CN101952421A

CN101952421A - 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸

Info

Publication number: CN101952421A
Application number: CN2008801261232A
Authority: CN
Inventors: 阿尔弗雷多·洛佩兹德利昂; 迈克尔·雷伊
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2011-01-19
Also published as: BRPI0820613A2; WO2009105141A2; US20090148902A1; US20150175990A1; US7741074B2; US20130291230A1; WO2009105141A3; US8268606B2; CA2707796A1; US20120331588A1; US20100203615A1; US8975059B2; EP2225372A2; US8465958B2

Abstract

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸

关于在联邦资助的研究和发展下完成的发明的权利的声明

该发明在能源部授予的主合同DE-AC36-98GO10337，NREL转包合同No.ZCO-30017-02下以政府支持完成。政府对本发明拥有一定权利。

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。

涉及生物材料保藏物

本申请含有对生物材料的保藏物的涉及，将所述保藏物通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

纤维素是由单糖葡萄糖通过β-1，4-键连接的多聚物。许多微生物产生水解β-连接葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化所述纤维素多聚物，使其开放以通过纤维二糖水解酶进行攻击。纤维二糖水解酶随后自所述纤维素多聚物末端释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性的β-1，4-连接二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。

将木质纤维质原料转化为乙醇具有如下优点：大量原料现成可得，期望避免焚烧或填埋所述材料，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物已经被考虑作为供乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦纤维素转换为葡萄糖，葡萄糖可容易的由酵母发酵为乙醇。

Kvesitadaze等，1995，Applied Biochemistry and Biotechnology 50：137-143描述了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)嗜热突变体菌株的热稳定内切葡聚糖酶的分离及其性质。Gilbert等，1992，Bioresource Technology 39：147-154描述了在土生梭孢霉255B纤维素酶系统中存在的酶的表征。Breuil等，1986，Biotechnology Letters 8：673-676描述了来自土生梭孢霉菌株C464和NRRL8126的纤维素酶和β-葡糖苷酶的产生和定位。

本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和

(d)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；和

(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制细胞中具有内切葡聚糖酶活性的多肽表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及在纤维素材料的降解或转换中使用所述具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。

本发明还涉及产生具有内切葡聚糖酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-20或SEQ ID NO：4的氨基酸1-18，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1-20或SEQ ID NO：4的氨基酸1-18组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

附图简述

图1A和1B显示土生梭孢霉NRRL 8126 CEL16内切葡聚糖酶的cDNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图2显示土生梭孢霉NRRL 8126 CEL16内切葡聚糖酶的cDNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：3和4)。

图3显示pTter16A的限制图谱。

图4显示pTter16B的限制图谱。

定义

内切葡聚糖酶活性：术语“内切葡聚糖酶活性”在本文中定义为内-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键，混合β-1，3-葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纤维素组分的植物材料中β-1，4-键的内水解。就本发明而言，内切葡聚糖酶活性使用羟甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法加以确定。一单位的内切葡聚糖酶活性定义为在50℃，pH4.8每分钟产生1.0μmol的还原糖。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的内切葡聚糖酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

家族16或家族GH16或CEL16：术语“家族16”或“家族GH16”或“CEL16”在本文中定义为按照Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，以及Henrissat和Bairoch，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696.属于糖苷水解酶家族16的多肽。

纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性"在本文中定义为水解含纤维素材料的生物学活性。纤维素分解蛋白可水解羧甲基纤维素(CMC)，由此减少温育混合物的粘度。所导致的粘度减少可通过振动粘度计(vibration viscosimeter、)(例如，来自Sofraser，France的MIVI 3000)来确定。以Cellulase Viscosity Unit(纤维素酶粘度单位)(CEVU)的形式测定的纤维素酶活性的确定，是通过测定样品减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来定量存在于该样品中的催化活性的量。所述分析法在适于所述纤维素分解蛋白与底物的温度与pH下进行。对于CELLUCLAST^TM(里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶Novozymes A/S，

Denmark)，该分析法在40℃在0.1M磷酸盐pH9.0缓冲液中以CMC作为底物(33.3g/L羧甲基纤维素Hercules 7 LFD)以及约3.3-4.2CEVU/ml的酶浓度进行。所述CEVU活性相对于已公知的酶标准物，如CELLUZYME^TM标准物17-1194(得自Novozymes A/S，

Denmark)来计算。

就本发明而言，纤维素分解活性可通过测定在下述条件下由纤维素分解混合物进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-10mg的纤维素分解蛋白/gPCS中的纤维素在50℃进行5-7日，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖。就本发明而言，纤维二糖水解酶活性是依照Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288所述的方法来确定的。在本发明中，Lever等的方法可用于估计玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法可用于确定纤维二糖水解酶对荧光二糖衍生物的活性。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J. Basic Microbiol.42：55-66记载的基本方法来测定的，只是如本文所述使用了不同的条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为：在100mM柠檬酸钠、0.01％

20中，在50℃、pH 5从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

纤维素材料：生物质的初级细胞壁(primary cell wall)中主要的多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，第三是果胶。在细胞停止生长后产生的次级细胞壁也含有多糖，并且通过与半纤维素共价交联的多聚体木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并因此为直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有复杂的分枝结构和一系列取代基。虽然纤维素通常是无定形的，但纤维素主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在于植物组织中。半纤维素通常通过氢键键合于纤维素以及其他半纤维素上，这有助于细胞壁基质的稳定化。

纤维素材料可以是含有纤维素的任何材料。纤维素通常存在于例如植物的茎、叶、果/种壳(hulls)、果/种皮(husks)和穗轴(cobs)，或者树的叶、枝、和木材等之中。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(herbaceous material)、农业残余物(agricultural residues)、林业残余物(forestry residues)、城市固体废物(municipal solid wastes)、废纸(waste paper)，以及纸浆和造纸厂残余物(pulp and paper mill residue)。纤维素材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(见例如Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，第105-118页，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，T. Scheper主编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag，New York)。在本文中应当理解，纤维素材料可为木素纤维素的形式，即在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。

在一方面，所述纤维素材料为草本材料。在另一方面，所述纤维素材料为农业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为林业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为城市固体废物。在另一方面，所述纤维素材料为废纸。在另一方面，所述纤维素材料为纸浆和造纸厂残余物。

在另一方面，所述纤维素材料为玉米秸秆。在另一优选的方面，所述纤维素材料为玉米纤维。在另一方面，所述纤维素材料为玉米穗轴。在另一方面，所述纤维素材料为桔/橙皮。在另一方面，所述纤维素材料为稻草/秆。在另一方面，所述纤维素材料为麦秸。在另一方面，所述纤维素材料为柳枝稷(switch grass)。在另一方面，所述纤维素材料为芒草属(miscanthus)。在另一方面，所述纤维素材料为甘蔗渣。

纤维素材料可以直接使用，或者可以使用本领域已知的常规方法对其进行预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的粉碎/磨制(milling)、辐射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆炸(steaming/steam explosion)和水热解(hydrothermolysis)；化学预处理技术可包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH受控的水热解；而生物预处理技术可涉及施用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment ofbiomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

