CN101921725B - 一种口服免疫阻断鸡生长抑素作用的转化子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡生长抑素基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。本发明转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因/免疫增强因子联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。

Description

一种口服免疫阻断鸡生长抑素作用的转化子及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种口服免疫阻断鸡生长抑素作用的转化子及其应用。

背景技术

我国的地方鸡种与国外品种相比，具有对周围环境的高度适应性、耐粗放管理、抗病性强、肉质好等特点。但由于我国地方鸡种生长慢、饲料利用率低，随着外来高生产性能品种的大量引入，残酷的市场竞争使我国地方鸡种的数量在急剧下降，有些品种甚至濒危或趋于灭绝，如素以体型大肉质好而著称的萧山鸡数量已大大减少。外来鸡种虽然生长快、饲料利用率高，但肉质风味差，随着生活水平的提高，人们已越来越注重肉的品质，目前市场对高品质瘦肉的需求量迅猛增长，这种转变给我们提出了培育生长快、风味佳新品种、品系的要求和挑战。

提高动物生长速度一直是动物生产研究人员所努力的目标。但目前通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物生产性能已很难再有大的进展。为了提高动物的生产性能，在饲料中添加各种违禁药物造成食物中毒的事件时有发生，因而研究一种安全、高效、对人类无毒副作用的促动物生长方法是目前养殖业所面临的迫切问题。

如果把免疫学的方法应用于动物生产性能的调控，选择对动物生长有抑制作用的激素或因子与免疫增强因子融合表达或共同免疫来增强其免疫原性，作为抗原来免疫动物，可诱发机体产生对抗该种激素或因子的抗体，从而抑制或减弱该激素或因子的生理功能。该技术可望提高动物的生产性能，对那些生长慢的品种或品系意义尤其重大，且十分安全无任何副作用。

由于大肠杆菌、酵母菌等不能在动物肠道中定植，所以不能进行口服免疫，必须将所表达的目的产物纯化进行注射免疫。蛋白纯化步骤大大增加了生产的成本和难度，使大规模生产目的蛋白制剂难以实现。同时注射免疫程序也较繁琐，不仅要耗费较大人力，对动物的应激和伤害也较大。因此迫切需要研制出一种对动物生长起促进作用的安全、方便并能进行大规模生产的口服制剂。

乳酸菌是一类在食品中应用最广泛的重要工业菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸杆菌等十几个属，被公认为是安全的食品级微生物。乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。

发明内容

本发明提供了一种口服免疫阻断鸡生长抑素作用的转化子，该转化子可以通过口服方式摄入并定植在鸡肠道内，其分泌的融合蛋白能有效诱发鸡体内产生抗鸡生长抑素的抗体，从而抑制或减弱内源生长抑素对鸡生长的抑制作用。

一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡生长抑素基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。鸡生长抑素(Somatostatin，SST，GenBank号：NM_205336)是一种14肽，除下丘脑分泌外，胃肠道和胰腺等组织也能产生。SST不仅对生长激素有抑制作用，还能抑制胰岛素、甲状腺素及一些促进消化吸收的胃肠激素的分泌和释放，因而它是调节动物生长的一个重要因子，在本发明中它作为免疫原。

为了增强机体免疫应答，提高免疫效果，在抗原基因上连接霍乱毒素B亚基基因，霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit，简称CTB，GenBank号：U25679)为免疫增强子，研究表明它是一种无毒性的非常有效的黏膜免疫佐剂，特别适合作为口服疫苗的免疫增强佐剂蛋白。

细胞壁锚定子M6(GenBank号：M11338)可与乳酸乳球菌细胞膜上的蛋白相结合，免疫原和免疫增强子被表达后分泌到胞外，通过细胞壁锚定子M6能够固定在细胞壁上。

原始载体pNZ8112含有强启动子即乳链菌肽A(Nisin A)的启动子NisA(GenBank号：AY303241)以及高效分泌型信号肽Usp45(GenBank号：M60178)，信号肽Usp45位于启动子NisA的下游，外源目的基因连接在信号肽的C端。

