CN101946178B - 检测被分析物的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用织物来分析样品以测定该样品中的被分析物，特别是碳水化合物，更特别是糖的存在或量的方法、装置以及试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及利用织物来分析样品以测定该样品中的被分析物，特别是碳水化合物，更特别是糖的存在或量的方法、装置以及试剂盒。
背景技术
实验室、候诊室(doctors’reception)、家庭、公共设施以及工业生产工厂的环境卫生日益受到关注。有开发下述方法的趋势：使用或清理空间的人们通过该方法能够快速确保其卫生。这样的方法应该是极其简单、用户友好、快速并且低成本的。
能够通过测定表面上诸如细菌浓度或促进细菌生长的物质的微生物的存在来确保卫生。利用目前的方法分析表面上的微生物不快并且要求专业技术。促进诸如细菌或真菌的微生物生长的诸如糖和蛋白质的物质的分析指示具有几乎相当的可靠性的表面清洁。
可用于测定蛋白质存在的快速且灵敏的测试是基于溴甲酚绿与蛋白质的反应。这样的测试描述于例如专利申请WO 2006/122733中，该申请详细地讨论了基于使用各种膜的现有测试方式。该申请还广泛地讨论了将试剂应用于膜的各种方法，例如卷对卷(roll-to-roll)或其它印刷技术。
分析诸如糖的碳水化合物的大多数已知方法是基于通过颜色变化来指示糖的方法。基于颜色变化的大多数方法是为糖的分光光度检定而开发的。迄今为止还没有低成本、快速且容易的测试来测定表面上糖的存在。与糖有关的问题是它们的稳定结构，这意味着它们的分析需要特异性且可能不稳定的酶的存在、升高温度下的孵育、延长的反应时间和/或使用对健康有害或不安全的化学物质。
可用于分析糖的几种基于颜色变化的方法。基于铜还原的方法包括费林试剂(Fehling’s reagent)、砷钼酸盐和BCA(二辛可宁酸(bicinchoninic acid))检测。其它可用于测定糖的方法包括氰化亚铁和DNS(二硝基水杨酸)方法、基于缩醛形成的方法、蒽酮方法、包括吩嗪基团、希夫试剂(Schiff’s reagent)和四唑蓝(tetrazolium blue)的指示方法以及基于圆二色性、光吸收和荧光(fluoresence)的硼传感器(boronicsensor)。可用于测定糖的其它方法包括酶促方法，如葡萄糖氧化酶/过氧化酶和己糖激酶；及发光方法，包括生物发光和化学发光。
这样的可用方法不适用于利用织物方法来检测糖的测试方式。所有基于铜还原的方法都需要加热以便使反应足够快速地进行。
在美国专利6,586,195中使用烟鲁绿B来指示糖。该专利表明，在碱性条件下，在大约10g/l的足够高的浓度下，还原性的糖能够还原烟鲁绿B，其中烟鲁绿B由蓝色变为灰色。颜色变化并不是最佳的，因为由蓝色变为灰色的这种反应使得难以确定浓度接近检测限时的测试结果。
基于缩醛形成的方法和蒽酮方法使用高浓度的强酸，这使得这些方法不适用于开发基于织物的快速测试。
指示剂方法涉及简单的试剂组合物，其降低需要被印刷到织物上的试剂的量。在足够高的糖浓度下，甚至在室温下也能观察到指示剂颜色的变化。缺点是只能检测到像果糖这样的具有高还原能力的糖。另一缺点是缺乏可商购的指示剂。
酶促方法和基于发光的方法灵敏且快速。与某些酶有关的缺点包括它们的成本和它们不稳定的性质。而且，酶的特异性作用，即它们仅作用于特定的糖，妨碍了这些酶在快速测试中的使用，该快速测试应当能够指示所有或几乎所有碳水化合物的总体水平。基于发光的方法仅在与糖修饰的酶有关时可行，因此存在与酶促方法相同的问题。
本领域专家熟悉的公知方法及他们使用的试剂本身不适用于快速诊断方法。例如，氰化亚铁方法不适用于糖的快速分析，因为在酸性环境下，氰化物以高毒性物质氰化氢的形式被释放。某些方法可能在室温下不起作用(如DNS方法或烟鲁绿B)，或者它们可能具有不好的稳定性(如要求酶的方法、希夫试剂和缩醛形成试剂)。一些方法还要求强酸或强碱的条件。
因此，需要用于测定表面上的碳水化合物的快速且灵敏的测试。特别是需要不升高温度就能够进行的测试。
发明概述
本发明提供测定样品中被分析物的存在或量的方法，所述方法包括：
将样品应用于织物；
如果所述被分析物存在于样品中，则将所述被分析物进行化学修饰；
检测所述化学修饰的被分析物的存在或量。
在一实施方案中，在将样品应用于织物之前，使诸如试剂的用于将被分析物进行化学修饰的手段存在于织物上。优选地，将试剂印刷至织物上或置于、吸收至或附着在织物上。
在本发明一实施方案中，所述方法还包括使干扰化学修饰的被分析物的检测的化学药剂失活。优选地，化学修饰和干扰剂的失活在检测化学修饰的被分析物之前进行。根据该实施方案，可以使任何样品或干扰产物(如存在于样品中的药剂、试剂、组合物或物质)、应用于织物的或在检定方法中形成的检定试剂失活，例如通过中和或者通过沉淀防止其移动。在一实施方案中，在将样品应用于织物之前，使用于将使干扰剂失活的手段存在于织物上。优选地，将这些手段印刷至织物上或置于、吸收至或附着在织物上。在一实施方案中，在将样品应用于织物之前，使用于将被分析物进行化学修饰的手段和用于使干扰剂失活的手段都存在于织物上。
本发明还提供适合于进行所述方法的测试装置，该装置包含织物，该织物带有用于将被分析物进行化学修饰的手段、用于检测化学修饰的被分析物药剂的手段以及任选的用于使干扰剂失活的手段。
