CN101914584B - 一种l-色氨酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L-色氨酸的生产方法，包括以下步骤：以谷氨酸棒杆菌为菌种，经初级培养后进行摇瓶培养得摇瓶液体菌种；以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为培养基的碳源及发酵流加糖；将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得L-色氨酸发酵液；将L-色氨酸发酵液进行提取、精制得L-色氨酸。本发明通过控制培养基组成及发酵条件，菌种产酸最高可达40g/L；利用玉米生产葡萄糖液，生产成本低；连续流加葡萄糖液，使培养基中葡萄糖的含量波动小，使发酵产酸水平盒糖酸转化率提高；提取精制工艺流程合理，L-色氨酸产品纯度可达99%以上，收率达75%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸的生产方法，具体涉及一种L-色氨酸的发酵生产方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸, 学名：β-吲哚基丙氨酸；英文名：Tryptophan；分子式为：C11H12N2O2 ，相对分子质量204.21，熔点289℃。其结构式如下：
L-色氨酸为白色或微黄色结晶或结晶性粉末；无臭味微苦。水中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中不溶，在甲酸中易溶，在氢氧化钠溶液或稀盐酸中溶解。它广泛地存在于天然蛋白质中。L-色氨酸除在营养代谢中起重要作用外,还广泛用于医药、食品、饲料等方面。近年来,随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面应用的开拓,市场需求量不断增加。
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸。广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在生物体内，从L-色氨酸出发可合成5-羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅酶等激素和生理活性物质。这些激素和生理活性物质参与生物体特定的生命活动。其中吲哚乙酸是一种植物生长激素，5-羟基色胺是脊椎动物的一种神经递质，它在神经系统中的含量与神经的兴奋和抑制状态有密切关系，同时它也是一种血管收缩素。因此，色氨酸具有消除精神紧张、改善睡眠效果、预防和治疗糙皮病等功效，在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中容易严重缺乏的氨基酸，可用它来强化食品和做饲料添加剂，这对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。此外，L-色氨酸还有防霉、消毒以及阻止氧化的作用，可以作为鱼类保鲜剂。
L-色氨酸的生产方法有化学合成法、蛋白质水解法、酶促转化法和发酵法。由于化学合成法和蛋白质水解法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题，在生产中极少使用；酶促转化法成本较高，污水量大，但由于产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易等优点，现在还有厂家在使用。发酵法生产L-色氨酸由于其产率高、周期短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产L-色氨酸的重要方法。以谷氨酸棒杆菌为发酵菌种制备L-色氨酸具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，谷氨酸棒杆菌成为L-色氨酸发酵工业最重要的生产菌。20世纪30年代日本就大规模开展了发酵法生产L-色氨酸研究，主要侧重于传统的诱变育种技术改变菌种特性，提高L-色氨酸产量，最高达7.2g/L，近几年对L-色氨酸发酵研究较少。而我国对氨基酸系列的化合物的研究始于70年代，随着L-色氨酸市场需求激增，越来越多的科研机构对L-色氨酸发酵进行了全面深入的研究。据调查显示，目前国内L-色氨酸发酵水平与世界先进水平有很大差距。主要原因是育种技术、生产工艺落后，菌种产酸水平不高；发酵周期长、转化率及提取综合收率低。因此，开发高产L-色氨酸工程菌和高效生产工艺是十分必要的。
发明内容
本发明针对上述生产L-色氨酸技术的不足，提供了一种产酸水平高、生产成本低的L-色氨酸的生产方法。
本发明是通过以下措施实现的：
一种L-色氨酸的生产方法，其特征是至少包括以下步骤：
（1） 以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为菌种，经初级培养后进行摇瓶培养得摇瓶液体菌种；
（2） 以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为培养基的碳源及发酵流加糖；
（3） 将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得L-色氨酸发酵液；
（4） 将L-色氨酸发酵液进行提取、精制得L-色氨酸。
上述摇瓶液体菌种培养至少包括以下步骤：
a. 以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为母种，按0.1%-0.2%（v/v）的接种量接入初级培养基中，在30℃-33℃下静置培养20-24h得初级菌种；初级培养基组分按重量比计为：葡萄糖1%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉2%，琼脂2％，水94.7%， pH7.0-7.2；
b. 将得到的初级菌种培养基液接种到摇瓶培养基中，在往复式摇床上培养，得OD600为0.6-0.8的摇瓶液体菌种；接种量为0.1%-0.2%( v/v)，摇床转速为120-140转/分，培养温度为30℃-33℃，培养时间为16-18h，摇瓶培养基组成：葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉1%，豆浓2％，水94.7%， pH 7.0-7.2。
上述葡萄糖液的制备至少包括以下步骤：
a. 将玉米放入浸泡罐中，在50-55℃下浸泡3-5h；
b. 浸泡后将玉米磨成乳浆；
c. 将玉米乳浆用液化喷射器在105℃-108℃条件下高温液化，然后在维持罐中保温维持90－120min得液化液；
