CN101914536B - 靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶a的锁核酸核酶与应用 - Google Patents
靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶a的锁核酸核酶与应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：1所示，所述核苷酸序列中，位于中部的15个脱氧核苷酸组成催化结构域，位于催化结构域左侧的8个核苷酸组成第一底物识别结构域，位于催化结构域右侧的8个核苷酸组成第二底物识别结构域，第一底物识别结构域和第二底物识别结构域均含有两个锁核酸tL。所述靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶可在制备治疗前列腺癌的药中应用。
Description
技术领域
本发明涉及靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A(简称Aurora A，说明书的下述内容中，以“Aurora A”表示丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A)的核酶及其应用。
背景技术
前列腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，迄今尚无特效治疗手段，前列腺癌发生的分子机制尚未完全明了，但近年来的研究发现，前列腺癌的发生发展与Aurora A的异常具有密切相关性。Aurora A基因定位于人染色体20q13，该区域在人类恶性肿瘤中经常出现扩增，因此基因治疗值得探索。
本专利申请的发明人曾设计合成了针对Aurora A的脱氧核酶DNAzyme2〔DNAzyme2的核苷酸序列见Cancer Gene Ther.200815(8)：518〕，实验表明，所述DNAzyme2能有效抑制前列腺癌细胞中Aurora A的表达，并抑制前列腺癌细胞生长〔见Cancer Gene Ther.200815(8)：517-525〕。但为了提高前列腺癌的治愈率，造福于人类，有必要获得更多的针对AuroraA的核酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶(简称“Aurora A-LNAzyme”，说明书的下述内容中，以“Aurora A-LNAzyme”表示靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶)，以便开发出疗效更好的治疗前列腺癌的药物。
本发明所述Aurora A-LNAzyme，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。所述核苷酸序列中，位于中部的15个脱氧核苷酸ggctagctacaacga组成催化结构域，位于催化结构域左侧的8个核苷酸tLtLaacagg组成第一底物识别结构域，位于催化结构域右侧的8个核苷酸cctLgaaatL组成第二底物识别结构域，第一底物识别结构域和第二底物识别结构域均含有两个锁核酸tL。
本发明所述Aurora A-LNAzyme，采用固相亚磷酰胺三酯法在DNA自动合成仪上合成。
实验证明：本发明所述Aurora A-LNAzyme抑制了Aurora A在前列腺癌细胞中的表达；明显抑制无胸腺小鼠体内前列腺癌移植瘤的生长，抑瘤率可达61％。因此，本发明所述AuroraA-LNAzyme可在制备治疗前列腺癌的药中应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明设计和合成了一种新型的靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶，为前列腺癌的治疗提供了新药品。
2、实验表明，本发明所述Aurora A-LNAzyme能抑制Aurora A在前列腺癌细胞中的表达；能明显抑制无胸腺小鼠体内前列腺癌移植瘤的生长，与DNAzyme2相比，对肿瘤生长的抑制能力更强，血清半衰期更长，可望成为更优的高效、特异、稳定的前列腺癌抑制剂。
附图说明
图1是Aurora A的电泳图和核酶对Aurora A体外切割的电泳图，图中，1为Aurora A的电泳图(405bp)；2为经对照核酶处理的Aurora A的电泳图，未见切割条带；3为经AuroraA-LNAzyme处理的Aurora A的电泳图，可见293bp和112bp两条切割条带。
