CN101914509B - 有机磷降解酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了有机磷降解酶突变体及其编码基因和应用。本发明根据有机磷降解酶OPHC2的空间结构特征，通过计算机辅助分子设计，对原酶编码基因进行定点突变筛选得到三个有机磷降解酶突变体，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。与原酶相比，本发明有机磷降解酶突变体对乙基对硫磷降解比活性分别提高了2.45倍、2.56倍和4.51倍，其对乙基对硫磷的降解能力(k_cat/K_m值)分别是原酶的2.7倍、3.3倍和4.2倍。酶学性质分析表明，本发明有机磷降解酶突变体的酶学性质与原酶相比没有变化，均有很好的耐热性。

Description

有机磷降解酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及酶突变体，尤其涉及有机磷降解酶的突变体及其编码基因，本发明还涉及该有机磷降解酶突变体在降解有机磷农药中的应用，属于有机磷降解酶领域。

背景技术

有机磷农药是我国甚至全世界范围内使用最广泛的一类农药。目前，我国化学农药年产量为200多万吨，共600多种，其中常用品种约300多种，其中有机磷农药占70％以上。我国农药的生产既满足了国内农业生产的需要，又满足了世界农业生产的需求，为世界农业发展做出了很大的贡献。在我国，农药在农作物病虫害防控中年挽回经济损失3500亿元以上；在美国，杀线虫的使用使甜菜增产175％；在非洲加纳，可可的产量能够翻3倍，这也是归功于杀虫剂的使用(http://www.agri.gov.cn/gndt/t20100423_1472380.htm，2010)。

有机磷农药作为现代农业的一分子，常被作为杀虫剂或除草剂喷洒在各类农作物上，如蔬菜、果树、水稻、棉花等等，在农业生产中发挥了巨大的作用。然而，农药的残留问题普遍存在。同时，在杀虫剂中多数为高毒的有机磷农药，但农药的利用率只有10-20％，其残留进入土壤和水体，严重破坏了农田生态系统，危害了人民健康，还直接影响了农产品的销售和出口创汇。

鉴于农药对人及环境造成如此重大的损害，中国先后出台了各项政策。2007年1月1日，据农业部第322号公告，全面禁止甲胺磷、甲基对硫磷、久效磷、对硫磷和磷胺5种高毒有机磷农药。即使如此，由于长期的农药使用，有机磷农药的残留已经造成了环境的严重污染。在金银花、花生、蔬菜、水、空气中均能检测到有机磷农药残留(吕春红等，毛细管气相色谱法测定金银花中敌敌畏、甲基对硫磷和马拉硫磷的残留量，中国医药导报，2008，5，32～33；朱臻怡等，气相色谱法同时测定花生中12种有机磷农药残留量.化学分析计量，2009，18，32～34；闫贻洋等，蔬菜中农残分析方法及残留农药去除率的研究.应用化工，2009，38，1708～1716)。因此，禁用农药虽然能解决不再对环境施加压力的问题，但如何快速治理环境有机磷农药残留依然是现在人们最迫切的需求。

有研究表明，如果有机磷中的一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性，以对硫磷为例，将使其毒性降低100倍(Serdar，C.M.et al.，Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase.U.S.patent.December 1996.5，589，386)。有机磷降解酶(Organophosphorushydrolase，EC3.1.8.1)，也称为磷酸三酯酶，它是一种能够破坏有机磷农药分子上的磷酯键而使其脱毒的酶。有机磷化合物由于取代基的不同而不同，因此一种有机磷降解酶可以作用多种底物，具有一定的广谱性。通过基因工程的手段将有机磷水解酶应用于工业生产，是目前认为治理有机磷农药污染的最有效的方法。(虞云龙等，农药微生物降解的研究现状与发展策略，环境科学进展，1996，Vol.4，No.3，28～36)。

自有机磷水解酶发现以来，很多科学工作者都在致力于有机磷降解酶结构与功能关系的研究并取得了进展。不仅对有机磷降解酶催化机制进行了解析，也为基因工程和蛋白质工程提供了很多信息，为有机磷降解酶的分子改良工作提供了指导。目前研究的较为清楚的两类酶是：甲基对硫磷水解酶(MPH)和乙基对硫磷水解酶(OPH)，其中，MPH的最适降解底物是甲基对硫磷，而OPH的最适降解底物为乙基对硫磷。

