CN101906165B - 两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其表达方法 - Google Patents

Abstract

两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其表达方法，涉及一种海洋生物的基因工程技术。提供两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物以及两种鱼类Hepcidin串联表达载体的构建和串联表达产物的制备方法。通过pET32a原核表达载体串联表达两种鱼类hepcidin基因，实现两种抗菌肽hepcidin同时可溶性表达，两种串联抗菌肽表达量超过50mg/L，可溶性串联表达产物通过N末端His-Tag亲和层析纯化后，再以肠激酶切除串联蛋白标签，切后混合物再经Ni亲和层析柱，获得纯化的Hepcidin串联表达产物。纯化表达产物对金色葡萄球菌、嗜水单胞气菌，溶壁微球菌等均有显著的抑制作用。

Description

两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其表达方法

技术领域

本发明涉及一种海洋生物的基因工程技术，尤其是涉及一种对具有抗菌活性的大黄鱼抗菌肽hepcidin(简写为PC-hepc)和黑鲷抗菌肽hepcidin(简写为AS-hepc2)基因进行串联表达，并进行体外表达产物的活性鉴定。

背景技术

抗菌肽是由动植物细胞产生的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，其生成和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入侵的重要屏障。Hepcidin(肝杀菌肽)是一个具β片层结构的在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族，参与宿主非特异性免疫。2000年，Krause等从人血浆中首先发现了LEAP-1(肝脏表达的抗菌肽，后称为hepcidin)，并用化学合成该多肽检测了hepcidin的抗菌活性，结果发现，hepcidin能够剂量依赖性地抑制革兰氏阳性菌藤黄微球菌、肉葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌灰色奈瑟球菌的生长，但是对大肠杆菌和萤光假单胞菌没有活性。Park等从人尿液中分离的Hep20和Hepc25天然产物，体外抗菌试验中在30μM浓度下对大肠杆菌(E.coliML35P G-)具较强的抑制作用，对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长抑制作用较弱。相关报道表明，人hepcidin是一种具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽，与机体内其他富含半胱氨酸的抗菌肽一样参与宿主的天然防御。

本申请人通过化学合成大黄鱼hepcidin成熟肽和原核表达AS-hepc2后进行体外实验也证实了鱼类hepcidin有抑菌和杀菌特性。有报道Hepcidin变体的氨基酸序列在种间高度相似，而与陆生哺乳动物具有的进化后高级适应性免疫系统相比，由于水生环境的复杂性和直接接触性，鱼类可能需要多种不同组抗菌肽存在，并且在先天性免疫系统中作为主要成分。对Hepcidin抗菌肽的研究必然加深人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，同时hepcidin抗菌肽作为潜在的海水水产养殖抗菌和治疗药物，具有很好的推广应用前景。但直接从鱼类组织或分泌物中生物化学提取或利用化学方法人工合成天然的hepcidin抗菌肽，很难获得大量的抗菌肽，且费时费钱。利用分子生物学技术可以克隆获得海水养殖鱼类的抗菌肽基因，通过建立海水养殖鱼类hepcidin抗菌肽基因表达工程菌，可以在体外大量生产抗菌肽，进行抗菌活性检测和替代抗生素添加到饲料中，用于预防和治疗水产动物疾病。

由于hepcidin多肽含有8个半胱氨酸，具有特殊的4个二硫键结构，国内外hepcidin体外表达见报道的不多，有报道真鲷hepcidin成熟肽基因的酵母表达，但只限于对大肠杆菌、绿脓杆菌和嗜水气单胞菌的剂量依赖性抑制实验，也没有阐明其上清表达的量和小肽抗菌稳定性等详尽问题。Zhang等([3]Zhang H，Yuan QP，Zhu YP，Ma RY.Expression and preparation ofrecombinant hepcidin in Escherichia coli[J].Protein.Expr.Purif.，2005，41：409-416)利用合成的人hepcidin核酸片段重组到pGEX-hpc表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，但其表达产物是以包涵体形式存在，需要经过复性过程才能获得有生物活性的hepcidin，因而利用pGEX-hpc这一类表达载体制备hepcidin的工艺相对复杂，成本较高。B.Srinivasulu等([4]B.Srinivasulu，R.Syvitski，J.-K.Seo，N.R.Mattatall，L.C.Knickle，S.E.Douglas.Expression，purificationand structural characterization of recombinant hepcidin，Anantimicrobial peptide identified inJapanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Protein.Expr.Purif.，2008(61)：36-44)报道利用大肠杆菌融合表达6His-hepcidin，也主要是包涵体表达。本申请人在前期工作中也已证明大黄鱼PC-hepc和黑鲷AS-hepc2成熟肽都具有显著的抗菌活性(见[5]Ke-Jian Wang，Jing-JingCai，Ling Cai，Hai-Dong Qu，Ming Yang，Min Zhang.Cloning and expression of a hepcidin genefrom a marine fish(Pseudosciaena crocea)and the antimicrobial activity of its syntheticpeptide[J].Peptides，2009(30)：638-646)。

