of Germany)。遗憾的是，这有时产生非最优的结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。尽管如此，该程序非常高效，可用于比较大量序列。一般在这样的序列比较中使用以下设置：-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i检索文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认＝10.0；-m 比对视图选项：0＝配对；1＝查询固定，显示名称；2＝查询固定，无名称；3＝平查询固定，显示名称；4＝平查询固定，无名称；5＝查询固定，无名称，平末端；6＝平查询固定，无名称，平末端；7＝XML Blast输出；8＝列表；9有注解行的表[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]可选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(DUST使用blastn，SEG使用其他)[字符串]；默认＝T；-G打开缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E延伸缺口的消耗(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X X缺口比对的降低值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，其他均为15[整数]；默认＝0；-I Show GI′s in deflines[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅用于blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配奖分(仅用于blastn)[整数]；默认＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值，0为默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g进行缺口比对(tblastx不提供)[T/F]；默认＝T；-Q使用的查询遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数[整数]；默认＝1；-O序列比对文件[File Out]可选；-J相信查询defline[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字号，0为默认(blastn 11，megablast 28，其他均为3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-K区域中保留的最佳命中数(默认关闭，如果使用则推荐值为100)[整数]；默认＝0；-P多个命中使用0，单个命中使用1[整数]；默认＝0；-Y检索空间有效长度(实际大小使用0)[实数]；默认＝0；-S针对数据库检索的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为都是，1为上，2为下[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l将数据库检索限制在GI列表[字符串]可选；-U使用FASTA序列的小写过滤[T/F]可选；默认＝F；-y无缺口延伸的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn 20，megablast 10，其他均为7[实数]；默认＝0.0；-Z最终缺口比对的X降低值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，其他均为25[整数]；默认＝0；-RPSI-TBLASTN checkpoint file[File In]可选；-n MegaBlast search[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多重命中的窗口大小，0为默认(blastn/megablast 0，其他均为40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(blastx使用OOF算法)[整数]；默认＝0；-t tblastn中用于连接HSP的最大允许内含子长度(0不进行连接)[整数]；默认＝0。
使用Needleman和Wunsch或者Smith或Waterman的算法得到了高质量的结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等，CABIOS 5，151(1989))或优选使用“Gap”和“Needle”程序来进行，它们都基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))，还有“BestFit”，它基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))，“Needle”是The European MolecularBiology Open Software Suite(EMBOSS)的一部分(Trends in Genetics 16(6)，276(2000))。因此，优选地，在完整序列范围内使用“Gap”或“Needle”程序进行用于确定序列同源性百分比的计算。对“Needle”使用以下标准调整用于核酸序列比较：矩阵：EDNAFULL，缺口罚分：10.0，延伸罚分：0.5。对“Gap”使用以下标准调整用于核酸序列比较：缺口权重：50，长度权重：3，评价匹配：10.000，评价错配：0.000。
例如，在核酸水平上与SEQ ID NO：27具有80％同源性的序列应理解为在以上述参数通过上述程序“Needle”与序列SEQ ID NO：27比较后具有80％的同源性。
两多肽间的同源性应理解为完整序列长度上在每条链上氨基酸序列的同一性，通过借助上述程序“Needle”进行比较来计算，其中使用矩阵：EBLOSUM62，缺口罚分：8.0，延伸罚分：2.0。
例如，在蛋白质水平上与序列SEQ ID NO：28具有80％同源性的序列应理解为用以上述参数设置通过上述程序“Needle”与序列SEQ ID NO：28比较后具有80％的同源性。
通过取代、插入或缺失而来自于根据本发明的表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽之一的功能等同物与根据本发明的表II申请号1第5列或第7列中所示多肽之一或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且其特征是与表II申请号1第5列和第7列中所示多肽、优选拟南芥的多肽具有基本相同的特性。
通过取代、插入或缺失而来自于根据本发明的表I申请号1第5列或第7列中所示核酸序列的功能等同物与根据本发明的表I申请号1第5列或第7列中所示核酸之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％，优选至少55％、60％、65％或70％，优选至少80％，特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，非常特别优选至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码与表II申请号1第5列中所示多肽具有基本相同的特性的多肽。
功能等同物的“基本相同的特性”首先应理解为指该功能等同物具有上述活性，例如当降低生物(例如植物或植物组织、植物细胞或其部分)中所述功能等同物的蛋白质的量、活性或功能时赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比增加的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生的提高。
可以这样产生编码本文所示蛋白质序列同源物的核酸分子：向包含如表I第5列或第7列所示核酸分子的核酸分子的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而向所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)向序列(例如表I第5列或第7列中所示序列)中引入突变。
优选地，在一个或多个预测的非必需或优选必需氨基酸残基处产生非保守性氨基酸取代，从而降低、减少或缺失各自蛋白质的活性。“保守性氨基酸取代”是这样的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括带有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
因此，本发明方法所用多肽或本发明多肽中预测的必需氨基酸残基优选被来自另一家族的另一氨基酸残基取代。或者，在另一实施方案中，可在编码本发明方法中所用多肽的核酸分子的编码序列或本发明多核苷酸的全部或部分中随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，并可在所得突变体中筛选本文所述活性，以鉴定下述突变体，所述突变体丧失或具有降低的活性，并赋予与相应的(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在诱变表I第5列或第7列的序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并可使用例如本文所述的测定法来测定蛋白质的活性。
通过用相应多肽序列进行BlastP数据库检索发现了与本文所示用于本发明方法的核酸分子基本同源的多核苷酸，其示于表I第5列。发现的表I第5列所示核酸分子的同源序列的SEQ ID NO示于表I第7列相应的同一行中。发现的表II第5列所示蛋白质分子的同源序列的SEQ ID NO示于表II第7列相应的同一行中。
使用BlastP工具，使用表I第5列所示核酸分子的蛋白质序列来检索蛋白质数据库。根据其与检索蛋白序列的相似性人工选择同源蛋白质序列。在多数情况下，对应于所选蛋白质序列的核苷酸序列显示在蛋白质数据库条目的表头部分，如果有的话，就使用它们。如果蛋白数据库条目不提供与相应核苷酸数据库条目的直接交叉索引，则使用序列检索程序TblastN从同一生物中检索编码完全相同的蛋白(100％同一性)的核苷酸数据库条目。TblastN中的预计值设置为0.001，使用blosum62矩阵，所有其他参数均以默认设置使用。
此外，使用对表II第5或7列所示蛋白序列定义的蛋白质模式来检索蛋白质数据库。将显示表IV第7列所示全部蛋白质模式的蛋白质序列与表II第5或7列同一行所示蛋白质序列比对，如果观察到显著相似性，则选择其作为同源蛋白质。
所用的具有或衍生自表I申请号1第5或7列所示序列的核酸序列的同源物，或者衍生自表II申请号1第5或7列所示序列或衍生自包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的核酸序列的同源物还包括等位变体，其与所示核苷酸序列或上述衍生的核酸序列或其同源物、衍生物或类似物或部分之一具有至少约30％、35％、40％或45％同源性、优选至少约50％、60％或70％、更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
等位基因变体特别地包括功能性变体，其可通过在所示序列或本发明方法中所用序列(优选表I申请号1第5或7列所示)或其衍生核酸序列中进行核苷酸缺失、插入或取代来获得。
然而，在一个实施方案中，所合成蛋白质的酶活性或活性有利地丧失或降低，例如通过突变本文所述序列或通过应用方法来减少或抑制或降低本文所述生物活性来实现。
在本发明一个实施方案中，用于本发明方法中的核酸分子或者本发明的核酸分子包含表I申请号1第5或7列所示序列或其互补序列。可以优选的是，如表I申请号1第5或7列所示核酸分子的同源物与表I申请号1第5或7列所示序列或其互补序列相比包含尽可能少的其他核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个另外或其他核苷酸。在另一个实施方案中，所述核酸包含少于30、20或10个另外或其他核苷酸。在一个实施方案中，用于本发明方法中的核酸分子与表I申请号1第5或7列所示序列或其互补序列相同。
还优选本发明方法中使用的核酸分子编码下述多肽，所述多肽包含表II或IV申请号1的第5或7列中所示序列、共有序列或多肽基序。在一个实施方案中，核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个另外或其他的氨基酸。在又一个实施方案中，所编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个另外或其他的氨基酸。在本发明方法中使用的一个实施方案中，编码的多肽与表II第5或7列中所示序列相同。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子(其编码包含如表II或IV申请号1的第5或7列中所示序列、共有序列或多肽基序的多肽)包含少于100个与表I申请号1的第5或7列中所示序列不同的另外或其他的核苷酸。在又一个实施方案中，所述核酸分子包含少于30个与表I申请号1第5或7列所示序列不同的另外或其他核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸分子与表I申请号1第5或7列所示序列的编码序列相同。
表I申请号1第5或7列所示序列的同源物，或者衍生自来自表I申请号1第5或7列所示序列的序列的同源物，或衍生自包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序之序列的同源物，还指编码及非编码DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。表I申请号1第5或7列所示序列或者衍生自表II申请号1第5或7列所示序列的序列或衍生自包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序之序列的同源物，还应理解成指包含非编码区(如UTR、终止子、增强子或启动子变体)的衍生物。
所述核苷酸序列上游或下游的调节序列可通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，然而，优选干扰启动子、开放读码框(＝ORF)的功能或活性，或者干扰3’调节区(如终止子或距离ORF很远的其他3’调节区)。还可以通过修饰其序列或其调节来降低启动子的活性，或者用活性较低的启动子完全取代它们，由此减少或缺失所表达核酸序列的活性，甚至是来自异源生物的启动子也可以使用。合适的启动子为本领域技术人员所知，并描述于下文。修饰调节区在完全消除本发明核酸的表达有不良副作用(例如生长或产量下降)的情况下可特别有利。本领域技术人员能够以这样的方式修饰本发明核酸的调节区，即使得所述减少足以获得与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，如提高的养分利用效率(如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，而不具有不想要的副作用。在这种情况下，以表达减少以空间或时间方式发生的方式修饰调节区可能是更有利的。例如，可以仅在成熟状态的植物中抑制、下调或阻抑本发明核酸或多肽，以获得期望的与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率(如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，而不干扰该生物的生长或成熟。还有其他方法可调节本发明基因的启动子，例如修饰反式作用因子的活性，所述反式作用因子是指能与启动子结合并影响其活性的天然或人工的转录因子。此外，还可以通过修饰参与目的启动子调节的上游信号组分(如受体或激酶)来影响目的启动子。
在另一实施方案中，本发明方法包括以下步骤：
(a)选择生物或其部分，其表达在本发明方法中减少其活性的多肽或核酸分子，例如包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽，或者包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子的核酸分子；
(b)对所选生物或其部分进行诱变；
(c)将诱变的生物或其部分中所述多肽或核酸分子的活性或表达水平与所选生物或其部分中所述多肽的活性或表达进行比较；
(d)选择诱变的生物或其部分，其与所选生物或其部分相比包含活性或表达水平降低的所述多肽；
(e)任选地，培养并栽培所述生物或其部分；和
(f)测试所述生物或其部分与相应的(例如未经转化的)野生型植物(如未诱变的来源或原始品系)相比是否具有提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率(如增强的氮利用效率)和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
有利地，所选生物根据本发明进行诱变。根据本发明，诱变是生物基因组中遗传信息的任何改变，这是指生物的核酸(优选DNA)中不是由正常分离或基因重组过程导致的任何结构或组成的改变。这些突变可以自发发生，或者可以通过本文所述的诱变剂诱导。这些改变可以随机或选择性地诱导。在两种情况下，生物的遗传信息均被改变。总体而言，这导致细胞内或生物内相关基因的基因产物的活性被减少或抑制的情况。
对于特异性诱变(或称为定点诱变)的情况，诱变独特的基因，并由此抑制、减少、降低或缺失其活性和/或所编码基因产物的活性。对于随机应变的情况，随机诱变一个或多个基因，其活性和/或其基因产物的活性被抑制、减少、降低或缺失，优选被降低或缺失。尽管如此，可以通过本领域技术人员所知的多种方法来选择目的基因中的突变。
为了进行生物的大种群诱变，可使用可用于抑制生物中尽可能多的基因(优选全部基因)的DNA群或DNA库或构建体或元件转化这些群。用这种方法，可以通过整合有利地鉴定的DNA片段来统计学地诱变生物的几乎全部基因。其后，本领域技术人员可以容易地鉴定敲除事件。对于植物的诱变，优选EMS、T-DNA和/或转座子诱变。
对于随机诱变的情况，用诱变剂处理大量生物。以统计学上几乎诱变每个基因的方式选择所述诱变剂的量和处理强度。随机诱变的方法以及相应试剂为本领域技术人员公知。这些方法描述于例如van Harten A.M.(，“Mutation breeding：theory and practical applications”，CambridgeUniversity Press，Cambridge，UK(1998)]，Friedberg E.，Walker G.，SiedeW.(“DNA Repair and Mutagenesis”，Blackwell Publishing(1995)]，或者Sankaranarayanan K.，Gentile J.M.，Ferguson L.R.(“Protocols inMutagenesis，Elsevier Health Sciences(2000))。如本领域技术人员所知，生物细胞中的自发突变率极低，有多种化学、物理或生物试剂可用于生物的诱变。这些试剂称为致变物或诱变剂。如上文所述，有三种不同类型的诱变剂可用：化学、物理或生物试剂。
有不同类别的化学诱变剂，可通过其作用模式来分类。例如，碱基类似物例如5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤。其他化学诱变剂与DNA相互作用，例如硫酸、亚硝酸、羟胺，或者其他烷化剂，例如单功能试剂如甲磺酸乙酯(＝EMS)、硫酸二甲酯、甲磺酸甲酯；双功能试剂如二氯乙基硫化物、丝裂霉素、亚硝基胍-二烷基亚硝胺、N-亚硝基胍衍生物、N-烷基-N-硝基-N-亚硝基胍、嵌入染料如吖啶、溴化乙锭。
物理诱变剂为例如电离照射(X射线)、UV照射。有不同形式的照射可用，它们是强诱变剂。可分为两大类照射：a)非电离照射，如UV光；或者电离照射，如X射线。生物诱变剂为例如转座元件如IS元件，如IS100、转座子如Tn5、Tn10、Tn903、Tn916或Tn1000，或者噬菌体如Muamplac、P1、T5、λplac等。将这种噬菌体DNA引入适当微生物的方法为本领域技术人员公知(参阅如Microbiology，第三版，Davis B.D.，Dulbecco R.，EisenH.N.和Ginsberg H.S.编辑，Harper International Edition，1980)。转座子诱变的常用方法是在基因内部或例如在启动子或终止子区附近插入转座元件，由此导致基因功能丧失。在生物基因组内部定位转座子的方法为本领域技术人员公知。对于植物中的转座子诱变，本领域技术人员已知玉米转座子系统Activator-Dissociation(Ac/Ds)和Enhancer-Supressor mutator(En/Spm)，但也可以类似地使用其他转座子系统。可通过不同的可用于植物转化的标准技术将转座子引入植物基因组中。植物中的另一类生物诱变包括T-DNA诱变，这是指T-DNA序列随机整合到植物基因组中(Feldmann K.A.，Plant J.1，71(1991))。然后可以通过PCR或其他高通量技术寻找突变了目的基因的事件(Krysan等，Plant Cell 11，2283(1999))。
生物方法描述于Spee等(Nucleic Acids Research，21(3)，777(1993)).Spee等教导了使用dITP进行随机诱变的PCR方法。Spee等描述的该方法被Rellos等进一步改进(Protein Expr.Purif.5，270(1994))。用于分子诱变的体外重组技术的用途描述于Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，10747(1994))。Moore等(Nature Biotechnology 14，458(1996))描述了将PCR与重组法相结合，用于提高酯酶对对硝基苄基酯的酶活性。对酶进行诱变的另一方法描述于Greener等，出自Methods in Molecular Biology(57，375(1996))。Greener等使用特定的大肠杆菌菌株XL1-Red来产生具有提高的抗生素抗性的大肠杆菌突变体。
优选地，使用化学或生物方法进行生物的诱变。优选的化学方法是用N-甲基-N-硝基-亚硝基胍进行诱变。
其他方法为例如借助病毒(例如噬菌体，如P1、P22、T2、T3、T5、T7、Muamplac、Mu、Mu1、MuX、miniMu、λ、λplac)或插入元件(如IS3、IS 100、IS900等)引入突变。同样，细菌的整个基因组被随机诱变。突变体易于鉴定。
破坏本发明方法所用核酸序列并由此减少、降低或缺失所编码多肽活性的另一方法可通过与本文所述本发明的发生少量改变的核酸序列发生同源重组来实现，所述核酸序列用于本发明的方法，例如衍生自表I第5或7列所示序列。例如，用于本发明方法的核酸序列可因此通过一个或多个点突变、缺失、插入或倒位而被改变。在本发明的另一实施方案中，编码本发明蛋白质的基因的一个或多个调节区(如启动子、阻抑物、UTR、增强子或诱导物)可被改变(例如通过缺失、截短、倒位、插入或点突变)，以使相应基因的表达被调节(即减少、降低或缺失)。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA、或蛋白质结合因子、负显性突变体，或者本发明的抗体或用于本发明重组的核酸分子，特别是用于同源重组的以下核酸分子，其包含选自以下的核酸分子的至少15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、70、100、200、300、500、1000、2000或更多个核苷酸的片段：
(a)编码表II申请号1第5或7列(优选表IIB申请号1)所示或含有表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽的多核苷酸；
(b)表I申请号1第5或7列(优选表I B申请号1)所示核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并性而衍生自表II申请号1第5或7列(优选表IIB申请号1)所示多肽序列；
(d)核酸分子，其与包含表I申请号1第5或7列(优选表I B申请号1)所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的同一性；
(e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)、(b)或(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％、优选至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性，并具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的核酸分子，所述多肽可借助于针对(a)、(b)、(c)、(d)或(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有表II申请号1第5或7列所示蛋白质的活性；
(g)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序；
(h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有表II申请号1第5列所示蛋白质的活性；
(i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过用表III申请号1第7列所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得(其中所述引物不从核苷酸5’端的ATA开始)；
(j)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过对(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而产生；和