根据一实施方案，优选地，将所述手段例如作为区域、区带或部分，连续地应用或印刷，从而当使用该装置时，样品能够以连续的顺序穿过区域。
本发明还提供用于测定样品中被分析物的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含测试装置，该测试装置包含：
织物材料；和
用于通过化学修饰剂来修饰被分析物的手段；和
用于将干扰试剂失活的手段；以及
用于检测化学修饰的被分析物的手段。
此外，本发明涉及卷对卷印刷方法，其中将试剂和所述手段顺序地印刷至织物上的特定区域。
在一实施方案中，被分析物是碳水化合物。在一实施方案中，碳水化合物是糖。糖优选包括果糖、糊精、乳糖、麦芽糖和/或蔗糖。
本发明提供检测样品中糖的方法，包括通过将所述样品应用于织物的在室温下进行的非酶促方法
附图简述
图1.吸湿织物方法的结构原理。
图2.适合于糖测试的织物的具体实例，其示出存在于不同织物区域中的试剂。
发明详述
本发明涉及以这样的方式来分析样品的方法、装置和试剂盒：能够将样品中的被分析物化学改造或修饰，并且任选地能够在检测期间使在检测期间形成的干扰试剂或药剂和/或产物失活。
所述方法广泛用于测量被分析物，该被分析物在样品中发现的形式中是稳定的或者通过其它方式难以测量的。本发明的方法尤其适合于测定样品中碳水化合物的存在，特别是糖的存在。
本发明涉及利用吸湿织物方法来检测样品中的糖。该方法不需升高反应温度来进行。本发明还涉及用于所述方法的包含织物的装置。在制造该装置时，可以利用常规印刷方法将检测中所用的化学物质转移到织物上。适合的制造方法详细地公开于WO 2006/122733，其通过引用并入本文。塑料膜之间的织物的层压允许液体沿着织物快速移动。然而，本发明的制造方法与WO 2006/122733所公开的方法的不同之处在于其更复杂和更具有挑战性，这是由于应用了改造剂(remoldingagent)、失活剂以及通常的检测试剂的明显不同的区域。本发明的方法和装置适合用作快测试。快速测试的基本要求是简单、灵敏、特异、安全、容易使用、可抛弃(disposability)以及适用于通过印刷方法进行工业生产。
虽然本发明的测试可以用于任何合适的被分析物，但是为了方便，下文将详细讨论被分析物为碳水化合物的实施方案。本发明的测试优选利用可见的颜色变化来测定碳水化合物，特别是糖，例如果糖(fruitsugar)、糊精、乳糖(milk sugar)、麦芽糖(malt sugar)和蔗糖(砂糖)。当使用常规方法时，果糖是最容易测定的，而蔗糖和淀粉是最难测定的。蔗糖和淀粉最难测定的原因是它们的还原能力比其它上述糖低得多。本发明能够检测150μg糖的存在，包括诸如果糖的中性糖的存在。
为了评价卫生，指示测试本质上主要是定性的，其指示给定的灵敏度范围内样品中糖的存在。本发明能够以检测限为1g/l的灵敏度来指示碳水化合物的存在，特别是糖的存在。这对应于如下的检测能力：能够检测取自10×10cm2表面的500μl样品中的500μg的糖。糖的检测限(使用相同的单位)优选为0.5g/l(250μg)，更优选为0.2g/l(100μg)、0.1g/l(50μg)、0.05g/l(25μg)、0.02g/l(10μg)或0.01g/l(5μg)。
本发明提供简单和低成本的装置，这种装置用于在例如医院、医生诊所(doctor’s office)、实验室、食品工业、乳品厂、面包房、酿酒厂和饮料工业中的卫生检测。
“碳水化合物”是含有碳、氧和氢的化合物。其优选为糖。
“糖”是水溶性单糖、低聚糖或多糖。
织物上的连续反应可以用于进行本发明的方法。简言之，将样品引入织物，从而以特定的预定顺序与期望的化学物质反应。
通常，通过将织物在要测试的表面上擦拭来将样品引入织物。还考虑了其它实施方案。例如，可以将织物置于要测试的表面上，或者可以将液体样品从测试区域移除并利用例如移液管或类似的转移器件导入织物。可以在使表面与织物接触之前对表面和/或织物进行处理。例如，可以将表面与织物之一(优选表面)用水溶液润湿以有助于提供流体样品。可以通过例如喷洒或洗涤来应用水溶液。如果要测试的表面是干燥的或者本身不带有足够的水分以产生适当的液体样品时，这是特别期望的。水溶液通常是水或者包含利于进行检定的材料的溶液，如缓冲液。
缓冲液应当不含有干扰用于修饰被分析物或检测修饰的被分析物的化学(chemistry)的化合物。例如，当被分析物是碳水化合物时，化学修饰通常是氧化，并且检测步骤通常涉及金属配合物的使用，该金属配合物的颜色是阳性结果的可见指示。在该实施方案中，优选应当不存在于水溶液中的干扰剂包括但不限于与铜形成配合物的碘酸盐和磷酸盐及与干扰氧化的碳水化合物形成配合物的硼酸和硼酸盐。缓冲溶液可以含有伯醇、仲醇和叔醇，尽管二元醇、三元醇等多元醇不是优选的。水溶液也可以含有用于检测淀粉或其它多糖的碘和稳定剂，如KI，由于色谱分离，淀粉或其它多糖在测试装置中的移动更加受限。
合适的水溶液是根据ACS或ProAnalysis级别制备的缓冲液。水溶液的金属阳离子杂质含量还应当较低。优选地，其所含的Fe不超过0.002％或不超过0.001％。优选地，其所含的诸如Pb的重金属不超过10ppm或不超过5ppm。更优选地，水溶液中的金属阳离子杂质的含量尽可能低。
