CN101906393B - 一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用。本发明主要采用同源重组技术，利用单交换使谷氨酰胺转胺酶编码基因被插入失活，从而得到不产谷氨酰胺转胺酶的重组子。本发明得到的吸水链霉菌，阻断了其分化过程，但是不影响其基内菌丝生长。以该阻断菌株为宿主构建了一株基因工程菌，用于生产谷氨酰胺转胺酶，表明该阻断菌株可以作为一个良好的链霉菌表达宿主，可用于解决链霉菌在发酵过程中由于分化过程而引起的代谢产物变化，提高发酵产量及稳定性，将极大促进后续链霉菌基因改造和微生物生理学研究，为链霉菌发酵生产提供一个新的模式菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TGase)是一种催化酰基转移反应的转移酶。它能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。谷氨酰胺转胺酶存在于在动物、植物、微生物中，目前工业生产谷氨酰胺转胺酶的菌株为链霉菌。
目前国内外的研究主要集中于提高谷氨酰胺转胺酶，例如：申请号为：200710023771.2的专利，一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达；申请号为：200610097160.8的专利，添加胰蛋白酶提高发酵法制备谷氨酰胺转胺酶产量的方法。
关于链霉菌中谷氨酰胺转胺酶功能及谷氨酰胺转胺酶基因阻断吸水链霉菌研究还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株谷氨酰胺转胺酶编码基因被阻断的吸水链霉菌。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
构建阻断载体，转化吸水链霉菌，通过抗性平板筛选和PCR验证得到谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株。
所述阻断载体是将含有不跟目的基因的片段插入到温度敏感型质粒pKC1139中，构建的重组质粒pKC1139-TG1。
谷氨酰胺转胺酶基因阻断的具体步骤如下：
(1)根据谷氨酰胺转胺酶编码基因序列设计扩增含有同源片段的引物，在5’和3’端引入HindIII(AAGCTT)和EcoRI(GAATTC)酶切位点，回收PCR片段；
(2)PCR产物经HindIII和EcoRI酶切后与相同酶切的pKC1139质粒连接，得到重组质粒pKC1139-TG1；
(3)将构建的重组质粒pKC1139-TG1转化吸水链霉菌原生质体；
(4)将转化后的原生质体涂布在链霉菌原生质体再生培养基上，培养18h后，加入阿伯拉(Apramycin)抗生素；
(5)将上述平板得到的菌落转移至新的Apramycin平板生，39℃培养，挑选长出来的菌落，提取基因组进行鉴定，即可得到谷氨酰胺转胺酶基因阻断菌株。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供所述工程菌的应用方法。
所述工程菌用于吸水链霉菌外源或内源基因的表达。
所述工程菌用于发酵生产抗生素。
所述抗生素为阿扎霉素B，尼日尼亚菌素。
本发明具有的优点：(1)本发明得到的吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株，在生长过程中营养菌丝阶段可以正常生长，但是不能够分化形成气生菌丝，阻断了其分化的过程，可用于链霉菌在发酵过程中由于分化过程而引起的代谢产物变化，影响发酵产量及稳定性，将极大促进后续链霉菌基因改造和微生物生理学研究，为链霉菌发酵生产提供一个新的模式菌；(2)本发明的基因阻断方法简单，高效，对同源交换片段要求较短，容易实现。
附图说明
图1pKC1139-TG1物理图谱及其验证
A：质粒图谱；B：PCR验证C：双酶切验证
图2谷氨酰胺转胺酶基因阻断菌株PCR验证
A：验证MTG突变株的示意图；B：用P1和P3为引物PCR得到的产物电泳图，根据图A，PCR产物大小为3000bp。1，2，3：MTG突变株；4：S.hygroscopicus；M：Maker；C：以引物P1和P3的PCR产物为模板的PCR产物电泳图D：阿伯拉霉素抗性基因的PCR产物电泳图
图3野生菌株和重组子谷氨酰胺转胺酶酶活比较
A：固体平板酶活检测；B：液体酶活检测。N：没有检测到酶活
图4谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断菌株的生长情况观察
图5TGase表达载体pIJTGM1的构建
具体实施方式：
实施例1吸水链霉菌中谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断
1、目的片段基因TG1获得
利用引物：