d. 将步骤c后的液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为80-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55-65℃，pH为3.8-4.5，糖化时间为33-36h； 所用糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶；
e. 糖化后用压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度为60℃-70℃，压滤机压力为0.15MPa-0.3MPa；
上述葡萄糖液制备过程中，步骤b所得乳浆的细度为30-35目，浓度为18°Bé-20°Bé；步骤c喷射液化器压力0.25-0.45MPa；步骤e所用压滤机为板框压滤机。
上述制备L-色氨酸发酵液至少包括以下步骤：
a. 按0.1-0.2%(v/v)的接种量将摇瓶液体菌种接种到二级菌种培养基上，在30℃-33℃、pH6-8、压力0.03－0.1MPa的条件下通风培养14h－16h，得OD600为0.7-1.0的二级菌种，通风比为1：0.2－0.4v/v·min；二级菌种培养基成分：葡萄糖5%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1，豆浓1.5%，水93.2%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌；
b. 按10-15%(v/v)的接种量将二级菌种接种到发酵培养基上进行通风发酵培养，同时以连续流加方式添加葡萄糖液，使葡萄糖液的浓度始终保持在4-5wt%，发酵停止后得L-色氨酸发酵液；发酵培养条件：温度30℃-33℃、pH 6－8、压力0.03 MPa－0.1MPa、通风比1：0.2－0.8 v/v·min、发酵时间38h－40h；发酵培养基成分：葡萄糖15%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，玉米浆1.0%，水83.7%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌。
上述L-色氨酸发酵液制备过程中，步骤a与步骤b中通入的空气为经0.25－0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气，无菌空气压缩、过滤所用的设备为通用的空气压缩机和空气净化系统；步骤b中，葡萄糖液的浓度为500-700g/L，葡萄糖液经118℃、10min蒸汽灭菌后加入。
上述L-色氨酸发酵液提取、精制至少包括以下步骤：
a. 将L-色氨酸发酵液加热至60℃-70℃，用酸调pH值为2-4，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色，得滤清液；
b. 将上述滤清液流入离子交换柱进行吸附，然后用洗脱剂进行洗脱，得L-色氨酸高浓液；
c. L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩、减压蒸发浓缩后，得到L-色氨酸料液；
d. L-色氨酸料液在0℃-4℃、pH 5.8-6.0下结晶10h-12h，然后经离心分离得初级L-色氨酸晶体；
e. 将初级L-色氨酸晶体重新溶解，配成30g/L-50g/L的L-色氨酸溶液，然后将L-色氨酸溶液用超滤膜脱色除杂、搅拌降温结晶、离心分离、干燥得L-色氨酸产品。
上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤a中，所用酸为工业硫酸或工业盐酸；微滤膜孔径为氧化锆膜、氧化铝膜或陶瓷膜，孔径0.15-0.35um，优选孔径为0.22um的陶瓷膜，微滤条件：温度60℃-70℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，发酵液流速60 L/m2·h-150L/m2·h；超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，截留分子量为8-10万D，优选截留分子量为10万D的卷式膜，超滤条件：温度40℃-60℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，发酵液流速50 L/m2·h-100L/m2·h。微滤条件优选：温度60℃，压力0.25Mpa，发酵液流速100 L/m2·h-120L/m2·h；超滤条件优选：温度50℃，压力0.25Mpa，发酵液流速60-80L/m2·h。
上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤b中，离子交换柱中填充物为强酸性阳离子交换树脂，优选磺酸型的强酸性离子交换树脂或001×7强酸性阳离子交换树脂，吸附温度为25-35℃，滤清液流速为1.0-2.5v/v·min；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水或0.5-1.5mol/L氢氧化钠溶液，洗脱流速为0.5-1.5 v/v·min。优选条件：吸附温度为30℃，滤清液流速为1.5-2.0v/v·min；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水，洗脱流速为1.0-1.2v/v·min。
上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤c中，反渗透膜醋酸纤维素膜或聚酰胺复合膜（孔径大于5埃），截留分子量小于等于100，脱水浓缩条件：压力0.5-0.6MPa，温度50-60℃；减压蒸发浓缩条件：温度70-90℃，真空度-0.06??-0.1MPa。脱水浓缩条件优选：压力0.55MPa，温度55℃；减压蒸发浓缩条件优选：温度80℃，真空度-0.08MPa。
上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤e中，超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，截留分子量为4000-6000D，优选截留分子量为5000D的卷式膜，脱色除杂条件：温度40℃-60℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，流速50 L/m2.h-80L/m2.h；溶液脱色除杂后，降温至0℃-4℃结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在70℃-80℃、真空度-0.06 Mpa～-0.1 Mpa的条件下干燥2-4h，得L-色氨酸产品。优选的，超滤膜脱色除杂条件：温度60℃，压力0.3Mpa，流速60-70L/m2.h；溶液脱色除杂后，降温至0℃结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在75℃、真空度-0.08 Mpa的条件下干燥2-4h，得L-色氨酸产品。