一旦将液体样品引入织物，通常第一步是将碳水化合物进行化学修饰。当碳水化合物是糖时，优选以在室温下允许测定的方式对其进行改造或修饰。在一实施方案中，通过打开糖环结构中以及单体之间的醚键，然后进行增加醛基数目的氧化方法使糖更具有反应性。用于将碳水化合物进行化学修饰的手段可以是试剂，例如高碘酸或高碘酸盐，如高碘酸钠；或者另一类型的化合物，如铈(IV)盐。优选地，这类化学修饰手段是具有足以切割两个羟基之间的碳水化合物链的氧化电势的氧化剂，且优选是无色的。
预期用于将碳水化合物修饰成更容易检测的形式，并且能够用作本发明方法和测试装置的基础的其它反应包括但不限于：
-变旋，其中通过弱酸将-OH基团从α-形式变旋为β-形式；
-糖-OH与醇之间的氧桥(醚)的酸催化形成；
-在诸如Cu2+的弱氧化剂的存在下形成羧酸，例如葡糖酸；
-通过强酸在升高的温度下形成二羧酸，例如葡糖醛酸(glucoronicacid)；
-用NaBH4还原成糖醇(破坏醚环并形成羟端基)；
-当乙酸钠和乙酸酐存在时形成乙酸酯；
-在例如氧化银和碘甲烷的存在下形成醛。
本发明人相信，将被分析物进行化学修饰然后检测化学修饰的被分析物的方法是以前没有用在织物上的操作。在本发明的方法中，样品以及修饰或改造手段应当满足：优选地应当使干扰剂失活并且应当只有期望的组合物或物质在织物材料中进一步移动。
“干扰剂”是这样的物质，如果其在检测化学修饰的被分析物时存在，则会干扰化学修饰的被分析物的检测。干扰剂可以原来就存在于样品中，可以是来自被分析物的化学修饰的过剩试剂，或者可以是将被分析物进行化学修饰的反应的结果，例如反应的产物或副产物。
当被分析物是碳水化合物时，干扰剂的实例包括与铜形成配合物的碘酸盐和磷酸盐以及趋向与碳水化合物形成干扰碳水化合物氧化的配合物的硼酸和硼酸盐。此外，诸如金属阳离子的还原剂能够还原铜，从而导致无糖情况下的显色反应。
可以在织物的发生化学修饰的相同区域中，或者在包含化学修饰的被分析物的样品所穿过的织物的随后区域中使干扰剂失活。优选地，失活发生在随后区域中。失活发生在检测化学修饰的被分析物之前。
然后，检测化学修饰的被分析物。当被分析物是碳水化合物时，优选地利用BCA检定来进行检测。在BCA方法中，Cu2+在碱煮(alkalineboiling)条件下将糖氧化。将酒石酸(tartratic acid)用作Cu2+的配合剂，从而防止形成氢氧化铜沉淀。在这个过程中，Cu2+被还原成与二辛可宁酸反应并形成有色配合物的Cu+，这种有色配合物的形成是由于糖的存在。
当BCA方法使用孵育时，甚至微量的还原的铜可作为BCA配合物而被检测到，并且所用的试剂在织物上可以固化成稳定的化合物。
织物优选为合成织物，因为基于例如天然纤维素和粘胶的织物在用于检测碳水化合物时趋向于产生假阳性。可以使用的合成织物包括但不限于不含纤维素的织物和不含粘胶的织物、聚酯织物、聚乙烯(poly ethane)、聚酰胺织物、聚丙烯织物、聚氯乙烯织物及它们的组合。在一实施方案中，织物是聚酯织物。
本公开使用术语“织物”，并将其定义为包括诸如能够通过毛细管作用吸收液体样品并传送或携带所述样品的任何材料。常用的术语是“基质”，其是具有相应特征的材料。
使用术语“修饰”并将其定义为还表示改造。
使用术语“区域”并将其定义为还表示“区带”、“相”、“地区”、“部分”，例如多步骤测试。
使用术语“擦拭”并将其定义为还表示“抹”。在擦拭过程中，织物从表面吸收液体。
使用术语“产品”并将其定义为表示任何药剂、试剂、组合物或物质。
在本发明的实施方案中，将BCA方法用于织物上起作用。在制造合适的装置时，将液体形式的化学物质印刷至织物上，并且所述化学物质在织物上干燥。固体形式的化学物质不沿织物移动，也不通过蒸发而稀释，并且其稳定性比其液体形式的稳定性高。本发明的快速诊断测试使得能基于引起颜色变化的反应而检测表面上的糖，这消除了描述为与上述测试有关的问题的缺陷。本发明的测试装置是可抛弃的，并且可以利用卷对卷印刷方法来制造，这保持了低成本。进行测试是容易的，并且不要求专门的培训。而且，所涉及的化学物质对日常使用是安全的。
有几种用于测定和指示糖的可用方法；这些测试在上文的介绍中进行了讨论。文献中的方法包括BCA和各种指示剂。这些方法满足测试成功的优选要求之一，即，它们在室温下引起颜色变化。缺点是它们要求高糖浓度，尽管通过热催化可以指示微小的量。然而，文献所讨论的性质对于可与织物直接使用的方法是不足的。本发明消除了这些问题及对加热的需要，并且测试的灵敏度仍然足以测定甚至很低的糖浓度。本发明允许在织物上产生试管方法条件，这使得样品从湿表面被转移到织物以发生颜色变化，如果样品中含有糖的话。
根据本发明，将研究的方法中所用的试剂通过印刷转移到织物上，除了测试装置的制造的低成本以外，也确保整个印刷区域均匀的试剂浓度。最常见的卷对卷印刷方法包括凸版印刷、凹版印刷、胶版印刷和绢印以及某些应用中的喷墨印刷。
凹版印刷是本发明的优选印刷方法。然而，本领域技术人员应当清楚，其它印刷方法经过稍微的修改也是可用的。优选凹版印刷是由于油墨转移的简单力学，这允许使用具有明显不同的流变性质的油墨；以及所述方法的良好化学转移和化学抗性。在实例中，通过桌面测试印刷机进行印刷。
吸湿织物的测试涉及将含糖液体样品以足量应用于干净的表面。使织物的边缘与样品保持接触，直到样品液体达到指示区域。
所有方法用如下糖进行测试：果糖、糊精、乳糖、麦芽糖和蔗糖，其中蔗糖是中性糖而不是还原性糖。
实施例1
对生物织物和合成织物都进行了测试。在早期阶段，发现包含纤维素和粘胶并且因此包含糖样基团的生物织物是不适合使用的，因为糖样官能性还导致零样品(zero sample)改变测试的颜色。因此，还测试了合成纤维素和不含粘胶的织物，并且未观察到由于零样品的颜色变化。在测试的合成织物中，发现聚酯织物由于其较低的疏水性质而优于聚丙烯(polypropane)。