(k)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，其具有与(a)至(d)所表征核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt、500nt、750nt或1000nt，并且所述核酸分子具有表II申请号1第5列所示蛋白质活性的多肽；
或者包含与其互补的序列；
其中所述反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或核酶核酸分子与表I A申请号1第5或7列所示序列存在至少1、5、10、20、50、100或更多个核苷酸的差异。
在一个优选的实施方案中，本文使用的术语“用于本发明方法中的核酸分子”指所述核酸分子，其表达赋予选自以下的活性的减少、抑制或缺失：At1g74730-蛋白、At3g63270-蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和/或含有SET结构域的蛋白。
在一个更优选的实施方案中，本文使用的术语“用于本发明方法中的核酸分子”指所述核酸分子，其表达赋予包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子的核酸分子之活性或包含表II或IV申请号1第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽之活性的减少、抑制或缺失。
在一个更优选的实施方案中，术语“用于本发明方法中的核酸分子”指本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子，负显性突变体，或者抗体的核酸分子或用于本发明重组的核酸分子，特别是用于产生同源重组事件的核酸分子。
用于本发明方法中的核酸序列有利地被引入核酸构建体(优选表达盒)中，其允许减少、抑制生物(特别是植物或微生物)中的该核酸分子。
因此，本发明涉及核酸构建体，优选表达构建体，其包含与一个或多个调节元件或信号功能性连接的用于本发明方法中的核酸分子或其片段。此外，本发明还涉及用于产生同源重组事件的核酸构建体，其包含用于本发明方法中的核酸分子或其部分。
如本文所述，所述核酸构建体还可包含要引入生物或细胞中的其他基因。可以(并且有利)向宿主生物中引入并表达调节基因，如诱导物、阻抑物或酶的基因，其由于其酶活性而与生物合成途径中一种或多种基因的调节相关。这些基因可以为异源或同源来源。此外，还可以有利地存在其他生物合成基因，或者这些基因可以位于一个或多个其他核酸构建体中。
如本文所述，调节序列或因子可优选对所引入构建体的表达有正影响，因此提高其表达。因此，调节元件的增强可有利的通过使用强转录信号(如启动子和/或增强子)而在转录水平发生。然而，此外也可以增强翻译，例如提高RNA稳定性。另一方面，要在本发明方法中减少的本文所述核酸分子及其基因产物被减少、降低或缺失，以与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增强产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生的提高。
原则上，核酸构建体可包含本文所述的调节序列，以及用于减少要在本发明方法中减少的核酸分子表达和用于表达构建体中其他基因的其他序列。
因此，本发明的构建体可用作表达盒，因此可直接引入植物中，或者它们可以引入载体中。因此，在一个实施方案中，所述核酸构建体是表达盒，其包含微生物启动子或微生物终止子，或者两者都包含。在另一实施方案中，所述表达盒包含植物启动子或植物终止子，或者两者都包含。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
在细胞或生物或其部分(特别是植物或植物细胞)中
(a)引入核酸构建体，其包含要在本发明方法中使用的核酸分子，例如其编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子，负显性突变体，或者本发明的抗体或用于重组的核酸分子，特别是用于同源重组的核酸分子。
(b)引入其表达提高(a)的表达的核酸分子，包括调节序列或因子；
(c)在细胞或生物或其部分(优选植物或植物细胞)中通过(a)或(b)中提及的核酸构建体和核酸分子抑制、减少或缺失要在本发明方法中减少的活性。
在引入和表达核酸构建体之后，有利地培养转基因生物或细胞，其后收获。所述转基因生物或细胞可以是真核生物，例如植物、植物细胞、植物组织，优选作物植物或其部分。
为了向核酸构建体中引入用于减少或抑制包含表I申请号1第5或7列所示核酸分子的多核苷酸或基因或其同源物或者所述多核苷酸的基因产物的核酸分子，例如其编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子，负显性突变体，或者本发明的抗体或用于重组的核酸分子，特别是用于同源重组的核酸分子或诱变的核酸序列，例如作为导致减少相应基因之活性和/或表达的表达盒的一部分，有利地以本领域技术人员已知的方式对编码基因区段或非翻译区进行扩增和连接反应。优选遵循与Pfu DNA聚合酶或Pfu/Taq DNA聚合酶混合物的方案相似的操作。根据待扩增序列选择引物。本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑构建体或病毒降解构建体，或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子的构建体，负显性突变体，或者本发明的抗体的构建体或用于重组(特别是用于同源重组)的构建体的具体克隆为本领域技术人员所知。合适的克隆载体为本领域技术人员公知(Cloning Vectors(PouwelsP.H.等编辑Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444904018))，并已公开，例如Earley等，Plant J.45(4)，616(2006)；Lu等，Nucleic Acids Res.32(21)，e171(2004)；Tao和Xhou，Plant J.38(5)，850(2004)；Miki和Shimamoto Plant Cell Physiol.45(4)，490(2004)；Akashi等，Methods Mol Biol.252，533(2004)；Wesley等，Plant J.27(6，：581(2001))。
具体地，它们包括能在易于操作的克隆系统(如基于细菌、酵母或昆虫细胞的系统(如杆状病毒表达系统))中复制的载体，也就是说，特别是确保在大肠杆菌中有效克隆以及可稳定转化植物的载体。具体地，必须提到的载体是适于T-DNA介导的转化的多种二元及共整合载体系统。这些载体系统的特征是它们至少含有vir基因(它是农杆菌介导的转化所需的)和T-DNA边界序列。
一般地，载体系统优选还包含顺式调节区，例如启动子和终止子和/或选择标记，通过后者可以鉴定合适地转化的生物。尽管在共整合载体系统的情况中vir基因和T-DNA序列位于同一载体上，但二元载体是基于至少两种载体，其中之一带有vir基因但没有T-DNA，另一种带有T-DNA，但没有vir基因。由于这一事实，最后提到的载体相对小，易于操作并能在大肠杆菌和农杆菌中复制。这些二元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。优选用于本发明的是Bin19、pBI101、pBinAR、pSun、pGPTV和pCAMBIA。二元载体及其用途的概况描述于Hellens等，Trends in Plant Science 5，446(2000)。
为了制备构建体，可以首先使用限制性内切核酸酶将载体线性化，然后以合适的方式酶促修饰。其后，纯化载体，并将等分试样用于克隆步骤中。在克隆步骤中，使用连接酶将经酶切并在必要时纯化的扩增产物与类似制备的载体片段克隆在一起。或者，可以通过本领域技术人员所知的不依赖于克隆的重组或连接步骤制备构建体。一般地，特定的核酸构建体或载体或质粒构建体可具有一个或多个核酸片段。这些构建体中的核酸片段优选与调节序列有效连接。调节序列具体包括植物序列，如上述启动子和终止子。构建体可有利地在选择条件下在微生物(特别是大肠杆菌和/或根癌农杆菌)中稳定增殖，并可将异源DNA转移到植物或其他生物中。根据一个具体的实施方案，所述构建体是基于二元载体(二元载体的概述：Hellens等，2000)。一般地，它们含有原核调节序列，如复制起点和选择标记，用于在微生物(如大肠杆菌和根癌农杆菌)中扩增。载体还可含有用于将DNA转移进植物基因组的农杆菌T-DNA序列，或者用于转移进其他真核生物(如酵母属物种)的真核调节序列，或者用于转移进其他原核生物细胞(如棒杆菌属或杆菌属物种)的原核调节序列。为了转化植物需要全部农杆菌T-DNA序列的至少右边界序列，其包含约25碱基对。通常，本发明的植物转化载体同时含有来自右边界和左边界的T-DNA序列，其包含位点特异性作用酶的识别位点，所述酶依次由一些vir基因编码。不同类型的抑制构建体(如反义、共阻抑、RNAi、miRNA等)需要本文所述的不同克隆策略。
有利地，本发明优选的是植物宿主生物。优选的植物选自以下科：槭树科(Aceraceae)、漆树科、伞形科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科(Boraginaceae)、十字花科、凤梨科、仙人掌科、番木瓜科、石竹科、大麻科、旋花科、藜科、胡颓子科、牻牛儿苗科、禾本科(Gramineae)、胡桃科、樟科、豆科(Leguminosae)、亚麻科、葫芦科、莎草科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、鸢尾科、百合科、兰科、牻牛儿苗科、Labiaceae、木兰科、毛茛科、Carifolaceae、茜草科、玄参科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯芯草科、禾本科(Poaceae)、多年生草本、饲用作物、蔬菜和观赏植物。
特别优选的是选自以下的植物：伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。特别有利的是作物植物。因此，有利的植物优选属于花生属、油菜、芸苔、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏仁、鳄梨、月桂、南瓜、亚麻子、大豆、阿月混子、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱和黍、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、甘蓝、茄子和多年生草本以及饲料植物、油棕榈、蔬菜(芸苔、食根蔬菜、食块茎蔬菜、食荚果蔬菜、结果蔬菜、洋葱蔬菜、叶菜和茎菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、巢菜、扁豆、苜蓿、四季豆、羽扇豆、三叶草和紫花苜蓿。
在本发明的一个实施方案中，宿主植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
其他优选的植物如上文所述。
为了通过向植物中引入用于本发明方法中的核酸分子来减少或抑制本发明基因产物的活性，有利地首先将例如分离的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子或者共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子或者重组核酸分子或诱变核酸序列转移进中间宿主，例如细菌或真核单细胞。已经显示大肠杆菌转化可用于这种情况，其可通过已知方式(例如热激或电穿孔)进行。
随后用核酸构建体(任选经过验证)转化植物。为此，可能需要首先从中间宿主获得构建体。例如，可以通过与常规质粒分离相似的方法从细菌宿主中获得作为质粒的构建体。
植物中的基因沉默可有利地通过瞬时转化技术来实现，即核酸优选不整合进植物基因组。用于瞬时植物转化的合适系统为例如基于农杆菌和基于植物病毒的系统。基于病毒的瞬时系统的详细内容及其用于植物基因沉默的用途描述于Lu等Methods 30(4)，296(2003)。农杆菌用于植物核酸瞬时表达的用途描述于例如Fuentes等，Biotechnol Appl Biochem.online：doi：10.1042/BA20030192(2003Nov 21))。
已知大量用于植物转化的方法。由于根据本发明，异源DNA稳定整合进植物基因组是有利的，因此T-DNA介导的转化已证明特别适用。为此，首先需要用包含待转化核酸分子(例如适合本发明方法的核酸分子，例如如本文公开的核酸分子，例如分离的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子或者共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子或者重组核酸分子或其他能够减少或抑制表II第5或7列或表I第5或7列所示基因产物的表达的多核苷酸或其同源物)的基因区段或相应质粒构建体转化合适的载体，特别是农杆菌。
这可以已知的方式进行。例如，根据上文详述产生的所述本发明核酸构建体或所述表达载体或所述质粒构建体可通过电穿孔或热激转化到感受态农杆菌中。原则上，必须将一方面共整合载体的形成与二元载体的转化区分开。在前一种情况下，包含用于本发明方法中的编码基因区段或核酸分子的的构建体不含有T-DNA序列，而是通过构建体与T-DNA的同源重组在农杆菌中形成共整合载体或构建体。T-DNA以Ti或Ri质粒(其中异源DNA便利地取代了癌基因)的形式存在于农杆菌中。如果使用二元载体，可通过细菌接合或直接转移将其转移到农杆菌中。这些农杆菌便利地含有带有vir基因的质粒(目前称为辅助Ti(Ri)质粒)。
此外，稳定转化质体在一些情况下可能是有利的，因为质体在多数作物中母系遗传，减少或消除了转基因通过花粉流出的风险。叶绿体基因组的转化方法一般通过概述于Klaus等，Nature Biotechnology 22(2)，225(2004)的方法来实现。质体转化对于抑制本发明的质体编码核酸来说特别有利。
简言之，将待转化序列与选择标记一起克隆，该标记序列位于与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导位点特异性整合进质体系中。已经对许多不同植物物种描述了质体转化，概述可见Bock等(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J.Mol.Biol.312(3)，425(2001)或Maliga，P，Trends Biotechnol.21，20(2003)。近期报道了无标记质体转化体形式的生物技术进展，其可通过瞬时共整合标记基因来产生，Klaus等，Nature Biotechnology 22(2)，225(2004)。
还可以将一种或多种标记与核酸构建体或载体一起使用，并且如果将转化植物或植物，则与T-DNA一起使用，由此可以分离或选择经转化的生物，例如农杆菌或经转化的植物细胞。这些标记基因允许通过一系列不同原理鉴定成功转移的本发明核酸分子，例如通过借助于荧光、发光或人眼可见波长的光进行目测鉴定，通过对除草剂或抗生素的抗性，通过已知的营养标记(营养缺陷标记)或抗营养标记，通过酶测定或通过植物激素。可以提到的这些标记的实例为GFP(＝绿色荧光蛋白)；萤光素/萤光素酶系统、β-半乳糖苷酶及其显色底物例如X-Gal，除草剂抗性，例如对咪唑啉酮、草甘膦、膦丝菌素或磺酰脲的抗性，抗生素抗性，例如对博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性，仅提及一小部分，营养标记如利用甘露糖或木糖，或者抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖或D-氨基酸的抗性(Erikson等，Nature Biotech 22(4)，455(2004)。该列表只是可能的标记中的一小部分。本领域技术人员非常熟悉这些标记。根据生物和所选方法优选不同的标记。
一般地，期望植物核酸构建体在基因区段的一侧或两侧侧翼为T-DNA。这在使用根癌农杆菌或发根农杆菌菌株用于转化时特别有用。本发明优选的方法是借助于根癌农杆菌进行转化。然而，也可以有利地将生物射弹法在本发明方法中用于引入序列，也可以通过PEG引入。转化农杆菌可以以已知的方式培养，并这样可用于植物转化。待转化的植物或植物部分以惯常的方式培养或提供。其后使转化的农杆菌作用于植物或植物部分，直至达到足够的转化率。可用多种形式使农杆菌作用于植物或植物部分作用。例如，可以使用形态发生植物细胞或组织的培养物。在T-DNA转移后，一般通过抗生素清除细菌，并诱导植物组织再生。具体地，这使用合适的植物激素以便首先诱导愈伤组织形成然后促进苗发育来实现。
外来基因转移至植物基因组内称作转化。其中，用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.16，735(1998))。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。其他有利的转化方法(特别是用于植物的)为本领域技术人员所知，并在下文描述。
其他有利的合适的方法是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取进行的原生质体转化、使用基因枪进行的“生物射弹”法(称为微粒轰击法)、电穿孔、干胚在DNA溶液中温育、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如Jenes B.等，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，Kung S.D和Wu R.编辑，AcademicPress(1993)128-143以及Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205(1991)。优选将待表达的核酸或构建体克隆进适用于转化根癌农杆菌的载体(例如pBin19)中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12，8711(1984))。转化有这些载体的农杆菌接着可以已知方式用于转化植物，特别是作物植物，例如烟草植物，例如通过将擦伤或剪断的叶浸泡在农杆菌溶液中，接着在合适的培养基中培养它们。通过根癌农杆菌进行的植物转化描述于例如
和Willmitzer，Nucl.Acid Res.16，9877(1988)，或者可从WhiteF.F.，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；出自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung S.D.和Wu R.编辑，AcademicPress，1993，15-38页等中获知。
上述核酸分子可以与其他基因组合克隆到本发明的核酸构建体或载体中，或者可通过将若干核酸构建体或载体(包括质粒)将不同的基因转化进宿主细胞(有利地为植物细胞)。
在一个实施方案中，在本发明方法中，用于本发明方法中的核酸序列可以有利地与一种或多种调节信号有效连接，以提高基因表达，例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者本发明的编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子，负显性突变体，或者抗体。
这些调节序列旨在允许核酸分子(例如基因或基因片段)或基因产物或用于本发明方法中的核酸特异性表达。根据宿主生物(例如植物还是微生物)，这可以指例如基因或基因片段或抑制构建体仅在诱导后表达和/或过表达，或者组成型表达和/或过表达。这些调节序列为例如与诱导物或阻抑物结合的序列以及这样调节核酸表达的序列。
此外，基因构建体还可以有利地包含一个或多个与启动子有效连接的已知的增强子序列，它们使得核酸序列的表达提高。还可以在DNA序列的3’端插入额外的有利序列，例如其他调节元件或终止子。
编码本发明蛋白质的核酸分子和编码其他多肽的核酸分子可以存在于一个核酸构建体或载体中，或者存在于多个中。在一个实施方案中，核酸构建体或载体中仅存在用于本发明方法中的核酸分子或其编码基因的一个拷贝。可以在宿主生物中一起表达若干载体或核酸构建体或载体。本发明的核酸分子或核酸构建体或载体可以插入载体中，并在细胞中以游离形式存在。如果优选稳定转化，则使用这样的载体，其在多个世代中稳定复制，或者所述载体或其部分插入基因组中。对于植物的情况，可以整合进质体基因组或者特别地整合进核基因组中。为了将多个构建体插入宿主基因组中，待表达的构建体可以存在于一个载体中，例如上述带有多个构建体的载体。
一般地，用于构建体表达率的调节序列(如抑制构建体，如RNAi、miRNA、反义、共阻抑构建体)位于待调节核酸分子的上游(5’)、中间和/或下游(3’)。它们具体控制转录和/或翻译和/或转录物的稳定性。表达水平取决于与其他细胞调节系统(如细胞的蛋白质生物合成和降解系统)的结合。
调节序列包括转录和翻译调节序列或信号，例如具体参与调节转录或翻译起始的位于上游(5’)的序列，例如启动子或起始密码子，以及具体参与调节转录或翻译终止及转录物稳定性的位于下游(3’)的序列，例如多腺苷酸化信号或终止密码子。调节序列还可以存在于转录的编码区中以及转录的非编码区中，例如内含子中，例如剪接位点。
原则上，用于调节细胞中本发明核酸分子的表达并可使用的启动子为所有在替代内源启动子后能够减少该核酸分子转录的那些，或者是可以刺激转录抑制性构建体的那些，例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA，共阻抑分子或者核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子，负显性突变体，或者抗体的构建体。在这些生物中有功能的合适启动子为本领域公知。它们可以为组成型或诱导型启动子的形式。合适的启动子可允许在多细胞真核生物中发育和/或组织特异性表达，因此可以有利地在植物中使用叶、根、花、种子、气孔、块茎或果实特异性启动子。
原则上，可以将天然启动子及其调节序列(如上文所述)用于本发明方法中。还可以有利地使用合成启动子(额外地使用或单独使用)，特别是在它们介导种子特异性表达的情况下，如WO 99/16890所述。
可能期望单独表达用于本发明方法中的核酸分子，或者与其他基因或核酸一起表达。根据要实现的目标，可以通过同时转化多个合适的核酸构建体(即表达构建体)或优选地通过将若干表达盒组合在一个构建体上而引入多个抑制或表达有利的其他基因的核酸分子。还可以转化多个载体，其中每种情况下多个表达盒逐步进入受者生物中。
如上文所述，除了待表达核酸分子或者所引入基因的引入以外的基因转录可以通过所引入生物合成基因3’端(终止密码子之后)合适的终止子来实现。可用于该目的的终止子为例如OCS1终止子、nos3终止子或35S终止子。像启动子一样，可以对每个基因使用不同的终止子序列。可用于微生物的终止子为例如fimA终止子、txn终止子或trp终止子。这些终止子可以是ρ依赖性的或ρ非依赖性的。
在用于减少表I第5或7列所示核酸分子或其本文所述同源物的构建体中可以有利地使用不同的植物启动子，例如USP、LegB4、DC3启动子或者来自欧芹的泛素启动子或者其他本文提到的启动子和不同的终止子。其他可用的植物启动子为例如玉米泛素启动子、ScBV(甘蔗杆状病毒)启动子、来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890所述那些(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因的启动子，稻的谷蛋白基因的启动子、稻的水稻素基因的启动子、稻的谷醇溶蛋白基因的启动子、小麦的麦醇溶蛋白基因的启动子、小麦的谷蛋白基因的启动子、玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子、燕麦的谷蛋白基因的启动子、高粱的kasirin基因的启动子、黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。
为确保用于本发明方法中的核酸分子与其他生物合成基因在多个世代中稳定整合进转基因植物中，用于该方法的每个编码区可以在其自身的(优选单一的)启动子控制下表达。
核酸构建体有利地以这种方式构建，即启动子之后是用于插入待表达核酸的合适的剪切位点，有利地在多聚接头中，其后适当地为多聚接头之后的终止子。适当时，这一顺序可以重复若干次，以将多个基因组合在一个构建体中，从而可引入转基因植物中进行表达。例如，这一顺序可重复至多3次。为进行表达，通过合适的剪切位点插入核酸序列，例如插入启动子后的多聚接头中。有利的是，每个核酸分子具有其自身的启动子，并且适当时有其自身的终止子，如上文所述。然而也可以在启动子之后(并适当地在终止子之前)插入多个核酸序列，特别是如果宿主或靶细胞中可以进行多顺反子转录的情况。在这种情况下，核酸构建体中的插入位点或所插入核酸分子的顺序不是决定性的，也就是说，核酸分子可以插入盒中的第一个位置或最后一个位置，而不对其表达有显著影响。然而，也可以在构建体中仅使用一个启动子类型。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的核酸构建体在植物中赋予包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子或所编码基因产物(例如，如表II申请号1第5或7列所示或者包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序的多肽)或本文所述其同源物和任选地其它基因的减少或抑制，并包含一个或多个植物调节元件。所述本发明核酸构建体有利地包括植物启动子或植物终止子或者植物启动子和植物终止子。它还编码例如本发明的分离的核酸分子，其编码反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA或核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者本发明的编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA、或蛋白质结合因子、负显性突变体，或者抗体或用于本发明重组的核酸分子。
“植物”启动子包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。