预处理玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过用热和稀酸处理源自玉米秸秆的纤维素材料。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的多肽。在一个优选的方面，基于预测SEQ ID NO：2的氨基酸1-20是信号肽的SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸21-797。在另一优选的方面，基于预测SEQ IDNO：4的氨基酸1-18是信号肽的SignalP软件程序，所述成熟多肽是SEQ IDNO：4的氨基酸19-285。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，基于SignalP软件程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸61-1428，该程序预测核苷酸1-60编码信号肽。在另一优选的方面，基于SignalP软件程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：3的核苷酸55-855，该程序预测核苷酸1-54编码信号肽。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的土生梭孢霉内切葡聚糖酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中具有小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有内切葡聚糖酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少660个氨基酸残基，更优选至少700个氨基酸残基，并且最优选至少740个氨基酸残基。在另一优选的方面，片段含有SEQ ID NO：4的成熟多肽或其同源序列的至少225个氨基酸残基，更优选至少240个氨基酸残基，并且最优选至少255个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1980个核苷酸，更优选至少2100个核苷酸，并且最优选至少2220个核苷酸。在另一优选的方面，亚序列含有SEQ IDNO：3的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少675个核苷酸，更优选至少720个核苷酸，并且最优选至少765个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有内切葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列或其同源序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有内切葡聚糖酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有内切葡聚糖酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸21至797，或其等位变体；或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸21至797。在另一优选的方面，多肽由SEQID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸21至797或其等位变体，或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸21至797组成。

本发明的多肽还优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQID NO：4的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸19至285，或其等位变体；或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸19至285。在另一优选的方面，多肽由SEQID NO：4的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸19至285或其等位变体，或它们的具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸19至285组成。

在第二个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严紧条件、更优选低严紧条件、更优选中严紧条件、更优选中-高严紧条件、甚至更优选高严紧条件、和最优选非常高严紧条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1或SEQID NO：3的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southem印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，或最优选至少800个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²p、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthem印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列；包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸61-1428。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50081中的质粒pTter16A中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50081中的质粒pTter16A中含有的成熟多肽编码区。

在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的核苷酸55-855。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50082中的质粒pTter16B中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50082中的质粒pTter16B中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算得出的T_m低约5℃至约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽或其同源序列包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，内切葡聚糖酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J. Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J. Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(idemity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有内切葡聚糖酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有内切葡聚糖酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有内切葡聚糖酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有内切葡聚糖酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aapergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila或土生梭孢霉(Thielavia terrestris)多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的土生梭孢霉多肽。在一个优选的方面，所述多肽是具有内切葡聚糖酶活性的土生梭孢霉NRRL 8126多肽，例如，包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有内切葡聚糖酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J. Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50081中所含质粒pTter16A中的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸61-1428或由SEQ ID NO：1的核苷酸61-1428组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50081中所含质粒pTter16A中的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50082中所含质粒pTter16B中的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸55-855或由SEQ ID NO：3的核苷酸55-855组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50082中所含质粒pTter16B中的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ IDNO：4的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：3或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：3的亚序列，所述亚序列编码具有内切葡聚糖酶活性的SEQ ID NO：4的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从梭孢壳属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的内切葡聚糖酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO：1或SEQID NO：3的成熟多肽编码序列的全长互补链。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的全长互补链。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn (WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至20或由SEQID NO：2的氨基酸1至20组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至60或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至60组成。

在另一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或由SEQ ID NO：4的氨基酸1至18组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸1至54或由SEQ ID NO：3的核苷酸1至54组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thome，1987，Journal of Bacteriology169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J. Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J. Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl. Acad Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何已知的将DNA引入宿主细胞的方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB Intemational，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是梭孢壳属的。在一个更优选的方面，所述细胞是土生梭孢霉。在一个最优选的方面，所述细胞是土生梭孢霉NRRL 8126。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽分别包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的成熟多肽或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，可以将含有该重组多肽的植物或植物部分按原样用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其它的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

去除或减少内切葡聚糖酶活性

本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调节元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。由此在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无内切葡聚糖酶活性的蛋白质产物的方法：在发酵之前、之中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制内切葡聚糖酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无内切葡聚糖酶活性的蛋白质产物的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以实质上(substantially)减少内切葡聚糖酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与内切葡聚糖酶抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的内切葡聚糖酶活性。可使用此方法获得内切葡聚糖酶活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无内切葡聚糖酶的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。内切葡聚糖酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

在另外的方面，本发明涉及基本上无内切葡聚糖酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及用于抑制细胞中多肽表达的这些包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3成熟多肽编码序列的部分的双链RNA(dsRNA)分子。虽然本发明不受限于任何特定作用机制，但dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默疗法。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述方法可以在体外、在活体外(ex vivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于在细胞、器官或动物中产生功能丧失突变(loss-of-function mutation)。制备或使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利号6,506,559；美国专利号6,511,824；美国专利号6,515，109；和美国专利号6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的内切葡聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库成镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明还涉及供降解或转换纤维素材料的方法，包含：用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在的情况下处理所述纤维素材料。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收经降解或转换的纤维素材料。

本发明还进一步涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物在本发明的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在的情况下糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；以及(c)从发酵物中回收发酵产物。

包含所述具有内切葡聚糖酶活性的多肽的组合物可以以移除或不移除细胞的粗发酵液的形式，或以半纯化的或纯化的酶制备物的形式存在，或者所述组合物可包含本发明的宿主细胞在用所述生物质进行的发酵工艺中作为具有内切葡聚糖酶活性的多肽的来源。

本发明的方法可用于将纤维素材料糖化成为可发酵的糖，并将该可发酵的糖转化为多种有用的物质，例如，化学品与燃料。自所述纤维素材料产生所期望的发酵产物通常涉及预处理，酶水解(糖化)与发酵。

根据本发明对所述纤维素材料的加工可使用本领域常规方法完成。此外，本发明的方法可使用任何经配置以依照本发明操作的常规生物质加工装置加以实施。

分别或同时的水解(糖化)与发酵包括但不仅限于：分别水解与发酵(SHF)；同时糖化与发酵(SSF)；同时糖化与共发酵(SSCF)；混合水解与发酵(HHF)；SHCF(分别水解与共发酵)；HHCF(混合水解与共发酵(hybrid hydrolysis and fermentation))，以及直接微生物转化(DMC)。SHF使用分别的过程步骤以首先将木素纤维素酶法水解为可发酵的糖，例如，葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖与戊糖，并随即将所述可发酵的糖发酵为乙醇。在SSF中，木素纤维素的酶法水解，以及糖发酵为乙醇合并为一步(Philippidis，G. P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF涉及多种糖类的共发酵(Sheehan，J.和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF涉及分别的水解分离步骤，并另外涉及同时的糖化与水解步骤，其可在同一个反应器中进行。在HHF过程中的步骤可在不同温度下进行，即，高温酶法糖化继之以在较低的、发酵菌株可容忍的温度的SSF。DMC将所有三个过程(酶产生，木素纤维素水解与发酵)合并于一个或多个步骤，其中使用相同生物体来产生酶用于将木素纤维素转化为可发酵的糖并将所述可发酵的糖转化为终产物(Lynd，L. R.，Weimer，P. J.，van Zyl，W.H.和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文中应理解，包括预处理，酶水解(糖化)，发酵或其组合的本领域已知的任何方法可用于实施本发明的方法。