在测定糖的实验中所用的Waffenschmidt或Smith方案如下(Smithet al.，Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid(利用二辛可宁酸来测量蛋白质)，1985，150，76-85；Waffenschmidt et al.，Anal.Biochem.1987，165，337-340)。
使用BCA方法测定还原糖的Waffenschmidt等人的方案：
溶液组合物
溶液A
-BCA 971mg
-Na2CO3x H2O 31.75g
-NaHCO3 12.1g
-ad.H2O 500ml
溶液B
-CuSO2x 5H2O 624mg
-L-丝氨酸631mg
-ad.H2O 500ml
每天将溶液以1∶1混合。
将糖样品与1ml的A溶液与B溶液的混合物混合。将这种含糖混合物在100℃的加热板上保持15分钟。冷却至室温约20分钟后，于560nm处记录吸收。
还原性单糖的检测限为约5nmol。对于葡萄糖，5nmol为约0.9μg。
用于通过BCA方法测定蛋白质的Smith等人的方案中所用的溶液组合物如表3.1所示：
表3.1 BCA混合物中的溶液组成
每天将A溶液和B溶液以50∶1的比例混合。
将样品溶液和A溶液与B溶液的混合物分别以1∶20的比例混合。如果测定的时间限制是狭窄的或者仅有微量蛋白质持续存在，则将混合物进行孵育。
利用分光光度计来测量吸光度。当使用不同的时间和孵育温度时，实现了相同的吸光度读取。这示于表3.2中。
表3.2.通过不同的蛋白质的量和孵育参数实现0.2的吸光度
| 吸光度 | 蛋白质的量 | 孵育温度 | 以分钟表示的孵育时间 |
| 约0.2 | 20μg | 室温 | 约5 |
| 约0.2 | 20μg | 37℃ | 约2.5 |
| 约0.2 | 5μg | 60℃ | 约3 |
尽管Smith方案用于蛋白分析，但是其也能够用于还原性糖的测定。这显示于表3.3中，其中示出还原性糖(葡萄糖)的干扰效果。
表3.3 Smith方案中还原性糖的影响
*牛血清白蛋白(蛋白质)。
**较早描述的用37℃孵育30分钟的方案。
在“水空白校正”中，所有试剂存在于空白中，并加入与样品大小相同的量的纯水，从而维持样品和空白的体积相同。记录空白吸收，并从样品吸收减去该吸收量以校正由污染物、试剂、实验器皿等引起的吸收。
“干扰剂空白校正”类似于“水空白校正”，但空白还包含与样品中相同的量的干扰剂。因此，能够从样品中减去由干扰剂、污染物、试剂、试验器皿等引起的吸收。
在Smith方案的实验中所用的BCA试剂的组成列于表3.1。在试管方法中，将试剂以50A∶1B的比率混合，除此之外，还将样品孵育。
利用桌面印刷机，将BCA方法所用的化学物质转移到平整并且用不同缓冲液洗涤的织物上。测试一系列的不同织物、pH值以及BCA化学物质的组合，从而创造进一步开发工作的基础。测验观察结果及它们的解释列于表3.4中。
表3.4 测试观察结果及它们的解释
为了在织物上创造试管方法的最优条件而进一步开发BCA方法。因为生物织物由于在阴性对照反应中的阳性结果而被证明是不适合的，所以选择聚酯织物作为底物，因为其不含导致错误对照反应的还原性基团。
为了研究缓冲液和pH的影响，将织物用pH值为10.2的0.1M碳酸盐缓冲液洗涤，并将结果与用pH值为4.7的乙酸盐缓冲液进行比较。将BCA试剂溶液以A+1/2B的比率印刷在用碳酸钠缓冲液洗涤的织物上，即将溶液B在印刷之前用水稀释到一半的强度。首先印刷溶液A；一旦印迹干燥，就添加1/2B溶液。表3.1列出稀释前的溶液组成。
在较早的测试中，果糖在用pH值为4.7的乙酸钠缓冲液洗涤的织物上的检测限为5g/l。其它测试的糖未能引起颜色变化。pH为10.2的碳酸盐缓冲液将果糖的检测限降低到1g/l，而其它糖仍然未能引起颜色变化。
由于试管方法分析涉及样品孵育，因此通过将用糖润湿的织物放在80℃的烘箱中并保持30分钟来测试加热对织物方法的影响。对于织物，热效应也是明显的；果糖的检测限为0.05g/l，但是未观察到在其它糖的颜色变化反应。
由于铜配合剂是方法中的要素，所以测试了各种配合剂以试图改进测试的性能。在以前的测试中，将酒石酸钠用作为Cu2+的配合剂，但是现在用L-丝氨酸代替，因为Waffenschmidt已经发现L-丝氨酸是比酒石酸钠更有效的铜配合剂。
以下测试基于Waffenschmidt试剂组合物(Waffenschmidt et al.，见上文)。将织物用相同的碳酸盐缓冲液处理，并将化学物质以与早期测试相同的方式印刷到织物上。在印刷中使用两种不同的试剂比率：A+B和A+1/2B。溶液A和B的组成如表3.5所示。
表3.5.Waffenschmidt BCA溶液的组成
当在织物上测试糖时，与水的零级反应是剧烈的，并且织物在两周内自发地变为蓝紫色。L-丝氨酸被认为与Cu2+配合，并且逐渐将其还原成Cu，然后形成深色的BCA铜配合物。因此，在进一步的开发工作中，Smith方案看起来优于Waffenshmidt方案。
基于上述测试，发现正确的pH值、缓冲溶液和配合剂没有给所述方法带来足够的灵敏度。基于文献，不能鉴定改进使用BCA方法的糖检测的合适催化剂。