本发明的优点是：①以普通的谷氨酸棒杆菌为发酵菌种，通过控制培养基组成及发酵条件，使菌种产酸水平大幅度提高，最高可达40g/L；②利用玉米生产葡萄糖液工艺合理，产品质量稳定，生产成本低；③连续流加葡萄糖液，使培养基中葡萄糖的含量波动小，能够控制在最佳的含量，利于微生物的生长和发酵产物的生成，使发酵产酸水平盒糖酸转化率提高；④提取精制工艺流程合理，L-色氨酸产品纯度可达99%以上，收率达75%以上。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，所述接种量均为体积比接种量。
本发明实施例所用的培养基组成如下：
初级培养基组分按重量比计为：葡萄糖1%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉2%，琼脂2％，水94.7%， pH7.0-7.2。
摇瓶培养基组成按重量比计：葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉1%，豆浓2％，水94.7%， pH 7.0-7.2。
二级菌种培养基成分按重量比计：葡萄糖5%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1，豆浓1.5%，水93.2%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌。
发酵培养基成分按重量比计：葡萄糖15%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，玉米浆1.0%，水83.7%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌。
实施例1
1、摇瓶液体菌种培养：
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.1%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在32℃条件下静置培养24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0.1%，转速120转/分，温度32℃，时间周期18h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.68。
2、葡萄糖液生产：
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间4h，维持温度50℃；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为30目，浓度达18 °Bé；
③将玉米乳浆用液化喷射器在105℃条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持120min得液化液，喷射液化器压力为0.25MPa；
④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为80-100单位/g纯淀粉，糖化温度保持为60℃，pH为3.8，糖化周期36h；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度70℃，压力0.25MPa，得浓度为250-350g/L的葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。
3、L-色氨酸发酵液制取：
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至33℃后接入摇瓶液体菌种，接种量为0.1%，同时将经过0.25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风比1：0.3v/V.min，pH6.8，压力0.05MPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.8；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至33℃后接入二级菌种进行通风发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118℃、10min蒸汽灭菌后的600g/L的葡萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0.5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液，接种量为10%，通风比为1：0.5v/V.min，pH 6.8（通入液氨控制PH值），压力0.05MPa，发酵38h，产酸达到38.6g/L、转化率18.2％。
4、L-色氨酸提取精制：
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70℃，用工业硫酸调PH值为4，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0.22um的陶瓷膜，微滤控制温度70℃，压力0.25Mpa，流速90 L/m2.h；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤滤控制温度50℃，压力0.30Mpa，流速80L/m2.h；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001×7强酸性阳离子交换树脂，在30℃流速为1.8v/V·min进行吸附，吸附后用2.5mol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1.0v/V·min，得到L-色氨酸高浓液。
③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩（反渗透膜为截留分子量≤100D的醋酸纤维素膜，压力0.5MPa，温度50℃）、减压蒸发浓缩后（温度80℃，真空度-0.08MPa），得到L-色氨酸料液。