图2是Aurora A在前列腺癌细胞PC3中所表达蛋白的电泳图，图中，1为Aurora A在未转染核酶的前列腺癌细胞PC3中所表达蛋白的电泳图；2为Aurora A在转染对照核酶的前列腺癌细胞PC3中所表达蛋白的电泳图；3为Aurora A在转染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌细胞PC3中所表达蛋白的电泳图；β-actin为Western blot的内参照，图中显示其在1、2、3中表达水平一致，说明Aurora A条带具有定量的可比性。
图3是流式细胞仪检测的细胞周期分布图，图中，1为对照核酶导入前列腺癌细胞PC3的周期分布图，实验表明，处理12h，24h，48h，前列腺癌细胞PC3的周期分布相似，图中为处理48h时前列腺癌细胞PC3的周期分布；2为Aurora A-LNAzyme导入前列腺癌细胞PC3处理12h的前列腺癌细胞PC3的周期分布图，图中显示G2/M期细胞明显增多；3为Aurora A-LNAzyme导入前列腺癌细胞PC3处理24h的前列腺癌细胞PC3的周期分布图，图中显示G2/M期细胞明显增多；4为Aurora A-LNAzyme导入前列腺癌细胞PC3处理48h的前列腺癌细胞PC3的周期分布图，图中显示G2/M期细胞明显增多，同时出现明显的凋亡峰(SubG1，箭头所指)。
具体实施方式
实施例1：Aurora A-LNAzyme设计与合成
Aurora A-LNAzyme设计：引入锁核酸，对本专利申请发明人曾设计合成的脱氧核酶DNAzyme2进行修饰，设计成了本发明所述的Aurora A-LNAzyme。本发明所述Aurora A-LNAzyme的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述核苷酸序列中，组成第一底物识别结构域、催化结构域和第二底物识别结构域的核苷酸及其排列如下：
第一底物识别结构域 催化结构域 第二底物识别结构域
5’tLtLaacagg ggctagctacaacga cctLgaaatL3’
为了验证本发明所述Aurora A-LNAzyme的效果，还设计了对照核酶(Control)，对照核酶的核苷酸序列及其排列如下：
第一底物识别结构域 催化结构域 第二底物识别结构域
5’tLtLaacagg ggctaactacaacga cctLgaaatL3’
对照核酶与Aurora A-LNAzyme的不同之处是催化结构域中的第6个核苷酸不同，即Aurora A-LNAzyme催化结构域中的第6个核苷酸是“g”，而对照核酶催化结构域中的第6个核苷酸是“a”。
本发明所述Aurora A-LNAzyme和对照核酶均采用固相亚磷酰胺三酯法(参见《核酸：结构.功能与合成下册》，王德宝，祁国荣主编，科学出版社，1987.6)，在DNA自动合成仪上合成。自90年代起，国内外有关核苷酸序列的合成均已专业化、商品化。因此，将所设计的Aurora A-LNAzyme和对照核酶交由有关专业公司合成。本发明的Aurora A-LNAzyme和对照核酶交由美国sigma公司合成。
实施例2：Aurora A-LNAzyme体外切割Aurora A
1、试剂和材料
RT-PCR试剂盒：为Qiagen LongRange 2-step RT-PCR Kit(德国Qiagen公司)；
PC3、LNCaP和Du145前列腺癌细胞：购自美国ATCC；
质粒pcDNA3.1(+)：购自美国Invitrogen公司；
EcoRI酶，XhoI酶和T4DNA连接酶：购自宝生物公司；
Aurora A-LNAzyme：实施例1设计与合成，用生理盐水配制成50μM/L的溶液备用；
对照核酶：实施例1设计与合成，用生理盐水配制成50μM/L的溶液备用；
T7/SP6体外转录试剂盒：购自美国Roche公司；
地高辛化学发光法检测试剂盒：购自美国Roche公司；
甲酰胺：购自美国Sigma公司；
溴酚蓝：购自美国Sigma公司；
EDTA：购自美国Sigma公司；
聚丙烯酰胺：购自美国Sigma公司。
2、实验方法
(1)克隆Aurora A cDNA部分片段
从基因文库(进入号AF011468)中获取Aurora A的编码序列，用RT-PCR克隆Aurora A保守片断。分别提取三个前列腺癌细胞PC3、LNCaP和Du145的总RNA，然后以相同比例合并，以其作为模板，合成第一条cDNA链，再以所述cDNA为模板进行PCR扩增：在95℃预变性6分钟后，进入循环扩增阶段(94℃，1min；58℃，1min；70℃，90s)，循环34次。引物序列设计如下：上游引物5‘-GCGAATTCC ATCATGGACCGATCTAA-3’，带有EcoRI酶切位点及二个保护碱基；下游引物5’-GCCTCGAGTTCAGGTGCCGATGGCAG-3’，带有XhoI酶切位点及二个保护碱基。PCR扩增后得到长度为341bp的PCR产物(见SEQ ID NO：2)，其经凝胶电泳纯化回收后，经EcoRI和XhoI酶切，并由T4DNA连接酶催化，连接到质粒pcDNA3.1(+)的EcoRI和XhoI酶切位点之间，形成重组质粒pcDNA3-Aurora A-1。