铜的氧化能力在BCA方法中起作用。因此，并且基于上文提到的结果和结论，试图发现比铜更强的氧化剂。根据本发明，可以利用合适的颜色变化指示剂来检测氧化剂的还原。
然而，采用更强的氧化剂产生了几个问题。随着物质的氧化能力提高，其毒性和对其它物质的反应性也提高。反应性使得几种物质自发地衰减或减少，这减弱了测试的稳定性和功能。
然后我们认识到，能够利用基于颜色变化的方法，以使得糖更容易被检测到的方式来修饰或改造糖自身。因此，我们试图氧化糖，以增加糖所含的醛基的数目，因为在基于铜还原的方法中，正是醛基特别地与铜反应。
从文献中鉴定了三种适合氧化糖的化学物质：高碘酸、高碘酸钠和Dess-Martin高碘酸盐，它们以增加醛基的方式氧化糖。如下文所述，我们发现，增加醛基数目降低了方法的检测限，并且还使得可以检测低还原能力的糖和中性糖。
实施例2
在试管方法中，将表3.1所列的糖、高碘酸钠和BCA试剂以给定的顺序加入到试管中。含糖的试管于室温下，在5分钟内发生颜色变化，但是零级反应(阴性对照)在五分钟后发生。该测试证实了明显的进步，因为BCA方法现在在室温下是有作用的，并且甚至中性糖也导致了颜色变化。零级反应归因于BCA试剂所含的酒石酸钠。
通过制备表3.1所示的BCA混合物中的溶液A但不含酒石酸钠来研究酒石酸钠的作用。所有的糖在试管方法中均未引起颜色变化。这可以归因于高碘酸钠的氧化作用，在该情况下铜被糖还原，但被高碘酸再次氧化(Cu+→Cu2+)。
决定用织物来测试作为BCA方法的一部分的高碘酸钠。以与以前的测试相同的方式将BCA试剂印刷到织物上，最后加入高碘酸钠。目的是在阴性对照样品与含糖样品之间建立清晰的时间限制。
基于这些结果，结论是高碘酸钠能够用于增强测试的灵敏度，但是高碘酸钠也干扰所述方法，使得只可以30-40分钟后观察到糖诱导的颜色变化。因此，需要在糖的改造或修饰之后中和和/或失活高碘酸钠的方法。
实施例3
我们最初的结果和创造性的问题解决方法使得我们采取了包含以一个系列反应的化学物质的多步骤测试，即多区域测试或多区带测试。毛细管作用使得样品溶液在织物中流动，其中该样品溶液与织物上的特定区域上印刷的化学物质反应。
在测试概念中，被研究的表面上的糖杂质被携带通过含有必需化学物质的吸湿织物。在织物中，液体样品中的糖以给定的顺序与化学物质反应。因此，甚至通常会抑制反应或引起零级反应的反应性化学物质，例如实施例2所述的那些，也能够被用作试剂，因为它们能够在BCA-被分析物指示区域之前被失活。因此，在快速多步骤测试中，当采用本发明的改造和失活时，所述试管方法中所用的试剂能够用在织物材料上。
在早期的试管方法中，发现高碘酸钠在室温下促进BCA方法。问题是几分钟后阴性样品出现阳性测试结果以及难以使得该方法对织物起作用。我们认识到，能够通过包含附加步骤来改进该方法。
已知的是，糖的环结构和单体之间的连接涉及醚键。打开该醚键加速糖与高碘酸钠的反应以及与铜的进一步反应。氢卤酸碘化氢、溴化氢或低pH可以用于断开醚键(Clayden et al.，Organic Chemistry，OUP 201，p.434)。由于卤化氢不能以固体形式固定在织物上，因而不能直接使用。
糖的醚键在酸性条件下被断开，这在试管方法测试中利用硫酸实现。然后，将糖用高碘酸钠氧化，并将过量的高碘酸钠用硫代硫酸钠中和。在加入BCA试剂之前，将溶液用氢氧化钠中和。将化学计量比用作优化化学浓度的起点，这获得了表4.1所示的浓度。
表4.1 高碘酸钠/硫代硫酸钠中的试剂配比
| 试剂 | 体积 |
| 糖溶液1g/l | 200μl |
| 硫酸0.1M | 100μl |
| 高碘酸钠11.3g/l | 100μl |
| 硫代硫酸钠x 5H2O 11.6g/l | 120μl |
| NaOH 0.1M | 200μl |
| BCA溶液B，稀释至5％ | 100μl |
| 含有酒石酸的BCA溶液A | 500μl |
在试管方法测试中，上述方法对于蔗糖引起了颜色变化，并且零样品(阴性对照)在24分钟后发生颜色变化。
根据我们创造性的理解，在指示样品中的被分析物之前，可以在多步骤方法中增加糖的反应性，并且可以使干扰其测定的试剂失活。
在织物测试的开发期间，将化学物质印刷到织物上，然后将该织物切成带。这些带并排放置，形成类似于连续织物的结构，并且将带在塑料膜之间进行层压。最初选择的是醋酸纤维素塑料；然而，其亲水性使液体在塑料-织物界面处移动。通过利用疏水性塑料解决了这个问题，所述疏水性塑料将样品液体保持在织物中。图1描述了吸湿织物方法的结构实例。可以存在包含不同试剂的织物的不同区域。图1中不同的颜色代表潜在的试剂区域。
因此，提供了包含织物材料的测试装置，其中该织物包含一组系列地组合在一起以形成连续织物的不同带，或者包含单一的织物。每一不同带中包含至少一种试剂，优选仅包含一种试剂，而该单一的织物包含以预定和连续顺序提供在织物上的多于一种的试剂。所述织物材料被两个不渗透性层层压，该不渗透性层的一个具有至少一个开口，优选具有多个开口。开口的形状可以是圆形、三角形、矩形、形成的正方形或其它类似形式。开口的大小可以为0.01mm至大于2cm的穿孔，而一个单一开口的大小可以超过2cm。通常，为了促进织物材料中液体的毛细管运输，不渗透性构件(member)通常由疏水性材料制成。合适的材料包含无纺的聚丙烯材料。
所述装置还可以提供这样的设计：其包含至少一个取样开口，该取样开口后连接了包含一系列试剂区带的通道，该试剂区带与所述不渗透性、透明或不透明的层层压，其末端为至少一个非层压开口或包含测试指示区域的透明层压层。