对于MPH，从Pseudomonas sp.WBC-3中分离得到的甲基对硫磷水解酶(MPH)的三级结构获得了解析，它属于β-内酰胺酶家族，由331个氨基酸残基组成，其中前35个氨基酸残基是信号肽序列，采用等离子体质谱仪测定出其活性中心有两个Zn²⁺离子，晶体结构为同型二聚体(Dong Y.J et al.，Crystal Structure of Methyl Parathion Hydrolasefrom Pseudomonas sp.WBC-3.J Mol Biol 2005，353：655～663)。对于乙基对硫磷水解酶OPH，它是最早发现的有机磷水解酶，因此对它的研究已经非常的透彻，其三维结构也已获得解析。通过原子光谱分析发现，乙基对硫磷水解酶是双金属酶，活性中心也有两个Zn²⁺离子，可被Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺取代而不影响其催化能力。乙基对硫磷水解酶X-射线晶体衍射的三级结构研究显示其蛋白分子为轴向对称的二聚体，亚基间的作用力主要发生在A亚基的Ser61、Asp33和B亚基的Phe73、Arg52之间。每个亚基是一个扭曲的α/β桶结构，由8个β折叠形成一个桶状，以14个α螺旋侧向相连(Benning MM et al.，Three-dimensional structure of phosphotriesterase：an enzyme capable ofdetoxifying organophosphate nerve agents.Biochemistry 1994，33：15001～15007；Benning MM et al.Three-dimensional structure of thebinuclear metal center of phosphotriesterase.Biochemistry 1995，34：7973～7978；Benning MM et al.，High resolution X-ray structures ofdifferent metal-substituted forms of phosphotriesterase fromPseudomonas diminuta.Biochemistry 2001，40：2712～2722)。

随着人们对有机磷农药降解酶的分子结构的不断认识，以及蛋白质工程技术的发展，研究酶蛋白的分子结构并进行了分子改造，使其改变底物特异性，从而能对多种有机磷农药具有高效的降解效率。1998年，Shim等人利用定点突变技术对有机磷水解酶进行突变，获得了一个突变株M317A，对磷酸二脂键的催化能力比原酶高(Shim etal.，Hydrolysis of phosphodiesters through transformation of the bacterialphosphotriesterase.J Biol Chem 1998，273(28)：17445～17450)。2000年，Gopal S对OPH的活性中心点进行突变，获得的突变体L136Y对神经毒剂VX的催化能力得到提高(Gopal et al.，Mutagenesis oforganophosphorus hydrolase to enhance hydrolysis of the nerve agent VX.Biochemical and Biophysical Research Communications 2000，279：516～519)。

Wu Ningfeng等从农药污染的土壤中分离得到一株高效降解有机磷农药的细菌，经鉴定为假单胞假产碱菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)(此菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 1150)，同时，对此细菌产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离纯化及酶学性质的研究[Wu Ningfeng，Deng Minjie，et al：Isolation，purification and characterization of a neworganphosphorus hydrolase OPHC2.Chinese Science Bulletin，2004，49(3)：268-272]，并从中克隆了有机磷降解酶的编码基因[WuNingfeng，Deng Minjie，et al：Cloning and expression of ophc2，a neworganphosphorus hydrolase gene.Chinese Science Bulletin，2004，49(12)：1245-1249](编码基因的核苷酸序列已在GenBank中登录，登录号为AJ605330)。

OPHC2属于甲基对硫磷水解酶，其降解的最适底物为甲基对硫磷，对于乙基对硫磷的降解率较低。因此，研究OPHC2的空间结构，并通过计算机辅助设计和蛋白质工程技术，对OPHC2进行突变，期望能获得对乙基对硫磷降解活性更好的突变酶，可望为有效扩大有机磷降解酶OPHC2的底物特异性提供新的基因源。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服原有机磷降解酶(该基因在GenBank中的登录号为AJ605330)对乙基对硫磷降解率低的缺陷，对原有机磷降解酶基因进行突变，得到对乙基对硫磷降解活性有显著提高的突变酶，扩大其底物特异性。

本发明所要解决的另一技术问题是提供编码上述有机磷降解酶突变体的基因。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种有机磷降解酶突变体(OPHC2_A1-5)，其氨基酸序列为SEQID NO.2所示；