发明内容

本发明的目的在于提供两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物及其两种鱼类Hepcidin串联表达载体的构建和串联表达产物的制备方法。

本发明的技术方案是通过构建一种串联大黄鱼hepcidin(前导肽和成熟肽的cDNA序列)和黑鲷hepcidin(前导肽和成熟肽的cDNA序列)基因的pET32/hepcidins表达载体，转化宿主菌BL21(DE3)诱导表达可溶性产物，以及纯化不带任何标签的串联hepcidin多肽的方法，从而获得抗菌谱比单一表达其中一种hepcidin更广的hepcidin串联表达产品。

所述两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物的串联抗菌肽hepcidins基因分别来自于大黄鱼抗菌肽hepcidin(简写为PC-hepc)和黑鲷抗菌肽hepcidin2(简写为AS-hepc2)，均包含前导肽基因，两者通过连接肽编码基因相连。

所述的两种鱼类Hepcidin串联表达载体的构建和串联表达产物的制备方法如下：

1)重组表达载体pET32/hepcidins的构建

(1)根据大黄鱼抗菌肽PC-hepc基因和黑鲷抗菌肽AS-hepc2基因合成F1、R1、F2、R2四条引物，其中引物F1和引物R1配对扩增大黄鱼hepcidin基因，引物F2和引物R2配对扩增黑鲷hepcidin基因，引物F1和引物R2配对，与相应模板反应可扩增的hepcidins串联目的产物；35个PCR反应后，分别得到大黄鱼hepcidin基因、真鲷hepcidin基因和hepcidin串联基因，琼脂糖凝胶电泳分别显示大小为：212bp、222bp和416bp；

(2)将回收的hepcidins PCR产物和pET32a载体用NcoI和XhoI进行双酶切，得到具有与处理好的预连接DNA片段和pET32a线性载体，通过基因克隆常规方法进行连接、转化和单克隆筛选及鉴定，酶切和测序结果显示hepcidins串联序列成功插入到表达载体并且读码正确；

2)pET32/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

用热击法将pET32a空质粒和pET32/hepcidins重组质粒分别转化至BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达，以pET32a空质粒转化的BL21(DE3)为对照，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白表达量；

3)pET32/hepcidins重组质粒融合表达产物的纯化

(1)hepcidins融合表达产物的可溶性分析

将pET32/hepcidins重组质粒在大肠杆菌中的表达产物离心收集菌体，用PBS悬浮菌体，超声破碎；离心超声液取上清进行SDS-PAGE电泳，确认表达产物的可溶性；

(2)亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物

将具有较高可溶性表达hepcidin的菌株大量诱导表达后收集菌体，采用金属鏊合层析柱进行亲和层析，金属鏊合层析填料为sepharose fast flow(GE Healthcare)，所用层析试剂为溶液A、B、C和D；

所述溶液A为Ni²⁺金属离子，溶液B洗去多余的Ni²⁺，溶液C平衡层析柱，将经0.45μm滤膜过滤后的表达菌超声上清液上柱，溶液C过柱洗去未结合的蛋白，溶液D过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，经SDS-PAGE电泳鉴定即为hepcidins融合表达产物；

(3)融合蛋白的酶切反应和不带标签hepcidins多肽的纯化

将融合蛋白于Tris-Cl缓冲液中低温透析，充分透析后按照带6×His重组肠激酶操作手册对该融合蛋白进行酶切，因为融合蛋白酶切后能得到不带标签序列和融合蛋白的hepcidins多肽，而未完全切割和载体蛋白及重组肠激酶均有6×His标签，酶切后混合物用酶切缓冲液适当稀释后以1.5ml/min流速过Ni²⁺亲和层析柱，收集穿过峰后，便得到目的多肽；Hepcidins多肽从缓冲液A缓慢更换透析液至超纯水中，去除多肽中盐类成分。再以0.22μm膜过滤除菌后-80℃低温冰箱冻存至低温冷冻干燥而浓缩目的多肽，冷冻干燥处理后的样品置于-20℃冰箱保存；所述缓冲液A为50mM Tris-Cl、50mM NaCl，pH 8.0；