明显地，擦拭或吸收测试装置可以具有能够利用本发明的原理的任何形式，如修饰要测试的样品和使干扰剂失活。例如，在装置的任一侧具有测试指示区域的不同形式是可以的，例如在样品擦拭或吸收区域的相同或相反侧。
如所述的，本发明优选地涉及一层织物，例如横向流动测试形式，其包含在不同区带顺序地应用的试剂。对于本领域技术人员而言显而易见的是，这样的横向流动测试可以包含各种设计和技术与方法学手段。
任选地，装置还可以包含一层织物材料，其允许样品通过，同时限制试剂或样品的回流。所述层也经常被称为半渗透层。例如，半渗透层可以由疏水性材料制成。合适的疏水性材料是无纺的聚丙烯材料。
通过使用桌面测试印刷机将每种试剂印刷在单独的织物上，将试管方法中所用的高碘酸钠-硫代硫酸钠方法转移到织物上。多步骤测试的目的是在酸性条件下断开糖环，并且用高碘酸钠将糖链氧化成包含还原性醛基的较短碳链。在指示之前将干扰BCA方法的过量高碘酸钠用硫代硫酸钠中和，并且所得的含有醛基链的碳链将铜还原并形成强吸收性的配合物。
所用的织物是聚酯织物，其用pH值为10.2的0.1M碳酸盐缓冲液进行预处理。将BCA试剂以A+1/2B的比率印刷至这种预处理的织物上。将其它试剂印刷至未处理的织物上。
优选在织物上不使用涉及中和高碘酸钠的硫代硫酸钠的方法，因为在测试过程中，少量的过量硫代硫代酸钠可以引起零级反应。另外，这种方法的检测限高；浓度低于1g/l的糖溶液未引起可见的颜色变化。优选使用硫酸亚铁来代替硫代硫酸钠。硫酸亚铁将过碘酸盐还原成碘酸盐，同时氧化成三价铁离子。
将浓度为72g/l的硫酸铁(II)(FeSO4x7H2O)、浓度为11.3g/l的高碘酸钠、浓度为0.1M的硫酸以及BCA试剂A+1/2B印刷至单独的织物上。将它们层压成单个结构，其顺序首先是硫酸，然后是高碘酸钠，最后为硫酸亚铁。其后是作为反应区域的织物的干净带，然后是BCA试剂。随着样品沿着织物移动，预期发生下文所示的反应系列(Waffenschmidt et al.，见上文；Clayden et al.，Organic Chemistry，OLIP2001，146，344，1369；Caldwell et al.，J.Biol.Chem.1938，123，595-606)。
织物上推定的反应系列。
在第一阶段中，用硫酸将环结构打开。在下一个阶段中，高碘酸盐切割二醇，并且将糖氧化成醛。用硫酸亚铁来中和高碘酸盐，并且在最后阶段中，铜被形成的醛还原，然后与BCA形成有色配合物。
随着样品沿着织物移动，发现硫化亚铁被携带直至指示区域，并且引起错误的阳性反应。这是由于二价铁与铜反应，导致铁氧化和铜还原：Fe2++Cu2+→Fe3++Cu+。硫酸亚铁应当以正确的量存在，以被高碘酸钠完全氧化而不引起零级反应。尽管三价铁不再与铜反应，但是它被携带至指示区域减弱了检测限，因为其红棕色可以覆盖形成的BCA铜配合物的紫色。
为了防止铁被携带至指示区域，引入碳酸盐缓冲液区带。将织物用pH值为10.2的0.1M碳酸盐缓冲液洗涤，然后在60摄氏度的烘箱中干燥。将碳酸盐层放置在硫酸亚铁之后和指示区域之前。铁在碱性碳酸盐层中与碳酸根离子和氢氧根离子反应，形成下文所示的化合物(Smith et al.，见上文)。
Fe2++CO3 2-→FeCO3
Fe2++2OH-→Fe(OH)2
Fe3++3OH-→Fe(OH)3
存在的铁化合物沉淀而不是被溶解，这阻止了累积的化合物在织物上的移动。
所得的测试是有作用的，并且用含糖的样品获得了响应，而阴性对照样品保持无色。该方法的检测限是0.5g/l。织物上糖测试的功能性测试概念的实例如图2所示，其包括：1.抹区域；2.硫酸；3.高碘酸钠；4.硫酸亚铁；5.碳酸盐缓冲液；以及6.BCA，A+1/2B。应当指出，能够用高碘酸替换高碘酸钠层和硫酸层。
本发明所公开的方法通常包括在一个织物上并排地印刷化学物质，或者在不同的织物上分别地印刷化学物质，然后将该不同的织物并排层压以形成连续的织物结构。这些层在测试过程中是可见的，因为其是由织物上不同的带堆积而成。然而，可以想象，连续的织物片会用于卷对卷批量生产，这会使得在实践中难以用碳酸盐缓冲液来洗涤织物的部分。因此，所需量的碳酸盐缓冲液必须是可以通过印刷转移的。将单分子(unimolar)碳酸盐缓冲液印刷在指示区域。通过增加碳酸盐缓冲溶液的摩尔浓度，例如用pH值为10.2的饱和溶液，来增加织物上铁沉淀区域中碳酸盐缓冲液的量。利用能够转移24.9ml/m2的印刷滚筒将溶液在织物上印刷两次。在印刷的区域中，铁以碳酸盐的形式沉淀并且其随样品液体的移动被防止了，因此消除了对硫酸亚铁量优化的需要。能够通过调整缓冲溶液的摩尔浓度并且通过改变印刷滚筒中网眼大小和杯深来控制要转移的试剂的量。
如之前所述的，可以通过用原高碘酸H5IO6(HIO4x2H2O)代替高碘酸钠来进一步减少化学物质的量(Masuda et al.，J.Org.Chem.1994，59，5550-5555)。原高碘酸可以以固体形式得到，并且在织物上保持稳定。原高碘酸的pKa值为1.64；因此其在断开糖环时也能代替弱硫酸。
为了增强测试的灵敏度，进一步优化了织物上BCA试剂的比率。在试管方法中，将溶液A和B以50∶1的比例混合。当将试剂印刷至织物上时，使用1∶1(A+B)和2∶1(A+1/2B)的更高比例，在这种情况下，铜的蓝色干扰紫色BCA配合物的观察。将铜溶液用水稀释至1∶10(1/10B)。铜的量的修正(redaction)降低了检测限，并且能够检测0.1g/l的糖溶液的颜色变化，而不是以前0.5g/l的糖溶液的颜色变化。