“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用本文中描述的核酸构建体或者载体所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。
适于植物表达的核酸构建体优选包含能控制基因在植物细胞中表达的调节元件，并有效连接以使得每一序列都能完成其功能。因此，核酸构建体还可包含转录终止子。转录终止子的实例是多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌T-DNA中的那些，例如Ti质粒pTiACH5的基因3，其称为章鱼碱合酶(Gielen等，EMBO J.3，835(1984)以及下列等等)或其功能等同物，但在植物中具有功能活性的所有其他终止子都是合适的。
如果使用适于植物表达的核酸构建体来表达多肽，其优选还含有其它有效连接的调节元件，如翻译增强子，例如超驱动序列，其包含烟草花叶病毒5’非翻译前导序列，其提高蛋白质/RNA的比(Gallie等，Nucl.AcidsResearch 15，8693(1987))。
为在植物中进行表达，如上文所述，核酸分子必须与合适的启动子有效连接或者包含启动子，其以细胞或组织特异性方式在正确的时间点表达例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA、或蛋白质结合因子、负显性突变体或者抗体。可用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBO J.8，2195(1989))，例如来自植物病毒的那些，如35SCAMV(Franck等，Cell 21，285(1980))、19S CaMV(还参见US 5,352,605和WO 84/02913)、34S FMV(Sanger等，Plant.Mol.Biol.，14，433(1990))、欧芹泛素启动子，或者植物启动子如Rubisco小亚基启动子，描述于US4,962,028，或者植物启动子PRP1(Ward等，Plant.Mol.Biol.22，361(1993))、SSU、PGEL1、OCS[Leisner，Proc Natl Acad Sci USA 85(5)，2553(1988))、lib4、usp、mas[Comai，Plant Mol Biol 15(3)，373(1990))、STLS1、ScBV(Schenk，Plant Mol Biol 39(6)，1221(1999))、B33、SAD1或SAD2(亚麻启动子，Jain等，Crop Science，39(6)，1696(1999))或nos[Shaw等，Nucleic Acids Res.12(20)，7831(1984))。稳定地组成型表达本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA、或蛋白质结合因子、负显性突变体或者抗体可能是有利的。然而，用于减少可用于本发明方法中的核酸分子的核酸分子的诱导型表达是有利的，如果在收获之前进行晚期表达是有利的话，因为代谢操作可能导致植物生长迟缓。
用于减少可用于本发明方法的核酸分子的核酸分子的表达还可以如上文所述用化学诱导型启动子来实现(综述见Gatz，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48，89(1997))。化学诱导型启动子在期望以时间特异性方式表达基因的时候特别有利。这些启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)和脱落酸诱导型启动子(EP 335528)、四环素诱导型启动子(Gatz等Plant J.2，397(1992))、环己醇或乙醇诱导型启动子(WO 93/21334)或本文所述其他启动子。
其他合适的启动子是与生物或非生物性协胁迫条件反应的启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22，361(1993))、番茄的热诱导hsp80启动子(US 5,187,267)、马铃薯的寒冷诱导α淀粉酶启动子(WO 96/12814)或者创伤诱导pinII启动子(EP-A-0 375 091)或本文所述其他启动子。
优选的启动子特别是在组织和器官中、在种子细胞中(如胚乳细胞和发育中的胚的细胞)产生基因表达的那些。
合适的启动子为油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆的USP启动子(Baeumlein等，Mol Gen Genet，225(3)，459(1991))、拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔的Bce4启动子(WO 91/13980)、豆arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，Plant Journal，2(2)，233(1992))，以及在单子叶植物(如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等)中带来种子特异性表达的启动子。有利的种子特异性启动子是蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)、菜豆蛋白启动子和油菜籽蛋白启动子。必须考虑的合适的启动子为大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)，以及WO 99/16890所述启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因的启动子，稻的谷蛋白基因的启动子、稻的水稻素基因的启动子、稻的谷醇溶蛋白基因的启动子、小麦的麦醇溶蛋白基因的启动子、小麦的谷蛋白基因的启动子、玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子、燕麦的谷蛋白基因的启动子、高粱的kasirin基因的启动子、黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他合适的启动子为Amy32b、Amy 6-6和Aleurain(US 5,677,474]、Bce4(油菜)(US 5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)(EP 571 741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)(JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)(WO 98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油菜)(US 5,689,040]或α淀粉酶(大麦)(EP 781 849]。可用于表达基因(如用于本发明方法中的核酸分子)特别是用于减少要在本发明方法中减少其活性的核酸分子的其他启动子为植物的叶特异性启动子，如DE-A 19644478所述，或者光调节启动子，如豌豆petE启动子。
其他合适的植物启动子为胞质FBP酶启动子或者马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，2445(1989))、大豆磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶启动子(GenBank登记号U87999)或者EP-A-0 249 676所述结节特异性启动子。
可用于具体情况下的其他启动子是产生质体特异性表达的那些。合适的启动子例如是病毒RNA聚合酶启动子，如WO 95/16783和WO 97/06250所述，以及拟南芥clpP启动子，如WO 99/46394所述。
除了上述若干病毒和细菌启动子以外，用于在尽可能多的组织中(特别是在叶中)强表达异源序列(如用于本发明方法中的核酸分子)、特别是用于减少要在本发明方法中减少其活性的核酸分子的其他启动子优选为植物肌动蛋白或泛素基因启动子，例如稻肌动蛋白1启动子。组成型植物启动子的其他实例为甜菜V-ATP酶启动子(WO 01/14572)。合成的组成型启动子的实例是Super启动子(WO 95/14098)和来自G盒的启动子(WO 94/12015)。适当时，也可以使用化学诱导启动子，比较EP-A 388186、EP-A 335528、WO 97/06268。
本发明的另一实施方案是核酸构建体，其赋予表达例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子，或者本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或者编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA、或蛋白质结合因子、负显性突变体或者抗体，适当地在植物中表达。
优选的受者植物如上文所述，特别是可以适当方式转化的植物。它们包括单子叶植物和双子叶植物。具体地，必须提到的植物是农业植物，例如谷类和草本，例如小麦属物种、玉米、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦、黑麦、稻(Oryza sativa)、御谷(Pennisetum glaucum)、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、黑小麦(Triticale)、Agrostis spp、Cenchrus ciliaris、Dactylisglomerata、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、黑麦草属物种、苜蓿属物种和甘蔗属物种(Saccharum spp.)；豆类和油料作物，例如芥菜(Brassicajuncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、落花生(Arachishypogaea，)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、向日葵(Helianthus annuus)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、白芥(Sinapis alba)、Trifolium repens和Vicianarbonensis；蔬菜和水果，如香蕉、葡萄、番茄(Lycopersicon esculentum)、芦笋、卷心菜、西瓜、猕猴桃、马铃薯(Solanum tuberosum)、甜菜(Betavulgaris)、木薯和菊苣；树，如咖啡、柑桔属物种、桉属物种、云杉属物种、松属物种和杨属物种；药用植物和树木以及花。
本发明的一个实施方案还涉及产生载体的方法，其包括向载体中插入本文表征的核酸分子、本发明的核酸分子或本发明的表达盒。例如，所述载体可以引入细胞中，例如微生物或植物细胞，如本文对核酸构建体所述，或者下文在转化和转染以及实施例中所述。可以瞬时或稳定转化宿主或靶细胞，然而，优选稳定转化。
本发明的载体优选为适于在植物中减少、抑制、降低或缺失本发明多肽的载体。因此，该方法可包括将调节信号(特别是介导植物中减少、介导或缺失的信号)整合进载体中的一个或多个步骤。
因此，本发明还涉及载体，其包含本文表征的作为适于植物表达的核酸构建体的一部分的核酸分子或者本发明的核酸分子。
在本发明方法中使用的一种有利的载体(例如本发明的载体)包含下述核酸分子，其编码在本发明方法中使用的核酸分子，或适用于在上文所述包含可用于本发明方法的核酸分子的植物中表达的核酸构建体。
因此，在本发明方法中有利地使用的重组表达载体包含在本发明方法中使用的核酸分子或根据本发明的核酸构建体，其形式适用于阻抑包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子或表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或其同源物的活性，和/或同时在宿主细胞中表达额外的基因，所述基因由根据本发明的或本文所述的核酸分子伴随。因此，重组表达载体包含一个或多个与要表达的核酸序列有效连接的调节信号，所述调节信号以要用于表达的宿主细胞为基础选择。
根据本发明，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其表示其中可以连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可以将额外的DNA区段连接至病毒的基因组内。某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它优选的载体是在导入宿主细胞后完全或者部分整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与它们有效连接的基因表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。如上所述，它们能够自主复制或者可部分或全部整合进宿主基因组中。适用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明还意图包含发挥类似功能的表达载体的其它形式，如病毒载体。术语载体还包括本领域技术人员已知的其他载体，如噬菌体，病毒如SV40、CMV、TMV，转座子，IS元件，噬粒，噬菌粒，粘粒，和线性或环状DNA。
在重组表达载体中，“有效连接”表示目的核酸分子与调节序列以基因可能表达的方式连接：它们以两条序列满足指定给所述序列的预定功能的方式彼此连接(例如在体外转录/翻译系统中，或在将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。
术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel：Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中，或参阅Gruber和Crosby，Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnolgy，CRC Press，Boca Raton，Florida，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，包括其参考文献。调节序列包括控制核苷酸序列在许多宿主细胞类型中组成型表达的调节序列以及控制核苷酸序列仅在特定宿主细胞类型或在特定条件下表达的调节序列。本领域技术人员已知，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的蛋白质量降低程度等因素。调节序列的优选的选择如上文所述例如为启动子、终止子、增强子等等。术语调节序列应当被认为包括在术语调节信号中。上文描述了若干有利的调节序列，尤其是启动子和终止子。通常，被描述为对适用于表达的核酸构建体而言有利的调节序列也适用于载体。
使用的重组表达载体可以特别针对本发明中使用的核酸分子在原核和/或真核细胞中的表达而设计。这是有利的，因为考虑到简单性，载体构建的中间步骤常常在微生物中进行。例如，根据本发明的基因和其他基因可以在细菌细胞、昆虫细胞中(使用杆状病毒表达载体)表达，在酵母细胞和其他真菌细胞中表达(Romanos，Yeast 8，423(1992)；van den Hondel，(1991)，More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure，编著，第396-428页：Academic Press：San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.(1991)，Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.，等编著，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge)，使用如WO98/01572中所述载体并根据其中所述转化方法在藻类中表达(Falciatore等，Marine Biotechnology.1，(3)，239(1999))，优选在多细胞植物中表达(参阅Schmidt，R.和Willmitzer，L.，Plant Cell Rep.583(1988)；Plant MolecularBiology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，第71-119页(1993)；White F.F.，Transgenic Plants，Bd.1，Engineering andUtilization，Kung和Wu R.编著，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205(1991)，(和其中的参考文献))。合适的宿主细胞还在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中讨论。作为替代方式，可以例如使用T7启动子-调节序列和T7聚合酶，体外转录和翻译重组表达载体的序列。
在大部分情况下，可以使用包含组成型或诱导型启动子的载体，在原核生物中表达多核苷酸如RNA或多肽或蛋白质，所述启动子控制融合蛋白或非融合蛋白的表达。典型的融合表达载体尤其是pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith D.B.和Johnson，K.S.Gene 67，31(1988))、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖-E-结合蛋白或A蛋白与重组的靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其是pTrc(Amann等，Gene 69，301(1988))和pET 11d(Studier等，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体的靶基因表达以宿主RNA聚合酶对杂交的trp-lac融合启动子的转录为基础。来自pET 11d载体的靶基因表达以T7-gn10-lac融合启动子的转录为基础，所述转录由病毒RNA聚合酶(T7gn1)的共表达介导。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)定居的“Symbol”-原噬菌体提供，所述原噬菌体带有位于lacUV 5启动子转录控制下的T7gn1基因。
适用于原核生物的其他载体是技术人员已知的；这些载体例如是在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、”Symbol”gt11或pBdCI，在链霉菌属中是pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌属中是pUB110、pC194或pBD214，在棒状杆菌属(Corynebacterium)中是pSA77或pAJ667。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYeDesaturasec1(Baldari等，Embo J.6，229(1987))、pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell 30，933(1982))、pJRY88(Schultz等，Gene 54，113(1987))和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。用于构建适用于其他真菌(例如丝状真菌)的载体和方法包括在以下详细描述的那些：van den Hondel，C.A.M.J.J.((1991)，J.F.Peberdy编著，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge；或More Gene Manipulations in Fungi；J.W.Bennet & L.L.Lasure编著，第396-428页：Academic Press：San Diego。其他合适的酵母载体的例子是2“Symbol”M、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。
可以通过举例提到的其他载体是真菌中的pALS1、pIL2或pBB116或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。
作为一种替代方式，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达核酸序列。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒表达载体包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell Biol.3，2156(1983))和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology 170，31(1989))。
上述载体仅为可能适用的载体的小量综述。其他质粒是技术人员已知的，并且描述于例如Cloning Vectors(Pouwels，P.H.，等编著，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中。用于原核细胞和真核细胞的其他合适的表达体系参阅Sambrook J.，Fritsch E.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的第16章和17章。
因此，本发明的一个实施方案涉及包含用于本发明方法中的核酸分子或用于本发明方法中的核酸构建体的载体，例如本发明的核酸分子或核酸构建体包括经分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子或本发明的共阻抑核酸分子或病毒降解核酸分子，或编码本发明的针对基因、RNA或蛋白质的DNA、RNA或蛋白质结合因子、显性负突变体、或抗体或用于本发明重组的核酸分子，尤其是用于同源重组的核酸分子。所述载体可用于在生物(优选植物)中减少、抑制、降低或缺失本发明的多肽。有利地，所述核酸分子与用于在原核或真核、或原核和真核宿主中表达的调节序列有效连接。另外，适用于同源重组的载体也在本发明范围内。
因此，本发明的一个实施方案涉及下述宿主细胞，所述宿主细胞用可用于本发明方法的载体、尤其是根据本发明的载体或根据本发明的核酸分子或根据本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化。所述宿主细胞可以是微生物、非人动物细胞或植物细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明核酸分子编码的多肽，例如表I B申请号1第5列或第7列中所示核酸分子编码的多肽，这表示例如本发明还涉及表IIB申请号1第5列或第7列中所示多肽，所述多肽在降低或阻抑其表达或活性后赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量生产的提高。有利地，所述多肽或其片段，尤其是表位或半抗原(这些均包括在术语“本发明多肽”中)可用于生产或产生针对所述多肽的抗体。有利地，抗体使在本发明方法中降低其活性的多肽的活性失活或降低。
本发明还涉及用于生产根据本发明的多肽的方法，所述多肽在根据本发明的宿主细胞中表达，优选地在微生物、非人动物细胞或转基因植物细胞中表达。
在一个实施方案中，在用于生产多肽的方法中使用的核酸分子来自于所述微生物，优选地来自于所述原核或原生细胞，所述真核生物作为宿主细胞。在另一实施方案中，用来自原核生物或真菌或藻类或另一微生物但不来自植物的核酸，在所述植物细胞或植物中生产多肽。在另一实施方案中，用来自植物或藻类的核酸分子，在所述植物细胞或植物中生产多肽。
技术人员已知，尽管具有相同的编码序列，但是在不同生物中表达的蛋白质和DNA在许多方面和特性(例如甲基化、降解和翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、ADP-核糖基化、法尼基化、羧基化、硫酸化、泛素化等)中有差异。优选相应蛋白质的细胞表达控制相应地在控制内源蛋白质或另一真核蛋白质活性和表达的控制机制中有差异。在原核或真核生物中表达的蛋白质之间一种主要的差异在于糖基化量。例如在大肠杆菌中无糖基化的蛋白质。在酵母中表达的蛋白质在糖基化蛋白质中具有高甘露糖含量，而在植物中糖基化模式是复杂的。
本发明的多肽优选地通过重组DNA技术生产。例如，将编码蛋白质的核酸分子克隆进载体中(如上文所述)，将载体引入宿主细胞中(如上文所述)，并在宿主细胞中表达所述多肽。然后可通过适当的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术从细胞中分离所述多肽。作为重组表达的替代方式，可以使用标准肽合成技术，化学合成由包含表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽或其同源物，尤其是本发明的片段或肽。另外，可以例如使用下文所述本发明的抗体从细胞(例如内皮细胞)中分离下述天然多肽，所述天然多肽具有相同的结构，并优选赋予可在本发明方法中使用的蛋白质活性。可以利用可在本发明方法中使用的多肽或其片段(即本发明的多肽)，通过标准技术生产抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及具有下述活性的多肽，所述活性是包含表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽展示的活性，尤其是选自At1g74730-蛋白、At3g63270-蛋白、蛋白激酶、蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和/或含SET结构域的蛋白质的活性。在例如通过降低多肽的表达或比活性来降低或阻抑其细胞活性后，所述多肽优选赋予上述活性，尤其是赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量生产。在一个实施方案中，本发明涉及具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列由本发明的核酸分子编码，或者可以通过用于生产本发明多肽的方法获得。