常规装置可包括补料分批搅拌反应器(fed-batch stirred reactor)，分批搅拌反应器(batch stirred reactor)，带超滤的连续流搅拌反应器(continuous flow stirred reactor with ultrafiltration)和/或连续的活塞流柱式反应器(continuous plug-flow column reactor)(Femanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology 25：33-38；Gusakov，A.V.和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose：1.Amathematical model for a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.7：346-352)，磨耗反应器(an attrition reactor)(Ryu，S.K.和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者带有由电磁场诱导的强搅拌的反应器(a reactor with intensive stirring induced by an electromagnetic field)(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V. Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其他类型的反应器包括：流化床(fluidized bed)、上流床(upfloW blanket)、固定化的以及挤出机(extruder)类型反应器以供水解和/或发酵。

预处理在实施本发明的方法时，本领域已知的任何预处理过程可用于破坏植物细胞壁组分。所述纤维素材料还可在使用本领域已知方法进行预处理之前进行预浸(pre-soaking)，润湿(wetting)，或调理(conditioning)。常规预处理包括但不限于，蒸汽预处理(爆炸或不爆炸)，稀酸预处理，热水预处理，石灰预处理，湿氧化，湿爆炸，氨纤维爆炸，有机溶剂预处理以及生物预处理。其它预处理包括超声，电穿孔，微波，超临界CO₂，超临界H₂O和氨渗滤预处理。

所述纤维素材料可在水解和/或发酵前进行预处理。预处理优选在水解前进行。或者，所述预处理可与水解过程同时进行，如与用一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性处理纤维素材料同时进行，以释放可发酵的糖，如葡萄糖和/或麦芽糖。在多数情况下，所述预处理步骤本身导致生物质部分转化为可发酵的糖(甚至酶不存在时亦如此)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，将纤维素材料加热以破坏其植物细胞壁组分(包括木质素、半纤维素和纤维素)，以使纤维素与其它部分(例如，半纤维素)易受酶作用(accessible to enzymes)。使木素纤维素材料传至或经过反应容器，在该反应容器中注入蒸汽以增加温度至所需温度和压力，并在其中保持到所期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，且最优选170-190℃进行，其中最佳温度范围取决于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选为1-15分钟，更优选为3-12分钟，且最优选为4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体装载(量)，从而使得纤维素材料通常仅在预处理过程中为潮湿的。所述蒸汽预处理常常与预处理之后材料的爆炸性排出(explosive discharge)组合，其称为蒸汽爆炸，即，所述材料迅速闪蒸至大气压力和湍流以通过碎裂增加其可接触表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团遭剪切，且所得的酸自催化半纤维素的部分水解为单糖与寡糖。仅有限程度地移除木质素。

常常在蒸汽预处理前添加催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常为0.3到3％w/w)，其减少时间与温度，增加回收(率)，并改善酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。

化学预处理：术语“化学预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理过程的实例包括，例如，稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(ammonia fiber/freeze explosion，AFEX)、氨渗滤(APR)以及有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将所述纤维素材料与稀酸，通常为H₂SO₄，以及水混合以形成浆料，由蒸汽加热至所期望的温度，并在停留时间后闪蒸至大气压力。所述稀酸预处理可用多种设计的反应器来实施，例如，活塞流反应器，逆流反应器(counter-current reactor)或连续逆流收缩床反应器(continuous counter-current shrinking bed reactor)(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，Bioresource Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。

亦可使用数种碱性条件下的预处理方法。这些碱性预处理方法包括但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)与氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

石灰预处理使用碳酸钙，氢氧化钠或氨在85-150℃的低温以及1小时到数日的停留时间进行(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol. 96：673-686)。WO 2006/110891、WO2006/11899、WO 2006/11900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿氧化为下述的热预处理方法，即其通常在180-200℃进行5-15分钟，加以氧化剂如过氧化氢或氧气超压(over-pressure)(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol. Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。该预处理优选以1-40％干物质，更优选2-30％干物质，且最优选5-20％干物质进行，且起始pH常常通过添加碱性物质，例如碳酸钠来增加。

所述湿氧化预处理方法的改进，称为湿爆炸(湿氧化与蒸汽爆炸的组合)，可处理多达30％的干物质。在湿爆炸中，氧化剂在预处理过程中一定停留时间之后导入。所述预处理随即通过闪蒸至大气压力来终止(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及用液态或气态氨在中等温度(如90-100℃)以及高压(如17-20巴)对纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物遭剪切。

有机溶剂预处理通过用乙醇水溶液(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而使纤维素材料脱木质化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl. Biochem.Biotechnol.121：219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素得到移除。

合适的预处理方法的其它实例由Schell等，2003，Appl. Biochem.and Biotechnol.Vol.105-108，p.69-85与Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及公布的美国申请2002/0164730描述。

在一方面，所述化学预处理优选作为酸处理来进行，且更优选作为连续性稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。所述酸通常为硫酸，但亦可使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物。弱酸处理在pH范围优选为1-5，更优选为1-4，且最优选为1-3进行。在一方面，所述酸浓度范围为优选0.01到20wt％的酸，更优选0.05到10wt％的酸，甚至更优选0.1到5wt％的酸，且最优选0.2到2.0wt％的酸。所述酸与纤维素材料接触，并在范围优选为160-220℃，且更优选为165-195℃的温度保持数秒至数分钟范围的时间，例如，1秒到60分钟。

在另一方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在一个优选的方面，所述纤维素材料在预处理过程中以优选为10-80wt％，更优选为20-70wt％，且最优选为30-60wt％，例如约50wt％的量存在。所述经预处理的纤维素材料可不经洗涤，或使用本领域任何已知方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指不同类型的碾磨或磨制(grinding or milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨(vibratory ball milling))。

物理预处理：术语“物理预处理”指任何促进自纤维素材料分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素的预处理。举例而言，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解以及其组合。

物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一方面，高压意为范围在优选约300到约600psi，更优选约350到约550psi，且最优选约400到约500psi，例如约450psi的压力。在另一方面，高温意为范围在约100到约300℃，优选约140到约235℃的温度。在一个优选方面，机械预处理在分批过程，蒸汽枪水解仪系统中进行，所述系统使用如上所述定义的高压与高温，例如，可自Sunds Defibrator AB，Sweden得到的Sunds Hydrolyzer。

组合的物理和化学预处理：纤维素材料可经物理与化学方法两者预处理。举例而言，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。物理与化学预处理可视需要顺序或同时进行。亦可包含机械预处理。

因此，在一个优选方面，可对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或其任意组合以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指任何促进自纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的生物预处理。生物预处理技术可涉及施用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

糖化在亦称为糖化的水解步骤中，将所述经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和可选地还有半纤维素分解为可发酵的糖，例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或可溶性寡糖。所述水解用酶法通过纤维素分解酶组合物进行，所述组合物包含有效量的本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽，其可进一步包含一种或多种分解半纤维素的酶。该组合物的酶亦可顺序添加。