另外一种有机磷降解酶突变体(OPHC2_E6)，其氨基酸序列为SEQID NO.4；

又一种有机磷降解酶突变体(OPHC2_AE)，其氨基酸序列为SEQID NO.6所示；

编码上述三种有机磷降解酶突变体的基因也当然的在本发明的保护范畴之内；优选的：编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；编码SEQ ID NO.4所示氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；编码SEQ ID NO.6所示氨基酸的核苷酸序列为SEQID NO.5所示，

此外，含有上述核苷酸的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范畴之列。

本发明采用计算机辅助设计的组合活性位点饱和实验(Combinatorial Active-Site Saturation Test，CAST)构建突变体库，通过高通量筛选得到上述三种对乙基对硫磷降解活性更高的有机磷降解酶突变体，其主要步骤如下：

首先对有机磷降解酶OPHC2进行三维结构分析：以发表的来源于Pseudomonas sp.WBC-3的MPH晶体结构为模版，构建OPHC2三维结构，确定活性中心；然后依据OPHC2的空间结构特征，在活性中心附近酶与底物结合的口袋处设计了5个突变区域，这些区域突变后不会影响酶催化活性中心的结构。每个区域的突变都是一个突变体库，通过高通量筛选得到对乙基对硫磷降解活性更高的突变体，每个库至少要筛3000个克隆，这样能够95％覆盖要选的突变体；按照设计的突变位点设计引物，采用重叠延伸PCR技术构建突变体库，将构建好的突变体库首先通过挑选12个克隆子检测插入片段阳性率和测序以鉴定突变体库质量，然后用Genetics QPix2自动挑取克隆机器人从每个大平板上挑3840个菌，分别放置于10个384孔板中，再利用96针复制器将菌复制到96孔深孔板中培养，再通过96孔酶标板测定酶活性，并通过酶标仪读数，以确定目标突变体。筛选出的好的突变体再进行组合突变以得到更好的突变酶。

乙基对硫磷降解活性分析表明，相比于原酶，本发明所筛选到的三种有机磷降解酶突变体对乙基对硫磷的降解率均呈显著性提高：有机磷降解酶突变体OPHC2_A1-5与原酶相比对乙基对硫磷的降解率提高了2.7倍；有机磷降解酶突变体OPHC2_E6与原酶相比对乙基对硫磷的降解率提高了3.3倍；有机磷降解酶突变体OPHC2_AE与原酶相比对乙基对硫磷的降解率提高了4.2倍。

酶学性质分析表明，本发明的三种突变酶酶学性质与原酶相比基本没有变化，均有很好的耐热性；其最适反应pH为9，与原酶一致；三种突变酶最适反应温度为60℃；三种突变酶在65℃下突变酶相对较稳定。

综上所述，本发明成功地通过计算机辅助设计了突变位点，运用组合活性位点饱和实验成功地构建了饱和突变体库，并建立了高通量的筛选技术，有效地筛选到了对乙基对硫磷降解活性高的突变体，再通过组合突变得到很好的突变酶。本发明筛选得到的三种突变酶与原酶相比，对乙基对硫磷降解比活性分别提高了2.45、2.56和4.51倍，其对乙基对硫磷的降解能力(k_cat/K_m值)是原酶(OPHC2)的2.7、3.3和4.2倍。

说明书附图

图1OPHC2三维结构图。

图2重叠延伸PCR过程。

图3纯化后OPHC2及其突变酶的SDS-PAGE分析。

图4OPHC2和突变酶对乙基对硫磷降解的比活性分析。

图5OPHC2和突变酶反应最适温度。

图6OPHC2和突变酶反应最适pH。

图7OPHC2和突变酶在65℃下的温度稳定性。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

一、试验材料和试剂

1、生化试剂、酶、试剂盒：

工具酶：PCR用Taq plus DNA聚合酶定购于天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶均定购于TaKaRa公司，RNase定购于Sigma公司(鼎国公司分装)，T₄DNA连接酶定购于NEB(北京)有限公司。

试剂：甲基对硫磷(MP)及乙基对硫磷(EP)均定购于国家农药质量监督检验中心，1kb的DNA分子量标准定购于鼎国公司，dNTP、DNA纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均定购于天根生化科技有限公司，琼脂糖定购于Sigma公司，X-gal和IPTG定购于经科宏达公司，其他试剂均为分析纯。