在一个实施方案中，所述多肽与表II A或B申请号1第5列或第7列中所示序列的差异在于一个或多个氨基酸。在另一实施方案中，本发明的所述多肽不由表II A或B申请号1第5列或第7列中所示序列组成。在另一实施方案中，本发明的所述多肽与表II A或B申请号1第5列或第7列所示序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。
优选本发明多肽的序列与表II A或B申请号1第5列或第7列中所示序列的差异不大于氨基酸的80％或70％，优选不大于60％或50％，更优选不大于40％或30％，甚至更优选不大于20％或10％。在一个实施方案中，所述多肽与表II A或B申请号1第5列或第7列中所示序列差异在于多于5、6、7、8或9个氨基酸，优选多于10、15、20、25或30个氨基酸，甚至更优选多于40、50或60个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽来自于植物细胞。
优选多肽是分离的。“分离的”或“纯化的”蛋白质或核酸分子或其生物活性部分基本不含当通过重组DNA技术生产时的细胞材料，或当化学合成时的化学前体或其他化学品。
词组“基本不含细胞材料”包括下述多肽制品，其中蛋白质与从其中天然或重组地产生此蛋白质的细胞的细胞组分分开。在一个实施方案中，词组“基本不含细胞材料”包括下述制品，其具有少于约30％(干重)的“污染蛋白质”，更优选少于约20％的“污染蛋白质”，仍更优选少于约10％的“污染蛋白质”，最优选少于约5％的“污染蛋白质”。术语“污染蛋白质”是指并非本发明多肽的多肽。当重组产生本发明的多肽或其生物学活性部分时，它还优选地基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于约20％、更优选地少于约10％并且最优选地少于约5％。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括下述制品，其中本发明的多肽与参与合成此多肽的化学前体或其它化学品分开。词组“基本不含化学前体或其它化学品”包括下述制品，其具有少于大约30％(干重)的化学前体或与蛋白质不同的其他蛋白质或化学品，更优选地少于大约20％的化学前体或其他蛋白质或化学品、仍更优选地少于大约10％的化学前体或其他蛋白质或化学品，并且最优选地少于大约5％的化学前体或与本发明蛋白质不同的其他蛋白质或化学品。在优选的实施方案中，分离的蛋白质或其生物活性部分缺乏来自产生本发明多肽的相同生物的污染蛋白质。通常，这类蛋白质由重组技术生产。
本发明的多肽优选包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与表II申请号1第5列或第7列中所示氨基酸序列足够同源，或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序，使得所述蛋白质或其部分保持赋予本发明活性的能力。优选所述多肽具有与表II申请号1第5列或第7列中所示相同的氨基酸序列。
另外，本发明的多肽或要在本发明方法中降低其活性的多肽可具有由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与本发明的核酸分子的核苷酸序列杂交，优选在如上述严格条件下杂交。
因此，多肽具有由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子之一至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，优选至少约75％、80％、85％或90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或更多同源性。优选的多肽至少具有根据本发明和本文所述的活性之一。
一种优选的多肽在敲除突变体中适当地表达时补回所述敲除，例如下述多肽的失活或减少、阻抑或缺失，所述多肽包含表II申请号1第5列或第7列中所示多肽，或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序。在这种情况下，适当表达表示所述多肽以与敲除突变体中经失活、缺失或减少的多肽相似的质和量、并在相同的发育阶段、组织和区室中生产。本发明的一种优选的多肽包括由下述核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与表I申请号1第5列或第7列中所示核苷酸序列杂交，优选在严格条件下杂交，或者与其同源，如上文所述。
因此，如本文所详述的，要在本发明方法中降低其活性的多肽、例如本发明的多肽可由于天然变异或诱变而在氨基酸序列上与表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽的氨基酸序列不同。因此多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽的整个氨基酸序列至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％，优选至少约75％、80％、85％或90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或更高同源性。
为了比较氨基酸序列，可以使用与上述核酸序列相同的算法。使用Needleman和Wunsch或者Smith或Waterman的算法得到了高质量的结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等，CABIOS 5，151(1989))或优选使用“Gap”和“Needle”程序来进行，它们都基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))，还有“BestFit”，它基于Smith和Waterman的算法(Ady.Appl.Math.2；482(1981))。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))，“Needle”是The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(EMBOSS)的一部分(Trends in Genetics 16(6)，276(2000))。因此，优选地，在完整序列范围内使用“Gap”或“Needle”程序进行用于确定序列同源性百分比的计算。对“Needle”使用以下标准调整用于氨基酸序列比较：矩阵：EBLOSUM62，缺口罚分：8.0，延伸罚分：2.0。对“Gap”使用以下标准调整用于氨基酸序列比较：缺口权重：8，长度权重：2，平均匹配：2.912，平均错配：-2.003。
多肽的生物活性部分包括下述肽，所述肽包含来自于本文公开多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，例如它们包含如表II第5列或第7列中所示氨基酸序列，或表IV第7列中所示共有序列或多肽基序，或其同源蛋白质的氨基酸序列，与具有例如公开的所述蛋白质活性的全长蛋白质相比，或与具有公开的蛋白质活性或要在本文所述本发明方法中减少的多肽的活性的蛋白质同源的全长蛋白质相比，所述生物活性部分包含更少的氨基酸，并且其阻抑、减少或降低导致与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量生产的提高。
通常，生物(或免疫)活性部分，即肽，例如长度为例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽包含下述结构域或基序，所述结构域或基序至少具有本发明多肽的一种活性或表位。另外，可以通过重组技术制备其中缺失多肽其他区域的其他生物活性部分，并评价本文所述的一种或多种活性。
针对可用于本发明方法中的多肽、尤其是本发明多肽的，导致本文公开的活性提高或降低的任何诱变策略不旨在限制；这些策略的变化应当是本领域技术人员显而易见的。使用这类策略并结合本文公开的机制，可以使用本文公开的核酸分子和多肽产生表达仍然可用于本发明方法中的突变的核酸分子和/或多肽分子的植物或其部分。该期望的化合物可以是植物的任何天然产物，包括生物合成通路的最终产物和天然存在的代谢通路的中间产物，以及在所述细胞代谢中不天然存在、但是由本发明所述细胞生产的分子。
本发明还提供了嵌合蛋白或融合蛋白。
在本文中使用时，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与下述多肽有效连接的多肽，所述多肽在其表达或活性被降低时不赋予上述活性，尤其不赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，优选下述蛋白质(＝“多肽”)，其活性被降低时赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生。所述蛋白质优选地表示下述多肽或其同源物，所述多肽具有对应于本文公开的多肽的氨基酸序列，优选具有对应于表II申请号1第5列或第7列中所示多肽的氨基酸序列，或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序。
在融合蛋白中，术语“有效连接”旨在表示本文公开的多肽和其他多肽或其部分彼此融合，使得两条序列均满足针对所用序列提出的功能。另一多肽可以与例如要在本发明方法中降低其活性的多肽的N-端或C-端融合。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是GST融合蛋白，其中多肽的序列与GST序列的C-端融合。这类融合蛋白质可有助于本发明的重组多肽的纯化。
优选地，可以通过标准DNA技术生产本发明的嵌合蛋白或融合蛋白。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段框内连接在一起，例如通过使用用于连接的平末端或交错末端(stagger-ended termini)，提供适当末端的限制性酶消化，适当时粘末端的填平，碱性磷酸酶处理以避免不想要的接合，和酶连接来完成。可以通过常规技术，包括自动化DNA合成仪来合成融合基因。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述扩增得到两条连续基因片段之间的互补悬突，所述互补悬突随后可退火并再扩增得到嵌合基因序列(参阅例如Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley & Sons：1992)。另外，可商业获得许多已编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体。可以将核酸分子克隆进这样的表达载体中，使得融合部分与所编码的蛋白质框内连接。
另外，可以使用适当的计算机程序(Olszewski，Proteins 25，286(1996)；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11，675(1995))，对要根据本发明的方法减少或阻抑的蛋白质、例如本文公开的多肽的结构基序进行折叠模拟和计算机再设计。蛋白质折叠的计算机建模可用于详细的肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247，995(1995)；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376，37(1995))。可使用适当的程序，通过针对互补肽序列的计算机辅助搜索，来鉴定多肽及其底物或结合因子或其他相互作用蛋白质的相互作用位点，(Fassina，Immunomethods 114(1994))。设计蛋白质和肽的其他适当的计算机系统描述于现有技术中，例如描述于Berry，Biochem.Soc.Trans.22，1033(1994)；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501，1(1987)；Pabo，Biochemistry 25，5987(1986)中。从上述计算机分析获得的结果可用于例如蛋白质或其片段的肽模拟物的制备。蛋白质天然氨基酸序列的这类假肽类似物可非常有效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271，33218(1996))。例如，将容易获得的非手性Q-氨基酸残基整合进蛋白质或其片段中，导致用脂肪族链的聚甲烯单元取代酰胺键，从而提供了构建肽模拟物的便利策略(Banerjee，Biopolymers 39，769(1996))。
现有技术(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224，327(1996))中描述了其他体系中小肽激素的强效肽模拟物类似物。也可以通过连续酰胺烷基化合成肽模拟物组合文库并针对例如结合特性和免疫特性测试得到的化合物，来鉴定多肽的适当的肽模拟物。现有技术例如Ostresh，Methods in Enzymology 267，220(1996)和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4，709(1996)中描述了产生和使用肽模拟物组合文库的方法。
另外，可以使用蛋白质的三维和/或结晶结构来设计下述蛋白质活性的肽模拟物抑制子，所述蛋白质包含表II申请号1第5列或第7列所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或者多肽基序(Rose，Biochemistry 35，12933(1996)；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4，1545(1996))。
另外，可以使用本文所述蛋白质的三维和/或结晶结构和鉴定的相互作用位点及其底物或结合因子，来设计具有经调节的结合或回转活性的突变体。例如，可以对本发明多肽的活性中心建模，并调控参与催化反应的氨基酸残基，以提高或降低使多肽失活的底物结合。活性中心和涉及催化反应的氨基酸的鉴定有助于筛选具有提高或降低的活性的突变体。
本发明的一个实施方案还涉及与本文公开的多肽(即这类蛋白质的特异性片段或表位)特异性结合的抗体。
术语“表位”涉及抗原中的特异性免疫反应性位点，也称为抗原决定簇。这些表位可以是多聚组合物中单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性排列，或者包含更复杂的二级结构或三级结构或者由其组成。本领域技术人员会认识到，免疫原(即能引发免疫应答的物质)是抗原，但一些抗原(如半抗原)则不是免疫原，而是可能通过与载体分子偶联而具有免疫原性。术语“抗原”包括提及可针对其产生抗体和/或抗体对其具有特异免疫反应性的物质。
抗体优选赋予下述蛋白质或本文所述其同源物的减少、阻抑或缺失，所述蛋白质包含表II申请号1第5列或第7列中所示、优选表IIB申请号1中所示多肽，或者包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序，例如抗体由于在生物或其部分中的结合而使本发明的蛋白质失活。
本发明的抗体也可以用于鉴定和分离要根据本发明降低其活性的靶多肽。这类抗体也可在合适的宿主生物中表达，从而通过与表达产物结合导致例如其活性的空间干扰，来降低本文公开的基因产物的活性，所述基因产物例如是本文公开的多核苷酸或多肽，例如是包含表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子，例如是包含表II申请号1第5列或第7列中所示多肽的多肽。
这些抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。单克隆抗体可例如通过最初描述于
和Milstein，Nature 256，495(1975)和Galfr6，Meth.Enzymol.73，3(1981)中的技术制备，所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与来自经免疫的哺乳动物的脾细胞融合。
另外，可以通过使用例如描述于Harlow和Lane“Antibodies，ALaboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中的方法获得上述肽的抗体或其片段。这些抗体可用于例如根据本发明的蛋白质的免疫沉淀和免疫定位，以及用于例如重组生物中这类蛋白质合成的监测和用于鉴定与根据本发明的蛋白质相互作用的化合物。例如，可以使用如BlAcore系统中使用的表面等离子体共振来提高噬菌体抗体选择的效率，从结合本发明蛋白质表位的单个噬菌体抗体文库中得到亲和力的高度增加(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7，97(1996)；Malmborg，J.Immunol.Methods 183，7(1995))。在许多情况下，抗体与抗原的结合现象等同于其他配体/抗-配体结合。
本发明的另一个实施方案还涉及产生转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物的方法，所述方法包括向所述植物、植物细胞或植物组织中引入根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体、或根据本发明的核酸分子。
本发明的另一个实施方案还涉及瞬时产生转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物的方法，所述方法包括向所述植物、植物细胞或植物组织中引入根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体、本文表征为包含在本发明核酸构建体中的核酸分子、或在根据本发明的方法中使用的核酸分子，从而使被引入的核酸分子、核酸构建体和/或载体不被整合进宿主或宿主细胞的基因组中。因此，就引入的核酸分子、核酸构建体和/或载体而言，宿主的繁殖期间转化体是不稳定的。
在根据本发明的方法中，转基因生物也应理解为表示(如果采取植物的形式)培养的植物细胞，植物组织，植物器官例如根、苗、茎、种子、花、块茎或叶，或完整植物。
“培养”应当理解为表示例如在营养培养基上或营养培养基中培养转基因植物细胞、植物组织或植物器官，或在基质上或基质中(例如例如在水培培养基、装盆堆肥中，在大田土壤上或在其各自N缺乏类似物上)培养完整植物。
在所述方法的另一个有利的实施方案中，可以在来自高等植物(例如种子植物例如作物)的植物细胞中表达核酸分子。植物表达载体的实例包括Becker D.(Plant Mol.Biol.20，1195(1992))以及Bevan M.W.，(Nucl.Acids Res.12，8711(1984)；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；出自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页)中详细描述的那些。二元载体及其用途的综述也参阅Hellens R.((Trends in Plant Science 5(10)，446(2000))。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入细胞。术语“转化”和“转染”包括接合和转导，在本文中使用时旨在包括用于将外来核酸分子(例如DNA)引入宿主细胞中的多种现有技术方法，包括磷酸钙共沉淀或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、PEG-介导的转染、脂质转染法、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可参阅Sambrook等(MolecularCloning：A Laboratory Manual.，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他实验室手册如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，Gartland和Davey编著，Humana Press，Totowa，New Jersey。
用于转化和从植物组织或植物细胞再生植物的上述方法被用于植物的瞬时或稳定转化。合适的方法是通过以下转化原生质体：聚乙二醇诱导的DNA摄入，使用基因枪的生物射弹(已知为微粒轰击方法)，电穿孔，在含DNA的溶液中孵育干胚，显微注射和农杆菌介导的基因转移。上述方法描述于例如Jenes B.，Techniques for Gene Transfer，出自TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung S.D.和Wu R.编著，Academic Press(1993)128-143和Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42，205(1991)中。优选将要表达的构建体克隆进适合转化根瘤农杆菌的载体例如pBin19中(Bevan，Nucl.Acids Res.12，8711(1984))。然后可以已知的方式使用用这类载体转化的农杆菌来转化植物，尤其是作物植物，如例如烟草植物，例如通过将有划痕的叶或叶段浸入农杆菌溶液中，随后在合适的培养基中培养来进行转化。用根瘤农杆菌对植物的转化例如由和Willmitzer，Nucl.Acid Res.16，9877(1988)转化，或者尤其从White F.F.，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；出自Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Kung S.D.和Wu R.编著，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
为了选择成功转移了核酸分子、载体或核酸构建体的宿主生物，使用上文已详细描述的标记基因是有利的。已知对于将核酸稳定或瞬时整合进植物细胞中而言仅有少数细胞摄取外来DNA并且在需要时将其整合进基因组中，这取决于使用的表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码可选择标记(如上文所述之，例如对抗生素的抗性)的基因连同目的基因一起引入宿主细胞。植物中优选的可选择标记包括赋予除草剂(如草甘膦或草丁膦(gluphosinate))抗性的可选择标记。其他合适的标记是例如下述标记，其编码例如糖或氨基酸生物合成通路中涉及的基因，如β-半乳糖苷酶、ura 3或ilv 2。编码例如萤光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样是适合的。这些标记和前述标记可以在突变体中使用，在该突变体中这些基因由于例如常规方法所致的缺失而无功能。此外，编码选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码所述方法中使用的核酸分子的核酸分子在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸分子稳定转染的细胞可以通过例如选择进行鉴定(例如整合了选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。
因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中通常就不再需要或不希望有标记基因，特别是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸或核酸构建体，而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。随后可通过进行杂交从经转化的植物中去除标记基因。在一个优选的实施方案中，使用允许阳性和阴性两种选择的条件性标记，从而首先通过阳性选择鉴定转化事件，随后通过阴性选择来鉴定已通过杂交或分离丢失标记的株系。赋予针对D-氨基酸抗性的标记是优选的条件性标记(Erikson等，Nature Biotech 22(4)，455(2004))。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则已经成功发生转化时通过表达重组酶而去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，22255(2000)；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，553(2000))。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
也可以本身已知的方式，使用经本发明表达载体转化的农杆菌用于植物的转化，所述植物例如实验植物如拟南芥，或作物植物，例如谷物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、西红柿、胡萝卜、柿子椒(bell pepper)、油菜、树薯(tapioca)、木薯(cassava)、arrow root、万寿菊、苜蓿、莴苣和多种树木、坚果、棉花和葡萄藤物种，尤其是含油作物植物如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜、椰子、油棕、红花(Carthamustinctorius)或可可豆，所述转化例如通过将有划痕的叶或叶段浸入农杆菌溶液中，随后在合适培养基中培养来完成。
