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CN101932341A - Mr成像剂或包含超极化13c-丙氨酸的成像介质和使用该成像介质的成像方法 - Google Patents

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CN101932341A CN2009801037782A CN200980103778A CN101932341A CN 101932341 A CN101932341 A CN 101932341A CN 2009801037782 A CN2009801037782 A CN 2009801037782A CN 200980103778 A CN200980103778 A CN 200980103778A CN 101932341 A CN101932341 A CN 101932341A
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G·汉森
S·曼森
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P·R·詹森
M·H·莱彻
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Abstract

本发明涉及超极化的13C-丙氨酸，它作为成像剂的用途，包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质和使用这样的成像介质的13C-MR检测方法。此外，本发明涉及生产超极化的13C-丙氨酸的方法。

Description

MR成像剂或包含超极化13C-丙氨酸的成像介质和使用该成像介质的成像方法
本发明涉及超极化的13C-丙氨酸，它作为成像剂的用途，包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质和使用这样的成像介质的13C-MR检测方法。此外，本发明涉及生产超极化的13C-丙氨酸的方法。
磁共振(MR)成像(MRI)是已经变成对医师特别有吸引力的技术，因为可以以非侵入方式获得患者身体或其部分的图像，且不需要将患者和医务人员暴露于潜在有害的辐射例如X射线。因为它的高质量图像和良好空间和时间分辨力，MRI是用于使软组织和器官成像的良好成像技术。
可以使用或不使用MR造影剂进行MRI。但是，对比度提高的MRI通常能检测许多更小的组织变化，这使它成为用于检测早期组织变化(例如，小肿瘤或转移灶)的有力工具。
几类造影剂已经用于MRI。水溶性的顺磁金属螯合物，例如钆螯合物如OmniscanTM(GE Healthcare)，是广泛使用的MR造影剂。因为它们的低分子量，当施用进脉管系统时，它们迅速分布进细胞外间隙(即血液和间质)。它们也相对迅速地从身体清除。
另一方面，血池MR造影剂，例如超顺磁的氧化铁颗粒，在脉管系统内长时间停留。已经证实它们对于增强肝中的对比度和检测毛细管通透性异常(例如肿瘤中“有漏隙的”毛细管壁，它们是肿瘤血管发生的结果)是非常有用的。
尽管前述造影剂具有无可争议的优良性质，它们的使用不是没有任何风险。虽然顺磁金属螯合物通常具有高稳定性常数，有毒的金属离子可能在施用后释放在体内。此外，这些类型的造影剂显示出较差的特异性。
WO-A-99/35508公开了使用超极化的高T1试剂溶液作为MRI造影剂对患者进行MR研究的方法。术语“超极化”是指增强高T1试剂中存在的NMR活性核(即具有非零核自旋的核，优选13C-或15N-核)的核极化。增强NMR活性核的核极化后，这些核的激发的和基础的核自旋状态之间的群体差异显著提高，由此使MR信号强度放大数百或更高的因子。当使用超极化的13C-和/或15N-富集的高T1试剂时，基本上不存在来自背景信号的干扰，因为13C和/或15N的天然丰度是可忽略的，因而图像对比度有利地提高。常规MRI造影剂和这些超极化的高T1试剂之间的主要差异是，在前者中，对比度的变化是通过影响水质子在体内的弛豫时间来实现，而后一类试剂可以视作非放射性示踪剂，因为得到的信号仅仅源自试剂。
在WO-A-99/35508中公开了许多种可能用作MR成像剂的高T1试剂，包括非内源性的和内源性的化合物。作为后者的实例，可以提及正常代谢循环中的中间体，据称它们优选地用于对代谢活性成像。通过体内代谢活性成像，可以得到组织的代谢状态的信息，所述信息可以例如用于辨别健康的和患病的组织。
例如丙酮酸盐是在柠檬酸循环中起作用的化合物，超极化的13C-丙酮酸盐向它的代谢产物超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的转化，可以用于人体中的代谢过程的体内MR研究。
超极化的13C-丙酮酸盐向它的代谢产物超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的代谢转化，可以用于人体中的代谢过程的体内MR研究，因为已经发现所述转化快得足以实现来自母体化合物(即超极化的13C1-丙酮酸盐)和它的代谢产物的信号检测。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量依赖于要研究的组织的代谢状态。超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的MR信号强度与这些化合物的量和在检测时剩余的极化程度有关，因此通过监视超极化的13C-丙酮酸盐向超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的转化，可能使用非侵入的磁共振成像和/或磁共振波谱分析，体内地研究人或非人动物体内的代谢过程。
从不同丙酮酸盐代谢产物产生的MR信号振幅随组织类型而异。由丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特代谢峰图案，可以用作检查的组织的代谢状态的指纹。
超极化的13C-丙酮酸盐可以例如用作MR成像剂，用于通过MR成像评估心肌组织的活力(在WO-A-2006/054903中详述)和用于体内肿瘤成像(在WO-A-2006/011810中详述)。
肿瘤组织的特征经常在于增加的灌注和更高的代谢活性。增加血管床的过程(血管发生)被细胞诱导，这是由于它们更高的代谢需求和/或它们离毛细管更大的距离，不能获取足够的底物来提供维持能量体内稳态所需的能量。在这样的细胞不能生产足够能量的区域中，预见到显著的代谢模式变化。不能维持能量体内稳态的组织会改变它的能量代谢，这特别地导致增加的乳酸盐生成。使用超极化的13C-丙酮酸盐作为MR成像剂，通过增加的13C-乳酸盐生成(这可以通过13C-MR检测来检出)，可以看到该更高的代谢活性。
但是，由于适合作为体内成像剂的超极化的13C-丙酮酸盐的生产面临挑战，需要替代性的超极化的成像剂，其可以用于获得关于代谢活性的信息。
我们现在已经发现，超极化的13C-丙氨酸可以用作这样的成像剂。
丙氨酸与α-酮戊二酸盐反应，形成丙酮酸盐和谷氨酸盐，该反应由丙氨酸转氨酶催化。此外，丙酮酸盐由丙氨酸与乙醛酸盐的反应形成。该反应由丙氨酸-乙醛酸盐转氨酶催化。两种酶存在细胞质和线粒体同种型。因此，通过使用超极化的13C-丙氨酸作为成像剂，可以评估代谢活性。
因而，在第一个方面，本发明提供了包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质。
术语“成像介质”表示液体组合物，其含有超极化的13C-丙氨酸作为MR活性剂，即成像剂。
根据本发明的成像介质可以用作用于体内13C-MR检测(即在活的人或非人动物中)的成像介质。此外，所述成像介质可以用作用于体外13C-MR检测的成像介质，例如细胞培养物、样品(如尿、唾液或血液)、离体组织(例如从活组织检查得到的离体组织)或分离的器官的体外13C-MR检测。在一个优选的实施方案中，根据本发明的成像介质可以用作用于体内13C-MR检测的成像介质。
