CN101923090A - 固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，涉及临床医学诊断技术，该光学敏感膜可用于脑钠肽临床检测，包括选择载体、表面处理、固定捕获抗体、封闭和捕获抗原、加入荧光量子点标记的检测抗体形成双抗体夹心复合物等制备步骤，其中载体表面经过醛基化试剂处理，脑钠肽捕获抗体分子通过双功能交联剂以共价键固定于载体表面。该方法制备的敏感膜，由表面经过处理的载体、脑钠肽捕获抗体、脑钠肽抗原、以及标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体四部分组成，可用于定量检测人体脑钠肽含量。本发明的方法操作简单，成品使用方便，适合临床上对痕量脑钠肽的定量检测。

Description

固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法

技术领域

本发明涉及临床医学诊断技术领域，是一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，该敏感膜可准确、快速、定量检测出人体脑钠肽的含量。

背景技术

随着人们生活水平的提高、生活节奏加快和心理压力增大，心衰的发病率逐年上升，已成为现代社会常见病。专家指出，在各种心脑血管意外中，要特别警惕心衰，因为心衰对心脏的损害不可逆转。要预防心衰，最好的办法是早发现早治疗。但从目前来看，因为心衰无明显临床症状，50％的心衰患者未能及时确诊，等发现患病时，已经非常严重。专家建议心衰发病的高危人群(心脏病、高血压、糖尿病、血脂异常患者以及肥胖者)，最好每年做一次脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)检查，以便在心衰早期及时干预。当心功能不全时，由于心脏容量负荷或压力负荷增加，会使血中脑钠肽浓度增高，因此，脑钠肽成为检测心衰状况的敏感指标。但脑钠肽水平的测定并没有得到很好的普及，主要原因是受检测方法的制约。为了适应这一需求，无论是基于实验室还是基于临床的很多检测方法都必须加以改进、优化。目前，我国对脑钠肽的检测主要依靠进口仪器和试剂，随之带来的检测费用也大幅度增加。因此，研制一种灵敏度高、准确度好、可快速检测脑钠肽浓度的光学敏感膜，来降低脑钠肽检测成本，使脑钠肽检测易于在国内普及，适合我国国情。该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，该方法制备的光学敏感膜能定量检测脑钠肽的含量，成本低廉、准确可靠、分析速度快。

为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其将载体表面进行醛基化处理后，固定脑钠肽捕获抗体，用卵清蛋白将未固定脑钠肽捕获抗体的醛基封闭，利用抗原抗体反应，将脑钠肽抗原分子的C-端区与脑钠肽捕获抗体结合，用酪蛋白将未结合脑钠肽抗原的脑钠肽捕获抗体进行封闭，在脑钠肽抗原分子内环结构端结合标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体；其包括步骤：

(1)制备荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体；

(2)将载体表面氨基化；将氨基化的载体进行双功能试剂的交联，使其表面形成活化的醛基；

(3)将脑钠肽捕获抗体固定在载体上；

(4)采用卵清蛋白将载体上未参与反应的醛基封闭；

(5)在载体上滴加待测脑钠肽样品溶液，37℃水浴10～120分钟；

(6)采用酪蛋白将未与待测样品中脑钠肽抗原结合的脑钠肽捕获抗体进行封闭；

(7)在载体上加入(1)步制备的荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体，37℃水浴5～60分钟，形成固相抗体-抗原-荧光量子点标记检测抗体的复合物；

(8)用PBST洗涤，去掉多余的未参与反应的荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体溶液；

(9)冲洗，晾干，制成成品。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述步骤(2)中，载体表面醛基化处理，所用试剂为氨基硅烷和戊二醛；先用氨基硅烷进行氨基化反应，然后用戊二醛进行醛基化反应，在载体表面形成活化的醛基，与脑钠肽捕获抗体的氨基进行缩合反应，形成共价键。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述步骤(3)，是将可以识别脑钠肽分子C-端区的脑钠肽捕获抗体滴加于醛基化的载体表面，在37℃水浴中放置30～120分钟，然后用洗液和缓冲液冲洗，晾干。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述步骤(4)，是在固定脑钠肽捕获抗体的光学敏感膜上滴加1％～10％的卵清蛋白封闭液，封闭没反应的醛基，在37℃水浴中放置60分钟后，用蒸馏水冲洗，晾干。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述步骤(6)，是加入酪蛋白溶液封闭60分钟，双蒸水清洗，晾干。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述载体，为玻璃片、金属片、PC板材、有机高分子薄膜其中之一。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述脑钠肽捕获抗体，为单克隆抗体，该抗体可以识别脑钠肽分子的C-端区；标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体，可以识别脑钠肽分子内环结构，即脑钠肽捕获抗体与脑钠肽检测抗体能识别脑钠肽抗原的不同表位形成双抗体夹心复合物，通过光源激发荧光量子点发光来检测脑钠肽含量。