(4)Hepcidins串联多肽抗菌活性的测定

a.微滴定肉汤稀释方法：通过测定最小抑菌浓度来评价hepcidins串联多肽的抗菌活性；

b.以最小抑菌浓度10倍MIC浓度剂量hepcidins多肽对金黄色葡萄球菌进行杀灭分析，设定固定的时间间隔从培养孔中吸取相等的体积，进行同样的稀释后接种到普通琼脂板，次日计数每板克隆。

在步骤3)的第(3)部分中，所述Tris-Cl缓冲液为20mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 8.0。

通过与硫氧还蛋白TrxA融合得到串联hepcidin基因可溶性表达产物后，可通过Ni亲和层析柱纯化，纯化后多肽在经带6×His标签的活性肠激酶切割，酶切混合物再经Ni亲和层析柱纯化，收集穿过峰而获得不带任何标签的两种hepcidin串联产物，所得hepcidin串联产物用于受试菌种抑菌活性测定。

本发明所述的黑鲷抗菌肽AS-hepc2基因的表达载体pET32a含有T7启动子、Trx融合蛋白编码基因及组氨酸标签(His-Tag)，利用其NcoI和XhoI两个内切酶位点克隆大黄鱼PC-hepc基因序列-linker-黑鲷AS-hepc2基因序列的串联多肽基因，而得到pET32/hepcidins表达载体。通过优化表达条件，可溶性串联融合表达产物可通过N末端His-Tag亲和层析纯化，纯化的融合产物可用肠激酶酶将融合蛋白中的Trx标签切除，再次过纯化柱，收集穿过峰可获得纯化的hepcidin串联融合表达产物。通过计算得知，pET32a空载体诱导表达的蛋白为158aa，理论分子量为17.1kDa；Trx/hepcidins重组载体诱导表达的蛋白为292aa，理论分子量为32.2kDa。

本发明与已有hepcidin研究报道对比其特点是：本发明通过疏水性连接肽(linker)串联大黄鱼PC-hepc和黑鲷AS-hepc2基因，并且融合了pET32a原核表达载体上的硫还氧蛋白，在低温和适当浓度的IPTG诱导下，大量地表达出两种鱼类的抗菌肽hepcidin可溶性融合蛋白。通过亲和层析纯化了该融合蛋白，再利用自带6×His的活性肠激酶切割融合蛋白，经二次亲和层析柱纯化，得到没有任何标签的串联hepcidin多肽。抑菌实验表明该串联hepcidin多肽对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(革兰氏阳性菌)MIC浓度达到6μM和6μM，对嗜水气单胞菌、溶壁微球菌也有显著的抑菌效果。另外，本发明选择将两个hepcidin的前导肽和成熟肽序列串联表达，结果证明，hepcidin的前导肽和成熟肽串联表达产物也具有显著的抗菌活性。

附图说明

图1为hepcidin和hepcidins的扩增。在图1中，(a)M：DNA Marker，DL2000；1：hepcidinsPCR产物；2：黑鲷hepcidin；3：大黄鱼hepcidin；(b)M：DNA Marker，DL2000；4：pET32/hepcidins质粒酶切鉴定(NcoI和XhoI)；(c)M：DNAMarker，DL2000；5～9：表达菌株阳性克隆菌液PCR鉴定；10：黑鲷hepcidin；图中箭头指向条带均为hepcidins串联基因。

图2为pET32a和pET32/hepcidins表达产物SDS-PAGE电泳。在图2中，M：proteinmarker(KDa)，Fermentas SM0431；1：pET32a表达菌超声上清；2：pET32/hepcidins表达菌超声上清。

图3为纯化前后hepcidins融合蛋白SDS-PAGE电泳。在图3中，M：protein marker FermentasSM0431；1：hepcidins融合蛋白纯化后样品；2：pET32/hepcidins表达上清样品；A为流穿部分，B为洗脱峰。

图4为hepcidins融合蛋白肠激酶切割效果。在图4中，1：hepcidins融合蛋白；2～6：酶切作用时间(下同)，1、2、3、4、5h；M：蛋白marker。