除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的(Feldman K.A.和Marks M.D.，Mol GenGenet 208，274(1987)；Feldmann K.，in Koncz C.，Chua N-H.和Shell J.，编著，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页(1992))。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座中心中的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang，Plant J.5，551(1994)；Katavic，Mol Gen Genet 245，363(1994))。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194(1993)]，而在“花浸染”法的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育(Clough S.J.，und Bent A.F.The Plant J.16，735(1998))。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。遗传修饰的植物细胞可以通过技术人员熟悉的所有方法加以再生。合适的方法可以在Kung S.D.和Wu R.，Potrykus或
和Willmitzer的前述出版物中找到。
因此，本发明还涉及包含本发明核酸构建体、本发明核酸分子或本发明载体的植物细胞。因此，本发明还涉及根据上述用于生产植物细胞的方法生产的植物细胞。
因此，本发明涉及对于本文公开的任何核酸分子或构建体而言是转基因的任何细胞，尤其是植物细胞、植物组织或植物或其后代，例如核酸分子的阻抑或减少或其基因产物活性的阻抑或降低赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如提高的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，本发明涉及对以下任何核酸分子而言是转基因的任何细胞，所述核酸分子包含要降低其活性的核酸分子或其部分，或者编码要在本发明方法中降低其活性的多肽，例如是本发明的核酸分子，本发明的核酸构建体，本发明的反义分子，本发明的载体或编码本发明多肽、例如编码具有本发明蛋白质活性的多肽的核酸分子。
因此，本发明涉及对以下而言是转基因的任何细胞：载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体、重组构建体或核酶分子、或病毒核酸分子、本发明的抗体，例如对载体、宿主细胞、多肽、或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体、重组构建体或核酶分子，或包含本文公开的核酸分子片段的病毒核酸分子，与本文公开的多肽表位结合的抗体。
通过非天然的、合成的“人工”方法如诱变进行修饰时，天然存在的表达盒(例如蛋白质启动子与编码目的蛋白质的相应基因的天然存在的组合)称为转基因表达盒。这类方法已描述(US 5,565,350；WO 00/15815；也见上文)。
另外，也可以转化植物细胞、植物组织或植物，使得其他酶和蛋白质被(过)表达或阻抑或减少，来支持与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量生产。
对任何核酸序列、含有所述核酸序列的核酸构建体或用所述核酸序列或所述核酸构建体转化的生物(＝转基因生物)而言，“转基因”表示通过遗传操作方法得到的所有这些构建体，并且其中
(a)所述核酸序列或其衍生物，或
(b)遗传调节元件，例如启动子，其与所述核酸序列或其衍生物功能性连接，或
(c)(a)和(b)
不存在于其天然遗传环境中，或已通过遗传操作方法被修饰，所述修饰例如可以是一个或多个核苷酸或核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。
“天然遗传环境”指来源生物中的天然染色体基因座或者在基因组文库中存在。对于基因组文库的情况，核酸序列的天然遗传环境优选至少仍部分保留。该环境在核酸序列的至少一侧，并且序列长度为至少50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1000bp，非常特别优选至少5000bp。
然而，转基因也指本发明的核酸位于其在生物基因组中的天然位置，但该序列与天然序列相比进行了修饰和/或天然序列的调节序列已被修饰。优选地，转基因/重组应理解为指本发明方法中使用的核酸的表达处于基因组中非天然位置，即，该核酸的表达是同源的，或者优选是异源的。这种表达可以是瞬时的，或者是稳定整合进基因组的序列的表达。
因此，本文所述核酸序列在本发明方法中的用途，或根据本发明的核酸构建体或另一实施方案用于生产转基因植物的用途也是本发明的主题。
本发明使用的术语“转基因植物”指转基因植物的后代，例如T1、T2、T3和后续的植物世代或者BC1、BC2、BC3和后续的植物世代。因此，可以产生本发明的转基因植物，并且自交或者与其他个体杂交，以获得其他本发明的转基因植物。还可通过无性繁殖转基因植物细胞来获得转基因植物。本发明还涉及来自于本发明转基因植物群的转基因植物材料。这些材料包括植物细胞和某些组织、器官和植物部分的所有表现形式，例如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物，它们来自于实际的转基因植物和/或可用于产生转基因植物。
根据本发明获得的任何转化植物可用于常规育种方案或体外植物繁殖，以产生更多具有相同特征的转化植物和/或可用于将同一特征引入相同或相关物种的其他变种中。这些植物也可以是本发明的一部分。得自转化植物的种子一般也含有相同的特征，并且也是本发明的一部分。如上文所述，本发明基本上可用于可以本领域技术人员已知的任何转化方法进行转化的任何植物和作物。在一个特定的实施方案中，在可转化的作物品种中，突变或以其他方式降低要根据本发明方法降低其活性的核酸或多肽的活性。随后通过例如(标记辅助的)杂交，将赋予所述降低的基因或突变版本的核酸或多肽转移至(商业有关的)良种作物品种，从而本发明的突变或以其他方式降低的核酸或多肽版本代替或者阻抑原始或天然的活性核酸或多肽。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的生物、宿主细胞、植物细胞、植物或植物组织是转基因的。
因此，本发明涉及转化由至少一种本文公开的核酸分子(例如反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体、重组构建体或核酶分子、或病毒核酸分子、本发明的核酸构建体或载体)的转基因生物，以及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物的情况，植物组织，例如叶、根等)或繁殖材料，或者完整植物。
因此，本发明还涉及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物的情况，植物组织，例如叶、根等)或繁殖材料，或者完整植物，其与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比具有提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性或/和提高的生物量产生。
具体地，本发明还涉及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物的情况，植物组织，例如叶、根等)或繁殖材料，或者完整植物，其具有减少或缺失的选自以下的活性：At1g74730-蛋白、At3g63270-蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，和/或含有SET结构域的蛋白质。
此外，本发明还涉及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物的情况，植物组织，例如叶、根等)或繁殖材料，或者完整植物，其包含要根据本发明方法减少的核酸分子或多肽的活性或表达减少。
因此，本发明具体涉及来自这些生物的细胞、细胞培养物、组织、部分(例如对于植物的情况，植物组织，例如叶、根等)或繁殖材料，或者完整植物，其包含核酸分子的活性或表达减少，所述核酸分子含有表I A或B申请号1第5或7列所示核酸分子，或者包含多肽的活性或表达减少，所述多肽包含表II A或B申请号1第5或7列所示多肽或包含表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序。
术语“重组(宿主)”和“转基因(宿主)”在这种情况下可互换使用。自然，这些术语不仅指目的宿主生物或靶细胞，还指这些生物或细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境效应而可能在后续世代中出现某些修饰，因此这些后代不一定与亲本细胞相同，但仍在本文所用术语的范围之内。
用于本发明方法的或作为宿主的合适生物如上文所公开。用作宿主的生物是微生物，例如细菌、真菌、酵母或藻类，或者植物，如双子叶植物或单子叶植物。
原则上，所有植物均可用作宿主生物，特别是上文提到作为来源生物的那些。例如，优选的转基因生物选自以下科：槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、菊科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、牻牛儿苗科(Gentianaceae)、Labiaceae、木兰科(Magnoliaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、Carifolaceae、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯芯草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)，优选选自以下科的植物：伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。优选作物植物，例如有利地选自以下的植物：花生属、油菜、芸苔、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏仁、鳄梨、月桂、南瓜、亚麻子、大豆、阿月混子、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱和黍、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、苜蓿和多年生草本以及饲料植物、油棕榈、蔬菜(芸苔、食根蔬菜、食块茎蔬菜、食荚果蔬菜、结果蔬菜、洋葱蔬菜(onion vegetables)、叶菜和茎菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、巢菜、扁豆、四季豆、羽扇豆、三叶草和紫花苜蓿，以上仅为一些实例。
优选的植物细胞、植物器官、植物组织或植物部分来源于在来源生物中提到的植物科，优选上述植物属，更优选上述植物物种。
在本发明的一个实施方案中，植物细胞、植物器官、植物组织或植物部分来源于包括玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻的组。
本发明的另一实施方案是组合物，其包含本发明蛋白质、本发明核酸分子、本发明多肽、本发明核酸构建体或载体、本发明拮抗剂、本发明抗体，以及任选的农用载体。
在另一方面中，本发明还涉及本发明转基因植物的可收获部分和繁殖材料，所述转基因植物含有表达本发明核酸分子的转基因植物细胞，或者含有这样的细胞，其显示减少、抑制、降低或缺失的选自At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和/含有SET结构域之蛋白的细胞活性，例如，其显示减少、抑制、降低或缺失的要在本发明方法中减少的多肽或核酸分子的活性，特别是减少或缺失多肽(其含有表II申请号1第5或7列所示(优选表II B申请号1所示)多肽，或者含有表IV申请号1第7列所示共有序列或多肽基序)的活性或者核酸分子(其包含表I申请号1第5或7列所示(优选表IB申请号1所示))的基因产物的活性。
原则上，可收获部分可以是任何有用的植物部分，例如花、花粉、苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。繁殖材料包括如种子、果实、插条、块茎、根茎等。优选种子、苗、块茎或果实作为可收获或繁殖材料。
在一个实施方案中，本发明涉及鉴定基因产物的方法，所述基因产物赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，该方法包括以下步骤：
(a)使含有候选基因的样品(如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库)中的一种、一些或全部核酸分子与表I A或B申请号1第5或7列所述核酸分子或其功能等同物相接触，例如杂交，所述候选基因编码赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生的基因产物；
(b)鉴定在严格度松弛的条件下与所述核酸分子(特别是表I申请号1第5或7列所述核酸序列)杂交的核酸分子，并任选地分离全长cDNA克隆或完整的基因组克隆；
(c)鉴定宿主细胞(优选植物细胞)中的候选核酸分子或其片段；
(d)在宿主细胞中减少或缺失所鉴定核酸分子的表达；
(e)测定宿主细胞中与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生；和
(f)在将表达与野生型进行比较后，鉴定宿主细胞中的核酸分子和其基因产物，所述核酸分子和其基因产物的表达减少或缺失赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
松弛的杂交条件为：在标准杂交操作后，洗涤步骤可在低至中等严格条件下进行，通常以40℃-55℃、盐浓度为2×SSC至0.2×SSC和0.1％SDS的条件进行洗涤，相比之下，严格洗涤条件为例如60至68℃，0.1％SDS。其他实例可参见上文关于严格杂交条件的内容。通常以提高的严格度和长度重复进行洗涤步骤，直至检测到合适的信噪比，并且取决于许多因素，例如靶标(例如其纯度、GC含量、大小等)、探针(例如其长度、是RNA还是DNA探针)、盐条件、洗涤或杂交温度、洗涤或杂交时间等。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定基因产物的方法，所述基因产物的减少赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，该方法包括以下步骤：
(a)鉴定生物中的核酸分子(例如通过数据库的同源性检索来鉴定)，其与编码蛋白质的核酸分子具有至少20％、优选25％、更优选30％、甚至更优选35％、40％或50％、甚至更优选60％、70％或80％、最优选90％或95％或更高的同源性，所述蛋白质包含表II申请号1第5或7列所述多肽分子，或包含表IV申请号1第7列所述共有序列或多肽基序，或者由包含表I申请号1第5或7列所述多核苷酸的核酸分子所编码，或者是其本文所述同源物；
(b)在宿主细胞中抑制、减少或缺失所鉴定核酸分子的表达；
(c)测定与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量的水平，特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生；和
(d)鉴定宿主细胞，其中核酸分子或其基因产物的抑制、减少或缺失赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在另一实施方案中，本发明涉及鉴定基因产物的方法，所述基因产物的减少赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，该方法包括以下步骤：
(a)提供本发明的生物或宿主细胞，其中编码包含该多肽之蛋白质的核酸分子已经被失活、缺失或以其他方式减少其活性；
(b)用cDNA表达或基因组文库或任何能有效表达所包含核酸序列的其他核酸文库转化该生物；
(c)测定与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比增加的产量(特别是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)的水平；和
(d)鉴定宿主细胞，其中所引入的核酸序列逆转了与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，重建了野生型状态。
在一个实施方案中，用于鉴定其减少赋予与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量(特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生)的基因产物的不同方法可以任何组合方式进行组合，以优化该方法。
此外，在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定化合物的方法，所述化合物刺激与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，该方法包括：
(a)在细胞培养条件下使细胞与候选化合物接触，所述细胞表达如表II申请号1第5或7列所示多肽或由包含表I申请号1第5或7列所示多核苷酸的核酸分子所编码的多肽，或其本文所述同源物或其mRNA；
(b)测定所述多肽或所述mRNA表达的减少、降低或缺失；
(c)将所述表达水平与不存在所述候选化合物时产生的标准应答进行比较，其中与标准相比的表达减少、降低或缺失表示该化合物刺激与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，特别是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
另外，在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选下述多肽或本文所述其同源物的活性的拮抗剂的方法，所述多肽是表II申请号1第5列或第7列中所示多肽，或由包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子编码，例如是这样的多肽，在降低其细胞活性后，例如降低具有要在本发明方法中减少的蛋白质或核酸分子所示活性的多肽或本发明多肽的活性后，赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，所述方法包括：
(a)在允许本发明多肽表达的条件下将表达本发明多肽的细胞、组织、植物或微生物与候选化合物或包含多种化合物的样品接触；
(b)测定细胞、组织、植物或微生物或培养或含有所述细胞、组织、植物或微生物的培养基中增加的产量(尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)的水平或多肽表达水平；和
(c)如下鉴定拮抗剂：将测量的增加的产量(尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)的水平或多肽表达水平与不存在所述候选化合物或包含所述多种化合物的样品时测量的标准产量(尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)水平或多肽表达水平比较，其中超出标准的提高的产量水平(尤其时产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)表明化合物或包含所述多种化合物的样品是拮抗剂。
本发明的又一个实施方案涉及用于鉴定下述化合物的方法，所述化合物赋予植物中与相应的(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生，所述方法包括步骤：
(a)培养或维持植物或动物细胞或其组织或微生物，其表达表II申请号1第5列或第7列中所示多肽，或者由包含表I申请号1第5列或第7列所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽或本文所述其同源物，或者编码所述多肽的多核苷酸，并且提供能与所述多肽在合适条件下相互作用的读出系统，所述条件允许该多肽与此读出系统在化合物或含有多种化合物的样品存在下相互作用，并且所述读出系统能够应答于化合物与所述多肽在下述条件下的结合而提供可检测信号，所述条件允许阻抑所述读出系统及下述蛋白质或本文所述其同源物，所述蛋白质如表II第5列或第7列中所示或由包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子编码；和
(b)通过检测所述读出系统所产生的信号的存在与否或者下降或提高来鉴定该化合物是否是有效的拮抗剂。
所述化合物可以是化学合成的或者是微生物产生的和/或包含于例如来自如植物、动物或微生物(如病原体)的样品(如细胞提取物)中。此外，所述化合物可以是本领域已知的，但还不了解其能够抑制本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物，或者可包含细胞或组织培养物。用于鉴定本发明化合物的方法的合适设置为本领域技术人员已知，并且一般性地描述于例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第三版(1994)，特别是第17章。所述化合物可以例如添加到反应混合物、培养基中，注射到细胞中或者喷洒到植物上。
如果在该方法中鉴定含有化合物的样品，则可以从鉴定为含有与相应(例如未经转化的)野生型植物相比能提高产量(尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)的化合物的原始样品中分离该化合物，或者可以将原始样品进一步细分(例如如果由多种不同化合物组成)，从而减少每个样品中的不同物质数，并重复细分原始样品的该方法。取决于样品的复杂度，上述步骤可以重复若干次，优选直至根据所述方法鉴定的样品仅含有数目有限的物质或仅含一种物质。优选地，所述样品含有具有相似化学和/或物理特性的物质，最优选地，所述物质是相同的。优选地，将根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物进一步配制成适于在植物育种或植物细胞和组织培养中应用的形式。
可根据所述方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库(例如cDNA表达文库)、肽、蛋白质、核酸、抗体、小有机化合物、激素、拟肽、PNA等(Milner，Nature Medicine 1，879(1995)；Hupp，Cell 83，237(1995)；Gibbs，Cell 79，193(1994)，及上文引用的参考文献)。所述化合物也可以是已知抑制剂或激活剂的功能衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法为本领域技术人员所熟知，并描述于例如Beilstein，Handbook ofOrganic Chemistry，Springer，edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010U.S.A.以及Organic Synthesis，Wiley，New York，USA。此外，可根据本领域已知的方法测试所述衍生物和类似物的效果。此外，可以使用拟肽和/或计算机辅助设计的合适衍生物或类似物，例如根据上文所述的方法。该方法中可使用的细胞或组织为上文实施方案中所述的本发明宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及可根据用于鉴定本发明拮抗剂的方法获得或鉴定的化合物，所述化合物是本发明多肽的拮抗剂。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及通过用于鉴定本发明化合物的方法鉴定的化合物。
所述化合物例如为本发明多肽的拮抗剂同源物。要在本发明方法中减少的多肽的拮抗剂同源物可以通过诱变(例如本发明多肽的离散点突变或平截)产生。在本文中使用时，术语“拮抗剂同源物”是指蛋白质的变体形式，其发挥本发明多肽活性的拮抗剂的作用。表II第5列或第7列中所示多肽或由包含表I第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子编码的蛋白质或本文所述其同源物的拮抗剂至少部分丧失本发明多肽的生物活性。具体地，所述拮抗剂赋予表II申请号1第5列或第7列中所示多肽或由包含表I申请号1第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽或本文所述其同源物表达水平的降低，因此所述拮抗剂在生物或其部分中的表达赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。就该含义而言典型的拮抗剂应当是要在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的显性负相版本，例如仍然能够参与蛋白质复合物、但是不再实现其原始生物(例如酶)功能、从而几乎使整个复合物失活的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或拮抗剂的抗体。
本发明还涉及诊断组合物，其包含至少一种上述本发明核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物，并任选地包含合适的检测手段。
本发明的诊断组合物适用于从细胞中分离mRNA，并在杂交条件下使这样获得的mRNA接触包含上述核酸探针的探针，检测与该探针杂交的mRNA的存在情况，从而检测细胞中该蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在与否的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。此外，可以在植物育种中使用本发明的核酸分子作为分子标记或引物。合适的检测方法为本领域技术人员所熟知，例如，描述于Sambrook等的用于杂交测定的缓冲液和溶液(例如上述溶液和缓冲液)以及用于Southern、Western、Northern等印迹的方法是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其设计成特异性检测待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明的核酸分子)的存在或表达水平，或者设计成区分本发明核酸分子或者待在本发明方法中降低其活性的核酸分子的变体或等位基因。