术语“13C-MR检测”表示13C-磁共振成像或13C-磁共振波谱分析或组合的13C-磁共振成像和13C-磁共振波谱分析，即13C-MR波谱成像。该术语另外表示在不同时间点的13C-MR波谱成像。
术语“13C-丙氨酸”表示同位素地富集13C的2-氨基-丙酸。
超极化的13C-丙氨酸的同位素富集优选地是至少75％、更优选至少80％、特别优选至少90％，超过90％的同位素富集是最优选的。理想地，富集是100％。通常，根据本发明的超极化的13C-丙氨酸可以在分子中的任意碳原子处同位素地富集。但是，为了实现长T1，优选地13C-丙氨酸在C1-位置(在下文中表示为13C1-丙氨酸)或在C2-位置(在下文中表示为13C2-丙氨酸)的13C同位素地富集。多重富集也是可能的，如在C1-和C2-位置(在下文中表示为13C1，2-丙氨酸)、在C1-和C3-位置(在下文中表示为13C1，3-丙氨酸)、在C2-和C3-位置(在下文中表示为13C2，3-丙氨酸)或在C1-、C2-和C3-位置(在下文中表示为13C1，2，3-丙氨酸)的同位素富集，在C1-位置的同位素富集是优选的。
术语“超极化的”和“极化的”在下文中互换地使用，表示超过0.1％、更优选超过1％和最优选超过10％的核极化水平。
极化水平可以例如通过固体超极化的13C-丙氨酸(例如，通过13C-丙氨酸的动态核极化(DNP)得到的固体超极化的13C-丙氨酸)的固态13C-NMR测量来测定。固态13C-NMR测量优选地包含使用低翻转角单脉冲获取NMR序列。将NMR波谱中超极化的13C-丙氨酸的信号强度与在极化过程之前获取的NMR波谱中13C-丙氨酸的信号强度相对比。然后，从极化之前和之后的信号强度比计算极化水平。
以类似的方式，通过液态NMR测量，可以测定溶液中超极化的13C-丙氨酸的极化水平。再将溶液中超极化的13C-丙氨酸的信号强度与极化之前溶液中13C-丙氨酸的信号强度相对比。然后，从极化之前和之后13C-丙氨酸的信号强度比计算极化水平。
通过描述在例如WO-A-98/30918、WO-A-99/24080和WO-A-99/35508中的不同方法，可以实现NMR活性的13C-核的超极化，它们都通过参考引用并入本文，本领域已知的超极化方法是，来自惰性气体的极化转移、“蛮力”、自旋冷冻、仲氢方法和动态核极化(DNP)。
超极化的13C-丙氨酸可以如下得到：通过直接极化13C-丙氨酸，或通过极化13C-丙氨酸的盐，并随后用碱或酸将盐转化(中和)成13C-丙氨酸。合适的13C-丙氨酸的盐可商业上获得，或可以从可商业获得的13C-丙氨酸制备，这将在下文段落中详细讨论。
获得超极化的13C-丙氨酸的一种方法是，来自超极化的惰性气体的极化转移，这描述在WO-A-98/30918。使用循环地极化的光，可以超极化具有非零核自旋的惰性气体。超极化的惰性气体，优选He或Xe，或这些气体的混合物，可以用于实现13C-核的超极化。超极化的气体可以是气相，它可以溶于液体/溶剂中，或超极化的气体自身可以用作溶剂。或者，可以在冷却的固体表面上浓缩气体，并以该形式使用，或使它升华。超极化的气体与13C-丙氨酸的亲密混合是优选的。
获得超极化的13C-丙氨酸的另一种方法是，通过在非常低的温度和高场的热力学平衡，将极化传递给丙氨酸的13C-核。通过使用非常高的场和非常低的温度(蛮力)，实现与NMR光谱仪的操作场和温度相对比的超极化。使用的磁场强度应当尽可能高，合适地高于1T，优选高于5T，更优选15T或更高，特别优选20T或更高。温度应当非常低，例如4.2K或更低，优选1.5K或更低，更优选1.0K或更低，特别优选100mK或更低。
获得超极化的13C-丙氨酸的另一种方法是，自旋冷冻方法。该方法用自旋冷冻极化覆盖固体化合物或系统的自旋极化。该系统掺有或亲密混合合适的晶体顺磁材料例如Ni2+、镧系无素或锕系元素离子，对称轴量级为3或更高。仪器操作比DNP所需更简单，不需要均一磁场，因为不应用共振激发场。通过绕着垂直于磁场方向的轴物理地旋转样品，进行该过程。该方法的前提条件是，顺磁物质具有高度各向异性的g-因子。作为样品旋转的结果，电子顺磁共振与核自旋接触，导致核自旋温度的降低。进行样品旋转，直到核自旋极化已经达到新的平衡。
在一个优选的实施方案中，DNP(动态核极化)用于获得超极化的13C-丙氨酸。在DNP中，要极化的化合物中MR活性核的极化受到极化剂或所谓的DNP试剂(包含未成对电子的化合物)的影响。在DNP过程中，提供能量，通常以微波辐射的形式，它最初激发DNP试剂。衰退到基础状态后，极化从DNP试剂的未成对电子转移至要极化的化合物的NMR活性核，例如13C-丙氨酸中的13C核。通常，在DNP过程中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如通过在液态氦和约1T或以上的磁场中进行DNP过程。或者，可以采用中等磁场和能够实现充分的极化增强的任意温度。DNP技术进一步描述在例如WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，它们二者通过参考引用并入本文。
为了通过DNP方法极化化学个体即化合物，制备要极化的化合物和DNP试剂的组合物，然后任选地冷冻，并插入DNP偏振器(如果以前没有冷冻，则在这里冷冻)进行极化。极化后，通过熔化它或通过把它溶于合适的溶解介质中，将冷冻的固态超极化的组合物迅速转化成液态。溶解是优选的，冷冻的超极化的组合物的溶解过程和使用的合适的装置详细描述在WO-A-02/37132中。熔化过程和适用于熔化的装置描述在例如WO-A-02/36005中。
为了在要极化的化合物中得到高极化水平，所述化合物和DNP试剂需要在DNP过程中密切接触。这不适用于组合物在冷冻或冷却后结晶的情况。为了避免结晶，需要在组合物中存在玻璃形成体，或需要选择用于极化的化合物，其在冷冻后不结晶，但是形成玻璃。
术语“玻璃形成体”在本申请的上下文中是指一种化学化合物，其在加入溶液(例如根据本发明方法步骤a)的溶液)中时，促进玻璃化并预防所述溶液在冷却或冷冻时结晶。在本发明的上下文中优选的玻璃形成体的实例是二醇，即含有至少2个羟基的醇，例如乙二醇、丙二醇，和甘油或DMSO。
在一个实施方案中，13C-丙氨酸，优选13C1-丙氨酸，用作原料，以通过DNP方法得到超极化的13C-丙氨酸。在另一个优选的实施方案中，13C-丙氨酸、优选13C1-丙氨酸的盐，用作原料，以通过DNP方法得到超极化的13C-丙氨酸。
在第一个实施方案中，13C-丙氨酸，优选13C1-丙氨酸，用作原料，以通过DNP方法得到超极化的13C-丙氨酸。13C-丙氨酸是可商业获得的化合物。在第二个实施方案中，13C-丙氨酸的盐，优选13C1-丙氨酸的盐，用作原料，以通过DNP方法得到超极化的13C-丙氨酸。合适的13C-丙氨酸的盐是例如13C-丙氨酸的铵盐或13C-丙氨酸的羧酸盐。13C-丙氨酸的铵盐是这样的化学个体，其包含13C-丙氨酸例如13C1-丙氨酸(即H3N+-C(CH3)(H)-13COOH)作为阳离子。13C-丙氨酸的羧酸盐是这样的化学个体，其包含2-氨基丙酸盐例如13C1-2-氨基丙酸盐(即H2N-C(CH3)(H)-13COO-)作为阴离子。
13C-丙氨酸的铵盐是可商业获得的化合物，或通常可以通过使13C-丙氨酸与酸反应来得到。原则上，具有比羧基13C-丙氨酸更低的pKa的任意酸，都可以用于将它转化成它的铵盐。如果用于得到铵盐的酸的反荷离子较大和/或是亲脂的，可能妨碍铵盐的溶解度。更优选的酸是强酸，更优选强无机酸如盐酸(HCl)，氢溴酸(HBr)，氢碘酸(HI)或硫酸(H2SO4)。最优选的酸是HCl，因为它廉价且容易获得。通过使13C-丙氨酸与HCl反应，得到氯化铵，即丙氨酸
Figure BPA00001189016600063