Y1：5′-TTTAAGCTT CCACTGTGAGTGCGGCGATA-3′(下划线，黑体字为Hind III位点)；Y2：5′-AAAGAATTCTTCCGTCTGAGCCCCAAACC-3′(下划线，黑体字为Eco RI位点)从吸水链霉菌基因组上扩增得到敲除片段TG1。
PCR反应的总体系为25μL，以1μL的吸水链霉菌总DNA为模板进行反应。反应条件为：95℃5min；95℃1min，65℃1min，72℃10min，30个循环。PCR产物为MTG基因片断，命名为TG1，测序验证。
2、阻断载体构建
用Eco RI和Hind III双酶切双功能温敏型穿梭质粒pKC1139(6.5kb)(Hopwood D，Bibb M，Chater KF e a.Genetic manipulation of Streptomyces[M].ALaboratory Manual.In：Norwich：JohnInnes Foundation Press；2000)，然后与TG1基因进行连接，转化E.coli DH5α感受态。从抗性平板上挑取单菌落，PCR和质粒酶切验证质粒pKC1139-TG1构建正确(图1)。
3、链霉菌原生质体转化
3.1.链霉菌原生质体的制备
(1)在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1∶1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30℃摇床中培养36～40h(视具体情况，有时培养24h已足够。)。
(2)将培养物倒入离心管中，然后3000rpm离心10min。
(3)弃上清，将菌丝体悬浮于15ml的10.3％的蔗糖溶液中，3000rpm离心10min，弃上清。同此法洗两次。
(4)取1ml菌丝体，加入4ml的溶菌酶溶液(溶菌酶母液为50mg/ml P Buffer，终浓度为2mg/ml，用P Buffer稀释)，于30度水浴30～60min(间隔七八分种轻轻摇动)至上清呈乳状。
(5)加入5ml的P Buffer并用5ml的吸管吹吸几次，继续温浴10min。(使大量的原生质体释放出来。)
(6)用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000rpm离心7min。原生质体沉淀呈黄色。
(7)弃上清，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次(洗去溶菌酶)。每次仍使用3000rpm离心7min。(此步可省略)
(8)弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。
3.2.链霉菌原生质体的转化
(1)将最多5ul的DNA(质粒或酶连产物)加于已经装有50ul原生质体的指型管(1.5ml)的管壁上(不与原生质体接触)。
(2)吸取200ul的25％PEG4000(PEG应先灭菌，再用P Buffer配置)，将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。
(3)将混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。
(4)30度培养14～20hr后(待原生质体再生后，即平板呈雾状)，用含有适当抗生素的1ml无菌水溶液覆盖。
(5)再培养1～2d后，可以看到小的转化子菌落长出。
(注P Buffer：蔗糖103g，K2SO4 0.25g，MgCl2·6H2O 2.02g，微量元素溶液2ml，蒸馏水800ml灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5％KH2PO4 1ml，3.68％CaCl2·2H2O 10ml，5.73％TES缓冲液(pH72)10ml)
4、吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因阻断菌株获得
将Apramycin抗性平板上长出的菌落转接至另一含有Apramycin的MS抗性平板上置于39℃培养，平板上长出的菌落即可能为重组质粒pKC1139-TG1整合于吸水链霉菌染色体上的重组菌株。
5、基因阻断菌株验证
利用引物：P2：5′-TGCAATACGAATGGCGAAAAG-3′
P3：5′-TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3′。验证质粒是否整合到链霉菌基因组中。PCR反应总体系为25μL，以1μL的总DNA为模板。反应条件为：95℃5min后；95℃1min，65℃1min，72℃1min，30个循环。同时利用引物，P1：5′-TGTACAAGCGTCGGAGTTTAC-3′P3：5′-TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3′验证质粒的整合位点是否在目的基因TG中，结果见图2。
实施例2.吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因功能的验证