酶水解优选在合适的水溶液环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下进行。在一个优选方面，水解在适于所述酶活性，即，对于所述酶为最佳的条件下进行。所述水解可作为分批补料或连续工艺进行，在后者中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐进料至，例如，含有酶的水解溶液中。

所述糖化通常在搅拌釜式反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的过程时间、温度与pH条件可由本领域技术人员容易地确定。举例而言，所述糖化可持续长达200小时，但通常优选进行约12到约96小时，更优选约16到约72小时，且最优选约24到约48小时。温度范围优选约25℃到约70℃，更优选约30℃到约65℃，且最优选约40℃到60℃，特别是50℃。pH范围优选约3到约8，更优选约3.5到约7，且最优选约4到约6，特别为约pH5。干物质含量范围优选约5到约50wt％，更优选约10到约40wt％，且最优选约20到约30wt％。

除本发明具有内切葡聚糖酶活性的多肽之外，所述组合物的纤维素分解酶组分优选是具有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶与β-葡糖苷酶活性的酶。在一个优选方面，所述纤维素分解酶组合物进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽(参见，例如，WO 2005/074647，WO 2005/074656和美国公开申请No.2007/0077630，其通过提述并入本文)。在另一个优选方面，所述纤维素分解酶制备物补充有一种或多种额外的选自下组的酶活性：半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。在本发明的方法中，所述额外的酶可在发酵之前或过程中添加，包括在繁殖发酵微生物的过程中或之后添加。

所述酶可源自或得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。在本文中术语“获得”指该酶可分离自天然产生该酶作为天然酶的生物。在本文中术语“获得”也指所述酶可在宿主生物中使用本文所描述的方法重组产生，其中所述重组产生的酶对于所述宿主生物可为天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个缺失、插入和/或取代的氨基酸的修饰的氨基酸序列，即，重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者其为通过本领域已知的核酸改组过程(nucleic acid shuffling process)产生的酶。天然酶含意中涵盖天然变体，而外源酶含意中涵盖重组获得的变体，例如，通过定位诱变或改组获得的变体。

用于本发明中的酶可为任何适用于本文所述方法的形式，例如，有或无细胞的粗发酵液，或基本上纯的多肽。所述酶可为干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化的液体或受保护的酶。颗粒可以，例如，如美国专利Nos.4,106,991和4,661,452中所公开的来产生，且可任选地通过本领域已知的方法包覆。液体酶制备物可，例如，通过添加稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或另一种有机酸根据已经确立的方法加以稳定化。受保护的酶可根据公开于EP 238,216中的方法制备。

所述具有纤维素分解增强活性的酶和多肽的最佳量取决于多种因素，包括但不限于，组分纤维素分解蛋白质的混合物、纤维素底物、纤维素底物的浓度、纤维素底物的预处理、温度、时间、pH以及发酵生物的包括(例如，供同时糖化与发酵的酵母)。

在一个优选方面，对于纤维素材料的纤维素分解蛋白质的有效量为每g纤维素材料约0.5到约50mg，优选约0.5到约40mg，更优选约0.5到约25mg，更优选约0.75到约20mg，更优选约0.75到约15mg，甚至更优选约0.5到约10mg，且最优选约2.5到约10mg。

在另一个优选方面，对于纤维素材料具有内切葡聚糖酶活性的多肽的有效量是每g纤维素材料约0.01到约50mg，优选约0.5到约40mg，较优选约0.5到约25mg，较优选约0.75到约20mg，更优选约0.75到约15mg，甚至更优选约0.5到约10mg，且最优选约2.5到约10mg。

在另一个优选方面，对于纤维素材料具有纤维素分解增强活性的多肽的有效量为每g纤维素材料约0.01到约50.0mg，优选约0.01到约40mg，更优选约0.01到约30mg，更优选约0.01到约20mg，更优选约0.01到约10mg，更优选约0.01到约5mg，更优选约0.025到约1.5mg，更优选约0.05到约1.25mg，更优选约0.075到约1.25mg，更优选约0.1到约1.25mg，甚至更优选约0.15到约1.25mg，且最优选约0.25到约1.0mg。

在另一个优选方面，对于纤维素分解蛋白质具有纤维素分解增强活性的多肽的有效量为每g纤维素分解蛋白质约0.005到约1.0g，优选约0.01到约1.0g，更优选约0.15到约0.75g，更优选约0.15到约0.5g，更优选约0.1到约0.5g，甚至更优选约0.1到约0.5g，且最优选约0.05到约0.2g。

发酵得自所述经预处理与水解的纤维素材料的可发酵的糖可由一种或多种能够将所述糖直接或间接发酵为所期望的发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵过程或任何包含发酵步骤的方法。发酵方法亦包括用于醇类消费品工业(例如，啤酒与葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业与烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所期望的发酵产物以及发酵生物，且可由本领域技术人员简单地确定。

在所述发酵步骤中，作为预处理与酶水解步骤的结果自所述纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵为产物，例如乙醇。可分别或同时进行水解(糖化)与发酵。上述方法包括但不限于，分别水解与发酵(SHF)；同时糖化与发酵(SSF)；同时糖化与共发酵(SSCF)；混合水解与发酵(HHF)；SHCF(分别水解与共发酵)；HHCF(混合水解与共发酵)，以及直接微生物转化(DMC)。

任何合适的经水解的纤维素材料可在实施本发明时用于所述发酵步骤。所述材料通常基于所期望的发酵产物(即，自发酵获得的物质)，以及所用的方法而选择，如本领域所公知的。适用于本发明方法的底物的实例包括含纤维素材料，如木材或植物残余物或得自经处理的纤维素材料的低分子糖DP1-3，所述纤维素材料可由发酵微生物进行代谢，且其可通过直接添加至发酵培养基中进行供应。

在本文中术语“发酵培养基”应理解为指在添加发酵微生物之前的培养基，如，由糖化方法产生的培养基，以及用于同时糖化与发酵方法(SSF)的培养基。

“发酵微生物”指任何微生物，包括细菌与真菌生物，其适用于所期望的发酵方法以产生发酵产物。所述发酵生物可为C₆和/或C₅发酵生物，或其组合。C₆与C₅发酵生物均是本领域所公知的。合适的发酵微生物能够将糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。

产生乙醇的细菌与真菌发酵生物的实例描述于Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642。

可发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌与真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株。

可发酵C5糖的发酵生物的实例包括细菌与真菌生物，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)，优选博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)，芸薹假丝酵母(Candida brassicae)，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，迪丹氏假丝酵母(Candida diddensii)，假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊氏酵母属(Hansenula)，如异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株；以及大肠杆菌(E.coli)，特别是经遗传修饰而改善了乙醇产量的大肠杆菌菌株。

在一个优选方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选方面，酵母为酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母为糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵母为葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选方面，酵母为克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选方面，酵母为脆壁克鲁维酵母。在另一个优选方面，酵母为假丝酵母属。在另一个更优选方面，酵母为博伊丁氏假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为迪丹氏假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母为棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母为葡萄牙棍孢(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母为仙人掌棍孢(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，酵母属于管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选方面，酵母为嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选方面，酵母属于毕赤酵母属。在另一个更优选方面，酵母为树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母属于酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选方面，酵母为克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。

可有效将己糖与戊糖发酵为乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌与热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上)。