图5为hepcidins融合蛋白酶切产物和二次过亲和层析柱SDS-PAGE电泳图。在图5中，M：protein marker；1：hepcidins融合蛋白酶切产物和二次过亲和层析柱穿过；2：hepcidins融合蛋白酶切产物。

图6为hepcidins串联多肽长时相杀灭金色葡萄球菌曲线。在图6中，横坐标为作用时间(min)，纵坐标为各个时间点(Tn)平板克隆数与起点(即0min，T0)克隆数的比值CFU(100％)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

1.重组表达载体pET32/hepcidins的构建

1)含有串联大黄鱼hepcidin(前导肽和成熟肽的cDNA序列)和黑鲷hepcidin(前导肽和成熟肽的cDNA序列)基因的重组pPMD18-T阳性质粒模板的获得：

(1)利用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司)提取大黄鱼、黑鲷幼鱼肝总RNA后进行RT-PCR扩增在按常规方法进行TA克隆，并测序正确，质粒置于-20℃保存，菌种添加15％甘油冻存于-80℃。

(2)同上述分别设计F1、R1、F2和R2四条引物，根据大黄鱼抗菌肽PC-hepc基因(Genbank登录号：EU443735)和黑鲷抗菌肽AS-hepc2基因(Genbank登录号：AY669377)合成如下引物：

F1：5′-CACCCATGG GTCCCAGCCAATGAAGAGCAAG-3′(下划线部分为NcoI酶切位点)

R1：5′-

3′(粗体部分为编码linker基因，斜体字部分为扩增大黄鱼hepcidin下游引物)

F2：5′-

3′(粗体部分为编码linker基因，斜体部分为扩增黑鲷hepcidin基因的上游引物)

R2：5′-CAGAACCTGCAGCAGACACCAC-3′(下划线部分为XhoI酶切位点)

分别以包含大黄鱼、黑鲷hepcidin(cDNA)重组pMD18-T质粒为扩增模板(本申请人自行构建并测序正确)，以F1-R1为配对引物扩增大黄鱼hepcidin基因(包含前导肽和成熟肽编码基因)，扩增条件为：100μl体系，94℃、5min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，共35个循环，pfu高保真Taq酶扩增(下同)；F2、R2为上、下游引物，扩增黑鲷hepcidin基因(包含前导肽和成熟肽编码基因)，反应条件为：100μl体系，94℃、5min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，35个循环。分别利用琼脂糖凝胶回收两种hepcidin基因后各去5μl作为搭桥模板，并以F1、R2为上、下游引物扩增hepcidins(hepcidin-linker-hepcidin)串联序列。PCR扩增条件如下：100μl体系，94℃、5min，94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，5个循环，只改变退火温度为65℃后再反应30个循环。三步PCR扩增目的片段的回收操作如下：PCR扩增产物用1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳分离后，切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，按照Qiaquick Gel Extraction Kit(购自QIAGEN)说明书操作回收DNA片断。因为大黄鱼hepcidin和黑鲷hepcidin前导肽和成熟肽有超过62％得同源性，并且两者下游引物序列只相差两个碱基，所以很容易相互配对，当使用F1、R2配对引物时，便能扩增出两条DNA带型，较小的是大黄鱼hepcidin序列，较大的是hepcidins串联序列，当进行回收时，只切下较大的hepcidins序列。表达载体pET32/hepcidins中目的融合基因对应的氨基酸序列如下，其目的基因表达产物包含肠激酶切位点、6×His-Tag和连接肽氨基酸序列(将其编码的串联多肽序列命名为hepcidins)：

(3)hepcidins目的片段与pET32a载体的酶切、连接与鉴定：用NcoI和XhoI双限制性内切酶酶切hepcidins目的片段和pET32a载体，置于37℃温箱，8h以上，利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切后hepcidins片段和pET32a线性载体，回收后的片段再进行琼脂糖凝胶电泳检测，依照回收量配制10μl连接体系，采用T4连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)，16℃冷循环水浴过夜，次日按照常规方法转化感受态DH5a，次日用无菌牙签挑取10-20个阳性克隆，以F1和R2为配对引物，菌落PCR鉴定克隆子，再选取两个PCR阳性克隆接种6ml LB液体培养基中，37℃200rpm摇床培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，用NcoI和XhoI双限制性内切酶酶切重组质粒，反应体系为质粒10μl，10×酶反应缓冲液2μl，限制性内切酶各1μl，无菌MiliQ水补至总反应体积20μl，于37℃温箱反应3h；取8μl反应液进行2％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳鉴定。将能够被酶切的重组阳性克隆送公司进行DNA核苷酸序列测定。