实施例4
在一实施方案中，用于室温下糖检测的测试装置包括五个不同的区域和印刷在这些区域上的五种不同化学物质和/或试剂液体。作为第一区域，存在不含有任何化学物质的抹或抽吸区域。然后，液体样品移动至含有印刷的原高碘酸的区域，其中糖环结构中以及单体之间的醚键被断开。而且，糖在这个区域中被原高碘酸氧化成醛。下一个区域含有将高碘酸盐还原成碘酸盐的硫酸亚铁，同时亚铁被氧化成三价铁。三价铁离子和亚铁离子在接下来的含有碳酸盐缓冲液的区域中以碳酸铁和氢氧化铁的形式沉淀。最后的功能性层含有用能够转移24.9ml/m2油墨的滚筒印刷的BCA-测试的纯A溶液和1∶10稀释的B溶液。对于含有0.5g/l糖的300μg样品，产生了紫色，这证明检测液体样品中150μg诸如果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或糊精的糖的能力。然而，测试灵敏度随着上述给出的糖的顺序而降低，因此，对于第一种描述的糖，即使更小的糖浓度也是可检测的。
能够用诸如弱硫酸的其它酸和高碘酸钠层代替原高碘酸。如图2所示，除了硫酸亚铁以外，硫代硫酸钠也能够使高碘酸盐失活。
还在试管中测试了吸湿织物的上文的概念。利用该测验实施方案的试剂，以表5.1所示的顺序测量试管中的化学物质。加入硫酸亚铁后，溶液变得有些混浊，因为溶液中形成了三价铁离子。加入BCA混合物中所包含的溶液A后，亚铁和三价铁的碳酸盐和氢氧化物在五分钟内沉淀至试管的底部。
表5.1 室温下BCA碳水化合物测试功能性
| 试剂 | 体积 |
| 糖溶液1g/l | 1ml |
| 高碘酸11.3g/L | 100μl |
| 硫酸亚铁72g/l | 30μl |
| BCA混合物，溶液B | 10μl |
| BCA混合物，溶液A | 1ml |
当糖浓度为1g/l时，溶液的颜色立即变为紫色。该颜色随时间继续变深，这被认为是由于铜的缓慢还原。当糖浓度为0.01g/l时，对于单糖和二糖，颜色耗费七分钟显色成视觉可检测的水平；对于糊精和淀粉，显色较慢。
本发明和相关测试的一个优势在于其利用卷对卷印刷方法的可加工性。由于这个原因，测验中所用的所有化学物质都能够通过印刷方式转移至织物上。优选测试的制造涉及5种被连续印刷在织物上的化学物质。织物在印刷时伸长，这要求设备高精确的对齐能力。而且，许多试剂是无色的，这使得监测印刷质量和对齐不同区域进一步复杂化。根据本发明，使用其中印刷单元的数目对应于所用试剂数目的印刷机的印刷是最容易的。在这种情况下，对于优选的测试，推荐的印刷单元的数目是5。这种设备使得可以在一次运行中将所有的化学物质印刷至织物上。这减少了与对齐不同化学物质层和伸长有关的影响，因为伸长会等同地影响所有的印刷单元。
本发明所开发的测试是第一种在室温下起作用的用于糖测定的非酶促测试。所述方法也能检测许多测试不能检测的中性糖。本发明所提供的重要理解在于被分析物的化学修饰，如用高碘酸对糖进行的化学修饰；和在指示步骤及使用织物之前使干扰剂失活。本发明的一实施方案提供基于吸湿织物的灵活测试，其促进干扰化学物质在织物上的沉淀，从而阻止它们在织物上的进一步移动。
Claims (34)
1.测定被分析物碳水化合物在样品中的存在或量的非酶促方法，所述方法包括：
将所述样品应用于合成织物；
如果所述碳水化合物存在于所述样品中，则用具有足以切割两个羟基之间的碳水化合物链的氧化电势的氧化剂将所述碳水化合物进行化学修饰；
检测所述化学修饰的碳水化合物的存在或量；
其中在室温下进行所述化学修饰和检测，并且所述化学修饰和检测在所述织物的不同区域中进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述碳水化合物包含糖。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述糖包括果糖、糊精、乳糖、麦芽糖或蔗糖。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，还包括使干扰化学修饰的碳水化合物的检测的药剂失活。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述化学修饰和干扰剂的失活在检测所述化学修饰的碳水化合物之前进行。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述干扰剂的失活发生在随后于其中发生化学修饰的织物区域的织物区域中并且所述化学修饰的碳水化合物穿过所述织物区域。
7.如权利要求2或3所述的方法，其中所述化学修饰是用氧化剂打开糖环中的醚键和/或产生醛基的反应。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述化学修饰剂是高碘酸或高碘酸盐。