④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至0℃、调PH为6.0、时间10h后获晶体，将结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到40g/L的L-色氨酸溶液使其充分溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结晶罐搅伴降温至0℃，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量为5000D的卷式膜，温度60℃，压力0.30Mpa，流速80L/m2.h；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度80℃、真空度-0.08Mpa的条件下进行真空干燥机烘干3小时，最后粉碎、包装,检测产品纯度为99.2%获合格L-色氨酸产品，收率77.2%。
实施例2
1、摇瓶液体菌种培养：
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.2%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在30-33℃条件下静置培养20-24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0.15%，转速140转/分，温度30-33℃，时间周期16h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.6。
2、葡萄糖液生产：
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间3-5h ，浸泡温度55℃；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为32-35目，浓度达20°Bé；
③将玉米乳浆用液化喷射器在108℃条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持90min得液化液，喷射液化器压力为0.45MPa；
④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为100-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55℃，pH为4.5，糖化周期33h；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度60℃，压力0.3MPa，得浓度为300-350g/L的葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。
3、L-色氨酸发酵液制取：
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至30-33℃后接入摇瓶液体菌种，接种量为0.2%，同时将经过0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风比1：0.4v/V.min，pH8，压力0.03MPa，培养14h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.7；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至30-33℃后接入二级菌种进行通风发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118℃、10min蒸汽灭菌后的500g/L的葡萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0.5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液，接种量为15%，通风比为1：0.8v/V.min，pH 6（通入液氨控制PH值），压力0.1MPa，发酵40h，产酸达到39.2g/L、转化率18.9％。
4、L-色氨酸提取精制：
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60℃，用工业盐酸调PH值为2，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0.15-0.2um的氧化锆膜，微滤控制温度60℃，压力0.35Mpa，流速150 L/m2.h；所用超滤膜为截留分子量为8万D的中空纤维膜，超滤滤控制温度60℃，压力0.20Mpa，流速50L/m2.h；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充磺酸型的强酸性离子交换树脂，在25℃流速为1.0v/V·min进行吸附，吸附后用2.0mol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1.5v/V·min，得到L-色氨酸高浓液。
③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩（反渗透膜为截留分子量≤100D的聚酰胺复合膜，孔径大于5埃，压力0.6MPa，温度60℃）、减压蒸发浓缩后（温度90℃，真空度-0.06MPa），得到L-色氨酸料液。
④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至4℃、调PH为5.8、时间12h后获晶体，将结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到30g/L的L-色氨酸溶液使其充分溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结晶罐搅伴降温至4℃，结晶时间10h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量为4000D的卷式膜，温度40℃，压力0.2Mpa，流速50L/m2.h；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度70℃、真空度-0.06Mpa的条件下进行真空干燥机烘干4小时，最后粉碎、包装,检测产品纯度为99.3%获合格L-色氨酸产品，收率77.8%。
实施例3
1、摇瓶液体菌种培养：