根据大黄鱼抗菌肽PC-hepc基因和黑鲷抗菌肽AS-hepc2基因合成F1、R1、F2、R2四条引物，其中引物F1和引物R1配对扩增大黄鱼hepcidin基因，引物F2和引物R2配对扩增黑鲷hepcidin基因，引物F1和引物R2配对，与相应模板反应可扩增的hepcidins串联目的产物；35个PCR反应后，分别得到大黄鱼hepcidin基因、真鲷hepcidin基因和hepcidin串联基因，琼脂糖凝胶电泳分别显示大小为：212bp、222bp和416bp(参见图1)。

2.pET32/hepcidins重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

1)小量诱导表达：用质粒小量提取试剂盒提取经测序鉴定正确的pET32/hepcidins重组质粒，用热击法将pET32a空质粒和pET32/hepcidins重组质粒分别转化至BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于表达用LB琼脂平板(含50μg/ml Amp)，37℃培养过夜；挑取若干pET32a空质粒和pET32/hepcidins重组质粒转化平板生长的单菌落，分别接种于10ml LB表达用培养基中(含50μg/ml Amp)，200rpm/min，37℃培养至菌浓度OD600约为0.5～0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.4mMol/ml，在29℃、180rpm，摇床培养7h。离心收集菌体，用PBS约20ml悬浮菌体，超声破碎后，12000rpm，30min离心超声液，取上清，以12％分离胶进行SDS-PAGE电泳，可见菌体上清中可溶性的表达产物(参见图2)。

3.亲和层析法纯化hepcidin融合表达产物

1)上柱样品的制备

将具有较高可溶性表达hepcidin的菌株，大量诱导表达1升LB培养基，离心收集菌体；用预冷的PBS(15ml/g湿菌)悬浮菌体，冰浴放置30min；冰浴下超声破碎菌体至菌液较清无粘性；12,000rpm高速冷冻离心30min，取上清用0.45μm膜过滤后，至此准备好了上柱样品。

2)准备金属鏊合层析柱

金属鏊合层析填料为sepharose fast flow(GE Healthcare)，亲和层析介质装柱后，先过5ml溶液A鏊合Ni2+金属离子，用3个柱体积MiliQ水洗柱；再过3个柱体积的溶液B洗去多余的Ni2+，并用3个柱体积MiliQ水洗柱；接着过5个柱体积溶液C平衡层析柱，等待上样。

层析试剂为：

溶液A：200mM硫酸镍；

溶液B：25mM NaH2PO4+500mM NaCl pH 4.0(用磷酸调pH)；

溶液C：50mM磷酸缓冲液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；

溶液D：50mM磷酸缓冲液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；

全部溶液用0.45μm滤膜过滤。

3)上柱纯化

将过滤后的可溶性上清液全部上柱，同时用10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；再用5个柱体积的溶液D过柱洗脱目标蛋白；收集洗脱峰，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定，通过凝胶扫描计算得知，扫描凝纯化后的融合表达产物具有90％以上的纯度(参见图3)。

4.Hepcidin串联融合蛋白的酶切反应

将融合蛋白于Tris-Cl缓冲液(20mM Tris-Cl，150mM NaCl(pH 8.0))中低温透析，充分透析后按照带6×His重组肠激酶(广州中大生物科技有限公司)操作手册对该融合蛋白进行酶切(参见图4)。因为融合蛋白酶切后能得到不带标签序列和融合蛋白的hepcidins多肽(hepcidins)，而未完全切割和载体蛋白及重组肠激酶均有6×His标签，酶切后混合物用酶切缓冲液适当稀释后以1.5ml/min流速过Ni²⁺亲和层析柱，收集穿过峰后，便得到目的多肽(参见图5)。Hepcidins多肽从缓冲液(50mM Tris-Cl、50mM NaCl pH 8.0)缓慢更换透析液至超纯水中，去除多肽中盐类成分。再以0.22μm膜过滤除菌后-80℃低温冰箱冻存至低温冷冻干燥而浓缩目的多肽。冷冻干燥处理后的样品置于-20℃冰箱保存。

5.Hepcidin串联蛋白抗菌活性的测定

1)应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线。根据公式可计算出hepcidins融合表达蛋白的浓度。