所述的生长抑素基因、霍乱毒素B亚基基因、细胞壁锚定子M6基因、启动子NisA和信号肽Usp45的碱基序列如SEQ ID NO.5～9所示。

乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。乳酸菌能在体内定植或短暂定植是它发挥生理功能的必要条件。通过载体把目的基因如免疫原基因导入乳酸菌中，然后制成活菌制剂饲喂，引入动物体内，产生外源目的基因的产物从而引起黏膜和体液免疫。经研究发现，在肠道中能较长时间定植的乳酸杆菌容易使动物对目的外源基因产物产生免疫耐受，而在肠道中短暂定植的乳酸乳球菌不产生这种免疫耐受现象。

本发明还提供上述转化子在免疫阻断鸡生长抑素作用中的应用，通过将分泌表达了外源目的基因产物的转化子喂食给鸡，乳酸乳球菌就会短暂定植在鸡肠道内，从而引起鸡对外源目的基因产物产生免疫，即对乳酸菌表达的生长抑素产生免疫，产生抗生长抑素的抗体，该抗体可减弱或抑制鸡内源生长抑素对鸡生长的抑制作用达到促进生长的目的。

根据上述应用，本发明又提供了一种利用上述转化子制备的鸡口服免疫制剂，它包括培养基和分泌了外源目的基因产物的转化子。该制剂制备和使用均十分方便。

所述的培养基可以为能促进乳酸乳球菌生长的培养基，优选为GM17培养基。在使用时，上述口服免疫制剂中转化子浓度最好为1×10⁸cfu/mL～1×10¹⁰cfu/mL，使得肠道内的乳酸乳球菌达到一定浓度，每次喂食量为1～2ml。

本发明还提供了一种上述鸡口服免疫制剂的制备方法，包括以下步骤：将转化子置于培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3～0.5，加入乳链菌肽继续培养2～3h。

所述的乳链菌肽为表达诱导物，加入后浓度优选为10～20ng/mL。

本发明转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因/免疫增强因子(无毒性的霍乱毒素B亚基)联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。

具体实施方式

GM17液体培养基：胰蛋白胨2％；酵母膏0.5％；Vc 0.05％；牛肉膏0.5％；乙酸钠0.15％；氯化钠0.4％；MgSO₄.7H₂O 0.25％；葡萄糖0.5％，调至pH 6.8。GM17固体培养基在上述培养基基础上添加1.6％的琼脂。

乳酸乳球菌NZ9800和载体pNZ8112均为商业化产品，来自荷兰的NIZO food research。

1、目的基因的构建及克隆表达

(1)CTB-SST嵌合基因的构建

上游引物(SEQ ID NO.1)：

5’-GG

ACACCTCAAAATATTACTG-3’

引物结构为：保护碱基(GG)-Xba I位点(框中序列)-CTB 5’端部分序列(下划线序列)

下游引物(SEQ ID NO.2)：

5’-TG

ACAGGATGTGAAAGTTTTCCAGAAGAAGTTCTTG CAGCCCGC

-3’

引物结构：保护碱基(TG)-BamH I位点(框中序列)-SST序列(下划线)-linker(粗斜体序列)-CTB 3’端部分序列(双下划线)。

用上述引物以霍乱弧菌基因组DNA(含CTB基因)为模板，进行PCR，PCR条件为：总反应体系为50μl，其中含50ng的DNA模板，1×PCR buffer，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.2μM上下游引物，2.5U Taq DNA聚合酶。PCR反应参数设置为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；然后72℃后延伸5分钟。

由于下游引物自身带有SST、连接子linker及CTB 3’端部分序列，因此经PCR后可直接得到CTB-SST嵌合基因。PCR产物用Xba I和BamH I酶切后克隆到pET28载体(Invitrogen公司)中。

然后将含CTB-SST的pET28质粒转化到E.coli DH5α(Takara公司)感受态细胞中，涂LB平板，37℃培养18-20h，挑取阳性斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。

(2)CTB-SST-M6重组表达载体的构建

上游引物(SEQ ID NO.3)：

5’-AA

AGAGTGTTTCCTAGGGG-3’

引物结构为：保护碱基(AA)-BamH I位点(框中序列)-M65’端部分序列(下划线序列)

下游引物(SEQ ID NO.4)：

5’-CG

GTTTTCTTCTTTGCGTT-3’

引物结构为：保护碱基(CG)-Hind III位点(框中序列)-终止子(粗斜体序列)-M63’端部分序列(下划线序列)