在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子或核酶分子或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或拮抗剂。
本发明试剂盒中的化合物可包装在容器(例如小瓶)中，任选地与缓冲液和/或溶液一起或者在缓冲液和/或溶液中。如果合适，所述组分的一种或多种可以包装在一个和相同的容器中。作为补充或替代，可将一种或多种所述组分吸附至固相支持体，例如硝酸纤维素滤膜、玻璃板、芯片或尼龙膜或其微量滴定板的孔。该试剂盒可用于任何本文所述方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物；检测同源序列；鉴定拮抗剂或激动剂；作为食品或饲料或其补充剂；或者作为处理植物的补充剂等。
此外，该试剂盒可包含将该试剂盒用于任何所述实施方案、尤其是用于生产下述生物或其部分的说明书，所述生物或其部分与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比具有提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种所述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一实施方案中，所述试剂盒包含用于检测和区分待在本发明方法中降低的核酸分子(例如本发明核酸分子)的PCR引物。
在另一实施方案中，本发明涉及用于产生农用组合物的方法，所述农用组合物提供用于本发明方法的核酸分子，本发明的核酸分子，本发明的载体，本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或抗体，本发明的病毒核酸分子或本发明的多肽；或者包含用于鉴定所述化合物或拮抗剂的本发明方法的步骤；以及制备本发明的核酸分子、载体或多肽；或者根据本发明方法或本发明的步骤或用本发明主题鉴定的拮抗剂或化合物，它们均为可植物农用组合物的形式。
在另一实施方案中，本发明涉及用于产生支持植物培养组合物的方法，其包括本发明方法的步骤，以及将所鉴定的化合物制备成可农用组合物的形式。
“可农用组合物”应理解为这样的组合物，其符合规定杀真菌剂、植物养分、除草剂等含量的法律。优选地，这样的组合物对所保护的植物和用其所喂饲的动物(包括人)无任何害处。
本文公开的核酸分子，尤其是表I A或B申请号1第5列或第7列中所示核酸，具有多种用途。首先，它们可用于鉴定生物或其近亲。其次，它们可用于鉴定混合的植物种群中其存在或其亲属的存在。通过在严格条件下用跨越本发明特有基因区域的探针对特有或混合的植物种群培养物提取的基因组DNA进行探针检测，可以查明是否使用了本发明或者是否存在本发明或其近亲。
另外，本文公开的核酸分子(尤其是表I A或B申请号1第5列或第7列中所示核酸分子)可与相关物种的序列充分同源，使得这些核酸分子可以发挥在相关生物中构建基因组图谱的标记物作用或者用于辅助作图。另外，对应于本文公开的核酸(尤其是表I A或B申请号1第5列或第7列中所示核酸分子)或其同源物的基因组区域中的天然变异可导致本文公开的蛋白质(尤其是包含表II A或B申请号1第5列或第7列中所示多肽、或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的蛋白质)及其同源物活性的变异，因此导致天然变异。
因此，天然变异最终也以较低活性的等位基因变体的形式存在，导致相对提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
因此，本发明涉及植物育种方法，包括：
(a)选择通过减低、阻抑、减少或缺失在本发明方法中降低其活性的(例如本文所公开的)多肽或核酸分子(尤其是包含表I A或B申请号1第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子，或包含表II A或B申请号1第5列或第7列中所示多肽的多肽，或包含表IV申请号1第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽，或本文所述其同源物)的表达而与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比具有提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生的第一植物品种，
(b)将与相应的(例如未经转化的)野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生与编码所述多肽或所述核酸分子的基因的表达水平或基因组结构联系在一起；
(c)将所述第一植物品种与第二植物品种杂交，所述第二植物品种和第一植物品种在产量(尤其是其产量相关性状，例如氮利用效率和/或其生物量产生)上显著差异；和
(d)通过分析产量(尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生)水平或所述多肽或核酸分子的表达或编码本发明所述多肽或核酸分子的基因的基因组结构，来鉴定哪些后代品种具有与相应(例如未经转化)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
在一个实施方案中，根据步骤(b)的基因的表达水平降低。
本发明的核酸分子也可用于进化和蛋白质结构研究。通过将例如表I申请号1第5列或第7列中所示序列与来自其他生物的编码相似酶的序列比较，可以评价生物的进化相关度。类似地，这样的比较允许评价序列中的哪些区域是保守的，哪些不是保守的，这可帮助测定对于酶功能而言必需的蛋白质区域。这一类型的测定具有蛋白质工程研究的价值，并且可以指出蛋白质可以耐受哪些诱变而不丧失功能。
因此，本文公开的核酸分子，例如要根据本发明方法降低其活性的核酸分子，例如如表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子或其同源物可用于鉴定下述其他核酸，所述其他核酸在降低、阻抑、减少或缺失其表达后赋予与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如提高的养分利用效率，如增强的氮利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生。
另外，本文公开的例如要根据本发明方法降低其活性的核酸分子，例如表I申请号1第5列或第7列中所示核酸分子或其同源物，尤其是本发明的核酸分子或其片段或赋予所编码的表达产物(例如本发明多肽)表达的基因，可用于标记辅助育种或产量(尤其是提高的产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生相关性状)关联作图(association mapping)。
这些实施方案和其他实施方案由本发明的说明书和实施例公开并包括。
涉及要根据本发明使用的任一方法、用途和化合物的其他文献可使用例如电子设备从公共图书馆获得。
例如，可以使用因特网上、例如在hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html可获得的公共数据库“Medline”。其他数据库和地址如hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/、hftp://www.infobiogen.fr/、hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html、hftp://www.tigr.org/是本领域技术人员已知的，并且也可以使用例如hftp://www.lycos.com获得。Berks，TIBTECH 12，352(1994)中给出了生物技术专利信息的综述和可用于回顾性搜索和目前知晓的专利信息相关来源的纵览。
另外，本发明涉及用于生产与相应野生型植物相比具有提高的产量的植物(例如转基因植物)的方法，所述方法包括：
(a)在植物细胞核、植物细胞、植物或其部分中缺失、降低或阻抑一种或多种所述活性；和
(b)在允许植物细胞、植物或其部分发育的条件下培育或培养所述植物细胞、植物或其部分；和
(c)从与相应(例如未经转化的)的、原始或野生型植物相比显示提高的产量的所述植物细胞核、植物细胞、植物部分中再生植物；
(d)任选地选择下述植物或其部分，所述植物或其部分与相应(例如未经转化的)的野生型植物细胞(例如显示可见的缺陷和/或死亡症状的植物细胞)相比显示提高的产量，例如显示提高的或改进的产量相关性状，例如改进的养分利用效率和/或非生物性协胁迫抗性。
在另一个实施方案中，本发明还涉及用于鉴定产量提高的植物的方法，所述方法包括针对核酸(其编码赋予如表I所示所述活性的多肽)的表达水平筛选一个或多个植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分的群体，将表达水平与参照比较；鉴定与参照相比具有较低表达水平的一个或多个植物细胞核、植物细胞、植物组织或植物或其部分，并任选地从所述鉴定的植物细胞核、细胞或组织生产植物。在另一个步骤中，可以测试鉴定的植物或其部分的产量，例如产量相关性状，例如氮利用效率。所述方法可以部分或整体重复一次或多次。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于提高植物种群产量的方法，所述方法包括检验种植区域中的种植条件，例如土地氮含量、平均温度、水分供应，将所述条件与考虑种植的植物物种或品种(例如本文提到的来源植物或野生型植物)的最佳条件进行比较，如果一种或多种所述条件、尤其是土地氮含量对于考虑种植的并非用本发明方法生产的植物物种或品种(例如对来源植物或野生型植物)的种植和培养而言并非最佳，则种植并培养本发明的植物。
另外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获生产或种植的植物或植物部分，并用收获的植物或其部分或从其中生产燃料。另外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获可用于淀粉分离的植物部分，并从该植物部分中分离淀粉，其中所述植物是可用于淀粉生产的植物，例如马铃薯。另外，在一个实施方案中，本发明的方法包括收获可用于油分离的植物部分，并从该植物部分中分离油，其中所述植物是可用于油生产的植物，例如油菜或芸苔、棉花、大豆或向日葵。
例如，在一个实施方案中，玉米种子中的油含量被提高。因此，本发明涉及生产具有提高的每英亩油含量(可收获的油)的植物。
例如，在一个实施方案中，大豆种子中的油含量被提高。因此，本发明涉及生产具有提高的每英亩油含量(可收获的油)的大豆植物。
例如，在一个实施方案中，OSR种子中的油含量被提高。因此，本发明涉及生产具有提高的每英亩油含量(可收获的油)的OSR植物。
例如，本发明涉及生产具有提高的每英亩油含量(可收获的油)的棉花植物。
用于测定受试土壤氮含量的方法包括以下步骤：
a)在所述土壤中培养根据本发明生产的植物，
b)将根据本发明生产的植物的产量与在所述土壤中培养的对照植物的产量相比，例如与野生型或原始植物、尤其是并非根据本发明方法生产的植物相比，并测定产量差异，生产产量提高的植物，
其中与所述对照植物、例如并非根据本发明方法生产的植物相比，本发明植物增加的产量表明土壤的氮缺乏。
在另一步骤中，所述方法可包括控制用于测定土壤氮含量的所述方法的结果的步骤：
c)在无氮含量缺乏的对照土壤中培养根据本发明生产的植物，
d)将根据本发明生产的植物的产量与在所述土壤中培养的对照植物的产量相比，例如与野生型或原始植物、尤其是并非根据本发明方法生产的植物相比，并测定产量差异，生产产量提高的植物，
其中与所述对照植物、例如并非根据本发明方法生产的植物相比，本发明植物增加的产量表明受试土壤无氮缺乏。
用于鉴定氮利用效率提高的植物的方法包括以下步骤：
a)在土壤中培养根据本发明的植物，
b)将根据本发明生产的植物的产量与在所述土壤中培养的对照植物或对照植物群体的产量相比，例如与一种或一群野生型或原始植物、尤其是一种或多种并非根据本发明方法生产的植物物种相比，并测定产量差异，生产产量提高的植物，
c)鉴定与根据本发明生产的植物相比，显示更高产量、尤其是更高氮利用效率的对照植物物种，
其中与本发明所述植物相比对照植物、例如并非根据本发明方法生产的植物的更高产量表明植物具有改进的氮利用效率。
在一个实施方案中，土壤是氮缺乏土壤。
在一个实施方案中，与对照或野生型植物、例如并非根据本发明方法生产的植物相比，本发明的植物在具有降低的NUE肥料的条件下培养。优选地，本发明植物或根据本发明方法生产的植物的产量与正常NUE肥料相比未降低，或者与对照或野生型植物、例如并非根据本发明方法生产的植物相比降低较少。在另一实施方案中，本发明的植物与对照或野生型植物、例如并非根据本发明方法生产的植物在相同条件(例如NUE肥料)下培养。优选与对照或野生型植物、例如并非根据本发明方法生产的植物相比，本发明植物或根据本发明方法生产的植物的产量提高。
在一个实施方案中，产量是蛋白质产量。因此，在一个实施方案中，提高的产量表示植物或其部分例如种子中提高的结合的氮量，例如提高的氨基酸含量或蛋白质量。
还通过引用并入2007年1月21日提交的申请EP 07150295.9，本申请要求其优先权。
本发明通过以下的实施例和附图(图1-3)阐述：
实施例
通过产量相关基因、尤其是产量相关性状基因(例如氮利用效率/生物量相关基因)的失活或下调改造拟南芥植物。
载体制备
以经修饰的pPZP二元载体主链(包含用于细菌选择的卡那霉素基因；(Hajdukiewicz P.等，Plant Mol.Biol.，25，989(1994))和由mas2′1′和mas271f启动子(Velten等，EMBO J.3，2723(1984)；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，Plant J.12，945(1997))驱动的选择标记bar-基因(De Block等，EMBO J.6，2513(1987)))为基础构建二元敲除载体。得到的用于插入诱变的载体为pMTX1a300 SEQ ID NO：1。
用于插入诱变的其他有用的二元载体的例子是pBIN19、pBI101、pBinAR、pSun或pGPTV。关于二元载体以及它们特定特征的综述在Hellens等，Trends in Plant Science 5，446(2000)和Guerineau F.，Mullineaux P.，Plant transformation and expression vectors in plantmolecular biology，LABFAX Series，(Croy R.R.D.，编著)第121-127页，BiosScientific Publishers，Oxford(1993)中给出。
农杆菌的转化
使用热休克或电穿孔方案将质粒转化进根癌农杆菌(GV3101pMP90；Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.204，383(1986))中。将转化的菌株在YEB培养基上培养，并在各自的抗生素(Rif/Gent/Km)上在28℃下选择2天。使用这些农杆菌培养物进行植物转化。
根据标准条件培养和转化拟南芥的生态型C24(Bechtold N.，Ellis J.，Pelletie，G.，C.R.Acad.Sci.Paris 316，1194(1993)；Bent A.F.，Clough J.C.，PLANT J.16，735(1998))。
通过使用其各自的抗性标记选择转化的植物(F1)。在
抗性的情况下，以2到3天的间隔对小植株喷洒0.02％
四次，并允许转化的植物结籽。对50-100个幼苗(F2)再次进行标记选择，在BASTA-抗性的情况下通过小植株期期间连续4天喷洒0.1％来进行。选择针对单个抗性基因座(抗性幼苗比敏感幼苗约为3∶1)分离的植物用于进一步分析。从这些株系中，再允许三株抗性幼苗(F2)结籽，并通过其种子(F3)在含有选择试剂(
15mg/L ammonium glufosinate，Pestanal，Riedel de Haen，Seelze，德国)的琼脂培养基上的体外萌发来检验纯合性。显示接近100％抗性后代(F3)的这些F2株系被认为是纯合子并用于功能分析。
筛选在有限氮供应下生长的植物(拟南芥)
为了筛选转基因植物，使用特定的培养设备。为了高通量目的，对植物筛选在有限氮供应下在琼脂平板上的生物量产生(改进自Estelle和Somerville，1987)。该筛选的流程由两个层次组成。如果与野生型植物相比生物量产生显著提高，则对转基因品系进行后续层次。在每个层次中，提高重复数和统计学严格度。
为进行播种，用牙签将保存于冰箱(-20℃)的种子从Eppendorf管中取出，并转移至有限氮供应(0.05mM KNO3)的上述琼脂平板上。总计将约15-30个种子水平分布在每个平板上(12×12cm)。
播种后，将平板在黑暗中在4℃下分层2至4天。分层后，将测试植物在以下条件下培养22至25天：16小时光照8小时黑暗的周期，20℃，大气湿度60％，CO2浓度约400ppm。所用光源产生模拟阳光色谱的光，光强约为100μE/m2s。10至11天后，将植物分盆，通过在生长20至25天后与野生型对照植物相比转基因植物苗和根的生物量产生来评估在氮有限条件下改进的生长。
对与野生型植物相比显示生物量产生显著提高的转基因品系进行后续层次的以下实验：
将拟南芥种子种在含有营养缺乏土(“Einheitserde Typ 0”，30％粘土Tantau，Wansdorf，德国)和沙子的1∶1(v∶v)混合物的盆中。黑暗中4℃，4天诱导萌发。然后将植物在标准条件(16小时光照和8小时黑暗，20℃，60％相对湿度，光子通量密度200μE)下进行培养。培养植物，每隔一天用N缺乏营养液浇水。N缺乏营养液例如在水中含有：
| 矿物养分 | 终浓度 |
| KCl | 3.00mM |
| MgSO4x7H2O | 0.5mM |
| CaCl2x6H2O | 1.5mM |
| K2SO4 | 1.5mM |
| NaH2PO4 | 1.5mM |
| Fe-EDTA | 40μM |
| H3BO3 | 25μM |
| MnSO4xH2O | 1μM |
| ZnSO4x7H2O | 0.5μM |
| Cu2SO4x5H2O | 0.3μM |
| Na2MoO4x2H2O | 0.05μM |
9至10天后，将植物分盆。总计29至31天后，收获植物，并根据植物地上部分的鲜重进行评分。其结果概括于表Va中。通过相应转基因植物与非转基因野生型植物地上部分鲜重的比例来衡量生物量增加。
表Va：氮利用效率
| SeqID | 基因座 | 生物量增加 |
| 27 | At1g74730 | 1.20 |
| 60 | At3g07670 | 1.11 |
| 94 | At3g63270 | 1.23 |
| 132 | At4g03080 | 1.10 |
| 171 | At5g65240 | 1.30 |
筛选在低温条件下生长的植物
在标准实验中，土壤制备成富营养土(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)与沙子的3.5∶1(v∶v)混合物。将盆中装满土壤混合物并置于盘中。向盘中加水，以使土壤混合物吸收足量的水用于播种步骤。将转基因拟南芥植物的种子播种在盆(6cm直径)中。在黑暗中在4℃-5℃3天进行分层。在以下生长条件下起始种子萌发和生长：20℃，约60％相对湿度，16小时光周期，用荧光灯150-200μmol/m2照明。在播种后第9天通过从上方对盆中小植株进行喷洒来进行BASTA选择。因此，喷洒自来水中0.07％(v∶v)浓度的BASTA(183g/L glufosinate-ammonium)溶液。仅用自来水喷洒(代替用溶于自来水中的BASTA喷洒)野生型对照植物，但是其他方面处理相同。将转基因事件和野生型对照随机分布在培养箱中。将盖子从盘上取下后每两天浇一次水。播种后12-13天通过除去多余的幼苗而在每个盆中留下一个幼苗对植物进行分盆。在播种后14-16天施加低温(降温至11℃-12℃)至实验结束。为了测量生物量性能，通过切下嫩枝并称重而在收获时(播种后36-37天)测定植物鲜重。植物在收获时为开花之前和长出花序之前的阶段。将转基因植物与非转基因野生型对照植物比较。通过应用“学生t检验”(参数：两侧，不等方差)来计算生物量改变的统计学显著性的显著性数值。
表Vb：施加低温胁迫后转基因拟南芥的生物量产生。
通过对植物莲座称重来测量生物量产生。生物量增加被计算为来自相同实验的转基因株系植物平均重量与野生型对照植物平均重量的比例(每种植物＞19棵)。给出了转基因植物的平均生物量增加(显著性数值＝0.045)。
SeqID 基因座 生物量增加
171 At5g65240 1.15
筛选在标准化生长条件下产量提高的植物
在这一实验中，在没有实质性非生物性胁迫的标准化的生长条件下针对产量提高(在这一情况下：生物量产量提高)进行植物筛选。在标准实验中，土壤制备成富营养土(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)与石英砂的3.5∶1(v∶v)混合物。或者将植物播种于富营养土(GS90，Tantau，德国)上。用土壤混合物填充盆并置于盘中。向盘中加水，以使土壤混合物吸收足量的水用于播种步骤。将转基因拟南芥植物及其非转基因野生型对照的种子播种在盆中(直径6cm)。在黑暗中在4℃至5℃3-4天进行分层。在以下生长条件下起始种子萌发和生长：20℃，约60％相对湿度，16小时光周期，用荧光灯以约150-200μmol/m2s照明。在第10天或第11天(播种后9或10天)通过从上方对盆中小植株进行喷洒来进行BASTA选择。在标准实验中，喷洒一次自来水中的0.07％(v/v)浓度的BASTA(183g/Lglufosinate-ammonium)溶液，或喷洒三次0.02％(v/v)的BASTA溶液。仅用自来水喷洒(代替用溶于自来水中的BASTA喷洒)野生型对照植物，但是其他方面处理相同。播种后13-14天通过除去多余的幼苗而在土壤中留下一个幼苗对植物进行分盆。将转基因事件和野生型对照植物均匀分布在培养箱中。
在标准实验中，将盖子取下后每两天或每一天浇一次水。为了测量生物量性能，通过切下嫩枝并称重而在收获时(播种后24-25天)测定植物鲜重。植物在收获时为开花之前和长出花序之前的阶段。将转基因植物与非转基因野生型对照植物比较。通过应用“学生t检验”(参数：两侧，不等方差)来计算生物量改变的统计学显著性的显著性数值。
表Vd：在标准化生长条件下生长的转基因拟南芥的生物量产生。
通过对植物莲座称重来测量生物量产生。生物量增加被计算为来自相同实验的转基因株系植物平均重量与野生型对照植物平均重量的比例(每种植物＞20棵)。给出了转基因植物的平均生物量增加(显著性数值＝0.002)。
SeqID 靶标 基因座 生物量增加
171 nd At5g65240 1.19
分析具有提高的产量，尤其是增加的产量相关性状，例如氮利用效率和/或提高的生物量产生的所选择的株系
因为针对单个插入基因座和抗性标记的纯合性情况进行了株系的预选择，所以期望通过T-DNA的整合破坏(或突变)单个基因导致抗胁迫的表型。选择显示始终如一表型的株系用于分子分析。
使用标准步骤(来自Qiagen，Hilden，德国的离心柱，或来自AmershamBiosciences，Freiburg，德国的Nucleon Phytopure试剂盒)，从来自这些株系的约100mg叶组织中纯化基因组DNA。使用两种不同的方法实现T-DNA插入侧的扩增。或者通过根据Spertini D，Béliveau C.和BellemareG.，Biotechniques 27，308(1999)的接头PCR-方法，所述方法分别使用T-DNA特异性引物
LB1(5′-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3′；SEQ ID NO：4)或
RB 1-2(5′-CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CA-3′；SEQ IDNO：5)
用于第一PCR，和
LB2(5′-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3′；SEQID NO：6)或
RB4-2(5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG-3′；SEQ ID NO：7)
用于第二PCR。
或者进行TAIL-PCR(Liu Y-G.，Mitsukawa N.，Oosumi T.和WhittierR.F.，Plant J.8，457(1995))。在这种情况下，分别针对第一PCR使用
LB1(5′-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3′，SEQ ID NO：4)或
RB1-2(5′-CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CA-3′；SEQ ID NO：5)，
针对第二PCR使用
LB2(5′-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3′；SEQID NO：6)或
RB4-2(5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG-3′，SEQ ID NO：7)，和
针对最后的PCR使用
LB3(5′-CCA ATA CAT TAC ACT AGC ATC TG-3′；SEQ ID NO：8)或
RB5(5′-AAT GCT AGA GCA GCT TGA-3′；SEQ ID NO：9)作为T-DNA特异性引物用于左侧或右侧T-DNA边界。
适当的PCR-产物在琼脂糖凝胶上鉴定，并使用柱和标准步骤(Qiagen，Hilden，德国)纯化。用额外的T-DNA-特异性引物对PCR产物测序，所述引物相对于用于扩增的引物而言位置朝向边界。对含有左侧边界序列的接头PCR产物而言使用引物
LBseq(5′-CAA TAC ATT ACA CTA GCA TCT G-3′；SEQ ID NO：10)，和对含有右侧边界序列的序列而言使用引物
RBseq(5′-AGA GGC CCG CAC CGA TCG-3′；SEQ ID NO：11)进行测序反应。对含有左侧边界序列的TAIL PCR产物而言使用引物
LBseq2(5′-CTA GCA TCT GAA TTT CAT AAC C-3′；SEQ ID NO：12)和对于含有右侧边界序列的PCR产物而言使用引物
