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CN101917857A - 真菌分离物及其在植物中赋予盐分和干旱耐受性的用途 - Google Patents

真菌分离物及其在植物中赋予盐分和干旱耐受性的用途 Download PDF

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CN101917857A
CN101917857A CN2008801080491A CN200880108049A CN101917857A CN 101917857 A CN101917857 A CN 101917857A CN 2008801080491 A CN2008801080491 A CN 2008801080491A CN 200880108049 A CN200880108049 A CN 200880108049A CN 101917857 A CN101917857 A CN 101917857A
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CN
China
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plant
plants
treating
fusarium
tolerance
Prior art date
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Application number
CN2008801080491A
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English (en)
Inventor
雷吉娜·S·雷德曼
拉塞尔·J·罗德里格斯
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US Government Represented By Secretary Of Interior
Montana State University
Original Assignee
US Government Represented By Secretary Of Interior
Montana State University
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Publication date
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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Abstract

本发明涉及赋予经接种的植物(包括单子叶植物和双子叶植物两者)应激耐受性的方法和植物内生真菌的组合物。具体的是，自华盛顿州的普吉特湾海滩上的植物群落中生长的沙丘草，即滨麦分离的镰孢属菌种。给靶标植物或植物部分接种植物内生真菌后，所得的植物显示应激耐受性，特别是干旱和盐分耐受性。

Description

真菌分离物及其在植物中赋予盐分和干旱耐受性的用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年7月19日提交的美国临时申请号60/950,755的权益，由此出于所有目的，通过提及而收录其全部内容。
联邦政府资助的研究下进行的发明的权利声明
美国政府具有本发明的已付许可，而且有权在有限情况中根据合理的条款要求专利权人向其他人许可，如根据国家科学基金会拨款号0414463和美国/以色列两国农业研究和开发基金拨款号3260-01C的条款所规定的。
对电子形式提交的文本文件的描述
本文通过提及而完整收录与本文一起以电子形式提交的文本文件的内容：计算机可阅读形式拷贝的序列列表(文件名：MONT 094 01WOSeqList_ST25.txt，2008年7月21日记录的数据，文件大小2千字节)。
发明领域
本发明涉及植物内生真菌(特别是镰孢属菌种(Fusarium species))处理植物(包括单子叶植物和双子叶植物两者)的用途。处理导致宿主植物获得应激耐受性，特别是盐分耐受性。另外，本发明的真菌可以潜在地用于降低土壤中的盐水平。
发明背景
植物对非生物应激(stress)诸如盐分、热和干旱的响应在遗传方面是复杂的。认为所有植物都具有察觉、传输信号和响应应激的能力(Bartels等，2005，Crit.Rev.Plant Sci.24：23-58；Bohnert等，1995，The Plant Cell 7：1099-1111)。对于这些应激共同的植物响应包括渗透物生成、水转运的改变、和活性氧类别(reactive oxygen species，ROS)的清除(Leone等，2003，于Abiotic Stresses inPlants，Kluwer Academic Pub.，London，1-22；Maggio等，于Abiotic Stresses inPlants，Kluwer Academic Pub.，London，53-70；Tuberosa等，于Abiotic Stressesin Plants，Kluwer Academic Pub.，London，71-122)。不论如何，相对较少的物种能够在施加高水平的非生物应激的生境中茁壮成长(Alpert P，2000，PlantEcol.151：5-17)。虽然在植物应激响应方面已经有广泛的研究(Smallwood等，1999，于Plant Responses to Environmental Stress，BIOS Scientific Pub.Ltd.，Oxford，第224页)，但是仍保留关于植物适应非生物应激的机制的问题。
植物生物学研究最少的方面之一是与植物内生真菌的共生。化石记录指出真菌已经与植物相联系达至少4亿年，而且提出真菌共生是植物向地面上移动的原因(Redecker等，2000，Science 289：1920-1；Pirozynski等，1975，Biosystems 6：153-164)。有至少三类真菌共生生物：菌根、1类内生菌、和2类内生菌(Rodriguez等，2005，于The Fungal Community：Its Organization andRole in the Ecosystem，Taylor & Francis/CRC Press，Boca Raton，FL，683-96)。关于菌根真菌大量已知的是，其与植物根部有关，而且与其植物宿主共享营养物，而关于麦角菌苛养内生菌(clavicipitaceous fastidious endophyte)(1类)的是，其感染凉季禾本科植物(cool season grass)(Read DJ，1999，于Mycorrhiza，Springer-Verlag Pub.，Berlin，3-34；Schardl等，2004，Annu.Rev.Plant Biol.55：315-40)。然而，关于2类内生菌的生态学意义知之相对较少：其是最大的真菌共生生物群体，而且被认为定殖(colonize)天然生态系统中的所有植物(Petrini O，1986，于Microbiology of the Phyllosphere，Cambridge UniversityPress，Cambridge，175-87)。