2、质粒与菌株：

基因：来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenesC2-1)的甲基对硫磷水解酶基因ophc2已由本发明人实验室克隆得到，它在GenBank中的登录号为AJ605330。

质粒：pUC19购自NEB(北京)有限公司，pET-30a(+)购自Novagen公司，pEASY-T3购自北京全式金生物有限公司，pPIC9购自Invitrogen公司。

菌株：大肠杆菌感受态细胞(E.coli)TOP10购自天根生化科技(北京)有限公司，BL21(DE3)购自Novagen公司。酵母宿主菌株GS115购自Invitrogen公司。

3、培养基：

LB完全培养基：NaC1 10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，调整pH值至7.0(固体培养基中琼脂粉的浓度为1.5％)，高温高压灭菌。

Freezing培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，KH₂PO₄1.8g，K₂HPO₄ 8.2g，柠檬酸钠0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.9g，甘油44mL，加水定容至1L后高温高压灭菌。使用前加入40mmol/L的MgSO₄至终浓度为0.4mmol/L(注：MgSO₄一定要灭完菌后再加，否则会形成沉淀)。

转化培养基RDB：YNB 13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L，山梨醇186g/L，100×氨基酸。

选择培养基MD：YNB 13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L。

选择培养基MM：YNB 13.4g/L，甲醇5mL/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L。

诱导表达培养基BMGY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10mL，pH 6.0。

诱导表达培养基BMMY：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，酵母氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇5mL/L，pH6.0。

4、相关溶液：

(1)抗生素：氨苄青霉素使用浓度为100μg/mL；卡那霉素使用浓度为50μg/mL。

(2)TAE(50×)：100mL 0.5mol/L EDTA(pH7.5)，57.1mL冰乙酸，242g Tris碱，用无菌水定容至1L。

(3)质粒提取溶液：

溶液I：25mmol/L Tris-C1(pH8.0)，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖。

溶液II：1％SDS，0.2mol/L NaOH(现配现用)。

溶液III：5mol/L冰乙酸(pH 4.8)，3mol/L乙酸钾。

(4)RNase溶液：10mg/mL RNase，15mmol/L NaC1，10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，100℃加热15min，冷却至室温后分装成小份，-20℃保存。

(5)1mol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.0)：121.1g Tris碱，加浓HCl调节pH值到8.0，定容至1L，分装以后高压灭菌。

(6)SDS-PAGE蛋白电泳：

30％丙烯酰胺溶液：1g N，N’-亚甲叉丙烯酰胺、29g丙烯酰胺，溶于100mL水。

上样缓冲液(2×)：2％β-巯基乙醇、10％甘油、100mmol/LTris-Cl(pH6.8)、4％SDS、2％溴酚蓝。

考马斯亮蓝染液：将0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)和10mL冰乙酸。

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：0.1％SDS、25mmol/L Tris碱、250mmol/L甘氨酸(pH8.3)。

脱色液：10mL冰乙酸和90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)混合至100mL。

5、DNA测序、引物合成：

委托农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室进行DNA测序；委托三博远志生物技术公司合成所有实验用的引物。实施例1计算机辅助设计组合活性位点饱和实验的突变位点

首先是对有机磷降解酶OPHC2(GenBank中的登录号为AJ605330)进行三维结构分析：以发表的来源于Pseudomonas sp.WBC-3的MPH晶体结构为模版，应用Accelrys Discovery Studio software(Ver.2.5)软件构建OPHC2三维结构，确定活性中心，其三维结构如图1。OPHC2是一个同源二聚体，属于典型的β/α(TIM)折叠桶结构，其中8个折叠结构构成一个桶，为酶的活性中心区域，中间含有两个Zn²⁺。依据OPHC2的空间结构特征，在活性中心附近酶与底物结合的口袋处设计了5个突变区域，这些区域突变后不能影响酶催化活性中心的结构。要保证所选择的氨基酸对能够在空间位置上相互接近，则需遵循以下原则选择两个相邻的氨基酸做饱和突变，即如果选择的第一个氨基酸是蛋白的第n个氨基酸，且这第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在β折叠上则选择第n+2位，若在3₁₀螺旋上，则选择第n+3位；若在α螺旋上，则选择第n+4位。因此在依据以上原则设计了5个突变区域，分别是A库(M188/M191)，B库(L250/N251)，C库(E168/F171)，D库(E264/F265)，E库(V55/L57)。其中A和C库位于螺旋上，B库位于loop上，D库在β转角处，E库在β折叠上，见图1。