用化脓性链球菌基因组DNA(含M6基因)为模板，以上述引物进行PCR(PCR条件同上)，可得到两端带BamH I和Hind III酶切位点的PCR产物，用该两种酶酶切PCR产物，重组入已含CTB-SST的pET28载体中的CTB-SST基因下游(通过设计的BamH I位点将CTB-SST与M6重组相连：(Xba I)CTB-linker-SST(BamH I)和(BamH I)M6-终止子(Hind III))。

然后将含CTB-SST-M6嵌合基因的pET28质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂LB平板，37℃培养18-20h，挑取阳性斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。

酶切条件为：37℃酶切过夜；连接酶及条件：T₄DNA连接酶，16℃连接过夜。其他过程均按常规方法进行。

2、CTB-SST-M6嵌合基因在中间宿主菌中的克隆和在乳酸乳球菌中的表达

(1)CTB-SST-M6嵌合基因在中间宿主菌中的克隆

由于表达载体pNZ8112(NIZO food research(荷兰))在乳酸乳球菌中的克隆拷贝数很低，要想得到足够的重组pNZ8112质粒(含CTB-SST-M6)，必须通过一个中间宿主菌E.coli MCl061(Invitrogen公司)来使pNZ8112质粒达到足够的拷贝数。

用氯霉素抗性筛选重组菌(10ug/ml氯霉素)：pNZ8112上含氯霉素抗性基因，E.coli MCl061菌株本身不具氯霉素抗性，只有被转化入pNZ8112质粒的E.coli MCl061才能在含氯霉素的平板上生长。

首先将目的基因(CTB-SST-M6)从pET28质粒中酶切(Xba I和HindIII)下来，割胶回收，重组入用相同酶切过的pNZ8112中，T₄DNA连接酶16℃连接过夜，然后转化E.coli MC1061感受态细胞，涂LB平板，37℃培养18-24h，挑取氯霉素平板上生长出的菌斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。

(2)CTB-SST-M6嵌合基因在乳酸乳球菌中的表达

得到含目的基因(CTB-SST-M6)的重组E.coli MC1061后，将其扩大培养，使其中的重组pNZ8112质粒得到足够的拷贝数(每个宿主细胞约10～60份拷贝)，然后抽提重组pNZ8112质粒，转化入乳酸乳球菌NZ9800(NIZO food research(荷兰))感受态细胞中，涂布含有10ug/ml氯霉素的GM17平板(同样用氯霉素抗性筛选重组菌)，于30℃培养48-60h，挑取长出的菌斑扩大培养，抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。

将含有阳性重组质粒的乳酸乳球菌转接到5ml含氯霉素(终浓度为10ug/ml)的GM17液体培养基中，在30℃、180r/min培养过夜后；按1∶25的比例稀释至10ml新鲜培养基中，30℃培养至OD600约为0.4，然后加入终浓度为10ng/ml乳链菌肽nisin(Sigma公司)诱导目的基因表达2-3h，菌液待用。

(3)检验目的蛋白

首先将上述菌液中的菌体用溶菌酶处理，再用超声波破碎，然后将经超声波破碎处理后的细胞溶液用70％饱和硫酸铵沉淀后，10000g离心30min，将沉淀溶解于50mMol/L pH6.0磷酸缓冲液中，活性炭脱色后用50mMol/L的磷酸缓冲液透析至透析液中检测不到铵根离子，直接上DEAE-Cellulose 52柱(2cm×60cm，Pharmacia，预先用含30mMol/L NaCl的pH6.0、20mMol/L的磷酸缓冲液平衡)，用缓冲体系(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液和含300mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液)进行线性梯度洗脱，先用起始缓冲液(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液)洗柱后，再进行NaCl浓度为30-300mMol/L的线形梯度洗脱，洗脱流速为12mL/h，用核酸/蛋白检测仪监测收集目的蛋白，用去离子水透析过夜，再冷冻浓缩后于4℃保存，用常规Western blotting(Western印迹法)检测验证，检测方法如下：