这部分是由于仅最近才阐明了2类内生菌的共生功能性(Redman等，2002，Science 298：1581；Arnold等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.100：15649-54；Waller等，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.102：13386-91)。2类内生菌赋予宿主物种应激耐受性，并且在至少一些植物在高应激环境中生存方面发挥重要作用。例如，2类内生菌赋予在地热土壤中生长的植物热耐受性(Redman等，见上文)，内生菌定殖树叶的程度与抵抗根部病原体的能力相关联(Arnold等，见上文)，而且内生菌赋予多种宿主物种干旱耐受性(Waller等，见上文)。基于地热土壤、海滩和农业耕地中的2类内生菌研究，本发明人描述了定义为适应性共生的新观察到的生态学现象。这种生境特异性现象提供了关于植物在高应激生境中的适应和存活的基因组间外遗传机制。
主要的非生物应激之一是盐分应激。土壤盐分是全世界食物生产的主要约束，因为它限制农业产量，而且限制先前未开垦的土地的使用。联合国环境署(United Nations Environmental Program)估计全世界约20％的农业土地和50％的耕地是盐应激的(Flowers等，1995，Aust.J.Plant Physiol.22，875-84)。土壤盐分施加的天然边界还限制农业生产的热量和营养潜力(Yokoi等，2002，JIRCAS Working Report 25-33)。由于基础设施不足或政治不稳定性，由盐分应激产生的对农业生产的约束在世界上食物分配有问题的地区是最严重的。虽然水和土壤管理实践已经推动了由于盐分而边缘化(marginalize)的土壤上的农业生产改善，但是目前可用于增强作物盐耐受性的策略仍有严重的缺陷。
因而，需要用于处理植物(包括单子叶植物和双子叶植物)中的盐应激的组合物和方法。还需要降低天然或人为积累的土壤盐含量。
发明概述
依照本文中所概述的目标，本发明提供了处理靶标植物以赋予应激耐受性的方法，包括给所述植物或所述植物的部分接种植物内生真菌诸如镰孢属菌种(Fusarium spp.)培养物。在一个例示性的实施方案中，给所述植物赋予的应激耐受性是盐耐受性。一方面，本发明的真菌和方法能够在植物中诱导对盐水(诸如海水)中的盐浓度的盐耐受性。
在盐耐受性外，本发明的真菌还可以给植物赋予其它类型的应激耐受性。本发明的植物内生真菌赋予的此类另外的应激耐受性的例子包括但不限于干旱耐受性、温度耐受性(诸如对高温或低温，或者对高温和低温两者)、CO2耐受性、重金属耐受性(诸如对铁的耐受性)、疾病耐受性(诸如对植物根部疾病)和对pH的耐受性(诸如对高pH或低pH，或者对高pH和低pH两者)。
本发明的真菌和方法可以应用于极其多种农业的、观赏的和天然的植物物种。本发明的真菌和方法可以提高任何此类植物的生长和/或产量。此外，本发明的真菌和方法不需要对所述植物的遗传修饰以获得由其赋予的益处。如此，本发明不必牵涉经过遗传修饰的生物体(GMO)，虽然其也可以与GMO植物一起使用。
在某些实施方案中，本发明的靶标植物包括单子叶的植物(也称为单子叶植物(monocotyledons or monocots))。在某些例示性的实施方案中，单子叶植物选自下组：禾本科植物(grass)(例如草皮草(turf grass))、玉米、小麦、燕麦、和稻。
在某些其它的实施方案中，本发明的靶标植物包括双子叶的植物(也称为双子叶植物(dicotyledons or dicots))。在一些实施方案中，双子叶植物是真双子叶植物(eudicot)，也称为真正的双子叶植物。在某些例示性的实施方案中，双子叶植物选自下组：番茄、西瓜、南瓜、黄瓜(squash)、草莓、胡椒(pepper)、大豆、苜蓿和拟南芥(Arabidopsis)。
在其它实施方案中，本发明提供了处理靶标植物的植物部分以赋予应激耐受性的方法。本发明的植物部分可以包括例如种子和幼苗，或幼苗的部分，诸如根。一方面，本发明的真菌可以容易地作为种子涂层应用。
另一方面，本发明提供了处理靶标植物以赋予生长增强的方法，包括给所述植物或所述植物的部分接种植物内生真菌诸如镰孢属菌种培养物。可以应用于本发明的其它植物内生真菌的例子包括弯孢霉属(Curvularia)、链格孢属(Alternaria)、拟茎点霉属(Phomopsis)、内脐蠕孢属(Drechslera)和木霉属(Trichoderma)的菌种。
另一方面，本发明提供了降低土壤或其它生长培养基中的盐水平的方法，包括给植物或植物部分接种植物内生真菌诸如镰孢菌属菌种(例如大刀镰孢(Fusarium culmorum)分离物FcRed1)培养物，并在此土壤或其它生长培养基之上或之中栽培经接种的植物。植物内生真菌使经接种的植物能够使盐从土壤或其它生长培养基移位至植物的叶分泌导管，由此自土壤除去盐。通过随后用液体(例如水)清洗植物并从该地区除去该液体或者通过随后除去完整植物或者植物部分，会有可能从该土壤地区除去过量的盐。
本发明的真菌和方法可以用于植物诸如作物植物在天然盐或盐侵蚀环境诸如靠近盐水或微咸水(brackish water)的一块或多块高度水浇地(highlyirrigated land)诸如进入海湾或盐沼内的半岛中的生长和维持。
出于其预期目的，本发明的真菌和方法可以用于对具有不可接受水平的盐分的土地进行环境修复。土地可以天然具有高水平的盐，或者高水平的盐可以是由人类活动而引起的，诸如经由灌溉土地或挖掘操作。因此，可以使用本发明的真菌和方法来降低土壤和其它生长培养基中的盐水平，以及使植物具有盐耐受性。
又一方面，本发明提供了一种组合物，其包含镰孢属菌种的纯培养物。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物包含大刀镰孢。在某些例示性的实施方案中，所述大刀镰孢分离物是FcRed1。
附图简述
图1显示了在单子叶植物和真双子叶植物中共生对盐和干旱耐受性的影响。所有描述均自左向右，并且图像是所有植株/处理的代表。在本文中所提供的描述中，植株/处理的数目以(N＝XX)标示，而％存活和成活植物的健康状况在每种处理后的圆括号中标示。植物健康基于与非共生对照的比较，并从1至5分级(1＝死亡，2＝严重枯萎的，3＝枯萎的，4＝轻微枯萎的，5＝健康的，无病斑(lesion)或枯萎的)。A)暴露于500mM NaCl达14天的与FcRed1共生的(100％，5)、与Fc18共生的(0％，1)、或者非共生的(0％，1)沙丘草植株(N＝30)。虽然所有植株均随着年龄增长而弯曲，但是未应激的对照和暴露于盐的FcRed1定殖植株保持完全含水，而其它处理则枯萎并丧失膨胀(turgor)。B)在无水情况中栽培14天的与FcRed1共生的(100％，4)、与Fc18共生的(100％，4)、或非共生的(0％，1)沙丘草植株(N＝30)。C)暴露于500mM NaCl达10天的与FcRed1共生的(100％，5)、与Fc18共生的(0％，1)、或非共生的(0％，1)稻植株[栽培种Dongjin(N＝45)]。D)在无水情况中栽培10天的与FcRed1共生的(100％，5)、与Fc18共生的(100％，5)、或非共生的稻植株[栽培种Dongjin(N＝45)]。E)暴露于300mM NaCl达14天的与FcRed1共生的(100％，5)、与Fc18共生的(0％，1)、或非共生的(0％，1)番茄植株[栽培种似虎(Tiger-like)(N＝12)]。F)在无水情况中栽培10天的与FcRed1共生的(100％，5)、与Fc18共生的(100％，5)、或非共生的(0％，1)番茄植株[栽培种似虎(N＝12)]。虽然未作显示，在没有应激的情况中栽培的共生和非共生对照植株在整个实验中是健康的(100％，5)。重复所有测定法至少三次。