氯化物。如果超极化的13C-丙氨酸用于体内MR，丙氨酸氯化物是优选的原料，因为人或非人动物体对氯化物离子的耐受性较好。但是，如果为了某种原因使用耐受性不太好的阴离子，可以在极化后，通过本领域已知的方法，例如使用阴离子交换柱，用生理上耐受性非常好的阴离子如氯化物交换所述阴离子。一种这样的原因是，使用用于制备13C-丙氨酸的铵盐的特定酸，可以得到更高浓度的13C-丙氨酸样品和/或更高的13C-丙氨酸极化水平。作为使用氢碘酸的一个实例，可以得到非常高浓度的13C-丙氨酸样品，但是当考虑生理耐受性时，碘化物不是优选的阴离子。因此，可以用具有更好生理耐受性的阴离子例如氯化物交换所述碘化物。
在本发明的方法中，如果13C-丙氨酸的铵盐不是可商业获得的化合物，可以制备并分离它，或原位制备且不分离得到的铵盐。分离铵盐的优点是，可以表征分离的盐，且可以确定多少13C-丙氨酸实际上转化成铵盐。此外，如果在DNP过程中使用制备铵盐以外的其它溶剂，优选地也分离铵盐。
13C-丙氨酸的羧酸盐通常通过使13C-丙氨酸与碱反应来得到。原则上，碱性比13C-丙氨酸中的氨基更强的任意碱可以用于将它转化成它的羧酸盐。如果用于得到羧酸盐的酸的反荷离子较大和/或是亲脂的，也可能妨碍羧酸盐的溶解度。优选的碱是无机碱，更优选碱金属或碱土金属氢氧化物的水溶液，如NaOH、KOH、CsOH、Ca(OH)2或Sr(OH)2的水溶液。最优选的碱是NaOH，因为它廉价且容易得到。通过使13C-丙氨酸与NaOH反应，得到羧酸钠盐即13C-2-氨基丙酸钠。如果超极化的13C-丙氨酸用于体内MR，13C-2-氨基丙酸钠是优选的原料，因为人或非人动物体对钠阳离子的耐受性非常好。但是，如果为了某种原因使用耐受性不太好的阳离子，可以在超极化后，通过本领域已知的方法，例如使用阳离子交换柱，用生理上耐受性非常好的阳离子如Na+或葡甲胺阳离子交换所述阳离子。一种这样的原因是，使用用于制备13C-丙氨酸的羧酸盐的特定碱，可以得到更高浓度的13C-丙氨酸样品和/或更高的13C-丙氨酸极化水平。
可以制备并分离13C-丙氨酸的羧酸盐，或原位制备且不分离得到的13C-丙氨酸的羧酸盐。在DNP极化之前分离盐的优点是，可以表征分离的盐，且可以确定多少13C-丙氨酸的羧酸盐实际上转化成羧酸盐。此外，如果在DNP过程中使用制备羧酸盐以外的其它溶剂，优选地也分离羧酸盐。
DNP试剂在DNP过程中起决定作用，因为它的选择对在13C-丙氨酸中可以实现的极化水平具有重大影响。已知许多种DNP试剂，在WO-A-99/35508中称作“OMRI造影剂”，如过渡金属例如铬(V)离子、磁性颗粒或有机自由基例如氧化亚氮基团或三苯甲基基团。在WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711或WO-A-96/39367中所述的基于氧的、基于硫的或基于碳的稳定的三苯甲基基团的应用，已经在许多不同的化学个体中产生高水平的极化。
在一个优选的实施方案中，通过DNP得到在本发明的成像介质中使用的超极化的13C-丙氨酸，且使用的DNP试剂是三苯甲基基团。如上面简单提到的，通过邻近电子拉莫尔频率的微波辐射，DNP试剂(即三苯甲基基团)的大电子自旋极化转化成13C-丙氨酸中13C核的核自旋极化。通过e-e和e-n跃迁，微波刺激电子和核自旋系统之间的交流。对于有效的DNP，即为了在13C-丙氨酸中实现高水平的极化，三苯甲基基团必须在13C-丙氨酸的溶液中稳定且可溶，以实现13C-丙氨酸和三苯甲基基团之间的亲密接触，这是前述电子和核自旋系统之间的交流所必需的。
在一个优选的实施方案中，三苯甲基基团是式(1)的基团
Figure BPA00001189016600081
其中
M代表氢或一价阳离子；且
R1可以相同或不同，代表任选地被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C6-烷基，或基团-(CH2)n-X-R2，
其中n是1，2或3；
X是O或S；且
R2是任选地被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C4-烷基。
在一个优选的实施方案中，M代表氢或一价生理上可耐受的阳离子。术语“生理上可耐受的阳离子”表示可被人或非人动物活体耐受的阳离子。优选地，M代表氢或碱阳离子、铵离子或有机胺离子例如葡甲胺。最优选地，M代表氢或钠。
在一个优选的实施方案中，R1是相同的，更优选直链或支链C1-C4-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或R1优选地相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链C1-C4-烷基，最优选-CH2-CH2-OH；或R1优选地相同，代表-CH2-OC2H4OH。
可以合成前述的式(1)的三苯甲基基团，详细描述在WO-A-88/10419，WO-A-90/00904，WO-A-91/12024，WO-A-93/02711，WO-A-96/39367，WO-A-97/09633，WO-A-98/39277和WO-A-2006/011811。
通常，对于DNP过程，制备包含原料和DNP试剂的液体组合物。如果原料或DNP试剂不是液体，需要向该组合物中加入溶剂。在下文中，用于DNP的液体组合物表示为“DNP组合物”。为了通过DNP方法得到超极化的13C-丙氨酸，制备DNP组合物，其包含原料(即13C-丙氨酸或其盐)(在下文中13C-丙氨酸或其盐代表样品)和DNP试剂，优选三苯甲基基团、更优选式(1)的三苯甲基基团。需要使用溶剂或溶剂混合物来促进DNP试剂和样品的溶解。如果超极化的13C-丙氨酸预期用作用于体内13C-MR检测的成像介质中的成像剂，优选地使溶剂的量保持最小。为了用于体内成像介质中，通常需要以相对较高的浓度施用超极化的13C-丙氨酸，即高浓度的样品优选地用于DNP过程中，因此优选地使溶剂的量保持最小。在该上下文中，也重要地提到，含有样品即DNP试剂、样品和溶剂(如果必要)的组合物的质量维持尽可能小。高质量对溶解过程的效率具有不利影响，如果使用溶解来将DNP过程后含有超极化样品的固态组合物转化成液态，例如在用于13C-MR检测的成像介质中使用它。这是由于下述事实，即在溶解过程中对于给定体积的溶解介质，当组合物质量增加时，组合物与溶解介质的质量比降低。此外，在将用于本发明的成像介质中的超极化的13C-丙氨酸施用给人或非人动物之前，可能需要去除使用的某些溶剂，因为它们可能不是生理上可耐受的。
如果用于获得超极化的13C-丙氨酸的原料是13C-丙氨酸的铵盐，例如优选的13C-丙氨酸
Figure BPA00001189016600101
氯化物，所述盐可以是可商业获得的盐，其溶于合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物。或者，优选地在用于制备DNP组合物之前，制备和分离铵盐。作为一个实例，13C1-丙氨酸氯化物可以如下制备：任选地在有溶剂例如乙醇存在下，将盐酸加入13C1-丙氨酸。得到的13C1-丙氨酸氯化物可以通过醚沉淀来分离，并干燥。然后将得到的13C1-丙氨酸氯化物溶于合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物。DNP试剂，优选三苯甲基基团和更优选式(1)的三苯甲基基团，可以作为固体或在溶液中加入溶解的13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600105
氯化物。或者，将DNP试剂溶于合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物，并将固体13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600106