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.15%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在30-33℃条件下静置培养20-24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0.2%，转速130转/分，温度30-33℃，时间周期16h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.8。
2、葡萄糖液生产：
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间3-5h ，浸泡温度53℃；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为30-32目，浓度达19°Bé；
③将玉米乳浆用液化喷射器在105℃条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持110min得液化液，喷射液化器压力为0.3MPa；
④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为120单位/g纯淀粉，糖化温度为65℃，pH为4.0，糖化周期36h；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度65℃，压力0.15MPa，得浓度为330g/L的葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。
3、L-色氨酸发酵液制取：
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至30-33℃后接入摇瓶液体菌种，接种量为0.15%，同时将经过0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风比1：0.2v/V.min，pH6，压力0.1MPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为1.0；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至30-33℃后接入二级菌种进行通风发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118℃、10min蒸汽灭菌后的700g/L的葡萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0.5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液，接种量为12%，通风比为1：0.2v/V.min，pH 8（通入液氨控制PH值），压力0.03MPa，发酵40h，产酸达到39.5g/L、转化率19.0％。
4、L-色氨酸提取精制：
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至65℃，用工业盐酸调PH值为3，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0.3-0.35um的氧化铝膜，微滤控制温度60℃，压力0.2Mpa，流速60 L/m2.h；所用超滤膜为截留分子量为10万D的中空纤维膜，超滤滤控制温度40℃，压力0.35Mpa，流速100L/m2.h；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充磺酸型的强酸性离子交换树脂，在35℃流速为2.5v/V·min进行吸附，吸附后用0.5mol/L的氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱流速控制在0.5v/V·min，得到L-色氨酸高浓液。
③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩（反渗透膜为截留分子量≤100D的醋酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，压力0.55MPa，温度55℃）、减压蒸发浓缩后（温度70℃，真空度-0.1MPa），得到L-色氨酸料液。
④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至2℃、调PH为5.8、时间12h后获晶体，将结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到50g/L的L-色氨酸溶液使其充分溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结晶罐搅伴降温至0℃，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量为6000D的卷式膜，温度50℃，压力0.35Mpa，流速60L/m2.h；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度75℃、真空度-0.1Mpa的条件下进行真空干燥机烘干2小时，最后粉碎、包装,检测产品纯度为99.1%获合格L-色氨酸产品，收率76.9%。
实施例4
1、摇瓶液体菌种培养：
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.2%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在32℃条件下静置培养24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养，接种量为0.15%，转速140转/分，温度32℃，时间周期18h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.68。
2、葡萄糖液生产：同实施例1。
3、L-色氨酸发酵液制取：同实施例3。
4、L-色氨酸提取精制：
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70℃，用工业硫酸调PH值为4，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0.22um的陶瓷膜，微滤控制温度60℃，压力0.25Mpa，流速120 L/m2.h；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤滤控制温度50℃，压力0.25Mpa，流速60L/m2.h；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001×7强酸性阳离子交换树脂，在30℃流速为1.5v/V·min进行吸附，吸附后用3.0mol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1.2v/V·min，得到L-色氨酸高浓液。