在一个优选方面，所述细菌为发酵单胞菌属。在一个更优选方面，所述细菌为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述细菌为梭菌属(Clostridium)。在另一个更优选方面，所述细菌为热纤维梭菌。

适用于产生乙醇的商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL RED^TM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre，USA)，FALI^TM(可得自Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART^TM与THERMOSACC^TM新鲜酵母(可得自Ethanol Technology，WI，USA)，BIOFERM^TM AFT与XR(可得自NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA)，GERT STRAND^TM(可得自Gert Strand AB，Sweden)，以及FERMIOL^TM(可得自DSM Specialties)。

在一个优选的方面，所述发酵微生物可经遗传修饰以提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖，利用阿拉伯糖以及共同利用木糖与阿拉伯糖的微生物。

将异源基因克隆入多种发酵微生物导致能够将己糖与戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物的构建(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：a proof of principle，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470)。

在一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为酿酒酵母。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为大肠杆菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

在本领域众所周知上述生物亦可用于产生其它物质，如本文所述。

所述发酵微生物通常添加至经降解的木素纤维素或其水解物，且将所述发酵进行约8到约96小时，例如约24到约60小时。温度通常为约26℃到约60℃之间，特别是约32℃或50℃，且在约pH3到约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个优选方面，将所述酵母和/或另一微生物施用于经降解的木素纤维素或其水解物，且所述发酵进行约12到约96小时，例如通常24-60小时。在一个优选方面，温度优选为约20℃-约60℃，更优选约25℃到约50℃，且最优选约32℃到约50℃，特别是约32℃或50℃，且pH通常为约pH3-约pH7，优选约pH4-7。然而，其中一些，例如细菌发酵生物具有较高的最适发酵温度。酵母或其它微生物优选以每ml发酵液约10⁵到10¹²，优选约10⁷到10¹⁰，特别是约2x 10⁸活细胞计数的量施用。关于使用酵母以供发酵的进一步指导可见于，例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P. Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)，其通过提述并入本文。

本领域最广泛使用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)方法，其中对糖化没有保持期(holding stage)，说明酵母和酶一起添加。

对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇(即，可饮用的中性酒精)，或工业乙醇。

发酵刺激剂(fermentation stimulator)可与任何本文所述的酶方法组合以进一步改善所述发酵方法，以及特别是所述发酵微生物的性能，例如，增强速率与乙醇产量。“发酵刺激剂”指针对发酵微生物(具体而言，酵母)生长的刺激剂。优选的对于生长的发酵刺激剂包括维生素与矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D及E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括矿物质与无机盐，其可供应营养物，其包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物：发酵产物可为任何源自发酵的物质。发酵产物可为，但不限于醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇与木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、蚁酸、富马酸、葡萄糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸与木质酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；以及气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。所述发酵产物亦可为作为高价值产物的蛋白质。

在一个优选方面，发酵产物为醇。应理解术语“醇”涵盖下述物质，即其包含一个或多个羟基部分(moiety)。在一个更优选方面，醇为阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，醇为丁醇。在另一个更优选方面，醇为乙醇。在另一个更优选方面，醇为甘油。在另一个更优选方面，醇为甲醇，在另一个更优选方面，醇为1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，醇为山梨醇。在另一个更优选方面，醇为木糖醇。参见，例如Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G. T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.和Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选方面，发酵产物为有机酸。在另一个更优选方面，有机酸为乙酸。在另一个更优选方面，有机酸为醋酮酸。在另一个更优选方面，有机酸为己二酸。在另一个更优选方面，有机酸为抗坏血酸。在另一个更优选方面，有机酸为柠檬酸。在另一个更优选方面，有机酸为2，5-二酮-D-葡萄糖酸。在另一个更优选方面，有机酸为蚁酸。在另一个更优选方面，有机酸为富马酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡萄糖二酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡萄糖酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡糖醛酸。在另一个更优选方面，有机酸为戊二酸。在另一个更优选方面，有机酸为3-羟基丙酸。在另一个更优选方面，有机酸为衣康酸。在另一个更优选方面，有机酸为乳酸。在另一个更优选方面，有机酸为苹果酸。在另一个更优选方面，有机酸为丙二酸。在另一个更优选方面，有机酸为草酸。在另一个更优选方面，有机酸为丙酸。在另一个更优选方面，有机酸为琥珀酸。在另一个更优选方面，有机酸为木糖酸。参见，例如，Chen，R.和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选方面，发酵产物为酮。应理解术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选方面，酮为丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上。

在另一个优选方面，发酵产物为氨基酸。在另一个更优选方面，氨基酸为天冬氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为谷氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为甘氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为赖氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为丝氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为苏氨酸。参见，例如，Richard，A.和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选方面，发酵产物为气体。在另一个更优选方面，气体为甲烷。在另一个更优选方面，气体为H₂。在另一个更优选方面，气体为CO₂。在另一个更优选方面，气体为CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methane production：A review。

回收发酵产物可任选地自发酵培养基使用任何本领域已知方法加以回收，方法包括但不仅限于层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。举例而言，醇自经发酵的纤维素材料分离并通过常规蒸馏方法纯化。可获取纯度高至约96vol.％的乙醇，其可用作，例如燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性酒精)或工业乙醇。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQID NO：2的氨基酸1到20或SEQ ID NO：4的氨基酸1到18，或者由SEQ IDNO：2的氨基酸1至20或SEQ ID NO：4的氨基酸1到18组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

在一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1-60或由SEQ ID NO：1的核苷酸1-60组成。在另一优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸1-54或由SEQ ID NO：3的核苷酸1-54组成。

本发明还涉及包含这样的核苷酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文中并非意指特定长度的编码产物，并因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括经组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一种或多种(几种)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质还包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。

蛋白质优选是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或内切葡聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

使用土生梭孢霉NRRL 8126作为编码具有内切葡聚糖酶活性的家族16多肽的基因的来源。

培养基

PDA平板由每升39克马铃薯右旋糖琼脂组成。

NNCYP培养基由每升5.0g NH₄NO₃、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.3g CaCl₂、2.5g柠檬酸、1.0g Bacto Peptone(细菌用蛋白胨)、5.0g酵母提取物、1mlCOVE痕量金属溶液和使最终pH达到5.4的足量K₂HPO₄组成。

NNCYPmod培养基由每升1.0g NaCl、5.0g NH₄NO₃、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.2g CaCl₂、2.0g柠檬酸、1.0g细菌用蛋白胨、5.0g酵母提取物、1ml COVE痕量金属溶液和使最终pH达到约5.4的足量K₂HPO₄组成。

COVE痕量金属溶液由每升0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g CuSO₄·5H₂O、1.2gFeSO₄·7H₂O、0.7g MnSO₄·H₂O、0.8g Na₂MoO₂·2H₂O和10g ZnSO₄·7H₂O组成。

LB平板由每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠和15g Bacto Agar(细菌用琼脂)组成。

MDU2BP培养基由每升45g麦芽糖、1g MgSO₄·7H₂O、1g NaCl、2gK₂HSO₄、12g KH₂PO₄、2g尿素和500μl AMG痕量金属溶液组成，将pH调节至5.0，然后用0.22μm过滤装置过滤灭菌。