RBseq2(5′-GCT TGA GCT TGG ATC AGA TTG-3′；SEQ ID NO：13)进行测序反应。使用blast算法(Altschul等，J Mol Biol，215，403(1990))将得到的序列与可得自Genebank的拟南芥基因组序列比较。
下表VI中给出用于鉴定基因组基因座的PCR产物的更多细节。标出了拟南芥基因组中经鉴定注释的开放读码框，获得的PCR产物的估计大小(以碱基对为单位)，扩增达到的T-DNA边界(LB：左侧边界，RB：右侧边界)，得到所示PCR产物的方法(解释见上文)，在接头PCR的情况下各自的限制性酶，和TAIL PCR情况下的简并引物。使用常规简并引物
ADP2(5′-NGT CGA SWG ANA WGA A-3′；SEQ ID NO：14)，
ADP3(5′-WGTGNAGWANCANAGA-3′；SEQ ID NO：15)，
ADP5(5′-STT GNT AST NCT NTG C-3′；SEQ ID NO：16)，
ADP6(5′-AGWGNAGWANCANAGA-3′；SEQ ID NO：17)，
ADP8(5′-NTGCGASWGANWAGAA-3′；SEQ ID NO：18)，
ADP9(5′-NTG CGA SWG ANT AGA A-3′；SEQ ID NO：19)和
ADP11(5′-SST GGS TAN ATW ATW CT-3′；SEQ ID NO：20)。
通过对照PCR证实每种情况下插入的基因座的身份，所述对照PCR使用上述T-DNA-特异性引物之一和从经鉴定的基因组接近插入位点的基因座演绎而来的引物。使用这两种引物从插入株系中扩增出预期大小的PCR-产物证明T-DNA整合破坏了经鉴定的基因座。
表VI：在与相应(例如未经转化的)的野生型植物相比显示提高的产量，尤其是提高的产量相关性状，例如增强的养分利用效率和/或提高的环境胁迫耐性和/或提高的生物量产生的株系中，用于鉴定下调基因的PCR产物的细节。下调的基因通过其TAIR基因座(基因座)来定义。
表VI：PCR-产物
| SEQ ID | 基因座 | 边界 | 方法 | 限制性酶或简并引物 |
| 27 | At1g74730 | RB | 接头 | SpeI |
| 60 | At3g07670 | RB | TAIL | ADP8 |
| 94 | At3g63270 | LB | 接头 | SpeI |
| 132 | At4g03080 | RB | 接头 | MunI |
| 171 | At5g65240 | LB | 接头 | Psp1406I/Bsp119I |
第1列指出被敲除的基因的SEQ ID NO.，第2列指出被敲除的基因的TAIR基因座(基因座)，第3列指出扩增PCR产物的T-DNA边界，第4列指出用于扩增的PCR方法，第5列指出在PCR方法中使用的简并引物或限制性酶(第4列和第5列的详细例证见上文；APX表示引物AP2、引物AP5、引物AP6、引物AP9或引物AP11任一)。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO.27的基因)活性或表达的反义构建体的构建。
通过PCR扩增SEQ ID NO.27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以对用于扩增的引物添加限制性位点。或者可以对引物添加重组位点，使得能够进行重组反应。可以将PCR片段克隆或重组进二元载体中，优选以下述方式处于强组成型、组织或发育特异性启动子的控制下，所述方式使得基因的方向可与其在原始基因组位置中具有的方向相反。
表III申请号1第5列中一行所示序列片段的扩增可以使用同一表III各自同一行中申请号1第7列中所示引物进行，所述引物包含外延5’-ATACCCGGG-3’(SEQ ID NO.：21)或5’-ATAGAGCTC-3’(SEQ IDNO.：22)。外延5’-ATACCCGGG-3’(SEQ ID NO.：21)或5’-ATAGAGCTC-3’(SEQ ID NO.：22)分别含有用于克隆目的的XmaI和SacI限制性酶识别位点。
将寡核苷酸溶于水中，得到20μM的浓度。PCR反应含有5μl Herculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(每种25mM)(Amersham)、0.5μl每种引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μl gDNA和42.6μl水。可以在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上通过以下程序进行PCR：
94℃ 4分钟，之后94℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃ 2分钟30个循环，之后72℃ 10分钟并冷却至25℃。
使用来自Qiagen的试剂盒纯化PCR产物。随后在37℃下用XmaI/SacI将DNA消化过夜。然后可以将片段克隆进能够用XmaI/SacI消化的载体1bxPcUbicolic SEQ ID NO.：2中。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO.27的基因)活性或表达的RNAi构建体的构建。
可以通过PCR扩增SEQ ID NO：27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以对用于扩增的引物添加限制性位点。或者可以对引物添加重组位点，使得能够进行重组反应。可以将PCR片段克隆或重组进二元载体中，优选以下述方式处于强组成型、组织或发育特异性启动子的控制下，所述方式使得片段可以作为颠倒重复在所述载体中引入两次，所述重复由DNA间隔隔开。
表III第5列中一行所示序列片段的扩增可以使用同一表III各自同一行中第7列中所示引物进行，所述引物包含外延5’-ATAGGTACC-3’(SEQID NO：23)或5’-ATAGTCGAC-3’(SEQ ID NO：24)。外延5’-ATAGGTACC-3’(SEQ ID NO：23)或5’-ATAGTCGAC-3’(SEQ ID NO：24)分别含有用于克隆目的的Asp718和SalI限制性酶识别位点。
可以将寡核苷酸溶于水中，得到20μM的浓度。PCR反应含有5μlHerculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(每种25mM)(Amersham)、0.5μl每种引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μl gDNA和42.6μl水。可以在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上通过以下程序进行PCR：
94℃ 4分钟，之后94℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃ 2分钟30个循环，之后72℃ 10分钟并冷却至25℃。
使用来自Qiagen的试剂盒纯化PCR产物。随后在37℃下用Asp718/SalI将DNA消化过夜。然后可以将片段克隆进能够用Asp718/SalI消化的载体10xPcUbispacer SEQ ID NO：3中。可以用XhoI/BsrGI消化得到的构建体，并可将相同的用Asp718/SalI消化的PCR产物连接进该载体中。随后可以将赋予BASTA抗性的表达盒作为XbaI片段连接进该载体中，所述载体之前用XbaI打开并被去磷酸化。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO.27的基因)活性或表达的共阻抑构建体的构建
通过PCR扩增SEQ ID NO.27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以对用于扩增的引物添加限制性位点。或者可以对引物添加重组位点，使得能够进行重组反应。可以将PCR片段克隆或重组进二元载体中，优选以下述方式处于强组成型、组织或发育特异性启动子的控制下，所述方式使得相对于启动子的方向可与基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。
表III第5列中一行所示序列片段的扩增可以使用同一表III各自同一行中第7列中所示引物进行，所述引物包含外延5’-ATACCATGG-3’(SEQID NO：25)或5’-ATATTAATTAA-3’(SEQ ID NO：26)。外延5’-ATACCATGG-3’(SEQ ID NO：25)或5’-ATATTAATTAA-3’(SEQ IDNO：26)分别含有用于克隆目的的NcoI和PacI限制性酶识别位点。
将寡核苷酸溶于水中，得到20μM的浓度。PCR反应含有5μl Herculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(每种25mM)(Amersham)、0.5μl每种引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μl gDNA和42.6μl水。可以在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上通过以下程序进行PCR：
94℃ 4分钟，之后94℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃ 2分钟30个循环，之后72℃ 10分钟并冷却至25℃。
使用来自Qiagen的试剂盒纯化PCR产物。随后在37℃下用NcoI/PacI将DNA消化过夜。然后可以将片段克隆进能够用NcoI/PacI消化的载体1bxPcUbicolic SEQ ID NO：2中。
通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因)的活性或表达
也可以通过引入合成的特异性阻抑子下调基因和其它物种中其同源的ORF。为此可以构建嵌合锌指蛋白的基因，所述嵌合锌指蛋白结合目的基因或其它物种中同源物的调节区或编码区中的特异性区域。人工锌指蛋白包含特异性DNA-结合结构域，所述结构域例如由锌指和任选的阻抑物如EAR结构域组成(Hiratsu等，Plant J.34，733(2003)；Dominantrepression of target genes by chimeric repressors that include the EARmotif，a repression domain，in Arabidopsis.)。
该嵌合阻抑子例如在植物中的表达随后导致靶基因或其它植物物种中同源物的特异性阻抑，导致提高的代谢生产。特别是关于特异性锌指结构域设计和构建的实验细节可如所述进行，或根据WO 01/52620或OrdizM.I.，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(20)，13290(2002))或Guan(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(20)，13296(2002))进行。
通过在黑麦草(ryegrass)中阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造黑麦草植物
可使用若干不同黑麦草品种的种子，包括可得自Weibull种子公司的商业品种Gunne或品种Affinity的种子作为用于转化的外植体来源。可通过先后用1％Tween-20处理1分钟、100％漂白剂(bleach)处理60分钟、去离子和蒸馏H2O冲洗3次每次5分钟，对种子表面灭菌，然后在潮湿、无菌滤纸上于暗中萌发3-4天。可以将幼苗进一步灭菌：1％Tween-20处理1分钟，75％漂白剂处理5分钟，并用dd H2O冲洗3次，每次5分钟。
将经表面灭菌的种子置于含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/L蔗糖、150mg/L天冬酰胺、500mg/L酪蛋白水解物、3g/L Phytagel、10mg/L BAP和5mg/麦草畏的愈伤组织诱导培养基上。可以将平板在黑暗中以25℃孵育4天以进行种子萌发和胚胎发生愈伤组织诱导。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，可剪去苗的嫩枝和根，可将愈伤组织转移至新鲜培养基，可再培养4周，接着可转移至MSO培养基在光照下培养2周。将一些愈伤组织片(11-17周龄)通过10目筛滤过并置于愈伤组织诱导培养基上，或者在250ml瓶中的100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与用琼脂的愈伤组织诱导培养基相同)中培养。可将瓶用箔裹住，并在黑暗中在23℃下以175rpm摇动1周。可用40目筛将液体培养基过筛来收集细胞。可将筛上收集的部分置于固体黑麦草愈伤组织诱导培养基并可在黑暗中以25℃培养1周。接着可将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基并可培养2周。
转化可通过农杆菌或微粒轰击法来实现。产生在pUC载体中含有组成型植物启动子或以其它适当的植物启动子和反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体、重组构建体或核酶分子或病毒核酸分子、核酸构建体的表达载体。可使用Qiagen试剂盒，根据生产商的说明从大肠杆菌细胞中制备质粒DNA。可将约2g胚胎发生愈伤组织涂在培养皿中无菌滤纸的中心。可在滤纸上添加含有10g/l蔗糖的液体MSO等分试样。根据Sanford等，1993的方法用质粒DNA包裹的金微粒(大小为1.0μm)，并使用以下参数递送至胚胎发生愈伤组织：每次轰击500μg微粒和2μg DNA，1300psi，挡板到愈伤组织平板的距离为8.5cm，每板愈伤组织轰击1次。
轰击后，将愈伤组织转移回新鲜的愈伤组织发育培养基中，并在室温下在黑暗中维持1周时间。接着可将愈伤组织转移至25℃下光照的生长条件，以用合适的选择剂(例如250nM Arsenal、5mg/L PPT或50mg/L卡那霉素)起始胚分化。出现了对选择剂有抗性的苗，一旦生根就转移至土壤中。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。通过Southern杂交证实这些结果，其中可将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)。可使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics)，通过PCR制备以洋地黄毒苷标记的探针，并如生产商的推荐来使用。另外，通过标准方法如Northern印迹或定量RTPCR来分析原代转基因植物(T0)中要抑制的基因受抑制的表达。
通过剪下分蘖对转基因T0黑麦草植物进行无性繁殖。将移植的分蘖在温室中维持2个月，直至已良好建立。除下嫩枝并培养2周。
通过在大豆中抑制基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造大豆植物
可根据对Texas A&M专利US 5,164,310所述方法的以下修改来转化大豆。一些商品大豆品种可适于通过该方法进行转化。通常可使用栽培种Jack(可得自Illinois Seed Foundation)进行转化。可通过将种子浸入70％(v/v)乙醇6分钟和补充有0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)20分钟而进行消毒，然后用无菌双蒸水漂洗4次。通过从每个苗中除去胚根、下胚轴和一个子叶来繁殖7日龄的苗。接着，可将带有一个子叶的上胚轴转移至培养皿中新鲜的萌发培养基，并在16小时光周期(约100μE/m2s)下以25℃孵育3周。可从3-4周龄植物上剪下叶腋节(约4mm长)。可切下叶腋节并在农杆菌LBA4404培养基中孵育。
已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An G.，Agrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，47-62页，Gartland KMA和Davey MR编辑.Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多可基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))所述的载体pBIN19，其包括侧翼为根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体或核酶分子或病毒核酸分子转录的植物启动子。可以如上所述使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,767,366和6,225,105)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以提供如上文所述基因转录的组成型、发育、组织或环境型抑制。在本实施例中，可以用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供抑制盒的组成型抑制。
共培养处理后，可洗涤外植体并转移至补充有500mg/L泰门汀的选择培养基。可剪下苗并置于苗延长培养基上。在移植至土壤之前，将长于1cm的苗置于生根培养基上2至4周。
可通过PCR分析原代转基因植物(T0)，以证实T-DNA的存在。可通过Southern杂交证实这些结果，其中可将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)。可使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics)，通过PCR制备以洋地黄毒苷标记的探针，并可如生产商的推荐来使用。另外，通过标准方法如Northern印迹或定量RTPCR来分析原代转基因植物(T0)中要抑制的基因受抑制的表达。
通过在玉米中抑制基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造玉米植物
可使用对Ishida等(Nature Biotech 14745(1996))所述方法的修改来进行玉米(Zeamays L.)转化。
玉米中的转化可以是基因型依赖性的，仅有特定的基因型适于转化和再生。近交株系A188(University of Minnesota)或以A188为亲本的杂种可以是转化供体材料的良好来源(Fromm等Biotech 8，833(1990))，但也可成功地使用其他基因型。可在授粉后约11天(DAP)从玉米植物上收获穗，这时未成熟胚的长度约可为1至1.2mm。可将未成熟胚与带有“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生获得转基因植物。JapanTobacco的超级双元载体系统描述于WO专利WO 94/00977和WO95/06722。可如所述构建载体。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。类似地，可以使用多种启动子来调节抑制盒，以提供反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体或核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育、组织或环境型表达。在本实施例中，可使用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供抑制盒的组成型表达。
可将剪下的胚在愈伤组织诱导培养基上培养，接着在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上培养。可将培养皿在光照下以25℃孵育2-3周，或者直至发育出苗。可将绿色的苗从每个胚上转移至玉米生根培养基，并以25℃孵育2-3周，直至发育出根。可将生根的苗移植到温室中的土壤里。可从下述植物产生T1种子，所述植物显示咪唑啉酮除草剂耐性，并显示要抑制的基因受抑制的表达。可以通过标准方法如Northern印迹或定量RTPCR完成这类分析。
T-DNA单基因座插入的T1代可以3∶1的比例分离该转基因。含有1或2个转基因拷贝的后代可对咪唑啉酮除草剂有耐性。纯合T2植物可显示与T1植物相似的基因型。纯合转基因植物与非转基因植物的杂种植物(F1后代)可也显示增强的类似表型。
通过在小麦中抑制基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造小麦植物
可使用Ishida等(Nature Biotech.14745(1996))所述方法进行小麦转化。通常转化中可使用Bobwhite栽培种(可得自CYMMIT，Mexico)。可将未成熟胚与带有“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并可通过器官发生回收转基因植物。Japan Tobacco的超级双元载体系统可描述于WO专利WO 94/00977和WO 95/06722。如所述构建载体。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。类似地，可以使用多种启动子来调节抑制盒，以提供反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑构建体、核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育、组织或环境型调节。在本实施例中，可使用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供阻抑盒的组成型表达。
与农杆菌孵育后，可将胚在愈伤组织诱导培养基上培养，接着在含有咪唑啉酮作为选择剂的再生培养基上培养。可将培养皿在光照下以25℃孵育2-3周，或者直至发育出苗。可将绿色的苗从每个胚上转移至生根培养基，并以25℃孵育2-3周，直至发育出根。可将生根的苗移植到温室中的土壤里。可从下述植物产生T1种子，所述植物显示咪唑啉酮除草剂耐性，并显示要抑制的基因受抑制的表达。可以通过标准方法如Northern印迹或定量RTPCR完成这类分析。
T-DNA单基因座插入的T1代可以3∶1的比例分离该转基因。含有1或2个转基因拷贝的后代可对咪唑啉酮除草剂有耐性。纯合T2植物显示相似的表型。
通过在油菜/芸苔植物中抑制基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造油菜/芸苔植物
可根据Babic等(Plant Cell Rep 17，183(1998))，使用5-6日龄幼苗的有子叶叶柄和下胚轴作为组织培养和转化的外植体。商品栽培种Westar(Agriculture Canada)可以是用于转化的标准品种，但也可使用其他品种。
可使用含有二元载体的根癌农杆菌LBA4404进行芸苔转化。已经描述了许多不同的二元载体系统用于植物转化(例如An G.，AgrobacteriumProtocols，Methods in Molecular Biology，第44卷，47-62页，GartlandK.M.A.和Davey M.R.编辑Humana Press，To-towa，New Jersey)。许多可基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))描述的载体pBIN19，其包含植物基因表达盒，其侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左和右边界序列。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节性状基因的抑制盒转录的植物启动子。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似地，可以使用调节抑制盒的多种启动子来提供反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育、组织或环境型调节。在本实施例中，可使用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供抑制盒的组成型表达。
可通过浸入70％(v∶v)乙醇中2分钟然后浸入含有一滴Tween-20的30％Clorox中10分钟对芸苔种子进行表面灭菌，然后用无菌双蒸水洗涤3次。然后可在23℃、16小时光照下将种子在1％蔗糖、0.7％Phytagar的无激素半强度MS培养基中体外萌发5天。可从体外苗上剪下带有子叶的子叶柄外植体，并可通过将叶柄外植体的切口端浸入细菌悬液中来接种农杆菌。然后将外植体在23℃、16小时光照下在含有3mg/L BAP、3％蔗糖、0.7％Phytagar的MSBAP-3培养基中培养2天。与农杆菌共培养2天后，可将叶柄外植体转移至含有3mg/L BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/L)的MSBAP-3培养基中7天，然后可在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基中培养至苗再生。当苗为5-10mm长时，将其剪下并转移至苗延伸培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/LBAP)。可将约2cm长的苗转移至生根培养基(MSO)进行根诱导。
通过PCR分析原代转基因植物(T0)的样品，以证实T-DNA的存在。可通过Southern杂交来验证这些结果，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并可转移至带正电的尼龙膜(Roche Diagnostics)。可使用PCR DIGProbe Synthesis试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记的探针，并根据生产商的推荐使用。另外，可以通过标准方法，例如Northern印迹或定量RTPCR，针对要抑制的基因受抑制的表达来分析原代转基因植物。
通过在苜蓿中抑制基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因的基因同源物)的活性或表达来改造苜蓿植物