图2显示了在真双子叶植物和单子叶植物中共生对热和干旱耐受性的影响。自左向右进行描述，并且图像是所有植株/处理的代表。在本文中所提供的描述中，植株/处理的数目以(N＝XX)标示，而％存活和存活者的健康状况在每种处理后的圆括号中标示。植物健康基于与非共生对照的比较，并从1至5分级(1＝死亡，2＝严重枯萎的，3＝枯萎的，4＝轻微枯萎的，5＝健康的，无病斑或枯萎的)。A)暴露于50℃根部温度达5天的与FcRed1(0％，1)、CpMH206(0％，1)、或Cp4666D(100％，5)共生的或者非共生的(0％，1)番茄幼苗[栽培种似虎(N＝30)]。B)在无水情况中栽培7天的与FcRed1(100％，5)、CpMH206(100％，5)、或Cp4666D(100％，5)共生的或者非共生的(0％，1)黍(Panic grass)(N＝30)。重复所有测定法至少三次。
图3显示了在5天里量化共生的(S)和非共生的(NS)植株(N＝25、120、和30，分别针对黍、稻、和番茄)的水利用，其中SD值不大于12.5，而P值(ANOVA单因素分析)小于1.00E-05。重复所有测定法至少三次。黍和番茄植株与Cp4666D共生(S)，稻植株定殖有FcRed1，而所有其它处理是非共生的(NS)。
发明详述
本发明涉及在经接种的植物(包括单子叶植物和双子叶植物两者)中赋予应激耐受性的植物内生真菌的方法和组合物。具体的是，自华盛顿州的普吉特湾海滩(Puget Sound beach)上的植物群落中生长的沙丘草(dunegrass)，即滨麦(Leymus mollis)分离的镰孢属菌种。给靶标植物或植物部分诸如幼苗或种子接种后，所得的植物显示应激耐受性，特别是干旱和盐分耐受性。
因而，本发明涉及某些植物内生真菌用于处理植物以赋予应激耐受性的用途。本文中的“植物内生真菌”指一般存在于植物的细胞内和/或细胞间空隙中的真菌。本发明的植物内生真菌赋予应激耐受性，特别是干旱和/或盐耐受性。
在一个例示性的实施方案中，所述植物内生真菌是镰孢属的菌种。在某些实施方案中，基于形态学和基因组序列(特别是rDNA序列)来鉴定所述镰孢属菌种，如本文中所概述的。一般而言，这些镰孢属菌种分离自沿海生境中于盐水浓度(诸如图中所概述的)生长的宿主植物，特别是那些如本文中所讨论的，诸如那些自滨麦分离的。
如本领域技术人员应当领会的，有许多可在本发明中应用的合适镰孢属菌种。具体地，优选由分离物FcRed1代表的菌种，其具有rDNA的可变ITS1和ITS2区和翻译延长因子的区域，如本文中所概述的。
本发明的植物内生真菌可用于处理靶标植物以赋予应激耐受性。合适的植物包括可以由本发明的植物内生真菌定殖的单子叶植物和双子叶植物(包括真双子叶植物)两者。植物可以处于任何生长阶段，包括种子、幼苗、或全植株、另外，如本文中所讨论的，可以接种植物的任何部分；合适的植物部分包括种子、根部、叶、花、茎等。
在一些实施方案中，靶标植物是禾本科(family Graminae)的植物(禾本科植物(grass))。其中导入这些内生菌的禾本科植物可以是任何属于下述属的有用的禾本科植物：冰草属(Agropyron)、剪股颖属(Agrostis)、须芒草属(Andropogon)、黄花草属(Anthoxanthum)、燕麦草属(Arrhenatherum)、燕麦属(Avena)、短柄草属(Brachypodium)、雀麦属(Bromus)、虎尾草属(Chloris)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、野麦属(Elymus)、画眉草属(Eragrostis)、羊茅属(Festuca)、甜茅属(Glyceria)、茅香属(Hierochloe)、大麦属(Hordeum)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、雀稗属(Paspalum)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗尾草属(Setaria)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉蜀黍属(Zea)和结缕草属(Zoysia)。换言之，本发明涉及向其中人工导入内生菌的属于这些属的禾本科植物。在本发明的语境中，这还包括禾本科植物的未来世代。
在某些实施方案中，靶标植物选自小麦，包括但不限于一粒小麦(Triticummonococcum)、圆锥小麦(Triticum turgidum)、提莫非维小麦(Triticumtimopheevi(提莫非维氏小麦)和普通小麦(Triticum aestivum)(面包小麦)。
在某些实施方案中，靶标植物是玉蜀黍属的玉米。玉蜀黍属是禾本科(Gramineae，Poaceae)(通常称为禾本科植物科)的属。该属由某四个种组成：玉蜀黍(Zea mays)，即栽培的玉米和玉米草(teosinte)；大刍草(Zea diploperennisIltis et at.)，即双多年生玉米草(diploperennial teosinte)；繁茂大刍草(Zealuxurians(Durieu et Asch.)Bird)；和多年生玉米(Zea perennis(Hitchc.)Reeveset Mangelsd.)，即多年生玉米草。
具体的有用的禾本科植物包括但不限于D.languinsoum、毒麦(rye grass)、和早熟禾(bluegrass)。本领域中已知的早熟禾包括肯塔基早熟禾(Kentuckybluegrass)、加拿大早熟禾(Canada bluegrass)、粗糙草地早熟禾(rough meadowgrass)、球茎草地早熟禾(bulbous meadow grass)、高山草地早熟禾(alpinemeadow grass)、波状草地早熟禾(wavy meadow grass)、森林草地早熟禾(woodmeadow grass)、Balforth草地早熟禾、沼泽草地早熟禾、阔叶草地早熟禾、狭叶草地早熟禾、光滑草地早熟禾、扩展草地早熟禾(spreading meadow grass)和展平草地早熟禾(flattened meadow grass)。
在某些其它的实施方案中，本发明的组合物可应用于处理双子叶植物，包括真双子叶植物，诸如番茄、西瓜、南瓜、黄瓜、草莓、胡椒、大豆、苜蓿和拟南芥。
本发明涉及如下获得的靶标植物，即将内生菌人工导入不含丝状植物内生真菌的植物，即未用内生菌感染的植物中和/或导入先前已经从中除去内生菌的感染植物中。在本发明的语境中，人工导入靶标植物(例如禾本科植物)中的内生菌是赋予靶标植物应激耐受性的植物内生真菌。