氯化物加入溶解的DNP试剂中。通过本领域已知的几种方式，例如搅拌、涡旋或声处理和/或轻轻加热，可以促进化合物的亲密混合。
如果用于获得超极化的13C-丙氨酸的原料是13C-丙氨酸的羧酸盐，例如优选的13C-2-氨基丙酸钠，所述盐可以是可商业获得的盐，其溶于合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物。或者，优选地原位制备它，并不经分离地用于制备DNP组合物。作为一个实例，可以如下制备13C1-2-氨基丙酸的钠盐：将NaOH的水溶液加入13C1-丙氨酸，任选地在有溶剂例如水存在下。然后向得到的13C1-2-氨基丙酸钠中，加入固体DNP试剂，优选三苯甲基基团、更优选式(1)的三苯甲基基团。或者，将DNP试剂溶于合适的溶剂，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物，然后将溶解的DNP试剂加入得到的13C1-2-氨基丙酸钠。通过本领域已知的几种方式，例如搅拌、涡旋或声处理和/或轻轻加热，可以促进化合物的亲密混合。
DNP组合物可以另外包含顺磁金属离子。已经发现，顺磁金属离子的存在，可以在要通过DNP极化的化合物中导致提高的极化水平，详细描述在WO-A2-2007/064226，它通过参考引用并入本文。
术语“顺磁金属离子”表示处于它们的盐形式或鳌合形式(即顺磁螯合物)的顺磁金属离子。后者是包含螯合剂和顺磁金属离子的化学个体，其中所述顺磁金属离子和所述螯合剂形成络合物，即顺磁鳌合物。
在一个优选的实施方案中，顺磁金属离子是包含Gd3+的盐或顺磁鳌合物，优选包含Gd3+的顺磁鳌合物。在一个更优选的实施方案中，所述顺磁金属离子在步骤a)的溶液中是可溶的且稳定的。
象前述的DNP试剂一样，样品也必须与顺磁金属离子紧密接触。可以以几种方式得到包含样品、DNP试剂和顺磁金属离子的DNP组合物。
在第一个实施方案中，将样品溶于合适的溶剂中，得到溶液，或者在如上所述合适的溶剂中原位制备样品。向样品的这些溶液中，加入并溶解DNP试剂。DNP试剂，优选三苯甲基基团，可以作为固体或在溶液中加入，例如溶解在合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物。在一个随后的步骤中，加入顺磁金属离子。顺磁金属离子可以作为固体或在溶液中加入，例如溶解在合适的溶剂中，优选水或玻璃形成体如甘油或二醇，或水和玻璃形成体的混合物。在另一个实施方案中，将DNP试剂和顺磁金属离子溶解在合适的溶剂中，然后向该溶液加入固体或溶解在合适溶剂中的样品。在另一个实施方案中，将DNP试剂(或顺磁金属离子)溶于合适的溶剂中，加入任选地溶解的样品。在一个后续步骤中，将固体或在溶液中的顺磁金属离子(或DNP试剂)加入该溶液。优选地，使溶解顺磁金属离子(或DNP试剂)的溶剂的量保持最小。通过本领域已知的几种方式，例如搅拌、涡旋或声处理和/或轻轻加热，也可以促进化合物的紧密混合。
如果使用三苯甲基基团作为DNP试剂，这样的三苯甲基基团在用于DNP的组合物中的合适浓度是1-25mM，优选2-20mM，更优选10-15mM。如果将顺磁金属离子加入组合物中，这样的顺磁金属离子在组合物中的合适浓度是0.1-6mM(金属离子)，0.3-4mM的浓度是优选的。
已经制备DNP组合物后，通过本领域已知的方法冷冻所述组合物，例如通过在冷冻柜、在液氮中冷冻它，或通过简单地把它加入探针保持杯(probe-retaining cup)(样品杯)，并将样品杯置于DNP偏振器中，在这里液态氦会冷冻组合物。在另一个实施方案中，将组合物冷冻成“珠子”，然后加入样品杯和插入偏振器。这样的珠子可以通过将组合物逐滴加入液氮中得到。已经观察到这样的珠子的更有效的溶解，如果要极化更大量的样品，这是特别相关的，例如当超极化的13C-丙氨酸预期用于体内MR成像介质中时。
如果在组合物中存在顺磁金属离子，可以在冷冻前将所述组合物脱气，例如通过将氦气鼓泡穿过组合物(例如2-15min的时间段)，但是脱气可以通过其它已知的普通方法来实现。
DNP技术描述在例如WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中，它们二者通过参考引用并入本文。通常，在DNP过程中使用中等或高磁场和非常低的温度，例如通过在液态氦和约1T或以上的磁场中进行DNP过程。或者，可以采用中等磁场和能够实现充分的极化增强的任意温度。在本发明的上下文中，在液态氦和约1T或以上的磁场中进行DNP过程。合适的极化装置描述在例如WO-A-02/37132。在一个优选的实施方案中，极化装置包含低温恒温器和极化装置，例如通过波导管连接微波源的微波室，所述波导管在周围被磁场产生装置例如超导磁体围绕的中心孔中。该孔垂直于向下延伸到至少接近超导磁体的区域P的水平，这里的磁场强度足够高，例如1至25T，足以发生NMR活性样品核的极化。探针的孔(即要极化的冷冻组合物)优选地是可密封的，且可以抽真空至低压，例如1mbar量级或更低的压强。在孔内侧可以含有探针引导装置，例如可取出的运输管，该管可以从孔的顶部向下插入到区域P中微波室内侧的位置。区域P被液态氦冷却至低到足以发生极化的温度，优选0.1-100K、更优选0.5-10K，最优选1-5K量级的温度。探针引导装置优选在它的上末端是可以通过合适方式密封的，以在孔至保留部分真空。探针保持容器，例如探针保持杯或样品杯，可以可取出地固定在探针引导装置的下末端的内侧。探针保持容器优选地由具有低比热容和良好低温性质的轻重量材料制成，例如KelF(聚三氟氯乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，可以以它容纳超过一个探针的方式设计它。
将探针插入探针保持容器，浸没在液态氦中，并用微波辐照，优选在200mW在约94GHz的频率。极化水平可以如下监视：例如，通过包含超极化样品的冷冻组合物中13C-核的固态13C-NMR测量。固态13C-NMR测量优选地包含使用低翻转角单脉冲获取NMR序列。将13C-NMR波谱中超极化样品的信号强度与在DNP极化过程之前获取的13C-NMR波谱中样品的信号强度相对比。然后，从极化之前和之后的信号强度比计算极化水平。
对于在成像介质中的应用，冷冻的含有超极化样品的组合物需要从固态转化成液态，即在动态核极化后液化。
通过溶于适当的溶剂或溶剂混合物(溶解介质)或通过熔化固体冷冻组合物，可以实现液化。溶解是优选的，溶解过程和使用的合适的装置详细描述在WO-A-02/37132中。熔化过程和适用于熔化的装置描述在例如WO-A-02/36005中。简而言之，使用溶解装置/熔化装置，其与偏振器物理地分离，或是含有偏振器和溶解装置/熔化装置的设备的一部分。在一个优选的实施方案中，在高磁场中进行溶解/熔化，例如在偏振器内，以提高弛豫和保留最大程度的超极化。应当避免场结点，低场可能导致增强的弛豫，尽管采取上述措施。
如果在DNP组合物中使用的样品是13C-丙氨酸的铵盐，所述盐需要通过与碱反应(中和)转化成游离的13C-丙氨酸。所述中和可以与液化同时或在其之后进行。因而，在一个实施方案中，通过熔化或溶解冷冻的组合物进行液化，在溶解/熔化冷冻的组合物后进行转化。在另一个实施方案中，同时进行液化和转化，例如通过将冷冻的组合物溶于溶解介质，后者是或含有能将超极化的13C-丙氨酸铵盐转化成13C-丙氨酸的化合物。中和通常用碱进行。原则上，碱性比13C-丙氨酸中的氨基更强的任意碱都可以用于中和。优选的碱是无机碱，更优选碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸氢盐或碳酸盐的水溶液，如NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、CsOH、Ca(OH)2或Sr(OH)2的水溶液。最优选的碱是NaOH，因为它廉价且容易得到。此外，钠阳离子能被人或非人动物体非常好地耐受，因而如果超极化的13C-丙氨酸用于体内MR成像介质中，钠碱和更优选的NaOH，优选地用于中和。