所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其所述荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体，其中使用的荧光量子点是CdSe、CdS、ZnS、InP、InAs及其核壳结构中的一种或几种。

用本发明方法制备的固定人体脑钠肽的光学敏感膜，可以实现对脑钠肽进行快速检测，对心衰的早期诊断具有重要意义。

附图说明

图1是本发明方法制备的固定人体脑钠肽的光学敏感膜示意图；

图2是本发明的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法流程示意图。

具体实施方式

本发明一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，所制备的光学敏感膜载体表面固定有能识别脑钠肽分子C-端区的脑钠肽捕获抗体。载体为固相载体，可以是金属片、PC板材、有机高分子薄膜或玻璃片，优选玻璃片，它具有价格便宜、来源方便等优点，而且采用发光检测的方法，玻璃片作为固定载体无论是透射光还是反射光均适合。

载体表面的羟基经硅烷处理使其氨基化，然后再用双功能试剂戊二醛处理，这样就得到了醛基化载体，脑钠肽捕获抗体的氨基可与载体表面的醛基发生共价交联，从而达到固定脑钠肽捕获抗体的目的。

本发明方法制备的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的载体表面经过醛基化处理，脑钠肽捕获抗体是通过双功能交联剂以共价键稳定地固定于载体表面，可以进行各种生化反应。

本发明的一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，包括选择载体、处理表面、固定捕获抗体、封闭和捕获抗原、加入荧光量子点标记的检测抗体形成双抗体夹心复合物等步骤组成。如图1所示，为固定人体脑钠肽的光学敏感膜，其中，载玻片1、脑钠肽捕获抗体2、脑钠肽抗原3、脑钠肽抗原分子的C-端区4、脑钠肽抗原分子内环结构端5、标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体7、荧光量子点6、酪蛋白封闭剂8、醛基9、卵清蛋白10。固定人体脑钠肽的光学敏感膜，由表面经过醛基化试剂处理的载体(载玻片)、脑钠肽捕获抗体、脑钠肽抗原、以及标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体四部分构成。

本发明的一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，包括如下步骤：

1.制备荧光量子点与脑钠肽检测抗体的偶联物，该检测抗体能识别脑钠肽分子内环结构。

2.选择载体，载体可以是生物载玻片或普通玻璃或PC板材或有机高分子薄膜中的一种。

如图2所示：

3.表面处理：用硅烷作为表面活性剂，使玻璃片表面氨基化，氨基可以和双功能试剂戊二醛结合，戊二醛与捕获抗体偶联，从而实现脑钠肽捕获抗体的固定。

4.固定抗体：将可以识别脑钠肽分子C-端区的脑钠肽捕获抗体滴加于醛基化的载体表面，在37℃水浴中放置30～120分钟，然后用洗液和缓冲液冲洗，晾干。

5.封闭：在固定脑钠肽捕获抗体的光学敏感膜上滴加1％～10％的卵清蛋白封闭液，封闭没反应的醛基，在37℃水浴中放置60分钟后，用蒸馏水冲洗，晾干。

6.以微量加样器加入待测脑钠肽样品溶液，于37℃孵育10分钟～120分钟，用PBST洗涤5次。

7.加入酪蛋白溶液封闭60分钟，双蒸水清洗，晾干。

8.以微量加样器加入荧光量子点标记的脑钠肽抗体，放入37℃水浴中温浴5～60分钟制备成固定脑钠肽的光学敏感膜，对该光学敏感膜进行冲洗，晾干待用。

实施例：

1)荧光量子点与脑钠肽抗体偶联物的制备

用移液器移取20μl(2nmol/L)亲和素标记的硒化镉(CdSe)荧光量子点置于2ml离心管中，加入100μl Tris-HCl缓冲液(内含1mmol/LEDTA、1mol/L NaCl，pH＝7.4)，将10μl生物素标记脑钠肽抗体溶于80μlTris-HCl缓冲液中，此时抗体浓度为0.15mg/mL。将上述生物素标记的抗体溶液加入亲和素修饰的荧光量子点溶液中，置37℃、150rpm/min摇床中反应30分钟。加入1ml PBST缓冲液(含0.05％Tween-20及0.1％BSA)，离心去掉未参与反应的脑钠肽抗体溶液。加入PBS缓冲液配制成浓度为2.5mg/mL荧光量子点标记脑钠肽抗体溶液。

2)脑钠肽捕获抗体固定在醛基修饰的玻璃基片

如图1所示，将载玻片1先后用强碱和浓硫酸浸洗；双蒸水冲洗，晾干。配制5％氨基硅烷的乙醇溶液，将载玻片浸入上述溶液中作用60分钟，取出洗涤后晾干。将上述氨基化处理的载玻片浸入4％的戊二醛PBS(0.2mol/L，pH＝8.0)溶液中60分钟，PBS溶液清洗晾干。