如下发现这些内生菌，即寻找生存于自然界生长的植物中的内生菌，至少使它们进行盐分或干旱测试，并人工导入通过所述测试证实的那些内生菌以具有此类抗性。
本发明的植物内生真菌组合物可用于赋予植物和植物部分应激耐受性。“应激”在此语境中指环境应激，包括但不限于高温(例如热应激)、干旱(例如缺水)、金属和金属离子(其引起多种植物问题和/或生物)、异常pH(包括酸性和/或碱性两者)、和盐分(例如盐应激)。这里所概述的植物内生培养物容许对靶标植物赋予(confirmation)应激抗性。
在一个例示性的实施方案中，所述应激耐受性是干旱耐受性。在这种情况中，虽然单独的靶标植物或真菌都不能在本文中所描述的水减少的条件下生存，但是靶标植物与真菌一起培养导致干旱耐受性至少约5、10、20、25和50％或更多的改变，如本文中所测量的，且与缺乏真菌的对照相比。
在另一个例示性的实施方案中，所述应激耐受性是盐分耐受性。在这种情况中，虽然单独的靶标植物或真菌都不能在本文中所描述的盐增加的条件下生存，但是靶标植物与真菌一起培养导致盐耐受性至少约5、10、20、25和50％或更多的改变，如本文中所测量的，且与缺乏真菌的对照相比。
如本文中所使用的，术语“盐应激”或“盐分应激”指对植物的离子和渗透应激两者。
可以在数个水平区别离子和渗透应激。在盐敏感性植物中，枝条生长和根生长(在较小程度上)在盐应激的若干小时内永久降低，而且此效应没有展现出依赖于生长组织中的Na+浓度，而是对外部溶液渗透摩尔浓度(osmolarity)的响应(Munns等，2002，Plant Cell and Environ.25：239-250)。Na+特异性损伤与Na+在叶组织中的积累有关，并且导致较老叶片的病斑，其在尖端和边缘处开始并逐渐移回整片叶。生长和产量降低由于单独叶的寿命缩短而发生，如此降低净生产率和作物产量。显示Na+特异性损伤所据的时间进程(timescale)取决于Na+在叶片中的积累速率和Na+在叶组织和细胞内分隔(compartmentation)的效率。这些Na+特异性效应被叠加于NaCl的渗透效应，并且重要的是，比渗透效应显示更大的种内变化。
在分子水平，由盐应激活化的信号传导机制包括干旱诱导的和Na+特异性途径两者。土壤Na+高的一些效应还是缺乏其它营养物的结果，或者是与其它环境因素诸如干旱(其加剧Na+毒性问题)相互作用的结果。
如本领域技术人员应当理解的，植物物种在它们有多耐受盐渍土壤(salt-affected soil)的方面有所变化。一些植物会耐受高水平的盐分，而其它植物能耐受些微盐分或不能耐受盐分。植物在存在盐分的情况中的相对生长被称为其盐耐受性。在某些例示性的实施方案中，本发明的方法和组合物在盐耐受性方面提高至少5、10、20、25、和50％或更多，如可以通过本文中所描述的方法所测量的(例如如下文所描述的EC升高、生物质产量增加、或暴露于盐耐受性后叶寿命延长)。
通常按照电导率(EC)水平范围里的植物生长阶段给出盐耐受性。电导率是溶液传导电流的能力。为了测定土壤盐分EC，在自所测量的土壤采集的土壤提取溶液(土壤盐分)中使用两个电极来在禾本科植物细胞中施加电流。单位通常以分西门子(deciSiemens)每米(dS/m)给出。盐分水平在盐水渗出(salineseep)之间变化广泛。盐分从春季至秋季也有所变化。盐分通常仅在春季解冻后在土壤表面上才出现。
因而，如本领域技术人员应当理解的，用于赋予应激耐受性(例如升高的盐分耐受性)的镰孢属菌种浓度可以有所变化，这取决于要处理的植物或植物部分和进行处理的季节。例如，植物诸如草莓植物具有相对较低的盐耐受性(≤4EC)，而某些冰草(wheatgrass)(例如高冰草和细茎冰草(slenderwheatgrass))具有相对较高的盐耐受性(≥8EC)。
在现有植物受压抑的生长外，高盐水平还能干扰新种子的萌发。盐分如干旱一样对植物起作用，其阻止根部执行其渗透活性，其中水和营养物从低浓度区域移动入高浓度区域中。因此，由于土壤中的盐水平，水和营养物不能移动入植物根部内。
随着土壤盐分水平升高，对萌发幼苗的应激也升高。一般而言，多年生植物比一年生植物更好地处理盐分。在一些情况中，盐分对植物还有毒性效应，这是由于某些盐类在土壤中的高浓度。盐分阻止植物吸收它们的健康生长所要求的适当营养物平衡。
如此，在本发明的另一方面，本发明的植物内生组合物可以赋予生长增强。生长增强一般通过比较与植物内生真菌(例如镰孢菌)一起培养的植物与缺乏该真菌的植物来测量。植物大小(包括叶、根和茎)的差异一般按照重量来测量，其中生长增加测量为对照与经处理的靶标植物之间至少约5-10％的差异，其中优选至少约25％的差异。
在本发明的又一方面，使用植物内生真菌的纯培养物来接种植物或植物部分。在此语境中的“纯培养物”指没有其它培养的植物内生真菌的培养物。培养物可以是孢子、菌丝、菌丝体、或真菌的其它形式的培养物，其中孢子是特别优选的。一般而言，以每株植株1-5x103-8个孢子使用孢子，其中优选1-3x104-6个且1-3x105个是特别优选的。如本文中所概述的，可以以多种方式培养本发明的植物内生真菌，包括使用如本发明中所显示的PDA平板，虽然也可以使用液体培养物。
可以将孢子或其它接种物放置在种皮上，特别是无植物内生真菌种子(天然存在的或者进行处理以除去任何内生菌的)的种子上。应当注意到，可以给植物(包括种子)接种植物内生真菌培养物(各赋予应激耐受性(或是相同类型或是不同类型)的任意不同菌种)的组合。另外，也可以使用镰孢属菌种的混合物。
以下实施例用来更全面地描述使用上文所描述的发明的方式，以及用来提出预期用于实施本发明的各方面的最佳方式。理解的是，这些实施例决不用来限制本发明的真正范围，而是出于例示目的而呈现。
实施例
实施例1
对沿海生境的评估—镰孢菌(Fusarium)在赋予盐耐受性方面的作用
华盛顿州的普吉特湾海滩上的植物群落通常由滨麦(沙丘草)占支配地位。在此生境中，在涨潮期间植物暴露于海水，并且夏季通常非常干燥。这些植物是一年生物种，其达到高种群密度，而且在它们在秋季开始衰老之前保持绿色。自普吉特湾的4处地理学不同位置(＞16km)收集200株沙丘草个体，并且发现它们被代表占所分离所有真菌的95％的一种优势的2类真菌内生菌定殖。使用形态学和分子技术将该内生菌鉴定为大刀镰孢，并自植物根部、冠部(crown)和较低的茎分离，如先前所描述的(Redman等，2002，Symbiosis 32：55-70)。
基于沿海生境中所施加的非生物应激，我们测试了大刀镰孢(分离物FcRed1)在实验室条件下将盐和干旱耐受性赋予沙丘草的能力。使用商品化的种子来产生非共生的和共生的滨麦植株(Redman等，2001，New Phytol.151：705-16)。如在其它研究中所观察到的，在没有应激的情况中非共生的和共生的植株的生长、发育和健康方面没有可观察到的差异(图1)(Redman等，2002，Science，见上文；Redman等，2002，Symbiosis，见上文；Redman等，2001，NewPhytol.，见上文)。然而，在暴露于NaCl浓度范围时，非共生植株在100mMNaCl(未显示)时开始枯萎并脱水，而共生植株没有显示枯萎，直至将它们暴露于500mM NaCl达14天(图1a)。如此，FcRed1赋予对相当于海水水平(0.5-0.6M)的水平的盐耐受性。