如果在DNP组合物中使用的样品是13C-丙氨酸的羧酸盐，所述盐需要通过与酸反应(中和)转化成游离的13C-丙氨酸。我们已经在pH大于7的溶液(即碱性溶液)中观察到超极化的13C-丙氨酸的高弛豫率和因此丧失极化。因而，如果在DNP组合物中使用13C-丙氨酸的羧酸盐，需要小心地进行包含超极化的13C-丙氨酸羧酸盐的固体组合物的液化和中和，以避免丧失极化。可以与液化同时或杂其之后进行中和，对于后者必须注意，在液化后马上且直接进行中和。因而，在一个实施方案中，通过熔化或溶解冷冻的组合物进行液化，在溶解/熔化冷冻的组合物后迅速用酸进行中和。在另一个实施方案中，同时进行液化和中和，例如通过将冷冻的组合物溶于溶解介质，后者是或含有能将超极化的13C-丙氨酸羧酸盐转化成13C-丙氨酸的化合物。在另一个实施方案中，将酸加入探针保持杯，后者在动态核极化过程中含有冷冻的组合物。这可以如下实现：在探针保持杯中冷冻DNP组合物，将酸加到冷冻组合物的顶部，并冷冻该酸。或者，可以在探针保持杯中冷冻该酸，将DNP组合物加到冷冻的酸的顶部，然后冷冻。该操作导致中和所需的酸和13C-丙氨酸羧酸盐的紧密邻近，当溶解冷冻的组合物时，立即发生中和。原则上，具有比13C-丙氨酸的羧基更低的pKa的任意酸都可以用于中和。优选的酸是强酸，更优选强无机酸如盐酸(HCl)，氢溴酸(HBr)，氢碘酸(HI)或硫酸(H2SO4)。最优选的酸是HCl，因为它廉价且容易获得。此外，氯化物阴离子能被人或非人动物体非常好地耐受，如果超极化的13C-丙氨酸用于体内MR成像介质中，HCl优选地用于中和。
如上所述，液化优选地如下进行：用溶解介质溶解，所述溶解介质是或包含溶剂或溶剂混合物，优选水性载体。在一个优选的实施方案中，使用生理上可耐受的和药学上接受的水性载体如水或盐水。在最优选的实施方案中，所述溶解介质是或包含缓冲液，具体地如果超极化的13C-丙氨酸用于体内MR检测的成像介质中。对于体外MR-检测，也可以将非水性的溶剂或溶剂混合物用作或用于溶解介质中，例如DMSO或甲醇或包含水性载体和非水性溶剂的混合物，例如DMSO和水或甲醇和水的混合物。在另一个优选的实施方案中，溶解介质可以另外包含一种或多种能结合或络合游离的顺磁金属离子的化合物，例如螯合剂如DTPA或EDTA。
在一个优选的实施方案中，液化优选地如下进行：用溶解介质溶解，优选包含适用于中和13C-丙氨酸的羧酸盐或铵盐的碱或酸的缓冲液，所述中和即将它们转化成游离的13C-丙氨酸。如果13C-丙氨酸的铵盐已经用于DNP组合物中，优选地如果超极化的13C-丙氨酸预期用于体内MR成像介质中，优选地使用包含pH约6.8-7的缓冲液和碱的溶解介质进行溶解。合适的缓冲液是例如磷酸盐缓冲液(KH2PO4/Na2HPO4)，ACES，PIPES，咪唑/HCl，BES，MOPS，HEPES，TES，TRIS，BIS-TRIS，HEPPS或TRICIN。如果13C-丙氨酸的羧酸盐已经用于DNP组合物中，优选地如果超极化的13C-丙氨酸预期用于体内MR成像介质中，优选地使用包含pH略低于生理pH(即pH约6.8-7.2)的缓冲液和酸的溶解介质进行溶解。合适的缓冲液是例如磷酸盐缓冲液(KH2PO4/Na2HPO4)，ACES，PIPES，咪唑/HCl，BES，MOPS，HEPES，TES，TRIS，BIS-TRIS，HEPPS或TRICIN。
液化之后，可以从含有超极化样品或超极化的13C-丙氨酸的液体去除DNP试剂，优选三苯甲基基团，和可选的顺磁金属离子。如果超极化的13C-丙氨酸预期用于预期用于体内MR检测的成像介质中，这些化合物的去除是优选的。优选地首先将超极化样品转化成游离的13C-丙氨酸，并在已经发生所述转化后，去除DNP试剂和可选的顺磁金属离子。
用于去除三苯甲基基团和顺磁金属离子的方法是本领域已知的，详细描述在WO-A2-2007/064226和WO-A1-2006/011809。
在一个优选的实施方案中，通过动态核极化DNP组合物，后者包含13C-丙氨酸的盐(优选13C-丙氨酸的铵盐或羧酸盐，更优选13C-丙氨酸
Figure BPA00001189016600151
氯化物或13C-2-氨基丙酸钠)、式(1)的三苯甲基基团和任选的包含Gd3+的顺磁鳌合物，得到根据本发明的成像介质的超极化的13C-丙氨酸。
根据本发明的成像介质可以用作用于体外13C-MR检测的成像介质，例如细胞培养物、样品、离体组织或从人或非人动物体衍生的分离的器官的13C-MR检测。为此目的，作为适合加入例如细胞培养物、样品(如尿、血液或唾液)、离体组织(如活组织检查组织)或分离的器官的组合物，提供成像介质。除了成像剂(即超极化的13C-丙氨酸)以外，这样的成像介质优选包含，与体外细胞或组织试验相容且使用的溶剂，例如DMSO或甲醇或包含水性载体和非水性溶剂的溶剂混合物，例如DMSO和水或缓冲液或甲醇和水或缓冲液的混合物。技术人员会明白，在这样的成像介质中可以存在药学上可接受的载体、赋形剂和制剂辅料，但不是这样的目的所必需。
此外，根据本发明的成像介质可以用作用于体内13C-MR检测的成像介质，即在活的人或非人动物上进行的13C-MR检测。为此目的，成像介质必须适合施用给活的人或非人动物体。因此，除了成像剂(即超极化的13C-丙氨酸)以外，这样的成像介质优选包含水性载体，优选生理上可耐受的和药学上接受的水性载体如水、缓冲液或盐水。这样的成像介质可以另外包含常规药学或兽医载体或赋形剂，例如制剂辅料例如稳定剂，渗透压调节剂，增溶剂等，它们常规地用于人或兽医药物的诊断组合物中。
如果本发明的成像介质用于体内13C-MR检测，即用于活的人或非人动物体，所述成像介质优选地肠胃外地、优选静脉内地施用给人或非人动物体。通常，将要检查的身体置于MR磁场中。放置专用的13C-MRRF-圈，覆盖目标区域。成像介质的确切剂量和浓度依赖于多种因素，例如毒性和施用途径。通常，以最高达1mmol 13C-丙氨酸/kg体重、优选0.01-0.5mmol/kg、更优选0.1-0.3mmol/kg的浓度，施用成像介质。在施用后小于400s，优选施用后小于120s、更优选小于60s，特别优选20-50s，应用MR成像序列，其以联合频度和空间选择性的方式编码目标体积。应用MR序列的确切时间非常依赖于目标体积。
根据本发明的成像介质优选地用于13C-MR检测方法中，这样的方法是本发明的另一个方面。
因而，在第二个方面，本发明提供了使用包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质进行13C-MR检测的方法。
在一个优选的第一实施方案中，本发明提供了使用包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质进行13C-MR检测的方法，其中检测13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号。
术语“检测13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的的信号”是指，在本发明的方法中，仅检测13C-乳酸盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙氨酸的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙酮酸盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-碳酸氢盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和13C-丙酮酸盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和13C-碳酸氢盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙酮酸盐和13C-碳酸氢盐的信号，或检测13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和13C-丙酮酸盐和13C-碳酸氢盐的信号。