实施例2突变基因片段的获得

采用的是重叠延伸PCR技术。设计一对两端侧翼引物(a和d)及五对含所需突变位点的引物(b和c)，其中b引物含有希望引入的突变位点。突变位点是双点的饱和突变，所需突变的氨基酸对的中间引物对应的是6个碱基，并将每个氨基酸对应的碱基换成nnk的形式，引物序列见表1。每个点突变均进行了两轮PCR，第一轮PCR分别用引物a和c扩增基因的上游序列的DNA片段，同时用引物b和d扩增含有突变位点及其下游序列的DNA片段。用琼脂糖凝胶回收这两段DNA片段，再混合这两段PCR产物，由于b和c有重叠区，重叠片段之间退火，可延伸成异源双链，加入两端侧翼引物进行第二次PCR，即可得到含一个位点突变的突变体，重叠延伸PCR过程见图2。

PCR反应具体扩增程序如下：

第一轮PCR：以原菌C2-1基因组为模板，b和c为引物，Taq plus酶进行两个反应的扩增，扩增条件为：94℃5min，94℃30sec，58℃45sec，72℃45sec，共30个循环，72℃延伸10min。

PCR产物进行胶回收备用。

第二轮PCR：取以上两种PCR产物等体积混合，取1μL作为PCR模板，a和d为引物，Taq plus酶进行第二轮扩增，扩增条件为：94℃5min，94℃45sec，55℃45sec，72℃30sec，5个循环；94℃30sec，58℃45sec，72℃45sec，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物的回收按照凝胶回收试剂盒所示方法进行。

表1突变位点和突变引物

n＝A/G/C/T；k＝G/T

实施例3饱和突变体库的构建

连接：将实施例2所回收的PCR产物直接用BamHI和HindIII双酶切后与用同样双酶切处理的pUC19载体进行连接，连接体系为：pUC19 2μL，PCR产物6.5μL，T₄连接酶0.5μL，10X反应缓冲液1μL，轻轻混合，16℃反应过夜。每个库做5个连接体系。

转化：将-70℃保存的Top10感受态细胞在冰上冻融，取50μL感受态细胞加入到上述的连接体系中，轻轻吸打混匀，冰浴30min。将冰浴好的体系于42℃准确热激90sec，然后立即置于冰上2min，并加400μL预冷的LB平衡至室温，200rpm，37℃摇床孵育1h。加入4μL 1mol/L IPTG，40μL 20mg/ml X-gal混合，转化后的菌液全部涂布LB(含100μg/mL，Amp)23cm×23cm的大平板，37℃培养至转化子出现。每个突变体库的所有连接体系转化的菌全涂于同一个平板上，保证每个库的转化子在3000个以上。

为了保证筛选菌株的数目足够覆盖所有可能出现的突变体，首先需要验证突变体库构建的质量，也就是插入片段阳性率的高低。本实验从5个库中随机挑取了12个克隆进行BamHI和HindIII双酶切鉴定。A、B、E库插入片段的阳性率可以达到为100％，C和D库的12个克隆中仅有一个为假阳性，阳性率能达到90％以上，这样的阳性率已达到了要求。为确定设计突变位点的氨基酸是否突变，在鉴定出的阳性克隆中随机选取两个进行序列测定，结果发现，所突变位点均都为突变碱基。因此，可以认为所构建的突变体库已经达到了要求，可以进行进一步筛选。

实施例4突变体库的筛选

将384孔板里的每个孔中加50μL含Amp抗性的Freezing培养基，用Genetics QPix2自动挑取克隆机器人从每个大平板上挑3840个菌，分别放置于10个384孔板中，37℃过夜培养。在96深孔板中加1mL含Amp抗性的LB培养基，利用96针复制器将菌复制到96孔深孔板中，同时在另一个96深孔板中加8个含野生酶基因重组质粒pUC19-ophc2的菌株，做为阳性对照，37℃过夜振荡培养。