终止灌溉后通过共生的和非共生的植株枯萎所需要的时间长度来测定FcRed1赋予干旱耐受性的能力(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。定殖有FcRed1的沙丘草植株在没水的情况中于14天后枯萎，而非共生植株在6天后枯萎，并且在14天后死亡(图1b)。
实施田间研究(field study)以确定FcRed1对于沿海生境中的生存是否是需要的。在带有防寒罩的温室(cold-frame greenhouse)中栽培共生的和非共生的植株达3个月，并以10株植株/处理的两簇移植至华盛顿大学的Cedar Rocks生物学保护区(Cedar Rocks Biological Preserve)，Shaw Island(San Juanarchipelago，WA)的海滩。移植前，对重复组的植株分析真菌定殖，指明所有共生植株(N＝30)均定殖有FcRed1，而所有非共生植株(N＝30)均没有真菌。移植后3个月，对植株评估存活和生物量。初始定殖有FcRed1的所有沙丘草植株(N＝20)在此沿海生境中存活，达到19.16g的平均生物量(sd＝5.95)，但是非共生植株(N＝20)中仅8株存活，达到17.58g的平均生物量(sd＝9.23)。发现8株成活的非共生植株定殖有FcRed1，提示它们在种植后被定殖。土壤微生物分析指明，FcRed1存在于沙丘草的根际(rhizosphere)，但是密度极低(＜0.01％的可培养真菌，未显示)。因此，我们猜测，非共生植株的存活和最终生物量依赖于FcRed1原位定殖的时机(timing)。不论存活与否，所有植株的根部均定殖有菌根，指明菌根联系不是盐耐受性所需要的，或者盐耐受性需要FcRed1和菌根共生的组合(即，未成活的植株具有菌根，但没有FcRed1，而所有成活的植株具有两者的结合)。
生物体大刀镰孢被称为单子叶植物和真双子叶植物的世界性病原体(Farr等，1989，于Fungi on Plants and Plant Products in the United States，APSPress，St.Paul，MN，第1252页)，然而，FcRed1无症状地定殖来自两种植物群体的物种(表1)。显著地，FcRed1将盐耐受性赋予稻(单子叶植物)和番茄(真双子叶植物)，指明FcRed1与沙丘草之间的联系不是关于应激耐受性的紧密共进化关系(表1，图1c和图1e)。
表1.宿主定殖和由真菌内生菌赋予的应激耐受性。
  内生菌   沙丘草   黍   稻   番茄
  Cp4666D   r，s，D，H   r，s，D，H   r，s，D，H   r，s，D，H
  CpMH206   nd   r，s，D   nd   r，s，D
  FcRed1   r，s，D，S   r，s，D，S   r，s，D，S   r，s，D，S
  Fc18   r，s，D   Nd   r，s，D   r，s，D
如下评估植物定殖(N＝5)，即表面灭菌，将植株切割成根(r)和茎(s)切片，并将切片铺于真菌生长培养基上(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。仅在真菌从那些组织长出时列出植株切片。如描述的那样评估共生方式赋予的干旱和热耐受性(Redman等，2002，Science，见上文；Redman等，2001，NewPhytol.，见上文)，并且分别表示为D或H。通过用300mM NaCl溶液灌溉植株来评估盐耐受性(S)。nd＝未测定的。
为了测定盐耐受性对于FcRed1和来自沙丘草的其它分组(cohort)是否是独特的，我们自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得了大刀镰孢分离物Fc18。Fc18分离自不施加盐应激的荷兰农业生境。比较研究揭示，FcRed1和Fc18两者在培养物中无菌培养(未显示)并无症状地定殖番茄和沙丘草时耐受相同水平的盐，但是仅FcRed1赋予盐耐受性(图1a)。这提示FcRed1赋予的盐耐受性是生境特异性共生适应现象。有可能的是，Fc18不能赋予盐耐受性是基于宿主定殖不足或不能建立互利共生。然而，比较研究揭示，FcRed1和Fc18等同地定殖宿主(表2)，而且赋予类似水平的干旱耐受性(图1b，图1d和图1f)，指明两种内生菌都分别通过赋予盐耐受性和/或干旱耐受性而赋予沙丘草、稻和番茄共生生物的(mutualistic)益处。因此，我们得出结论，由FcRed1赋予的盐耐受性是生境特异性的共生适应。
表2.在有和没有热应激的情况中植物的真菌定殖
  真菌分离物   无应激   有应激   无应激   有应激
  Cp4666D   34.7+5.0(0.236)   11.0+4.0(0.048)   13.7+2.5(0.74)   4.3+1.5(0.067)
  CpMH206   40.7+5.5(0.236)   3.7+2.2(0.048)   14.3+5.0(0.74)   1.0+1.7(0.067)
  FcRed1   11.6+2.79(0.49)   4.8+1.64(0.027)   16.8+3.7(0.43)   5.6+1.15(0.001)
  Fc18   10.2+4.55(0.49)   2.4+1.14(0.028)   15.2+2.28(0.43)   1.4+1.14(0.001)
将单子叶植物(黍或沙丘草)和真双子叶植物(番茄)植株维持于22℃(无应激)，或者将根区加热至50℃达12天(有应激)(Redman等，2002，Science，见上文)。将等量的来自5株植株/处理的根和较低茎组织(总共0.5g)在10ml STC缓冲液(1M山梨糖醇、10mM Tris-HCl、50mM CaCl2，pH 7.5)中混合，并将100ul在真菌生长培养基上铺板。表示CFU，其中标准偏差在+号的右侧。通过ANOVA单因素分析来确定P值，并且放在圆括号中。
实施例2
对地热土壤生境的评估
本发明人先前报告了，真菌内生菌(弯孢霉属菌种)负责黄石国家公园地热土壤中茁壮成长的单子叶植物Dichanthelium lanuginosum(黍)的热耐受性(Redman等，2002，Science，见上文)。使用形态学和分子技术(方法)将该内生菌鉴定为管突弯孢(Curvularia protuberate)。用源自于苏格兰，英国的非地热生境中生长的禾本科植物的、自ATCC获得的管突弯孢(CpMH206)分离物实施与上文所讨论的那些类似的研究。用来自黍的管突弯孢分离物(Cp4666D)和CpMH206进行的比较研究揭示，两种分离物相等地定殖番茄和黍(表2)。虽然Cp4666D赋予黍和番茄植株两者热耐受性，但是CpMH206不然(图2a)。为了确保CpMH206与植物共生通讯并确定热耐受性是否是生境适应性现象，如先前所描述的那样实施干旱研究(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。如用FcRed1和Fc18所观察到的，两种弯孢霉分离物(Cp4666D和CpMH206)赋予类似水平的干旱耐受性，指明CpMH206赋予植物宿主共生生物的益处(图2b)。
实施例3
对农业生境的评估