术语“13C-乳酸盐”表示同位素地富集13C的乳酸的盐，即其中13C同位素的量大于它的天然丰度。除非另有说明，术语“13C-乳酸盐”表示在C1-和/或C2-和/或C3-位置富集13C的化合物。13C-乳酸盐中同位素富集的位置当然依赖于它的母体化合物13C-丙氨酸中同位素富集的位置。因而，如果例如超极化的13C1-丙氨酸用于在本发明的方法中使用的成像介质中，检测13C1-乳酸盐的信号。
术语“13C-丙酮酸盐”表示同位素地富集13C的丙酮酸的盐，即其中13C同位素的量大于它的天然丰度。除非另有说明，术语“13C-丙酮酸盐”表示在C1-和/或C2-和/或C3-位置富集13C的化合物。13C-丙酮酸盐中同位素富集的位置当然依赖于它的母体化合物13C-丙氨酸中同位素富集的位置。因而，如果例如超极化的13C1-丙氨酸用于在本发明的方法中使用的成像介质中，检测13C1-丙酮酸盐的信号。
术语“13C-碳酸氢盐”表示同位素地富集13C的HCO3 -，即其中13C同位素的量大于它的天然丰度。仅在母体化合物13C-丙氨酸在C1-位置同位素地富集时，可以检测13C-碳酸氢盐。
在13C1-丙氨酸的方案1中，显示了丙氨酸向丙酮酸盐和乳酸盐的代谢转化；*表示13C-标记：13C-丙氨酸与α-酮戊二酸盐的氨基转移，形成13C-丙酮酸盐，该反应由丙氨酸转氨酶(ALT，EC 2.6.1.2)催化。此外，13C-丙氨酸与乙醛酸盐的氨基转移，形成13C-丙酮酸盐，该反应由丙氨酸-乙醛酸盐转氨酶(AGT，EC 2.6.1.44)催化。13C-丙酮酸盐会被乳酸盐脱氢酶(LDH，EC 1.1.1.27)转化成13C-乳酸盐，被丙酮酸盐脱氢酶复合物(PDC)转化成13C-碳酸氢盐。
Figure BPA00001189016600171
方案1
术语“信号”在本发明的上下文中是指13C-MR波谱中相对于峰噪音的代表13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的MR信号振幅或积分或峰面积。在一个优选的实施方案中，信号是峰面积。
在本发明方法的一个优选的实施方案中，13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的上述信号用于产生活的人或非人动物的代谢图谱。所述代谢图谱可以源自整个身体，例如通过整个身体体内13C-MR检测获得。或者，从目标区域或体积(即所述人或非人动物体的某种组织、器官或一部分)产生所述代谢图谱。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的上述信号用于产生细胞培养物的细胞、样品(如尿、血液或唾液)、离体组织(如从活组织检查组织)或从人或非人动物分离的器官的代谢图谱。然后通过体外13C-MR检测，产生所述代谢图谱。
因而，在一个优选的第一实施方案中，本发明提供了使用包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质进行13C-MR检测的方法，其中检测13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号，其中所述信号用于产生代谢图谱。
在一个更优选的第一实施方案中，使用13C-乳酸盐和13C-丙氨酸的信号产生所述代谢图谱。在另一个更优选的实施方案中，使用13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号产生所述代谢图谱。
在一个实施方案中，使用13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的波谱信号强度产生代谢图谱。在另一个实施方案中，使用13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的波谱信号积分产生代谢图谱。在另一个实施方案中，使用来自13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的分离图像的信号强度产生代谢图谱。在另一个实施方案中，在2个或多个时间点得到13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号强度，以计算13C-乳酸盐的变化速率和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的变化速率。
在另一个实施方案中，代谢图谱包括处理过的13C-乳酸盐和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号数据，例如从多次MR检测的信号图案(即波谱或图像)推论出的信号比、校正过的信号、或动态或代谢速率常数信息，或使用这样的信号数据产生代谢图谱。
因此，在一个优选的实施方案中，校正过的13C-乳酸盐信号，即13C-乳酸盐相对于13C-丙氨酸的信号和/或13C-乳酸盐相对于13C-丙酮酸盐和/或13C-乳酸盐相对于13C-碳酸氢盐的信号，用于产生代谢图谱或被包含在其中。在另一个优选的实施方案中，校正过的13C-乳酸盐相对于总13C-碳信号，用于产生代谢图谱或被包含在其中，总13C-碳信号是13C-乳酸盐和13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的信号的总和。在一个更优选的实施方案中，13C-乳酸盐与13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐和/或13C-碳酸氢盐的比，用于产生代谢图谱或被包含在其中。
在根据本发明的方法的优选实施方案中产生的代谢图谱，提供了关于要检查的身体、身体的一部分、细胞、组织、身体样品等的代谢活性的信息，所述信息可以在后续步骤中用于例如鉴别疾病。
这样的疾病可以是肿瘤，因为肿瘤组织通常特征在于比健康组织更高的代谢活性。通过对比肿瘤或肿瘤离体样品的代谢图谱与健康组织(例如周边组织或健康离体组织)的代谢图谱，这样的更高的代谢活性显而易见，且可以通过13C-乳酸盐的高信号或高校正过的13C-乳酸盐信号或13C-丙氨酸与13C-乳酸盐的比或13C-乳酸盐累积的高代谢速率，在代谢图谱中显示出它自身。
术语“高”是相对的术语，必须理解，与在健康组织的代谢图谱中看到的信号、比、代谢速率等相比，在如上所述的患病组织的代谢图谱中看到的“高信号、比、代谢速率”等增加。
另一种疾病可以是心脏缺血，因为缺血的心肌组织通常特征在于比健康心肌组织更低的代谢活性。以前段所述的方式，通过对比缺血的心肌组织的代谢图谱与健康心肌组织的代谢图谱，这样更低的代谢活性也显而易见。
另一种疾病可以是肝相关的疾病，例如糖尿病，肝纤维化或肝硬化。在这些疾病中，血清丙氨酸转氨酶是发病的灵敏预报因子。如上所述，可以对比健康肝和患病肝直接的代谢图谱。
在本发明的方法中可以包含解剖的和/或灌注信息(在合适时)，用于鉴别疾病。解剖学信息可以例如如下得到：在本发明的方法之前或之后，使用或不使用合适的造影剂，获取质子或13C-MR图像。
在另一个优选的实施方案中，重复施用包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质，从而实现动态研究。这是与使用常规MR造影剂(在更高的剂量，可能显示出毒性效应)的其它MR检测方法相比根据本发明的方法的另一个优点。丙氨酸存在于人体中，超极化的13C-丙氨酸在我们已经研究的动物模型中耐受性较好，记载在本申请的实施例部分。因此预见到，超极化的13C-丙氨酸在患者中也耐受性较好，因而施用重复剂量的该化合物应当是可行的。