AMG痕量金属溶液由每升14.3g ZnSO₄·7H₂O、2.5g CuSO₄·5H₂O、0.5gNiCl₂·6H₂O、13.8g FeSO₄·7H₂O、8.5g MnSO₄·7H₂O和3g柠檬酸组成。

SOC培养基由2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl₂和10mM MgSO₄组成，通过高压灭菌进行灭菌，然后加入过滤灭菌的葡萄糖至20mM。

冷冻培养基由60％SOC培养基和40％甘油组成。

2X YT培养基由每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和15g细菌用琼脂组成。

实施例1：表达序列标签(EST)cDNA文库构建

将土生梭孢霉NRRL 8126在250ml摇瓶中补充有1％葡萄糖的50mlNNCYPmod培养基中于45℃，以200rpm振荡培养24小时。使用土生梭孢霉NRRL 8126的24小时液体培养物的2ml等分试样接种含有补充2％

20(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的100mlNNCYPmod培养基的500ml烧瓶中。将所述培养物在45℃以200rpm振荡温育3天。通过经具有玻璃纤维预滤器(Nalgene，Rochester，NY，USA)的漏斗过滤收获菌丝体，用10mM Tris-HCl-1mM EDTA pH 8(TE)洗涤2次，并在液氮中快速冷冻。

通过下述方法分离总RNA。将土生梭孢霉NRRL 8126的冷冻菌丝体在电动咖啡研磨机中研磨。将经研磨的材料与20ml FENAZOL^TM(Ambion，Inc.，Austin，TX，usA)按1∶1 v/v在50ml管中混合。一旦将菌丝体悬浮，就用氯仿提取菌丝体并用酚-氯仿-异戊醇25∶24∶1 v/v/v混合物提取三次。通过加入1/10体积的3M乙酸钠pH 5.2和1.25倍体积的异丙醇从得到的水相沉淀RNA。通过在4℃以12,000xg离心30分钟来回收沉淀的RNA。最终沉淀用冷的70％乙醇洗涤、风干并重悬在500ml用焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC水)中。

用2100 Bioanalyzer(生物分析仪)(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA，USA)评定纯化的RNA的质和量。在POLY(A)PURIST^TMMagnetic Kit(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)的辅助下按照制造商的说明从360μg总RNA分离聚腺苷酸化的mRNA。

为了创建cDNA文库，采用CLONEMINER^TM Kit(InVitrogen CorP.，Carlsbad，CA，USA)构建定向文库，其不需要使用限制酶克隆，由此降低了嵌合克隆数和大小偏好。

为了确保cDNA的成功合成，以两种不同的mRNA浓度(2.2和4.4μg多聚(A)⁺mRNA)平行进行了两个反应。将mRNA样品与Biotin-attB2-Oligo(dt)(生物素-attB2-寡聚(dt))引物(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)、1x第一链缓冲液(InVitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)、2μl 0.1M二硫苏糖醇(DTT)、每种dNTP 10mM和水混合以使终体积分别为18和16μl。

将反应混合物混合，然后加入2和4μl的SUPERSCRIPT^TM逆转录酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)。将反应混合物在45℃温育60分钟以合成第一互补链。对于第二链合成，向每个第一链反应加入30μl 5X第二链缓冲液(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)、3μl 10mM的每种dNTP、10单位大肠杆菌DNA连接酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)、40单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)和2单位大肠杆菌RNase H(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，总体积为150μl。然后将所述混合物在16℃温育2小时。2小时温育之后，向每个反应加入2μl T4 DNA聚合酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)并在16℃温育5分钟以产生平端cDNA。用酚-氯仿-异戊醇25∶24∶1 v/v/v的混合物提取所述cDNA反应物并且在20μg糖原、120μl 5M乙酸铵和660μl乙醇存在下沉淀。在4℃以12,000xg离心30分钟后，用冷的70％乙醇洗涤cDNA沉淀，真空干燥2-3分钟，并重悬在18μl DEPC水中。向每个重悬的cDNA样品加入10μl 5X适应缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、每种attB1衔接子(adapter)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)10μg、7μl 0.1M DTT和5单位T4 DNA连接酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。

将连接反应在16℃温育过夜。通过在1ml SEPHACRYL^TM S-500HR树脂(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)中进行的大小排阻层析去除过量的衔接子。按照CLONEMINER^TM Kit的说明收集柱级分，并且用

2100 Bioanalyzer(生物分析仪)分析级分3-14以确定attB1衔接子开始洗脱的级分。所述分析显示衔接子约在级分10或11开始洗脱。对于第一文库，汇集级分6-11，而对于第二文库，汇集级分4-11。

按照

系统规程(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)使用BPCLONASE^TM(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)作为重组酶通过同源DNA重组进行cDNA的克隆。每个BP CLONASE^TM重组反应含有约70ng侧翼为attB的cDNA、250ng pDONR^TM222、2μl 5X BP CLONASE^TM缓冲液、2μl TE和3μl BP CLONASE^TM。所有试剂获得自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。将重组反应在25℃温育过夜。

然后将热失活的BP重组反应分成6个等分试样，并且电穿孔入ELECTROMAX^TM大肠杆菌DH10B电感受态细胞(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，所述电穿孔使用GENE PULSER^TM(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA)和以下参数：电压：2.0kV；电阻：200Ω；和电容：25μF。将电穿孔的细胞重悬在1ml SOC培养基中并在37℃、200rpm恒定振荡下温育60分钟。在温育期之后，汇集转化的细胞并与冷冻培养基按1∶1混合。取200μl等分试样用于文库滴定(library titration)，然后将剩余的每种文库分装至1.8ml冷冻小瓶(Wheaton Science Products，Millville，NJ，USA)中并在-80℃冷冻储藏。

制备每种文库的四个系列稀释物：1/100，1/1000，1/10⁴和1/10⁵。对于每种稀释物，将100μl铺板到150mm补充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上并在37℃温育过夜。计数每种稀释物的平板上的菌落数并用于计算每种文库中的转化体总数。

第一文库含有约540万独立克隆，而第二文库含有约900万独立克隆。

实施例2：cDNA克隆的模板制备和核苷酸测序

将来自实施例1中所述的两个文库的等分试样混合并铺板在补充有50μg/ml卡那霉素的25x25cm LB平板上。在QPix Robot(Genetix Inc.，Boston，MA，USA)的辅助下将单独的菌落排列在96孔板上，所述96孔板含有100μl补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基。针对总共4320个独立的克隆获得了45个96孔板。将这些平板在37℃、200rpm振荡下温育过夜。温育之后，向每孔加入100μl无菌的50％甘油。借助96针工具(Boekel，Feasterville，PA，USA)将转化体复制到次级深皿96孔微量培养板中(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD，USA)，其中每孔含有1ml补充有50μg/ml卡那霉素的MAGNIFICENT BROTH^TM(MacConnell Research，San Diego，CA，USA)。将原始微量滴定板冷冻储藏在-80℃。将次级深皿板在旋转摇床上在300rpm剧烈摇动条件下在37℃温育过夜。为了避免溅出和交叉污染，也为了允许充分的通气，将每个次级培养板用聚丙烯垫(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD，USA)和塑料微量滴定皿盖覆盖。用Robot-Smart 384(MWG Biotech Inc.，High Point，NC，USA)和MONTAGE^TM Plasmid Miniprep Kit(质粒微量制备试剂盒)(Millipore，Billerica，MA，USA)制备了质粒DNA。