来自刺盘孢属(Colletotrichum)的真菌被称为植物病原体，但是它们仍可以表现出(express)共生生物的生活方式，这取决于它们定殖的宿主(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。例如，大刺盘孢(C.magna)分离物CmL2.5是葫芦(cucurbit)的毒性病原体，但是无症状地定殖番茄。根据番茄基因型，CmL2.5会提高生长速率和/或果实产量，而且赋予干旱耐受性和/或赋予针对毒性病原体的疾病抗性(Redman等，2002，Science，见上文；Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。有趣的是，刺盘孢菌种并不将盐或热耐受性赋予番茄或葫芦，而上文所描述的弯孢霉和镰孢菌分离物未赋予疾病抗性(未显示)。因此，刺盘孢菌种适应应激(高的疾病压力)特异性的农业生境，而且将疾病抗性赋予植物宿主。如用上文所描述的弯孢霉和镰孢菌分离物所看到的，刺盘孢菌种还赋予干旱耐受性(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。
实施例4
共生的无症状性质
已知真菌共生生物表现出从互利共生至寄生的不同生活方式，这取决于环境条件或宿主基因型(Redman等，2001，New Phytol.，见上文；Francis等，1995，Can.J.Botany 73：S1301-9；Johnson等，1997，New Phytol.135：575-86；Graham等，1998，New Phytol.140：103-10)。病原体定殖的植物通过活化防御系统来进行响应以用墙隔开(wall-off)病原体，致使形成坏死的病斑，或者屈从于攻击。然而，共生生物定殖的植物不展现出活化宿主防御系统或者形成病斑(Redman等，1999，Plant Physiol.119：795-803)。在上文所描述的实验中，在没有应激的情况中在共生的与非共生的植物之间没有可观察到的差异，提示宿主防御没有得到活化。此外，植物种子萌发、幼苗生长和发育、和植物健康在温室中栽培1-2年的共生植株与非共生植株中是相同的(未显示)。
实施例5
应激耐受性机制
不论起源生境，上文所描述的所有内生菌均赋予单子叶植物和真双子叶植物宿主干旱耐受性，如此，支持如下理论，即约4亿年前植物向地面上的移动牵涉真菌(Pirozynski等，1975，Biosystems，见上文)。自水生生境转变至陆地生境很可能带给(present)植物新的应激，包括可能已经被耐受的脱水期，这是由于已经在该时间发生的真菌共生。干旱、热和盐应激影响植物的水状态，导致复杂的植物响应，包括渗透物的产量升高(Bohnert等，1995，The PlantCell，见上文；Wang等，2003，Planta 218：1-14)。然而，暴露于热应激后，非共生植物显著提高渗透物浓度，而共生植物在与非应激的对照相比时维持相同的或较低的渗透物浓度(表3)。这提示，共生植物使用不同于提高渗透物浓度的办法来减轻热应激的影响。
表3.共生对植物渗透物浓度的影响。
Figure GPA00001062871300151
将非共生的(NS)和共生的(S，与Cp4666D)的植株于22℃维持(没有应激)，或者使根区加热至50℃达12天(有应激)。在具有3mg无菌沙的500ul水中研磨等量的来自3株植株/条件的根和较低的茎组织(总计100mg)，煮沸30分钟，并用Micro Osmometer 3300(Advanced Instruments)测量渗透物(Marquez等，2007，Science 315：513-5)。至少重复测定法3次，并使用ANOVA单因素分析来分析数据。渗透物浓度(毫渗透压摩尔(milliosmole)/kg湿重)+SD值后面有圆括号中的P值。
不论定殖的内生菌，共生植株比非共生植株消耗显著更少的水(图3)。因为共生植株达到与非共生植株相同或提高的生物量水平，水消耗降低提示更有效的水利用。水消耗降低和水利用效率提高可以提供关于以共生方式赋予的干旱耐受性的独特机制。所有非生物应激与生物应激共有的一种植物生化过程是活性氧类别(ROS)的积累(Apel等，2004，Annu.Rev.Plant Biol.55：373-99)。ROS对生物学细胞具有极端的毒性，引起对DNA、脂质、和蛋白质的氧化性损伤。一种模拟内源产量和评估对ROS的组织耐受性的方式是将光合组织暴露于除草剂百草枯(paraquat)。此除草剂被来自植物光系统I的电子转移还原，并且被分子氧氧化，导致超氧化物离子的生成和后续的光漂白(Vaughn等，1983，Plant Cell Environ.6：13-20)。我们将共生的(与Cp4666D)和非共生的植株暴露于有(+)和无(-)热应激，然后在存在光的情况下使切割的成熟叶组织漂浮在百草枯溶液(1uM)上。暴露于百草枯后24至48小时，来自暴露于应激的非共生植株的叶组织被完全光漂白，指明完全的叶绿素降解，而来自暴露于应激的共生植株的叶组织保持绿色(表4)。在没有应激的情况中，在存在或没有百草枯的情况中非共生植株和共生植株的叶组织都保持绿色。这提示，在共生植物被暴露于非生物应激时，Cp4666D清除ROS，诱导植物更有效地清除ROS，或者阻止ROS生成。
表4.共生对活性氧类别(ROS)生成的影响。
Figure GPA00001062871300161
来自于其根区暴露于22℃或50℃达5-7天(在热应激症状发生前)的非共生的(NS)和共生的(S，与Cp4666D)植株(N＝3株植株/条件)的叶盘(leaf discs)(N＝12)。切出叶盘(3-5mm)，并在存在荧光的情况中在1uM百草枯上漂浮24-48小时。叶盘保持绿色(RG)，或者由于叶绿素降解而漂白(BW)。
1类和2类真菌内生菌在数方面有所不同：1类内生菌包含相对少量的具有少许单子叶植物宿主的苛养种(fastidious species)，而2类内生菌(这里所描述的)包含大量易处理的(tractable)种，其具有宽宿主范围，包括单子叶植物和真双子叶植物两者。另外，ROS在与1类和2类内生菌的植物共生中的作用可以有所不同。1类内生菌羊茅香柱菌(Epichloe festucae)表现出产生ROS以限制宿主定殖，而且维持互利共生(Tanaka等，2006，The Plant Cell 18：1052-66)，而2类内生菌Cp4666D降低ROS产量，可能以便减轻非生物应激的影响。
基于来自禾本科植物的内生菌赋予番茄植物应激耐受性的能力，表现出以共生方式赋予的应激耐受性所要求的遗传/生化通讯(communication)先于1.4-2.35亿年前建立的单子叶植物和真双子叶植物趋异(Wolfe等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.86：6201；Chaw等，2004，J.Mol.Evol.58：424；Yang等，1999，J.Mol.Evol.48：597)。此外，用不同真菌和植物物种及不同环境应激证实如下观念，即真菌内生菌以生境特异性方式适应应激。现在此现象被鉴定为适应性共生，而且在与由达尔文提出的相当慢的遗传机制相比时提示真菌内生菌提供关于植物在适应生境应激中进行量子进化跳跃(quantum evolutionaryjump)的基因组间外遗传机制。事实上，本发明人完成的田间研究指明，适应性共生可以在单一生长季节内赋予植物应激耐受性(Redman等，2002，Science，见上文)。然而，关于内生菌对应激的适应的精确时间范围尚未得知。