(2)Aurora A的体外切割
用XhoI酶切重组质粒pcDNA3-Aurora A-1，使之线型化。按T7/SP6体外转录试剂盒说明书的要求，用T7/SP6体外转录试剂盒合成地高辛-UTP标记的Aurora A，此地高辛-UTP标记的Aurora A由405个核苷酸构成(见SEQ ID NO：3)，其中核酶切点位于SEQ ID NO3的112位碱基a和113位碱基c之间。将地高辛-UTP标记的Aurora A和Aurora A-LNAzyme以1∶100的摩尔比加到20μl反应缓冲液(50mmol/L Tris-Hcl，pH7.2，15mM Mgcl2，0.01％SDS)中，40℃孵育2小时后，加质量浓度96％的甲酰胺、质量浓度0.1％的溴酚蓝和20mmol/L EDTA中止反应。上述反应的反应产物在质量浓度50％的甲酰胺中变性8分钟，置于冰上冷却，然后在质量浓度8％的聚丙烯酰胺凝胶(含8mol/l尿素)，500V，电泳1.5h。
电泳结束后，按地高辛化学发光法检测试剂盒说明书的要求，用地高辛化学发光法检测切割条带。
采用上述方法用对照核酶体外切割Aurora A，并用地高辛化学发光法检测试剂盒检测切割条带。
3、实验结果
地高辛化学发光法检测切割条带的结果见图1，图1显示，本发明所述Aurora A-LNAzyme能酶切约80％的Aurora A，对照核酶不能切割Aurora A。
实施例3：Aurora A-LNAzyme转染前列腺癌细胞PC3
1、试剂、材料和器材
FuGENE6，购自美国Roche公司；
Aurora A-LNAzyme：实施例1设计与合成，用生理盐水配制成50μM/L的溶液备用；
对照核酶：实施例1设计与合成，用生理盐水配制成50μM/L的溶液备用；
前列腺癌细胞PC3：购自美国ATCC；
Coulter流式细胞仪，购自Beckman公司；
数据分析软件ModFitLT 2.0，美国Verity Software House产品。
2、实验方法
常规培养前列腺癌细胞PC3，当前列腺癌细胞PC370％融合以后，通过FuGENE6按照说明书要求分别将浓度300nmol/L的Aurora A-LNAzyme液、浓度300nmol/L的对照核酶液转染到前列腺癌细胞PC3中，在转染24小时和48小时后分别收集上述被转染Aurora A-LNAzyme、对照核酶的前列腺癌细胞PC3，然后用常规Western印迹方法分别检测未转然核酶的前列腺癌细胞PC3中的Aurora A蛋白，转染了Aurora A-LNAzyme和对照核酶的前列腺癌细胞PC3中的AuroraA蛋白。
为测定前列腺癌细胞PC3中Aurora A表达水平对细胞周期进程的影响，使用流式细胞术测定细胞周期分布，测定操作：通过FuGENE6按照说明书要求分别将浓度300nmol/L的AuroraA-LNAzyme液、浓度300nmol/L的对照核酶液转染到前列腺癌细胞PC3中，在转染(处理)12、24、48小时后分别收集被转染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌细胞PC3与被转染对照核酶的前列腺癌细胞PC3，然后分别用0.1M的PBS冲洗、用含0.05mg/L碘化丙啶的Krishan缓冲液(0.1％sodium citrate，0.2mg ml_1RNAase，0.3％NP40)终止反应，在4℃孵育30分钟，继后用Coulter流式细胞仪进行检测分析，用ModFitLT 2.0软件进行数据分析。
3、实验结果
Western印迹方法检测结果见图2，图2显示，转染对照核酶的前列腺癌细胞PC3中Aurora A蛋白的表达水平与未转染对照核酶的前列腺癌细胞PC3中Aurora A蛋白的表达水平相同；转染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌细胞PC3与未转染Aurora A-LNAzyme的前列腺癌细胞PC3相比，所含Aurora A蛋白明显减少。上述检测结果表明，本发明所述Aurora A-LNAzyme抑制了AuroraA在前列腺癌细胞中的表达。
流式细胞术检测结果见图3，图3显示，在Aurora A-LNAzyme处理组的细胞中，出现于G2-M期的细胞百分率在12小时增加到约18.23％，24小时为28.02％，48小时为39.56％。在对照核酶处理组的细胞中，G2-M期的细胞百分率在12小时、24小时、48小时每个时间点都接近于9.27％。相较于对照核酶处理组的细胞，Aurora A-LNAzyme处理组的细胞中有一部分处于细胞周期中的亚G1的细胞(18.33％)，提示凋亡细胞明显增加。上述检测结果表明，本发明所述AuroraA-LNAzyme介导的Aurora A表达受抑，会引起前列腺癌细胞PC3在G2-M期异常聚集直至最终凋亡。