测序反应使用(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods 38：47-60)和如下M13 Forward(正向)(-20)测序引物进行：

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID NO：7)。

所述测序反应以384孔形式用Robot-Smart 384进行。终止子的去除用

Seq384 Sequencing Clean-up Kit(测序纯化试剂盒)(Millipore，Billerica，MA，USA)进行。反应含有6μl质粒DNA和4μl测序用主混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，所述混合物含有1μl 5X测序缓冲液(Millipore，Billerica，MA，USA)、1μl

终止子(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)、1.6皮摩尔M13正向引物和1μl水。单轮DNA测序(single-pass DNA sequencing)用ABI PRISM Automated DNA Sequencer Model3700(自动DNA测序仪3700型)(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。

实施例3：cDNA克隆的DNA序列数据分析

碱基判定(base calling)、质量赋值(quality value assignment)和载体修整(vector trimming)借助PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)进行。EST的聚类分析用Transcript Assembler v.2.6.2.(Paracel，Inc.，Pasadena，CA，USA)进行。EST聚类(clustering)分析表明存在395个独立的簇。

对装配的EST序列针对PIR和其他数据库的序列同源性分析用Blastx程序(Altschul等，1990，J. Mol.Biol.215：403-410)在32节点Linux簇(Paracel，Inc.，Pasadena，CA，USA)上使用BLOSUM 62矩阵(Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)进行。从这些看，246个在不同的蛋白质数据库对已知的基因具有命中，149个对这些数据库没有显著的命中。在这246个基因中，13个针对糖基水解酶基因经充分表征的同源物具有命中。

实施例4：编码土生梭孢霉家族16A和16B内切葡聚糖酶的cDNA克隆的鉴定

编码土生梭孢霉家族16A内切葡聚糖酶的cDNA克隆最初是通过与来自粟酒裂殖酵母的推定的糖基水解酶家族16(

登录号NP_595680)的序列同源性来鉴定的。

在此初始鉴定之后，从原始冷冻贮存平板取回定名为Tter30G12的克隆并划线接种到补充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上。将所述平板在37℃温育过夜并使用来自该平板的单菌落接种3ml补充有150μg/ml卡那霉素的LB培养基。将所述液体培养物在37℃温育过夜并且用

9600(QIAGEN，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。用

终止子化学如上所述再次测序来自克隆Tter30G12质粒DNA，其中使用M13正向引物和M13反向引物及如下所示的多聚T引物来测序该克隆的3’端。

5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′(SEQ ID NO：8)

其中V＝G、A、C且N＝G、A、C、T

用Interproscan程序(Zdobnov和Apweiler，2001，Bioinformatics 17：847-8)分析克隆30G12的推导的氨基酸序列，该分析显示所述氨基酸序列含有刀豆素A样葡聚糖酶的序列特征。这种称为InterPro：IPR008985的序列特征存在于自起始氨基酸甲硫氨酸起第88个氨基酸处。该区域还包含糖基水解酶家族16活性位点的特征序列InterPro：IPR008263，确证克隆Tter30G12编码家族16糖基水解酶。

cDNA序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图1A和1B。该cDNA克隆编码797个氨基酸的多肽。全长编码区的％G+C含量为64.5％，并且成熟蛋白编码区(SEQ ID NO：1的核苷酸61-1428)的％G+C含量为65％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测了20个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有777个氨基酸，具有80.7kDa的分子量。

使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J. Mol.Biol.48：443-453)，如在EMBOSS的Needle程序中，以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对。该比对显示土生梭孢霉内切葡聚糖酶基因的推导的氨基酸序列与来自红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)β-葡聚糖酶家族16序列(GENESEQP：AAW77311；WO 98/36056)推导的氨基酸序列共享34％同一性。

编码土生梭孢霉家族16B内切葡聚糖酶的cDNA克隆最初是通过与来自Rhodothermus marinus的糖基水解酶家族16(

登录号P45798)的序列同源性鉴定的。

在此初始鉴定之后，从原始冷冻贮存平板取回定名为Tter07B12的克隆并划线接种到补充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上。自该大肠杆菌菌株的培养物制备质粒DNA，并使用与上述同样的方法进行完全测序。

用Interproscan程序(Zdobnov和Apweiler，2001，见上)分析克隆07B12的推导的氨基酸序列，该分析显示所述氨基酸序列含有刀豆素A样葡聚糖酶的序列特征。这种称为InterPro：IPR008985的序列特征存在于自起始氨基酸甲硫氨酸起第58个氨基酸处。该区域还包含糖基水解酶家族16活性位点的特征序列InterPro：IPR008263，确证克隆Tter07B12编码家族16糖基水解酶。

cDNA序列(SEQ ID NO：3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)示于图2。该cDNA克隆编码285个氨基酸的多肽。全长编码区的％G+C含量为68.4％，并且成熟蛋白编码区(SEQ ID NO：3的核苷酸55-855)的％G+C含量为68.7％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，见上)，预测了18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有267个氨基酸，具有28.2kDa的分子量。

使用Clustal W方法(Higgins，1989，见上)，用Vector NTI Advance 10.3软件(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的AlignX模块和blosum62mt2评分矩阵，以及下列多重比对参数：K-元组大小1；最佳对角线5；窗口大小5；缺口罚分5；缺口开放罚分10；缺口延伸罚分0.1确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对。该比对显示土生梭孢霉GH16B基因的推导的成熟氨基酸序列与哈茨木霉内-1，3(4)-β-葡聚糖酶家族16序列(GENESEQP：AAR88406；WO95/31533)共享58％同一性。

一旦确认了克隆Tter30G12和Tter07B12的同一性，将来自每个克隆的定名为pTter16A(图3)和pTter16B(图4)的质粒DNA的0.5μl等分试样分别转移至大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)的小瓶中，轻轻混合，并在冰上温育10分钟。然后将细胞在42℃热休克30秒并再次在冰上温育2分钟。将细胞重悬在250μl SOC培养基中，并在37℃、以200rpm恒定振荡条件下温育60分钟。温育期之后，将两份30μl等分试样铺板在补充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上并在37℃温育过夜。次日，从每个转化物挑取单菌落并划线接种到3个1.8ml冷冻小瓶中，所述冷冻小瓶含有约1.5ml补充有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖上。将小瓶用PETRISEAL^TM(Diversified Biotech，Boston MA，USA)密封，并作为NRRL B-50081(pTter16A)和NRRL B-50082(pTter16B)保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northem Regional Research Center)，Peoria，IL，USA，保藏日期为2007年11月30日。

生物材料的保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心，亦称农业研究保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，并给予下述的登录号：

保藏物登录号保藏日期

大肠杆菌pTter16A NRRL B-50081 2007年11月30日

大肠杆菌pTter16B NRRL B-50082 2007年11月30日

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律决定授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了题述申请的副本或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施题述发明的许可，实施题述发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