用于实施例1-5的别的材料和方法
在12小时光方案中于22℃将内生菌在1/10X马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextrose agar)(PDA)培养基(补充有50-100μg/ml氨苄青霉素、四环素、和链霉素)上培养。生长5-14天后，通过用无菌玻璃载玻片温和地刮掉孢子来从平板收集分生孢子。将孢子在10ml无菌水中重悬，流过4层无菌棉花干酪包布纱布(sterile cotton cheesecloth gauze)进行过滤，并将孢子浓度调节至104-105个孢子/ml。
真菌鉴定
使用分生孢子梗和分生孢子形态学来鉴定真菌(Barnett等，1998，于Illustrated Genera of Imperfect Fungi，American Phytopathology Society，St.Paul，MN，第240页；Von Arx JA，1981，于The Genera of Fungi Sporulating in PureCulture，J.Cramer Pub.Co.，Vaduz，Germany，第410页；Leslie等，2005，于TheFusarium Laboratory Manual，Blackwell Publishing，第400页)。物种命名基于对rDNA的可变ITS1和ITS2序列(ITS4＝5’-tcctccgcttattgatatgc-3’引物(SEQ IDNO.1)和ITS5＝5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’引物(SEQ ID NO.2)(White等，1990，于PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc，San Diego，第315-22页))和翻译延长因子(EF1T＝5’-atgggtaaggaggacaagac-3’引物(SEQ ID NO.3)；EF2T＝5’-ggaagtaccagtgatcatgtt-3’引物(SEQ ID NO.4)；EF11＝5’-gtggggcatttaccccgcc-3’引物(SEQ ID NO.5)；和EF22＝5’-aggaacccttaccgagctc-3’(SEQ ID NO.6)引物(O’Donnell等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.97：7905-10)的序列分析。自菌丝体提取DNA，并进行PCR扩增，如先前所描述的(Redman等，2002，Science，见上文)。对PCR产物测序，并针对GenBank数据库对该序列进行BLAST搜索。形态学和GenBank分析鉴定出供直接序列比较用的购自ATCC的候选物种。分离物CP4666D和FcRed1的rDNA和EFII序列分别与CpMH206和Fc18的相同。
植物定殖
将番茄、沙丘草和黍种子在温和搅动的情况中在0.5-1.0％(v/v)次氯酸钠中进行表面灭菌达15-20分钟，并用10-20个体积的无菌蒸馏水漂洗。将稻种子在70％乙醇中进行表面灭菌达30分钟，然后转移至5％(v/v)次氯酸钠在温和搅动的情况中达30分钟，并用10-20个体积的无菌蒸馏水漂洗。使植物种子在无菌蛭石上或者在补充有1x霍格兰氏溶液的1％琼脂培养基上萌发，维持于25℃，并暴露于12小时荧光方案。如下评估种子表面灭菌的效率，即将30-50粒种子放置在1/10X PDA培养基上，并监测真菌的长出物，如先前所描述的(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。仅在100％的所测试植物没有自组织出现的真菌时才认为植物是没有内生菌的。
将没有内生菌的植株(多至5株植株/品红盒子)种植入装有等量(380克+/-5克)无菌沙的改良无菌品红盒子(Redman等，2001，Science，见上文；Marquez等，2007，Science，见上文)。下部的室装满200mi无菌水或补充有5mM CaCl2的1x霍格兰氏溶液。1-4周后，通过在冠部或茎的基部吸取100-1000ul孢子(104-105个/ml)来用真菌内生菌模拟接种(非共生的)或接种植物(Redman等，2001，Science，见上文)。在12小时光方案下于25℃种植植物达1-4周，之后施加应激。
在每次应激实验开始时，如下评估接种植物中内生菌定殖的效率和模拟接种的对照中的内生菌缺乏。将代表占每次处理20-30％的一个亚组的植株进行表面灭菌，切成切片(根、茎或冠部、和叶)，并放置在0.1X PDA培养基上以评估真菌定殖(Redman等，2001，Science，见上文；Redman等，2001，NewPhytol.，见上文)。在12小时光方案的情况中于22℃生长5-14天后，使用标准的分类学和显微技术(上文的)来鉴定植物组织长出的真菌(Redman等，2001，New Phytol.，见上文)。在每次实验结束时使用相同的规程来评估真菌定殖。在所有情况中，没有真菌从模拟接种的植株出现(0％定殖)，而所有接种的植物都具有自其组织出现的接种它们的真菌(100％定殖)。
非生物学应激
实施如下实验，其中植物在温度受控房间的品红盒子和12小时荧光方案中种植。将品红盒子随机放置在房间的架子上的不同位置以进行盐和干旱应激实验。将热应激实验中使用的植物随机放置在地热土壤模拟器中(Redman等，2001，Science，见上文)。重复每次实验至少3次，并且图1中的图像是每次处理的所有重复的代表。品红盒子装有1-5株植株，并且植株总数/重复以图注中的(N＝XX)标示。按1-5的等级评估植物健康状况(1＝死亡，2＝严重枯萎的，3＝枯萎的，4＝轻微枯萎的，5＝健康的，无病斑或枯萎的)，并列于图注中。
为了模拟热应激，将番茄植株[幼苗(图2)或3-4周龄植株(表2-4)]放置在地热土壤模拟器中，并通过以每48小时5℃增量使温度从环境温度倾斜(ramp)上升至50℃来对根区施加热应激。在幼苗中5天后而在较大的植株中12天后观察到热应激的第一种症状。热应激72小时后对植株拍照(图2)，并使实验再继续进行48小时。
为了模拟盐应激，通过使双层结构(double decker)系统中的下部品红盒子装满盐溶液来使植株暴露于300-500mM NaCl达10-14天。
为了模拟干旱应激，终止灌溉达7-14天，这取决于植物宿主。使用液体比重计(Stevens-Vitel Inc.)来确保土壤湿度水平在终止灌溉时在各处理之间是等同的。所有植株都枯萎后，将它们在无菌水中再水合达24-48小时，并拍照。
植物水利用
对双层结构品红盒子中的植株测量水消耗(Redman等，2001，Science，见上文；Marquez等，2007，Science，见上文)。最初，将200ml水放置在下部室中。测量植物生长5天后保留在下部室中的水，并以所消耗的ml/5天来计算水利用。
田间研究
使用商品化的滨麦种子来产生共生的(与FcRed1)和非共生的植株，如上文所描述的。将植株在暴露于环境温度和光的带有防寒罩的温室中在无菌盆栽土中种植3个月。使用植株(30株/处理)的重复组来确保非共生植株没有真菌，并确保共生植株含有FcRed1，如上文所描述的。移植后3个月，移出带有完整的根系统的植株，并运回实验室，在那里评估生物量，接着分析真菌定殖(上文的)。