取50μL过夜培养的菌液(已测定OD₆₀₀数据)，加入到含有2μL，2mg/mL乙基对硫磷(EP)和100μL 50mM Tris-Cl(pH 8.0)缓冲液的96孔酶标板中，进行初筛。37℃保温30min，然后用酶标仪测定OD₄₁₀和OD₅₅₀的数值。为去除菌体量不同对测定结果的影响，参照Miller的方法(Miller，1972)，用下列公式计算后与阳性对照比较。

计算公式： $\mathrm{Units}=\frac{{\mathrm{OD}}_{410}-1.75\×{\mathrm{OD}}_{550}}{T\×V\×{\mathrm{OD}}_{600}}\×1000$

T：反应时间(min)；V：反应体系中菌体体积(mL)

将上述测得比原酶降解以及乙基对硫磷活性好的突变株进行复筛，挑单菌接种于2.5mL含Amp抗性的LB培养基中，37℃过夜培养。将每个样品的菌浓度用LB培养基调成一致后，取100μL菌液加入到含有4μL 10mg/mL EP和900μL 50mM Tris-Cl(pH 8.0)缓冲液的体系中，37℃保温10min后加入1mL 10％的TCA终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃显色，410nm测定光吸收值。

对5个突变体库中约15,000个克隆子进行了筛选，初筛得到了12个对乙基对硫磷水解活性提高的突变株。复筛后，发现A库中的A1-5，A2-5，A6-3和E库中的E6、E8五个菌株对乙基对硫磷的水解能力比原酶OPHC2好。通过再次测定确定了2个突变株最好，分别为A1-5和E6。将A1-5和E6送去测序，结果显示，A1-5的突变位点为M188L/M191S。E6的突变位点为L57V，其中55位的V的核苷酸序列也发生了改变，但氨基酸序列未变。

实施例5组合突变体的构建

为了获得对乙基对硫磷水解活性更高的突变体，本实验将A库中最好的突变体A1-5和E库中最好的突变体E6的突变位点进行组合突变。以A1-5的重组质粒为模板，参照E6突变位点设计突变引物，将A1-5中第57位的亮氨酸(Leu)定点突变为缬氨酸(Val)，构建了组合突变体AE(M188L/M191S/L57V)。突变体的构建方法与前面突变基因片段获得的方法相同，均是采用重叠延伸PCR技术。

实施例6突变酶在毕赤酵母中表达以及酶活性的测定

将A1-5、E6和AE中的突变基因先用PCR扩增，再用限制性内切酶SnaBI和NotI消化PCR产物，连入用同样两种酶切好的pPIC9载体，转化大肠杆菌Top10，测序正确后，转化酵母GS115。线性化的重组质粒电转入酵母菌株，通过RDB、MM和MD平板筛选，得到表型为His⁺的克隆子，进一步在摇床水平上进行诱导表达。将His⁺Mut^s转化子首先在BMGY培养基中培养48h，离心弃BMGY，换入诱导培养基BMMY，诱导培养48h，取上清液按下述方法进行有机磷降解酶活性测定：

取100μL待测酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基对硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)缓冲液的体系中，37℃保温10分钟，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定OD值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶的活性单位(U)定义为在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量。

有机磷降解酶酶活单位计算公式：

其中：3×10^-3：反应总体积(L)；N：酶液的稀释倍数；10^①：将100μL稀释酶液中的酶活性折算为1mL的酶活性；10^②：反应时间。

选取表达高的菌株进行大量诱导培养用于下一步的降解活性分析。

试验例1突变酶和原酶的纯化及底物降解活性分析

由于需要纯蛋白来测定酶对不同底物的降解活性，因此本实验先对酵母表达的原酶和突变酶进行纯化。挑取具有较高酶活性的重组菌株(实施例6所构建)，接入1L BMGY培养基中，28℃摇床震荡培养48h后，离心弃上清，加入200ml BMMY培养基，28℃诱导培养48h。离心得到的培养上清液即为含有重组酶蛋白的粗酶液。由于酵母表达的重组蛋白约为上清液总蛋白的90％以上，采用Pall(Pall Life Sciences，USA)切向流过滤器进行纯化和蛋白的浓缩。首先使用孔径为0.22μm的微滤膜包，过滤去除上清液中的离心未能去除的细胞碎片。然后根据目的蛋白分子量的大小选用超滤膜包进行蛋白截流和浓缩，由于目的蛋白分子量为36kDa，因此选择截流分子量为10kDa的超滤膜包，将其他它小的蛋白和一些小分子化合物过滤掉，并将缓冲液置换成50mMTris-Cl(pH 8.0)缓冲液。纯化后的酶蛋白进行SDS PAGE电泳分析，结果显示，只有一条单一条带，大小为36kDa(图3)。纯化的原酶OPHC2和三种突变酶用来进行降解底物比活性及动力学参数的比较分析。