首先用商品化的SST抗原(Sigma产品)免疫兔子，制备用于Westernblotting检测的一抗，用商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(Sigma产品)为二抗。为了检测目的蛋白CTB-SST-M6(基因大小为1674bp)是否被乳酸乳球菌表达，我们用纯化的表达产物和另一种已知SST融合蛋白(沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因(H-1^d)-生长抑素，简称H-1^d-SST，基因大小为1542bp)做比较，如果用商品SST抗原免疫兔子所制备的一抗既能与纯化产物结合，又能与H-1^d-SST蛋白结合，且蛋白分子量大小相符，则证明纯化的表达产物中含目的蛋白CTB-SST-M6。Western blotting结果显示：H-1^d-SST和纯化产物均能与商品SST抗原免疫兔子所制备的一抗结合，显示出所对应的蛋白条带(H-1^d-SST分子量为40～50KD，CTB-SST-M6为50～60KD)，说明CTB-SST-M6融合蛋白被乳酸乳球菌成功表达。

3、CTB-SST乳酸乳球菌口服免疫鸡后的抗体产生情况

随机选取40只AA鸡进行了重组乳酸菌口服免疫，将浓度为1×10⁹cfu/mL的菌液喂食刚出生的雏鸡(1日龄)，每次喂食1～2ml，每周2次，喂食3周。当然可以根据实际情况改变菌液浓度，一般选择1×10⁸～1×10¹⁰cfu/mL。

在首次免疫后3周、6周和8周抽取鸡血，分离得到鸡血清，用于检测鸡SST抗体产生情况。采用ELISA间接法测定鸡血清中的抗体水平，具体步骤如下：

用0.5mg/ml的SST抗原(Sigma产品)包被96孔免疫板，每孔加抗原溶液100ml，48℃包被过夜，然后用含1.5％BSA(牛血清白蛋白，Sigma产品)的PBST溶液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)封闭免疫板，37℃封闭2h。加入稀释度为1∶50的待测鸡血清，洗涤三次，再加稀释度为1∶1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG抗体(Sigma产品)，然后将10mg 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Sigma产品，酶的底物，可在辣根过氧化物酶作用下显蓝色)溶解在0.025M磷酸盐柠檬酸缓冲液中并加至免疫板各孔中，每孔50ml。底物显色后加0.2M H₂SO₄终止反应，然后用酶联测定仪以波长450nm测定底物显色后的光吸收值(OD值)，将测得标本(即免疫鸡血清标本)OD值(P)与阴性对照(未免疫鸡血清标本)OD值(N)相比，若P/N值大于或等于2.0，则所测样本抗体为阳性，鸡SST抗体产生情况检测结果如下表所示：

4、CTB-SST乳酸菌活菌制剂主动免疫对鸡生产性能的影响

从上述被免疫的40只AA鸡中选取抗体阳性的20只作为免疫组，另选20只未免疫鸡作为对照组。AA鸡经上述菌液主动免疫后饲养至56日龄时进行称重，同时统计鸡的日增重及料重比，结果如下表所示：

本发明免疫制剂主动免疫对AA肉鸡生长性能的影响

同列中不同上标字母表示差异显著，a，b表示p＜0.05，a，c表示p＜0.01.

以上数据表明，本发明所研制的鸡CTB-SST乳酸菌活菌制剂能刺激鸡产生抗生长抑素(SST)的抗体，减弱体内生长抑素对鸡生长的抑制作用，提高了鸡的生长速度和饲料转化率。

Claims (6)

1.一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，其特征在于：所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，所述重组载体由含有启动子NisA和信号肽Usp45的原始载体pNZ8112以及插入原始载体pNZ8112连接信号肽Usp45的C端的外源目的基因组成；所述外源目的基因由碱基序列如SEQ ID NO.5~7所示的鸡生长抑素基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因组成。

2.一种利用权利要求1所述转化子制备的鸡口服免疫制剂，其特征在于：包括培养基和分泌了所述外源目的基因产物的转化子。

3.根据权利要求2所述的鸡口服免疫制剂，其特征在于：所述的培养基为GM17培养基。

4.根据权利要求2所述的鸡口服免疫制剂，其特征在于：所述的转化子浓度为1×10⁸cfu/mL~1×10¹⁰cfu/mL。

5.根据权利要求2所述的鸡口服免疫制剂的制备方法，包括以下步骤：将转化子置于培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3~0.5，加入乳链菌肽继续培养2~3h。

6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于：所述的乳链菌肽加入后浓度为10~20ng/mL。