保藏物信息
申请人已经于2008年7月21日在布达佩斯条约下以农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)1815 NorthUniversity Street，Peoria，IL 61604 USA，NRRL保藏号50152进行了大刀镰孢分离物FcRed1(如本文中所描述的)的样品保藏。本申请和保藏是及时提交的，因为提交本申请以要求美国临时申请号60/950,755的优先权的日期是2008年7月19日，这天是星期六。星期一，即2008年7月21日是2008年7月19日后的第一个工作日，并且本PCT申请是于2008年7月21日提交的。
由于在本申请的提交日前，从共同发明人Russell J.Rodriguez(拉塞尔·J·罗德里格斯)，美国内政部，美国地质调查局维持的保藏物取得了保藏于NRRL的真菌样品。真菌样品的此保藏物会在NRRL贮藏库(其是公共储藏室)中维持30年，或者最新要求后的5年的期间，或者达该专利的可执行寿命，以最长者为准，并且在该期间里若其变得不能存活，则会被替换。另外，申请人已经满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品生存力指征，或者会在颁布基于本申请的专利权之前这样做。申请人没有对来自NRRL的保藏材料的可用性施加限制；然而，申请人没有授权放弃法律对商业方面的生物材料转移或其运输所施加的任何限制。申请人没有放弃对此专利权下授予的权利的任何侵权。
仅为了理解的清楚而给出了上述详细的描述，并且不应当自此将不必要的限制理解为修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。
虽然本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但是应当理解的是，其能够进一步修饰，而且本申请意图覆盖本发明的任何如下变化形式、用途、或改编，其一般遵循本发明的原理，并且包括诸如在本发明所属技术领域内的已知或惯例实践范围内和可以应用于前文所提出的实质特征及如下在所附权利要求书的范围内的本公开内容的偏离。
出于任何和所有目的，由此本文通过提及而完整收录本文中所引用的各篇和每篇专利、专利申请、和出版物的公开内容。
序列表
<110>蒙大拿州立大学(Montana State University)
    
<120>真菌分离物及其在植物中赋予盐分和干旱耐受性的用途
<130>MONT-094/01WO
<150>US 60/950,755
<151>2007-07-19
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>ITS4引物
<400>1
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<210>2
<211>22
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<223>ITS5引物
 
<400>2
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<210>3
<211>20
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<210>4
<211>21
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<223>EF2T引物
<400>4
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<213>未知的
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<223>EF11引物
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<210>6
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<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>EF22引物
<400>6
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Claims (19)

1.一种处理靶标植物以赋予盐分耐受性的方法，包括给所述植物或所述植物的部分接种镰孢属菌种的培养物。
2.依照权利要求1的处理靶标植物的方法，其中所述植物是单子叶植物或者所述植物部分来自单子叶植物。
3.依照权利要求2的处理靶标植物的方法，其中所述单子叶植物选自下组：禾本科植物、小麦和稻。
4.依照权利要求1的处理靶标植物的方法，其中所述植物是双子叶植物或者所述植物部分来自双子叶植物。
5.依照权利要求4的处理靶标植物的方法，其中所述双子叶植物是真双子叶植物。
6.依照权利要求5的处理靶标植物的方法，其中所述真双子叶植物选自下组：番茄、西瓜、南瓜、黄瓜、草莓、胡椒、大豆、苜蓿和拟南芥(Arabidopsis)。
7.依照权利要求1的处理靶标植物的方法，其中所述植物部分是种子。
8.依照权利要求1的处理靶标植物的方法，其中所述植物部分是幼苗。
9.依照权利要求1的处理靶标植物的方法，其中所述镰孢属菌种是大刀镰孢。
10.依照权利要求9的处理靶标植物的方法，其中所述大刀镰孢是具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1。
11.依照权利要求1或10的处理靶标植物的方法，其进一步包括给所述植物或所述植物的部分接种至少一种别的2类植物内生真菌内生菌。
12.依照权利要求1至权利要求11任一项的处理靶标植物的方法，其中该方法还赋予所述靶标植物干旱耐受性。
13.一种处理靶标植物以赋予干旱耐受性的方法，包括给所述植物或所述植物的部分接种具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1的培养物。
14.一种从生长培养基除去盐的方法，包括给植物或所述植物的部分接种具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1的培养物，并容许所述经接种的植物在所述生长培养基中生长。
15.权利要求14的方法，其中所述生长培养基是土壤。
16.一种组合物，其包含具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1的纯培养物。
17.一种接种物，其包含具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1的菌丝体和/或孢子。
18.权利要求17的接种物，其中所述接种物是种子接种物。
19.权利要求17或18的接种物，其中所述接种物进一步包含与具有NRRL保藏号50152的大刀镰孢分离物FcRed1的菌丝体、菌丝和/或孢子不同的真菌的菌丝体、菌丝和/或孢子。
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