测定不同的酶液的蛋白含量，并测定酶活性，这样得出酶的比活性。应用BioRad Protein Assay Kit(BioRad，USA)来测定蛋白浓度。将蛋白染料∶蒸馏水以4∶1比例混合，取60μL待测酶液加入到3mL上述混合溶液中，准确反应30min，595nm读数，将所获得的数据代入到蛋白标准曲线中计算蛋白质的浓度。

通过比较突变酶与野生型OPHC2对甲基对硫磷和乙基对硫磷水解的比活性(表2)，可以看出本发明的三种突变酶OPHC2_A1-5(SEQID NO：2)、OPHC2_E6(SEQ ID NO：4)和OPHC2_AE(SEQ ID NO：6)对乙基对硫磷的降解比活性均比原酶有显著提高，分别是原酶(OPHC2)的2.45倍，2.56倍和4.51倍(图4)。

表2OPHC2和突变酶比活性分析

本试验进一步测定了突变酶OPHC2_A1-5、OPHC2_E6、OPHC2_AE和野生型OPHC2对甲基对硫磷(MP)及乙基对硫磷(EP)的动力学参数。首先以乙基对硫磷为底物，进行了反应初速度的测定。分别配制9个反应体系，在37℃水浴锅中预热5min，用同一管酶液依次加样，在酶作用1、3、5、7、10、15、20、30min时用TCA终止反应，Na₂CO₃显色，410nm测定光吸收值，然后算出反应时间和酶活性的比值，若在一定时间范围内其比值保持恒定，则在这个时间范围内酶反应为一级反应。据此来确定测K_m和V_max的反应时间。根据所测的反应初速度，确定测K_m和V_max的反应时间。用不同浓度的甲基对硫磷和乙基对硫磷作底物，在50mM Tris-Cl(pH 8.0)缓冲液中，37℃下测定酶活性，计算酶的反应速度。按双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)求取K_m和V_max。结果见表3，发现：A1-5、E6和AE对EP的亲和能力基本上没有太大变化，但对其降解能力均有所提高，其k_cat/K_m值均比OPHC2要高，分别是2.7倍、3.3倍和4.2倍。A1-5对MP的降解能力(k_cat/K_m)略有提高，E6和AE对MP的降解能力有不同水平的下降。

表3OPHC2和突变酶对MP和EP的动力学参数结果

试验例2突变酶和原酶的酶学性质分析

为了确定突变酶的酶学性质是否变化，本试验将原酶(OPHC2)和突变酶OPHC2-A1-5、OPHC2-E-6和OPHC2-AE在不同温度和不同pH下进行酶促反应测定其酶活性，结果显示本发明的三种突变酶的最适反应温度为60℃(图5)，最适反应pH为9.0(图6)，与原酶基本一致。同时，还测定了在65℃下原酶与突变酶的热稳定性(图7)，从图中可以看出三种突变酶的热稳定性都很好，在保温30分钟后其相对剩余酶活性大于70％。

Claims (12)

1.有机磷降解酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

2.编码权利要求1所述有机磷降解酶突变体的基因。

3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的碱基为SEQ ID NO.1所示。

4.有机磷降解酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示。

5.编码权利要求4所述有机磷降解酶突变体的基因。

6.按照权利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因的碱基为SEQ ID NO.3所示。

7.有机磷降解酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示。

8.编码权利要求7所述有机磷降解酶突变体的基因。

9.按照权利要求8所述的基因，其特征在于：其碱基为SEQ IDNO.5所示。

10.含有权利要求2、5或8任何一项所述基因的表达载体。

11.含有权利要求10所述表达载体的宿主细胞。

12.权利要求1、4或7所述的有机磷降解酶突变体在降解有机磷农药中的用途。

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