9.如权利要求7所述的方法，其中在所述化学修饰反应之后和在所述化学修饰的碳水化合物的检测之前，使会干扰所述化学修饰的碳水化合物的检测的过量氧化剂失活。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述化学修饰的碳水化合物的检测是用含铜化合物在所述化学修饰的碳水化合物的存在下给出可视的颜色变化而进行的。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述化学修饰的碳水化合物的检测是用含铜化合物在所述化学修饰的碳水化合物的存在下给出可视的颜色变化而进行的。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述化学修饰的碳水化合物的检测是用含铜化合物在所述化学修饰的碳水化合物的存在下给出可视的颜色变化而进行的。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述织物为聚酯织物。
14.如权利要求4所述的方法，其中所述样品通过毛细管作用穿过所述织物，并且用于化学修饰的手段、用于使所述干扰剂失活的手段和所述检测手段存在于所述样品穿过的所述织物的顺序区域中。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述样品通过毛细管作用穿过所述织物，并且用于化学修饰的手段、用于使所述干扰剂失活的手段和所述检测手段存在于所述样品穿过的所述织物的顺序区域中。
16.如权利要求1所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法将所述样品应用于织物上：使所述织物与表面接触，并从所述表面擦拭或吸收所述样品。
17.如权利要求16所述的方法，其中使所述织物与所述表面互相接触之前，使所述织物或所述表面与缓冲溶液接触。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述织物包含作为糖的氧化剂的高碘酸钠或高碘酸，并且其中所述方法包括用硫代硫酸钠或硫酸亚铁中和所述高碘酸钠或高碘酸。
19.适合进行前述权利要求中任一权利要求所述非酶促方法的测试装置，所述装置包括携带用于在室温下用具有足以切割两个羟基之间的碳水化合物链的氧化电势的氧化剂将碳水化合物进行化学修饰的手段的合成织物，以及用于在室温下检测化学修饰的碳水化合物的手段，其中所述化学修饰和检测在所述织物的不同区域中进行。
20.如权利要求19所述的装置，其中所述装置还包括用于使干扰剂失活的手段。
21.如权利要求20所述的装置，其中将所述织物与不渗透性层和/或允许样品或试剂单向通过的层材料层压。
22.如权利要求21所述的装置，其中所述层压的不渗透性层包括至少一个开口。
23.如要求21所述的装置，其中允许样品或试剂的单向流动的层压的层限制样品或试剂向取样表面的回流。
24.用于非酶促地检测样品中碳水化合物的存在或量的如权利要求20至23中任一权利要求所述的装置，所述装置包括合成织物层，所述织物层适合于所述样品通过所述织物层的顺序移动，
所述织物层包括
化学修饰区域，其包含用于在室温下将碳水化合物进行化学修饰的手段；
失活区域，其包含用于将干扰化学修饰的碳水化合物的检测的药剂失活的手段；以及
指示区域，其包含用于在室温下检测化学修饰的碳水化合物的手段。
25.如权利要求24所述的装置，其中所述失活区域在随后于化学修饰区域并适于所述化学修饰的碳水化合物穿过的织物区域中。
26.如权利要求19至23中任一权利要求所述的装置，所述装置包括织物材料层，其包含作为用于将所述碳水化合物进行化学修饰的试剂的高碘酸或高碘酸钠；所述装置还包括用于在利用使用二辛可宁酸的铜配合剂来检测所述化学修饰的碳水化合物之前，将所述化学修饰剂中和的硫代硫酸钠或硫酸亚铁。
27.如权利要求24所述的装置，所述装置包括织物材料层，其包含作为用于将所述碳水化合物进行化学修饰的试剂的高碘酸或高碘酸钠；所述装置还包括用于在利用使用二辛可宁酸的铜配合剂来检测所述化学修饰的碳水化合物之前，将所述化学修饰剂中和的硫代硫酸钠或硫酸亚铁。
28.如权利要求25所述的装置，所述装置包括织物材料层，其包含作为用于将所述碳水化合物进行化学修饰的试剂的高碘酸或高碘酸钠；所述装置还包括用于在利用使用二辛可宁酸的铜配合剂来检测所述化学修饰的碳水化合物之前，将所述化学修饰剂中和的硫代硫酸钠或硫酸亚铁。
29.制造权利要求19至28中任一权利要求所述的测试装置的方法，所述方法包括：
通过印刷将用于在室温下用具有足以切割两个羟基之间的碳水化合物链的氧化电势的氧化剂将碳水化合物进行化学修饰的试剂和用于在室温下检测所述化学修饰的碳水化合物的试剂应用至所述合成织物材料，其中使卷对卷印刷与所述织物材料接触，同时将所述接触卷旋转并使所述接触卷和所述织物材料相对地移动；和
将所述织物材料在两个不渗透性层之间层压，所述不渗透性层的一个具有至少一个与所述织物材料对齐的开口，样品通过所述开口可以从表面被吸收至所述织物材料。
30.如权利要求29所述的制造测试装置的方法，其中所述卷对卷印刷为凹版印刷。
31.用于非酶促地测定碳水化合物在样品中的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求19至28中任一权利要求所述的测试装置。
32.如权利要求31所述的试剂盒，还包含缓冲溶液，所述缓冲溶液用于将所述织物材料或要取样的表面或要产生所述样品的表面润湿。
33.如权利要求1至18中任一权利要求所述方法的用途，其用于检测表面上碳水化合物的存在以指示所述表面的污染。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述污染是被促进微生物生长的物质的污染。
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