1、接种重组菌株进行吸水链霉菌液体培养基和固体培养，不同时间段检测酶活，野生菌株可以检测到MTG酶活，但重组子在固体及液体培养过程中均检测不到MTG酶活，结果见图3。
2、对S.h-ΔTG进行固体平板培养，以野生菌株为对照，分别将野生菌和重组子接种到同一平板不同区域(图4)，32℃培养。在菌体前期生长过程中，基内菌丝可以正常生长，48h时野生菌株已经全部分化形成气生菌丝，而重组子S.h-ΔTG还是处于营养菌丝生长状态，没有气生菌丝生成。继续培养至120h，野生菌株S.h已经开始形成大量孢子，重组子S.h-ΔTG没有孢子形成。谷氨酰胺转胺酶阻断使重组菌株无法正常的形成气生菌丝和产生孢子。以上结果表明谷氨酰胺转胺酶是吸水链霉菌正常生长分化所必须的。
实施例3.谷氨酰胺转胺酶基因阻断吸水链霉菌用于表达生产谷氨酰胺转胺酶
1、将TGase基因片段及载体pIB13载体上面信号肽片段和表达载体pIJ8600(Hopwood D，Bibb M，Chater KF e a.Genetic manipulation of Streptomyces[M].ALaboratory Manual.In：Norwich：John Innes Foundation Press；2000)分别进行Nde I和Xba I双酶切，回收后用T4连接酶进行连接图5。连接反应体系为(10μL)：目的基因片断2μL，载体DNA2μL，10×T4连接酶Buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，ddH2O 4μL。
连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下：
(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
(3)42℃热休克90s(准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；
(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。
挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。
2、将构建好的表达载体转化吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶阻断菌株
原生质体转化及菌落筛选见实施例1
3、谷氨酰胺转胺酶活力检测
(1)重组子和空载体pPIC9K转化的S.h-ΔTG分别接种于20mL链霉菌液体培养基，30℃振荡培养过夜(稳定期)；
(2)30℃，200r/min振荡培养3天；定时进行酶活测定。
谷氨酰胺转胺酶酶活测定方法：
以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1U定义为：37C时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)
吸水链霉菌液体培养基(g/L)：甘油20蛋白胨20，酵母膏5，K2HPO42，KH2PO42，MgSO42，pH 7.0；
将所得到的转化子用于发酵生产谷氨酰胺转胺酶，发酵30小时后，谷氨酰胺转胺酶酶活达到2.2U/ml，缩短了发酵周期，酶活提高了83％。
实施例4谷氨酰胺转胺酶基因阻断吸水链霉菌用于生产阿扎霉素B
发酵培养基组分(％，质量分数)：甘油4.5，玉米粉3，黄豆粉1，蛋白胨1，NaNO3 0.5，NaCl0.2，CaCO3 0.3，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4 0.05，pH 7.5。
发酵条件为：发酵前期温度30℃(60h前)，起始pH 7.4；发酵后期温度28℃(60h后)，pH调整为6.8，接种量为15％，发酵时间4天。
最终阿扎霉素B的产量达到1521mg/ml，产量比原始菌株提高了36％，发酵周期缩短了20％。
核苷酸序列表
<110>江南大学
<120>一种谷氨酰胺转胺酶编码基因阻断吸水链霉菌及其应用
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
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<213>人工序列
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<223>根据基因序列设计，用于基因扩增。
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1.一种谷氨酰胺转胺酶编码基因被阻断的吸水链霉菌的应用，其特征在于用于发酵生产抗生素阿扎霉素B。
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