用0.01mol/L，pH＝7.4的PBS缓冲液稀释脑钠肽单克隆抗体为5μg/mL，在醛基9修饰的载玻片上点加20μl上述脑钠肽捕获抗体溶液，37℃温育60min，然后用生理盐水洗3次，将脑钠肽捕获抗体2固定在载玻片上，加入350μl封闭液(0.02mol/L，pH＝7.4PBS，10％卵清蛋白封闭液，0.5％NaN₃)，室温封闭1h，冷冻干燥，密封于铝箔袋中，4℃保存备用。

3)待测抗原的固定

用0.1％的Proclin-300为防腐剂的新生牛血清作为稀释液，系列稀释脑钠肽阳性血清，并用国家参考品校定浓度。将10μl的脑钠肽阳性血清3滴加到上述固定有脑钠肽捕获抗体的载玻片上，然后置于37℃水浴箱中温育2h，取出载玻片，用PBST溶液(0.01mol/L，0.05％Tween20)轻轻冲洗5次，加入60μl，1％的酪蛋白封闭剂8封闭1min，双蒸水清洗，晾干。

4)荧光量子点标记检测抗体与抗原的结合

20μl荧光量子点标记检测抗体7溶液加入到固定有脑钠肽抗原的载玻片上，置于37℃水浴箱中温育30分钟，形成载玻片-待测抗原-荧光量子点标记的检测抗体的复合物。用200μl的PBST缓冲液(含0.5％Tween-20；0.1～0.5％BSA)清洗5次，去掉多余的荧光量子点6或荧光量子点标记的抗体溶液。

在激发光照射下，用光学传感器测量荧光量子点的发射光强，从而实现对脑钠肽样品溶液浓度的定量检测。

以上实施例只是为了起到说明的目的，并非对本发明的限制，在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变，所作改进和改变，及选用其它功能材料等方法均应在本发明权利要求保护范围之内。

Claims (8)

1.一种固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，将载体表面进行醛基化处理后，固定脑钠肽捕获抗体，用卵清蛋白将未固定脑钠肽捕获抗体的醛基封闭，利用抗原抗体反应，将脑钠肽抗原分子的C-端区与脑钠肽捕获抗体结合，用酪蛋白将未结合脑钠肽抗原的脑钠肽捕获抗体进行封闭，在脑钠肽抗原分子内环结构端结合标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体；其包括步骤：

(1)制备荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体；

(2)将载体表面氨基化；将氨基化的载体进行双功能试剂的交联，使其表面形成活化的醛基；

(3)将脑钠肽捕获抗体固定在载体上；

(4)采用卵清蛋白将载体上未参与反应的醛基封闭；

(5)在载体上滴加待测脑钠肽样品溶液，37℃水浴10～120分钟；

(6)采用酪蛋白将未与待测样品中脑钠肽抗原结合的脑钠肽捕获抗体进行封闭；

(7)在载体上加入(1)步制备的荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体，37℃水浴5～60分钟，形成固相抗体-抗原-荧光量子点标记检测抗体的复合物；

(8)用PBST洗涤，去掉多余的未参与反应的荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体溶液；

(9)冲洗，晾干，制成成品。

2.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，载体表面醛基化处理，所用试剂为氨基硅烷和戊二醛；先用氨基硅烷进行氨基化反应，然后用戊二醛进行醛基化反应，在载体表面形成活化的醛基，与脑钠肽捕获抗体的氨基进行缩合反应，形成共价键。

3.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)，是将可以识别脑钠肽分子C-端区的脑钠肽捕获抗体滴加于醛基化的载体表面，在37℃水浴中放置30～120分钟，然后用洗液和缓冲液冲洗，晾干。

4.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)，是在固定脑钠肽捕获抗体的光学敏感膜上滴加1％～10％的卵清蛋白封闭液，封闭没反应的醛基，在37℃水浴中放置60分钟后，用蒸馏水冲洗，晾干。

5.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)，是加入酪蛋白溶液封闭60分钟，双蒸水清洗，晾干。

6.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述载体，为玻璃片、金属片、PC板材、有机高分子薄膜其中之一。

7.如权利要求1所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述脑钠肽捕获抗体，为单克隆抗体，该抗体可以识别脑钠肽分子的C-端区；标记有荧光量子点的脑钠肽检测抗体，可以识别脑钠肽分子内环结构，即脑钠肽捕获抗体与脑钠肽检测抗体能识别脑钠肽抗原的不同表位形成双抗体夹心复合物，通过光源激发荧光量子点发光来检测脑钠肽含量。

8.如权利要求1或7所述的固定人体脑钠肽的光学敏感膜的制备方法，其特征在于，所述荧光量子点标记的脑钠肽检测抗体，其中使用的荧光量子点是CdSe、CdS、ZnS、InP、InAs及其核壳结构中的一种或几种。

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