本发明进一步由下述编号的段落描述：

[1]一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性；和

[2]段落1的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列。

[3]段落2的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少65％同一性的氨基酸序列。

[4]段落3的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少70％同一性的氨基酸序列。

[5]段落4的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列。

[6]段落5的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[7]段落6的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[8]段落7的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[9]段落8的多肽，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[10]段落1的多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段，或者由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。

[11]段落10的多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。

[12]段落10的多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽，或者由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽组成。

[13]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[14]段落13的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中-高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[15]段落14的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[16]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列。

[17]段落16的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少65％同一性的核苷酸序列。

[18]段落17的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

[19]段落18的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列。

[20]段落19的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。

[21]段落20的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。

[22]段落21的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

[23]段落22的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。

[24]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其编码具有木聚糖酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其编码具有木聚糖酶活性的片段的亚序列组成。

[25]段落24的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列，或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列组成。

[26]段落24的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列，或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列组成。

[27]段落1的多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

[28]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于质粒pTter16A或质粒pTter16B中，所述质粒pTter16A包含于大肠杆菌NRRLB-50081中，所述质粒pTter16B包含于大肠杆菌NRRL B-50082中。

[29]段落1-28任一所述的多肽，其中所述成熟多肽为SEQ ID NO：2的氨基酸21到797或SEQ ID NO：4的氨基酸19到288。

[30]段落1-29任一所述的多肽，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ IDNO：1的核苷酸61到1428或SEQ ID NO：3的核苷酸55到855。

[31]分离的多核苷酸，其包含编码段落1-30任一所述的多肽的核苷酸序列。

[32]段落31的分离多核苷酸，其在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列分别编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽。

[33]核酸构建体，其包含段落31或32的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于一个或多个(数个)调控序列，所述调控序列指导该多肽在表达宿主中产生。

[34]重组表达载体，其包含段落33的核酸构建体。

[35]重组宿主细胞，其包含段落33的核酸构建体。

[36]产生段落1-30任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

[37]产生段落1-30任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

[38]产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码段落1-30任一所述多肽的核苷酸序列，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

[39]通过段落38的方法产生的突变体细胞。

[40]段落39的突变体细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

[41]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养段落40的突变体细胞；和(b)回收该蛋白质。

[42]段落31或32所述的分离的多核苷酸，通过下述方法获得：(a)在至少中等严紧度的条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的成熟多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所述杂交多核苷酸，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。

[43]段落42的分离多核苷酸，由下述方法获取：(a)在至少中-高严紧度的条件下将DNA群体与下述杂交：i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所述杂交多核苷酸，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。

[44]段落43的分离多核苷酸，由下述方法获取：(a)在至少高严紧度的条件下将DNA群体与下述杂交：i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所述杂交多核苷酸，其编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽。

[45]段落42-44任一所述的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸61到1428或SEQ ID NO：3的核苷酸55到855。

[46]产生包含突变体核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突变体核苷酸序列编码具有内切葡聚糖酶活性的多肽，该方法包括：(a)将至少一个突变导入SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中，其中所述突变体核苷酸序列分别编码包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽组成的多肽；和(b)回收包含所述突变体核苷酸序列的多核苷酸。

[47]通过段落46的方法产生的突变体多核苷酸。

[48]产生多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的段落47的突变体多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

[49]产生段落1-30任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，其包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[50]转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码段落1-30任一所述的多肽的多核苷酸转化。

[51]双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落31或32的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA可选地为siRNA或miRNA分子。

[52]段落51的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多双链体核苷酸。

[53]在细胞中抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落31或32的多核苷酸的亚序列。

[54]段落53的方法，其中所述dsRNA在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多双链体核苷酸。

[55]核酸构建体，其包含可操作连接于编码信号肽的核苷酸序列的编码蛋白质的基因，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到20或SEQ ID NO：4的氨基酸1到18，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1到20或SEQ ID NO：4的氨基酸1到18组成，其中所述基因对所述核苷酸序列为外源的。

[56]重组表达载体，其包含段落55的核酸构建体。

[57]重组宿主细胞，其包含段落55的核酸构建体。

[58]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养段落57所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

[59]降解或转换纤维素材料的方法，其包括在段落1-30任一所述的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在的条件下用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物处理所述纤维素材料。

[60]段落59的方法，其中所述组合物进一步包含内切-1，4-β-葡聚糖酶、外切-1，4-β-D-葡聚糖酶和/或β-D-葡糖苷酶。

[61]段落59或60的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。

[62]段落59-61任一所述的方法，进一步包括回收所述经降解或转换的纤维素材料。

[63]产生发酵产物的方法，包括：(a)在存在段落1-30任一所述的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的条件下用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。

[64]段落63的方法，其中所述组合物进一步包含内切-1，4-β-葡聚糖酶、外切-1，4-β-D-葡聚糖酶和/或β-D-葡糖苷酶。

[65]段落63或64的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。

[66]段落63-65任一所述的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。

[67]段落64-67任一所述的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

在本文中描述和要求保护的发明并不局限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面的意欲作为本发明的数个方面的说明。任何等同的方面意欲在本发明的范围之内。事实上，从前述的说明中，除本文中显示和描述的那些之外，本发明的多种修改对本领域技术人员是显而易见的。这样的修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

Claims

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的分离的多肽，其选自下组：

2.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段，或由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其具有内切葡聚糖酶活性的片段组成。

3.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其编码具有内切葡聚糖酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其编码具有内切葡聚糖酶活性的片段的亚序列组成。

4.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于质粒pTter16A或质粒pTter16B中，所述质粒pTter16A包含于大肠杆菌NRRLB-50081中，所述质粒pTter16B包含于大肠杆菌NRRL B-50082中。

5.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-4任一所述的多肽的核苷酸序列。

6.核酸构建体，其包含权利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于一个或多个(数个)调控序列，其在表达宿主中引导该多肽的产生。

7.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。

8.产生权利要求1-4任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养细胞，其以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所得多肽。

9.产生权利要求1-4任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所得多肽。

10.产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-4任一所述多肽的核苷酸序列，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

11.产生权利要求1-4任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

12.转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码权利要求1-4任一所述的多肽的多核苷酸转化。

13.双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含权利要求5的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA可选地为siRNA或miRNA分子。

14.在细胞中抑制具有内切葡聚糖酶活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含权利要求5的多核苷酸的亚序列。

15.核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作连接于编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到20或SEQ ID NO：4的氨基酸1到18，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1到20或SEQID NO：4的氨基酸1到18组成，其中所述基因对所述核苷酸序列为外源的。

16.重组宿主细胞，其包含权利要求15的核酸构建体。

17.产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养权利要求16所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

18.降解或转换纤维素材料的方法，包括：用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物在权利要求1-4任一所述的具有内切葡聚糖酶活性的多肽存在的情况下处理所述纤维素材料。

19.权利要求18的方法，进一步包括回收所得经降解或转换的纤维素材料。

20.产生发酵产物的方法，包括：(a)用包含一种或多种分解纤维素的蛋白质的组合物在存在权利要求1-4任一所述的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的情况下糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的经糖化的纤维素材料；和(c)自所述发酵回收所述发酵产物。