实施例4：LNAzyme抑制小鼠前列腺癌移植瘤的生长
1、材料和实验动物
前列腺癌细胞PC3：购自美国ATCC；
Aurora A-LNAzyme：实施例1设计与合成；
对照核酶：实施例1设计与合成；
BALB/C裸鼠：四川大学动物实验中心提供。
2、实验方法
BALB/C雌性裸鼠12只，BALB/C雄性裸鼠12只，平均年龄5周，平均体重20g。所有裸鼠被分成三组，每组由四只雌性BALB/C裸鼠和四只雄性BALB/C裸鼠组成。第一组为生理盐水组，第二组为Aurora A-LNAzyme组，第三组为对照核酶组。
将1X107前列腺癌细胞PC3经皮下注射移植到各组的每只裸鼠。5周以后，肿瘤组织的体积增加到约65mm3用于后续实验。
第一组中的各只裸鼠每天接受10μl/只的生理盐水注射。第二组中的各只裸鼠每天通过瘤内多位点注射将Aurora A-LNAzyme液注入肿瘤组织，各只裸鼠每天的注射量为：8μg AuroraA-LNAzyme溶于10μl生理盐水形成的Aurora A-LNAzyme液。第三组中的各只裸鼠每天通过瘤内多位点注射将对照核酶液注入肿瘤组织，各只裸鼠每天的注射量为：8μg对照核酶溶于10μl生理盐水形成的对照核酶液。注射14天后处死每组裸鼠。测量各只裸鼠体重和肿瘤湿重及体积，数据以(平均数±标准差)表示。计算抑瘤率〔抑瘤率＝(生理盐水组瘤重-核酶处理组瘤重)/生理盐水组瘤重X100％〕，通过方差分析来进行统计学分析，P＜0.05视为有显著性差异。
3、实验结果
实验数据见表1。
表114天时裸鼠体重，移植瘤体积及重量(n＝8)
*Aurora A-LNAzyme组与生理盐水组和对照核酶组比较，P＜0.05
实验数据表明，本发明所述Aurora A-LNAzyme明显抑制了人前列腺癌在无胸腺小鼠体内的移植瘤的生长，而对照核酶并没有表现出抑制肿瘤生长的效果。
实施例5：Aurora A-LNAzyme与DNAzyme2的比较
1、血清半衰期比较
(1)Aurora A-LNAzyme血清半衰期测定
①试剂和仪器
酚、氯仿、聚丙酰胺变性凝胶：购自美国Sigma公司；
FH2408自动定标器：购自北京核仪器厂；
Aurora A-LNAzyme：实施例1设计与合成。
②测定方法
Aurora A-LNAzyme的32P标记参照文献[Sambrook J.Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2nd.New York：Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989]进行。降解反应如下：取每分钟脉冲数(counts per minute，cpm)为2×105的标记Aurora A-LNAzyme，20μl人血清，0.9nmol未标记Aurora A-LNAzyme，加水至总体积为100μl。混匀，置37℃水浴。分别于反应后第1h、2h、4h、8h、16h各取20μl样品，酚和氯仿抽提后，20％聚丙酰胺变性凝胶电泳，-20℃压片8h，在X线观片灯上切下对应条带凝胶，FH2408自动定标器计数CPM值，按下式计算Aurora A-LNAzyme的降解率，降解率＝降解条带CPM/(未降解条带CPM+降解条带CPM)×100％。
③测定结果
AuroraA-LNAzyme在16小时的降解率为12.3％。
(2)DNAzyme2血清半衰期测定
DNAzyme2的血清半衰期测定同上述方法，测定结果为：DNAzyme2血清半衰期为4小时。
2、抑瘤率的比较
Aurora A-LNAzyme的抑瘤率为61％(见实施例4)，DNAzyme2的抑瘤率为53％(见CancerGene Ther.200815(8)：523)。
上述数据表明，与DNAzyme2相比，本发明所述Aurora A-LANzyme对肿瘤生长的抑制能力更强，血清半衰期更长，因此Aurora A-LNAzyme可望成为更优的高效、特异、稳定的前列腺癌抑制剂。
Claims (2)
1.一种靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述核苷酸序列中，位于中部的15个脱氧核苷酸ggctagctacaacga组成催化结构域，位于催化结构域左侧的8个核苷酸tLtLaacagg组成第一底物识别结构域，位于催化结构域右侧的8个核苷酸cctLgaaatL组成第二底物识别结构域，第一底物识别结构域和第二底物识别结构域均含有两个锁核酸tL。
2.权利要求1所述靶向丝-苏氨酸蛋白激酶极光激酶A的锁核酸核酶在制备治疗前列腺癌的药中的应用。
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