如上所述，代谢图谱会提供关于要检查的身体、身体的一部分、细胞、组织、身体样品等的代谢活性的信息，所述信息可以在后续步骤中用于例如鉴别疾病。但是，医师也可以在其它步骤中使用该信息为要检查的患者选择适当的治疗。
因而，所述信息可以用于监视治疗反应，例如上述疾病的治疗成功，它的灵敏度使该方法特别适合监视早期治疗反应，即开始治疗后短期内对治疗的反应。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以用于评估药物功效。在所述实施方案中，可以在药物筛选的非常早的阶段，测试用于治愈某种疾病的潜在药物，如例如抗癌药物，例如体外在细胞培养物(所述某种疾病的相关模型)中，或在患病的离体组织或患病的分离的器官中。或者，可以在体内药物筛选的早期，测试用于治愈某种疾病的潜在药物，例如在与所述某种疾病相关的动物模型中。通过对比用潜在药物治疗之前和之后所述细胞培养物、离体组织、分离的或实验动物的代谢图谱，可以确定所述药物的功效，并从而确定治疗反应和成功，这当然会在潜在药物的筛选中提供有价值的信息。
本发明的另一个方面是组合物，其包含13C-丙氨酸、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。所述组合物可以用于通过动态核极化(DNP)获得超极化的13C-丙氨酸，后者可以在根据本发明的成像介质中用作成像剂(MR活性剂)。
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含13C-丙氨酸的盐，优选13C-丙氨酸的铵盐或羧酸盐，更优选13C-丙氨酸
Figure BPA00001189016600201
氯化物或13C-2-氨基丙酸钠。进一步优选地，13C-丙氨酸或13C-丙氨酸的盐是13C1-丙氨酸或13C1-丙氨酸的盐。在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的组合物中的DNP试剂是三苯甲基基团，更优选式(1)的三苯甲基基团，最优选式(1)的三苯甲基基团，最优选下述的式(1)的三苯甲基基团，其中M代表氢或钠，且R1优选地相同，更优选直链或支链C1-C4-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基；或R1优选地相同，更优选被一个羟基取代的直链或支链C1-C4-烷基，最优选-CH2-CH2-OH；或R1优选地相同，代表-CH2-OC2H4OH。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含顺磁金属离子，优选包含Gd3+的盐或顺磁鳌合物，更优选包含Gd3+的顺磁鳌合物。合适地，所述组合物另外包含溶剂或溶剂和/或玻璃形成体。如果所述组合物包含13C-丙氨酸的盐，它优选地也包含玻璃形成体如例如甘油。前述组合物可以用于通过动态核极化(DNP)获得高极化水平的超极化的13C-丙氨酸。如果所述组合物包含13C-丙氨酸的盐，如本申请前面所述，通过用酸或碱中和，可以将超极化的13C-丙氨酸的盐转化成超极化的13C-丙氨酸。
本发明的另一个方面是组合物，其包含超极化的13C-丙氨酸或超极化的13C-丙氨酸的盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子，其中所述组合物通过前面段落中所述的组合物的动态核极化得到。在前面段落中也描述了所述组合物的优选实施方案，其包含超极化的13C-丙氨酸或超极化的13C-丙氨酸的盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子。
本发明的另一个方面是超极化的13C-丙氨酸或超极化的13C-丙氨酸的盐。后者的一个优选的实施方案是超极化的13C-丙氨酸的铵盐或羧酸盐，更优选超极化的13C-丙氨酸
Figure BPA00001189016600211
氯化物或13C-2-氨基丙酸钠。进一步优选地，超极化的13C-丙氨酸或13C-丙氨酸的盐是超极化的13C1-丙氨酸或超极化的13C1-丙氨酸的盐。前述化合物可以在根据本发明的成像介质中用作成像剂(MR活性剂)，所述成像介质可以用于根据本发明的13C-MR检测方法中。
本发明的另一个方面是生产超极化的13C-丙氨酸的方法，该方法包含：制备组合物，其包含13C-丙氨酸或13C-丙氨酸的盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子，并对所述组合物进行动态核极化。如果在制备组合物时已经存在13C-丙氨酸的盐，通过在DNP后中和组合物，得到游离的13C-丙氨酸。在本申请的前面详细描述了所述组合物的制备和如何对所述组合物进行动态核极化。
附图简述
图1描述了从小鼠(整个身体)的13C-磁共振波谱分析成像检测出的13C1-丙氨酸和13C1-乳酸盐随时间的信号强度。
图2描述了5个13C-MR扫描的叠加图，显示了13C1-丙氨酸(177.0ppm)和13C1-乳酸盐(183.7ppm)的信号强度。
图3描述了从小鼠肝的13C-磁共振波谱分析成像检测出的13C1-丙氨酸和13C1-乳酸盐随时间的信号强度。
图4描述了15个分开的13C-MR扫描的组合13C-MR波谱，显示了13C1-丙氨酸(177.0ppm)、13C1-乳酸盐(183.7ppm)、13C1-丙酮酸盐(171.6ppm)和13C1-碳酸氢盐(161.5ppm)的信号强度。
图5描述了从小鼠心脏的13C-磁共振波谱分析成像检测出的13C1-丙氨酸和13C1-乳酸盐随时间的信号强度。
下述非限制性实例解释了本发明。
实施例
实施例1 13C1-丙氨酸的制备
实施例1a 13C1-丙氨酸的铵盐(13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600221
氯化物)的制备
将13C1-丙氨酸(100mg，1.1mol，Cambridge Isotopes)加入10ml离心试管，然后加入浓盐酸(145μl，12M)和乙醇(1ml，95％)。溶解13C1-丙氨酸(可能需要声处理)后，通过加入二乙醚(约5ml)，沉淀得到的13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600222
氯化物。通过离心收集沉淀，抛弃上清液。用二乙醚洗涤沉淀，真空干燥。回收的产量：125mg白色粉末(90％，呈细针状)。
实施例1b  包含13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600223
氯化物、DNP试剂和顺磁金属离子的组合物的制备和DNP极化
将32.5mg(0.258mmol)在实施例1a中得到的13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600224
氯化物加入在微量试管中的42mg母液。母液已经如下制备：将已经根据WO-A1-98/39277的实施例7合成的DNP试剂(三苯甲基基团)三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并-[1，2-4，5’]-二-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐和已经根据WO-A-2007/064226的实施例4合成的顺磁金属离子(1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰胺基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]triazinane-2，4，6-三酮的Gd-鳌合物)溶于甘油，得到含有26mM三苯甲基基团和0.52mM Gd-鳌合物的甘油溶液。声处理得到的组合物，以溶解13C1-丙氨酸氢氯化物，生成澄清溶液。用吸量管将溶液(65μl，4M13C1-丙氨酸