可以使用McKersie等，Plant Physiol 119，839(1999))的方法转化苜蓿(Medicago sativa)的再生克隆。苜蓿的再生和转化可以是基因型依赖性的，因此可能需要再生植物。获得再生植物的方法已有描述。例如，它们可选自Rangelander栽培种(Agriculture Canada)或任何其他市售的苜蓿变种，如Brown D.C.W.和Atanassov A.(Plant Cell Tissue Organ Culture 4，111(1985))所述。或者选择RA3变种(University of Wisconsin)用于组织培养(Walker等，Am.J.Bot.65，654(1978))。
可以将叶柄外植体与含有二元载体的根癌农杆菌C58C1 pMP90(McKersie等，Plant Physiol 119，839(1999))或LBA4404的过夜培养物共培养。已经描述了许多不同的二元载体系统用于植物转化(例如An G.，Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology，第44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey M.R.编辑Humana Press，Totowa，NewJersey)。许多可基于Bevan(Nucleic Acid Research.12，8711(1984))描述的载体pBIN19，其包含植物基因表达盒，其侧翼为来自根癌农杆菌Ti质粒的左和右边界序列。植物基因表达盒由至少两个基因组成——选择标记基因和调节反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、核酶分子或病毒核酸分子转录的植物启动子。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,7673,666和6,225,105)。相似地，可以使用多种启动子来调节抑制盒，所述抑制盒提供组成型、发育、组织或环境型调节的基因抑制。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登记号M59930和X16673)来提供抑制盒的组成型表达。
在黑暗中将外植体在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基中共培养3天。可以将外植体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，其中不含有乙酰丁香酮，而是含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，可将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素但含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基。然后可将体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基中萌发。将生根的苗转移至盆中并在温室中培养。
可通过节剪切并在Turface生长培养基中生根来繁殖T0转基因植物。植物可落叶并生长至约10cm的高度(落叶后约2周)。另外，可以通过标准方法如Northern印迹或定量RTPCR来分析原代转基因植物(T0)中要抑制的基因受抑制的表达。
根据说明书201页(黑麦草植物)、说明书203页(大豆植物)、说明书204页(玉米植物)、说明书205页(小麦植物)、说明书206页(油菜/芸苔)或说明书207页(苜蓿植物)的耐性植物显示提高的产量，尤其是产量相关性状，例如氮利用效率和/或生物量产生。
通过基因(例如包含SEQ ID NO：27中所示序列)的同源重组来敲除基因
在随机诱变的种群中鉴定基因的突变：
a)在化学或放射突变的种群中
产生化学或放射突变的群体是一种常用技术，并为本领域技术人员所知。方法描述于Koorneef等，1982及其参考文献，以及Lightner和Caspar“Methods in Molecular Biology”第82卷。这些技术一般诱导点突变，可使用诸如TILLING(Colbert等，2001)的方法在任何已知基因中鉴定所述点突变。
b)通过反向遗传在T-DNA或转座子中突变的种群
已在多种情况下描述了用于鉴定目的基因内的插入突变体的反向遗传策略，例如Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))；Sessions等(Plant Cell14，2985(2002))；Young等(Plant Physiol.125，513(2001))；Koprek等(Plant J.24，253(2000))；Jeon等(Plant J.22，561(2000))；Tissier等(PlantCell 11，1841(1999))；Speulmann等(Plant Cell 11，1853(1999))。简言之，可以收获来自大T-DNA或转座子诱变植物群中所有植物的材料，并制备基因组DNA。接着按照Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))所述的特定结构合并基因组DNA。接着通过检测插入诱变剂(如T-DNA或转座子)与目的基因之组合的特异性多重PCR反应来筛选基因组DNA库。因此，用T-DNA或转座子边界引物与基因特异性引物的特定组合对DNA库进行PCR反应。引物设计的一般原则也可得自Krysan等(Plant Cell 11，2283(1999))。对低水平DNA库再次进行筛选，导致鉴定出目的基因被插入诱变剂破坏的个体植物。
等同物
本领域技术人员应当明白，或者能够使用不超过常规的实验确定，本文所述本发明的特定实施方案的许多等同物。这类等同物可以意欲包括在以下的权利要求中。
Claims (40)
1.与相应野生型植物相比提高植物产量的方法，所述方法包括降低植物或其部分中选自以下的一种或多种活性：At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶以及含有SET结构域的蛋白。
2.产生与相应未经转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比具有提高的产量的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)降低、抑制或缺失植物细胞、植物或植物部分中选自以下的一种或多种活性：At1g74730蛋白、At3g63270蛋白、蛋白激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和含有SET结构域的蛋白；和
(b)产生与相应未经转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比具有增强的NUE和/或提高的生物量产生之转化植物细胞、植物或其部分，并在允许该植物细胞、植物或其部分发育的条件下进行培养。
3.用于产生与相应未经转化的野生型植物相比具有提高的产量的转基因植物细胞、植物或其部分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)降低、抑制或缺失植物细胞、植物或其部分中的以下活性：
(i)分别包含表II或表IV第5或7列所示多肽、共有序列或至少一种多肽基序的多肽；或
(ii)包含表I第5或7列所示多核苷酸的核酸分子的表达产物，
(iii)或者(i)或(ii)的功能等同物；和
(b)产生与相应的未经转化的野生型植物细胞、植物或其部分相比具有增强的NUE和/或提高的生物量产生的转化植物，并在允许该植物发育的条件下进行培养。
4.权利要求1到3中任一项所述的方法，所述方法包括降低、减少或缺失至少一种下述核酸分子的表达或活性，所述核酸分子具有或编码表I第5列所示核酸分子的至少一种核酸分子的活性，并包含选自以下的或者包含与下述内容互补的序列的核酸分子：
(a)编码表II第5或7列所示多肽的核酸分子；
(b)表I第5或7列所示核酸分子；
(c)核酸分子，其由于遗传密码的简并性而能够衍生自表II第5或7列所示多肽序列；
(d)核酸分子，其与包含表I第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；
(e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)至(c)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并具有包含表I第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(f)编码多肽的核酸分子，所述多肽能够借助于针对(a)至(e)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体或多克隆抗体来分离，并具有包含表I第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(g)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或者一种或多种多肽基序，并优选具有包含表II或IV第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性；
(h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列所示蛋白质的活性；
(i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过用表III第7列的引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得，并优选具有包含表II或表IV第5列所示多核苷酸的核酸分子的活性，所述引物在其5’端不以核苷酸ATA开始；
(j)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过在(a)至(d)核酸分子所编码多肽的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而产生；和
(k)核酸分子，其能够通过在严格杂交条件下筛选合适的核酸文库而获得，其中使用包含(a)或(b)核酸分子之互补序列的探针或其片段，所述探针或其片段具有与(a)至(d)所表征的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt，优选20nt，30nt，50nt，100nt，200nt或500nt，并编码下述多肽，所述多肽具有包含表II第5列所示多肽的蛋白质的活性；
或者降低、抑制、减少或缺失包含(a)至(k)所示核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含表II第5或7列所示多肽的多肽；或者所述核酸分子所编码的蛋白质的表达产物。
5.权利要求1到4中任一项的方法，包括降低植物细胞、植物或其部分中下述多肽的活性或表达，所述多肽包含权利要求3所表征的核酸分子所编码的多肽。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的步骤：
(a)引入编码核糖核酸序列的核酸分子，所述核糖核酸序列能形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt片段与选自以下的核酸分子具有至少50％的同源性：
(i)权利要求1到3中任一项表征的核酸分子；
(ii)核酸分子，其如表I第5或7列所示，或者编码如表II第5或7列所示的多肽，和
(iii)核酸分子，其编码具有表II第5列所示多肽之活性的多肽，或者编码包含表I第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的表达产物；
(b)引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子包含与选自本权利要求(a)部分所定义的核酸分子具有至少50％同源性的至少17nt的片段；
(c)引入核酶，其特异性切割选自本权利要求(a)部分所定义的核酸分子；
(d)引入(b)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子以及(c)中表征的核酶；
(e)引入有义核酸分子，以诱导内源表达产物的共抑制，所述有义核酸分子赋予下述核酸分子表达，所述核酸分子包含选自权利要求2到3任一项中定义组的或本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的核酸分子，或是编码下述多肽的核酸分子，所述多肽与权利要求3(a)至(c)的核酸分子所编码多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性，并具有包含表II第5列所示多肽之蛋白质的活性，
(f)引入赋予蛋白质显性负突变体表达的核酸分子，所述蛋白质具有表II第5或7列所示蛋白质的活性，或者包含由权利要求2到3中任一项表征的核酸分子编码的多肽；
(g)引入编码下述因子的核酸分子，所述因子与核酸分子结合，所述核酸分子包含选自权利要求2到3中任一项定义的或者本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质具有权利要求2到3中任一项表征的核酸分子所编码的蛋白质的活性；
(h)引入赋予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子包含选自权利要求2到3中任一项定义的或者本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质由权利要求2到3中任一项表征的核酸分子所编码；
(i)引入能与内源基因重组并使其活性沉默、失活、抑制或降低的核酸构建体，所述内源基因包含选自权利要求2到3中任一项定义的或者本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的核酸分子，其赋予蛋白质表达，所述蛋白质由权利要求2到3中任一项表征的核酸分子所编码；
(j)在内源基因中引入非沉默突变，所述内源基因包含权利要求2到3中任一项中定义的或者本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义的核酸分子；
(k)引入表达构建体，其赋予(a)至(i)中任一项所表征核酸分子的表达。
7.权利要求1到6中任一项所述的方法，其中包含下述核酸分子的序列之至少17bp且具有至少50％同一性的3’或5’核酸序列片段被用于减少权利要求2到3中任一项表征的核酸分子或所述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子选自权利要求2到3中任一项定义的组或由本权利要求(a)(ii)或(a)(iii)部分所定义。
8.权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述植物选自漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、胡桃科、樟科、豆科、亚麻科、多年生草本、饲用作物、蔬菜和观赏植物。
9.权利要求1到8中任一项的方法，包括引入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体和/或反义核酸的步骤，其被设计成靶向基因的表达产物以诱导所述目的基因mRNA断裂，由此使基因表达沉默，或者引入确保前者表达的表达盒，所述基因包含权利要求2到3任一项中表征的核酸分子。
10.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
(a)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表II B第5或7列所示多肽；
(b)核酸分子，其包含表I B第5或7列所示多核苷酸；
(c)包含下述核酸序列的核酸分子，所述核酸序列由于遗传密码的简并性而能够衍生自表II B第5或7列所示多肽序列，并具有表II第5列所示蛋白质的活性；
(d)编码多肽的核酸分子，所述多肽与(a)或(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性，并具有表II第5列所示蛋白质的活性；
(e)编码多肽的核酸分子，所述多肽借助于针对(a)至(c)核酸分子之一所编码多肽而产生的单克隆抗体来分离，并具有表II第5列所示蛋白质的活性；
(f)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列所示共有序列或多肽基序，并具有表II第5列所示蛋白质的生物活性；
(g)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列所示蛋白质的活性；
(h)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通过使用表III第7列所示引物扩增cDNA文库或基因组文库而获得，所述引物在其5’端不以核苷酸ATA开始；和
(i)核酸分子，其可通过在严格杂交条件下筛选合适的文库而获得，并编码多肽，所述多肽具有表II第5列所示蛋白质的活性，所述筛选中使用包含(a)到(c)核酸分子序列之一的探针或使用(a)至(h)任一项所表征核酸分子的至少17nt的片段；
或者包含与其互补的序列；
其中(a)至(i)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与表I A第5或7列所示序列不同，并优选地编码至少在一个或多个氨基酸上与表II A第5或7列所示蛋白质序列不同的蛋白质。
11.RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或反义核酸分子，其用于降低权利要求1表征的活性，或者降低权利要求2到10任一项中表征的核酸分子或所述核酸分子编码的多肽的活性或表达。
12.权利要求的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，其包含权利要求10的核酸分子的至少17nt的片段。
13.双链RNA(dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、反义或ta-siRNA分子或核酶，其能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与选自以下的核酸分子具有至少50％的同源性：
(i)权利要求2到3中任一项表征的核酸分子；
(ii)核酸分子，其如表I第5或7列所示，或者编码如表II第5或7列所示的多肽，和
(iii)核酸分子，其编码具有表II第5或7列所示多肽之活性的多肽，或者编码包含表I第5或7列所示核酸分子之多核苷酸的表达产物。
14.权利要求10到13中任一项的dsRNA分子，其中所述有义链和反义链彼此共价结合，并且反义链与“有义”RNA链基本互补。
15.赋予RNA分子降低的病毒核酸分子，所述RNA分子赋予具有权利要求1表征的活性的蛋白质表达，或者权利要求2到10中任一项表征的核酸分子的活性或表达，或者所述核酸分子所编码多肽的活性或表达。
16.用于鉴定基因敲除的tilling引物，所述基因包含表I第5或7列中任一项所示核酸分子的核酸序列。
17.多肽的显性负突变体，所示多肽包含表II第5或7列所示多肽。
18.编码权利要求17的显性负突变体的核酸分子。
19.权利要求16的tilling引物，其包含表I第5列或第7列中所示核酸序列的片段或其互补片段。
20.赋予以下表达的核酸构建体：权利要求11到14中任一项的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶、抗体或反义核酸分子，权利要求15的病毒核酸分子或者权利要求10的核酸分子。
21.核酸构建体，其包含权利要求10所述的分离的核酸分子，或权利要求11到14中任一项的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，或权利要求15的病毒核酸分子，其中所述核酸分子与一个或多个调节信号功能性连接。
22.载体，其包含权利要求10所述的核酸分子，或权利要求11到14中任一项的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，或权利要求15的病毒核酸分子，或权利要求21中所述核酸构建体。
23.权利要求22中所述载体，其中所述核酸分子与用于在植物细胞、植物或其部分中表达的调节序列有效连接。
24.转基因植物细胞、植物或其部分，其稳定转染或瞬时转染了权利要求22或23中所述载体，或权利要求10所述核酸分子，或权利要求20或21中所述核酸构建体。
25.转基因植物细胞、植物或其部分，其中包含表II第5或7列、优选表II B第5或7列，或者表IV第5或7列所示多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质的活性被降低，或者包含表I第5或7列、优选表I B第5或7列所示核酸分子的核酸分子被降低。
26.权利要求24或25的来自于单子叶植物的转基因植物细胞、植物或其部分。
27.权利要求24或25的来自于双子叶植物的转基因植物细胞、植物或其部分。
28.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉米(玉蜀黍)，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦，稻，大麦，大豆，花生，棉花，油菜(包括芸苔和冬季油菜)，木薯，胡椒，向日葵，亚麻，琉璃苣，红花，亚麻子，报春花，油菜，芜青，万寿菊，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，西红柿，蚕豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草本植物，饲料作物和拟南芥。
29.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自玉米、大豆、油菜(包括芸苔和冬季油菜)、棉花、小麦和稻。
30.分离的多肽，其由权利要求10所述核酸分子编码或者包含表II B第7列所示多肽。
31.与权利要求31所述多肽特异性结合的抗体。
32.包含权利要求24或25所述植物细胞的植物组织、植物、收获的植物材料或繁殖材料。
33.用于生产由权利要求10所述核酸序列编码的多肽的方法，所述多肽在权利要求24或25所述的宿主细胞中表达。
34.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，其在对于未经转化的的野生型植物细胞、植物或其部分的生长而言氮有限的条件下具有提高的产量。
35.筛选权利要求1表征的活性或权利要求2到3中任一项表征的核酸分子所编码多肽之活性的拮抗剂的方法：
i)将表达该多肽的生物、其细胞、组织或部分与化合物或含有多种化合物的样品在下述条件下相接触，该条件允许降低或缺失编码该蛋白之活性的核酸分子的表达或者允许降低或缺失该蛋白之活性；
ii)测定所述植物、其细胞、组织或部分中蛋白质的活性水平或者多肽的表达水平；和
iii)通过将测得的蛋白质活性水平或多肽表达水平与下述条件下测得的标准蛋白质活性水平或多肽表达水平进行比较而鉴定拮抗剂，该条件无所述化合物或包含所述多种化合物的样品，其中与标准相比降低的水平表示所述化合物或者包含所述多种化合物的样品是拮抗剂。
36.用于鉴定赋予植物中与相应未经转化的野生型植物相比提高产量的化合物和/或的方法；所述方法包括步骤：
(i)培养或维持植物或其部分，其表达具有权利要求1表征的活性的多肽，或者由权利要求2或3中任一项表征的核酸分子所编码的多肽，或者编码所述多肽的多核苷酸，以及能与所述多肽在合适条件下相互作用的读出系统，所述条件允许该多肽与此读出系统在化合物或含有多种化合物的样品存在下相互作用，并且所述读出系统能够应答于化合物与所述多肽在允许抑制所述读出系统及所述多肽的条件下的结合而提供可检测信号；和
(ii)通过检测所述读出系统所产生的信号的存在与否或者下降或提高来鉴定该化合物是否是有效的拮抗剂。
37.组合物，其包含根据权利要求30的蛋白质，权利要求10的核酸分子，权利要求20或21的核酸构建体，权利要求22或23的载体，根据权利要求35鉴定的拮抗剂，权利要求31的抗体，权利要求24到29中任一项的植物，权利要求2到3中任一项表征的核酸分子，权利要求11到14中任一项的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，以及任选的农业可接受运载体。
38.食物或饲料组合物，其包含根据权利要求30的蛋白质，权利要求10的核酸分子，权利要求20或21的核酸构建体，权利要求22或23的载体，根据权利要求35鉴定的拮抗剂，权利要求31的抗体，权利要求24到29中任一项的植物，权利要求2到3中任一项表征的核酸分子，权利要求11到14中任一项的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共阻抑分子、核酶或反义核酸分子，权利要求32或36的植物的植物、植物组织、收获的植物材料或繁殖材料。
39.i)权利要求11到14中任一项的核酸分子，权利要求15的病毒核酸分子或权利要求10的核酸分子，或
ii)根据权利要求20或21的核酸构建体，或
iii)权利要求22或23的载体；
用于制备与相应未经转化的野生型植物细胞、植物或植物部分相比具有增强的NUE和/或提高的生物量产生的植物细胞的用途。
40.用于测定受试土壤氮含量的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地，在无氮缺乏的土壤中培养包含权利要求11到14中任一项的核酸分子的植物，比较产量并测定所述植物与所述土壤中培养的对照植物产量的产量差异，优选地与野生型植物比较，并且在所述植物与对照植物相比不显示提高的产量时选择所述植物；
b)将包含权利要求11到14中任一项的核酸分子的所述植物在要测试的土壤中培养，
c)比较产量，并测定所述植物生产的产量与相同条件下在所述土壤中培养的对照植物的产量的差异，优选地与野生型植物相比，
其中与所述对照植物相比所述植物提高的产量表明土壤的氮缺乏。
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