③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩（反渗透膜为截留分子量≤100D的醋酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，压力0.55MPa，温度55℃）、减压蒸发浓缩后（温度80℃，真空度-0.08MPa），得到L-色氨酸料液。
④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至0℃、调PH为6.0、时间10h后获晶体，将结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到40g/L的L-色氨酸溶液使其充分溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结晶罐搅伴降温至0℃，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量为5000D的卷式膜，温度60℃，压力0.30Mpa，流速70L/m2.h；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度75℃、真空度-0.08Mpa的条件下进行真空干燥机烘干3小时，最后粉碎、包装,检测产品纯度为99.7%获合格L-色氨酸产品，收率78.9%。
实施例5
1、摇瓶液体菌种培养：同实施例2。
2、葡萄糖液生产：同实施例2。
3、L-色氨酸发酵液制取：同实施例2。
4、L-色氨酸提取精制：
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70℃，用工业硫酸调PH值为4，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0.22um的陶瓷膜，微滤控制温度60℃，压力0.25Mpa，流速100 L/m2.h；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤滤控制温度50℃，压力0.25Mpa，流速60L/m2.h；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001×7强酸性阳离子交换树脂，在30℃流速为2.0v/v·min进行吸附，吸附后用1.5mol/L的氢氧化钠水溶液进行洗脱，洗脱流速控制在1.2v/V·min，得到L-色氨酸高浓液。
其他，同实施例2。 所得L-色氨酸产品纯度为99.5%，收率79.5%。
实施例6
1、摇瓶液体菌种培养：同实施例3。
2、葡萄糖液生产：同实施例3。
3、L-色氨酸发酵液制取：
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至33℃后接入摇瓶液体菌种，接种量为0.15%，同时将经过0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风比1：0.5v/V.min，pH6.8，压力0.05MPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均匀，粗壮，无污染，用752分光光度计测量（量程：10mm，波长：600nm）得OD为0.9；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至32℃后接入二级菌种进行通风发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118℃、10min蒸汽灭菌后的700g/L的葡萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，发酵停止后得L-色氨酸发酵液，接种量为15%，通风比为1：0.6v/V.min，pH 6.8（通入液氨控制PH值），压力0.05MPa，发酵40h，产酸达到40.0g/L、转化率19.8％。
4、L-色氨酸提取精制：同实施例3，所得L-色氨酸产品纯度为99.5%，收率78.3%。
Claims (6)
1.一种L-色氨酸的生产方法，其特征是至少包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为菌种，经初级培养后进行摇瓶培养得摇瓶液体菌种，至少包括以下步骤：
a.以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为母种，按0.1%-0.2%（v/v）的接种量接入初级培养基中，在30℃-33℃下静置培养20-24h得初级菌种；初级培养基组分按重量比计为：葡萄糖1%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉2%，琼脂2％，水94.7%， pH7.0-7.2；
b.将得到的初级菌种培养基液接种到摇瓶培养基中，在往复式摇床上培养，得OD600为0.6-0.8的摇瓶液体菌种；接种量为0.1%-0.2%( v/v)，摇床转速为120-140转/分，培养温度为30℃-33℃，培养时间为16-18h，摇瓶培养基组成：葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，酵母浸粉1%，豆浓2％，水94.7%， pH 7.0-7.2；
（2）以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为培养基的碳源及发酵流加糖；
（3）将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得L-色氨酸发酵液，至少包括以下步骤：
a.按0.1-0.2%(v/v)的接种量将摇瓶液体菌种接种到二级菌种培养基上，在30℃-33℃、pH6-8、压力0.03－0.1MPa的条件下通风培养14h－16h，得OD600为0.7-1.0的二级菌种，通风比为1：0.2－0.4v/v·min；二级菌种培养基成分：葡萄糖5%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1，豆浓1.5%，水93.2%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌；