Figure BPA00001189016600231
氯化物，17mM三苯甲基基团和0.9mM Gd3+)转入样品杯，将它快速放入液氮中，以冷冻溶液，然后插入DNP偏振器。在微波辐射(93.90GHz)下、在3.35T磁场中、在1.2K的DNP条件下，极化冷冻溶液。极化后进行固态13C-NMR，测得固态极化是40％。
实施例1c液化和中和
动态核极化150分钟后，将得到的冷冻的极化的溶液溶于含有6ml磷酸盐缓冲液(20mM，pH 6.8，100mg/lEDTA)、NaOH水溶液(27μl 12M溶液，1eq)和30mg NaCl的溶解介质中。最终液体的pH是6.8。
通过400MHz的液态13C-NMR，测得液态极化是35％。
实施例2 超极化的13C1-丙氨酸的制备
实施例2a  包含13C1-丙氨酸的羧酸盐(13C1-2-氨基-丙氨酸钠)、DNP试剂和顺磁金属离子的溶液的制备和DNP极化
将13C1-丙氨酸(21.6mg，0.24mmol)称量进微量试管，溶于20μlNaOH水溶液(12M)。声处理混合物，轻轻加热，生成澄清溶液。向该溶液中加入3.8μl三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙基)-苯并-[1，2-4，5’]-二-(1，3)-二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐的水溶液(三苯甲基基团；143mM)和1.5μl 1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰胺基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]triazinane-2，4，6-三酮)的Gd-鳌合物的水溶液(顺磁金属离子；5mM)，声处理得到的组合物，轻轻加热，生成澄清溶液。用吸量管将溶液(约38μl，6M13C1-2-氨基-丙氨酸钠，12.5mM三苯甲基基团和0.15mM Gd3+)转入样品杯，将它快速放入液氮中，以冷冻溶液。从液氮中取出样品杯，将22μl HCl水溶液(12M)加入样品杯。再次将样品杯快速放入液氮中，然后插入DNP偏振器。在微波辐射(93.90GHz)下、在3.35T磁场中、在1.2K的DNP条件下，极化冷冻的组合物。极化后进行固态13C-NMR，测得固态极化是18％。
实施例2b液化和中和
动态核极化120分钟后，将得到的冷冻的极化的溶液溶于含有6mlBISTRIS(40mM，pH 6，100mg/l EDTA，0.9％NaCl)的溶解介质中。含有溶解的组合物的最终溶液的pH是6。
通过400MHz的液态13C-NMR，测得液态极化是16％。
实施例3使用包含超极化的13C1-丙氨酸的成像介质进行体外13C-磁共振波谱分析
如实施例1所述制备成像介质，将100μl成像介质(3mM13C1-丙氨酸)混合进10x106Hep-G2细胞(人肝细胞癌细胞)。温育共20秒后，使用90度射频脉冲，获得单个13C-MR波谱。在波谱中鉴别13C1-丙酮酸盐和13C1-乳酸盐。丙氨酸向乳酸盐和丙酮酸盐的转化是约0.1％。
实施例4使用包含超极化的13C1-丙氨酸的成像介质在小鼠(整个身体)中进行体外13C-磁共振波谱分析
经6秒的时间段，将175μl如实施例1所述制备的成像介质注射进C57B1/6小鼠。所述成像介质中的13C1-丙氨酸浓度是约50mM，在实验中使用3只动物。将大鼠大小的整个身体圈(调节质子和碳)置于动物上，在9.4T磁场进行13C-磁共振波谱分析。使用15度射频脉冲，每隔5秒获取13C-MR波谱的动态集(共5个)。观察向13C1-乳酸盐的代谢(约1％的13C1-乳酸盐信号)，参见图1。图2显示了5个获得的波谱的叠加图。从MR波谱计算下述衰退时间：13C1-乳酸盐33s。没有检测出丙酮酸盐信号，这指示丙酮酸盐快速转化成乳酸盐。因而有利地检测乳酸盐信号，由于它的缓慢衰退，会提供更大的MR检测窗。
实施例5使用包含超极化的13C1-丙氨酸的成像介质在小鼠(肝)中进行体内13C-磁共振波谱分析
经6秒的时间段，将175μl如实施例1所述制备的成像介质注射进C57B1/6小鼠。所述成像介质中的13C1-丙氨酸浓度是约55mM。将表面圈(调节质子和碳)置于动物的肝上，在94T磁场进行13C-磁共振波谱分析。使用30度射频脉冲，每隔5秒获取13C-MR波谱的动态集(共15个)。该实验证实，13C1-乳酸盐在实验的时间过程中积累，参见图3。在该实验(肝)中，也可以检测出13C1-丙酮酸盐和13C1-碳酸氢盐，图4显示了15个收集的MR波谱的组合图。
实施例6使用包含超极化的13C1-丙氨酸的成像介质在小鼠(心脏)中进行体内13C-磁共振波谱分析
经6秒的时间段，将175μl如实施例1所述制备的成像介质注射进C57B1/6小鼠。所述成像介质中的13C1-丙氨酸浓度是约55mM。将表面圈(调节质子和碳)置于动物的心脏上，在9.4T磁场进行13C-磁共振波谱分析。使用30度射频脉冲，每隔5秒获取13C-MR波谱的动态集(共10个)。在该实验(心脏)中，13C1-乳酸盐的积累显著缓慢，在实验的时间过程中信号不衰退，参见图5。预见到在该实验中观察到的乳酸盐源自丙酮酸盐。丙酮酸盐在该实验中的缺失表明，丙酮酸盐在心肌中即时地转化成乳酸盐。对比实施例5和6，从肝和心脏得到的不同代谢图谱表明，13C-丙氨酸是组织特异性的代谢标志物。

Claims (15)

1.包含超极化的13C-丙氨酸的成像介质。
2.根据权利要求1的成像介质，其中所述超极化的13C-丙氨酸是超极化的13C1-丙氨酸。
3.用于体内或体外13C-MR检测的根据权利要求1-2的成像介质。
4.使用根据权利要求1-2的成像介质进行13C-MR检测的方法。
5.根据权利要求4的方法，其中检测13C-乳酸盐的信号和任选地13C-丙氨酸和/或13C-丙酮酸盐的信号。
6.根据权利要求4和5的方法，其中所述信号用于产生代谢图谱。
7.根据权利要求4-6的方法，其中所述方法是体内13C-MR检测方法，且所述代谢图谱是活的人或非人动物的代谢图谱。
8.根据权利要求4-6的方法，其中所述方法是体外13C-MR检测方法，且所述代谢图谱是细胞培养物中的细胞、样品、离体组织或分离的器官的代谢图谱。
9.根据权利要求6-8的方法，其中所述代谢图谱用于鉴别疾病，优选肿瘤，心脏缺血和肝相关疾病。
10.包含13C-丙氨酸或13C-丙氨酸的盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子的组合物。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述顺磁金属离子存在，且是包含Gd3+的顺磁鳌合物。
12.根据权利要求10和11的组合物，其中所述DNP试剂是式(1)的三苯甲基基团
Figure FPA00001189016500011
其中
M代表氢或一价阳离子；且
R1可以相同或不同，代表任选地被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C6-烷基，或基团-(CH2)n-X-R2，
其中n是1，2或3；
X是O或S；且
R2是任选地被一个或多个羟基取代的直链或支链C1-C4-烷基。
13.用于动态核极化的根据权利要求10-12的组合物。
14.包含超极化的13C-丙氨酸或超极化的13C-丙氨酸的盐、DNP试剂和任选地顺磁金属离子的组合物，其中所述组合物通过动态核极化权利要求10-12的组合物得到。
15.超极化的13C-丙氨酸或超极化的13C-丙氨酸的盐。
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