b.按10-15%(v/v)的接种量将二级菌种接种到发酵培养基上进行通风发酵培养，同时以连续流加方式添加葡萄糖液，使葡萄糖液的浓度始终保持在4-5wt%，发酵停止后得L-色氨酸发酵液；发酵培养条件：温度30℃-33℃、pH 6－8、压力0.03 MPa－0.1MPa、通风比1：0.2－0.8 v/v·min、发酵时间38h－40h；发酵培养基成分：葡萄糖15%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，玉米浆1.0%，水83.7%，pH 7.0-7.2，121℃-125℃、15min蒸汽灭菌；
（4）将L-色氨酸发酵液进行提取、精制得L-色氨酸，至少包括以下步骤：
a.将L-色氨酸发酵液加热至60℃-70℃，用酸调pH值为2-4，经微滤膜除菌、超滤膜除杂脱色，得滤清液；所用酸为工业硫酸或工业盐酸；微滤膜孔径为0.15-0.35μm，微滤条件：温度60℃-70℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，发酵液流速60 L/m2·h-150L/m2·h；超滤膜截留分子量为8-10万D，超滤条件：温度40℃-60℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，发酵液流速50 L/m2·h-100L/m2·h；
b.将上述滤清液流入离子交换柱进行吸附，然后用洗脱剂进行洗脱，得L-色氨酸高浓液；离子交换柱中填充物为强酸性阳离子交换树脂， 吸附温度为25-35℃，滤清液流速为1.0-2.5v/v·min；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水或0.5-1.5mol/L氢氧化钠溶液，洗脱流速为0.5-1.5 v/v·min；
c.L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩、减压蒸发浓缩后，得到L-色氨酸料液；反渗透膜截留分子量小于等于100D，脱水浓缩条件：压力0.5-0.6MPa，温度50-60℃；减压蒸发浓缩条件：温度70-90℃，真空度-0.06～-0.1MPa；
d.L-色氨酸料液在0℃-4℃、pH 5.8-6.0下结晶10h-12h，然后经离心分离得初级L-色氨酸晶体；
e.将初级L-色氨酸晶体重新溶解，配成30g/L-50g/L的L-色氨酸溶液，然后将L-色氨酸溶液用超滤膜脱色除杂，溶液脱色除杂后，降温至0℃-4℃结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在70℃-80℃、真空度-0.06 Mpa～-0.1 Mpa的条件下干燥2-4h，得L-色氨酸产品；超滤膜截留分子量为4000-6000D，脱色除杂条件：温度40℃-60℃，压力0.2MPa-0.35Mpa，流速50-80L/m2·h。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是葡萄糖液的制备至少包括以下步骤：
a.将玉米放入浸泡罐中，在50-55℃下浸泡3-5h；
b.浸泡后将玉米磨成乳浆；
c.将玉米乳浆用液化喷射器在105℃-108℃条件下高温液化，然后在维持罐中保温维持90－120min得液化液；
d.将步骤c后的液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为80-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55-65℃，pH为3.8-4.5，糖化时间为33-36h；
e.糖化后用压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度为60℃-70℃，压滤机压力为0.15MPa-0.3MPa。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征是：葡萄糖液制备过程中，步骤b所得乳浆的细度为30-35目，浓度为18°Bé-20°Bé；步骤c喷射液化器压力0.25-0.45MPa；步骤e所用压滤机为板框压滤机。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是：L-色氨酸发酵液制备过程中，步骤a与步骤b中通入的空气为经0.25－0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气；步骤b中，葡萄糖液的浓度为500-700g/L，葡萄糖液经118℃、10min蒸汽灭菌后加入。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是：L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤a中，微滤膜为氧化锆膜、氧化铝膜或陶瓷膜，微滤条件：温度60℃，压力0.25Mpa，发酵液流速100 L/m2·h-120L/m2·h；超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，超滤条件：温度50℃，压力0.25Mpa，发酵液流速60-80L/m2·h；
步骤b中，离子交换柱中填充物为磺酸型的强酸性离子交换树脂，吸附温度为30℃，滤清液流速为1.5-2.0v/v·min；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水，洗脱流速为1.0-1.2v/v·min；
步骤c中，反渗透膜为醋酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件：压力0.55MPa，温度55℃；减压蒸发浓缩条件：温度80℃，真空度-0.08MPa；
步骤e中，超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，脱色除杂条件：温度60℃，压力0.3Mpa，流速60-70L/m2·h；溶液脱色除杂后，降温至0℃结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在75℃、真空度-0.08 Mpa的条件下干燥2-4h，得L-色氨酸产品。
6.根据权利要求1或5所述的生产方法，其特征是：步骤a中，微滤膜为孔径为0.22μm的陶瓷膜，超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜；步骤b中，离子交换柱中填充物为001×7强酸性阳离子交换树脂；步骤e中，超滤膜为截留分子量为5000D的卷式膜。
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