2)Hepcidins串联多肽抗菌活性的测定

(1)通过测定最小抑菌浓度来评价hepcidins串联多肽的抗菌活性。

①蛋白样品的稀释

目的蛋白的稀释按照MIC设定浓度进行，用μM为单位进行稀释配比，如96、48、24、12、6、3、1.5μM为梯度在96孔微量培养板上进行。蛋白样品要经过0.22μm过滤膜过滤除菌菌再进行稀释配比，每个浓度设置一个平行孔。

②取被测细菌，在MH平板上划线，倒置培养12～16h；挑取单克隆接种于MH斜面，继续培养过夜达到中期对数生长阶段；用DPBS清洗斜面培养物，调整稀释至OD600＝0.1，取18μl OD600＝0.1的稀释菌加入终体积为1ml的MH稀释培养基(DPBS：600μl，MH：400μ1)中，该菌浓度则为MIC工作浓度。其中表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌培养温度为37℃，副溶血弧菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌培养温度为28℃。

(2)MIC在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样：

①空白对照组：加50μl蛋白样品和50μl DPBS；

②阴性对照组：加50μl菌悬液和50μl DPBS；

③样品实验组：加50μd待测各浓度蛋白样品和50μl菌悬液；

28℃培养24h后，判定hepcidins串联多肽对细菌的MIC，判定标准为该浓度孔细菌数少于或等于对照孔(没有抗菌肽成分)中的一半。

结果表明，串联hepcidins多肽对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌模式菌和腊状芽孢杆菌(均购自中国科学院微生物研究所(CGMCC)菌种保藏中心)均具有剂量依赖的抑菌活性，hepcidins串联多肽抗菌活性参见表1。

表1

菌种名称	菌种来源及编号	MIC(μM)
			表皮葡萄球菌	CGMCC 1.2429	3～6
金黄色葡萄球菌	CGMCC 1.363	3～6
			溶壁微球菌	CGMCC 1.643	6～12
枯草芽孢杆菌	CGMCC 1.108	12～24
			谷氨酸棒杆菌	CGMCC 1.1886	12～24
嗜水气单胞菌	CGMCC 1.1801	6～12
			大肠杆菌模式菌	CGMCC 1.2389	＞48
腊状芽孢杆菌	CGMCC 1.447	＞48

(3)以10倍MIC(60μM)浓度剂量hepcidins多肽对金黄色葡萄球菌进行杀灭分析，设定固定的时间间隔从培养孔中吸取相等的体积，进行同样的适当稀释后接种到普通琼脂板，次日计数每板克隆，曲线图中CFU为各个时间点(Tn)平板克隆数与起点(即0min，T0)克隆数的比值：CFU＝Tn/T0*100％(n＝15、30、60、90、120和180min)(参见图6)。

Claims (2)

1.两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物，其特征在于所述两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物的串联抗菌肽hepcidins基因分别来自于大黄鱼抗菌肽hepcidin和黑鲷抗菌肽hepcidin2，均包含前导肽基因，两者通过连接肽编码基因相连，大黄鱼抗菌肽hepcidin的编码序列为：

gccatggcga atggtgtccc agccaatgaa gagcaagagc tggagcagca aatttatttt    60

gctgatccag agatgccagt ggaatcatgc aagatgccgt attacatgcg tgagaatcgt    120

cagggcagcc ctgctagatg caggttttgc tgccgttgct gtcctagaat gaggggatgt    180

ggtatctgct gcaggttc                                                  198

黑鲷抗菌肽hepcidin2的编码序列为：

ggctcattca ctgaggtgca agagccggag gagccaatga acaatgagag tccagttgct    60

gcacatgaag agaagtcaga ggagtcctgg aagatgccgt ataacaacag acacaagcgc    120

agccccgctg gttgtcgctt ttgctgcggt tgctgtccta acatgagagg atgtggtgtc    180

tgctgcaggt tctaactcga g                                              201

连接肽的编码序列为：

5’-ggttctccaggttccggt-3’；

所述大黄鱼抗菌肽hepcidin基因和黑鲷抗菌肽hepcidin2基因在美国国家生物技术信息中心Genbank登录号分别为：EU443735和AY669377。

2.如权利要求1所述的两种鱼类抗菌肽基因的串联表达产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)重组表达载体pET32/hepcidins的构建

(1)根据大黄鱼抗菌肽hepcidin基因和黑鲷抗菌肽hepcidin2基因合成以下4条引物：

F1：5′-CACCCATGGCGGTCCCAGCCAATGAAGAGCAAG-3′

R1：5′-ACCGGAACCTGGAGAACCGAACCTGCAGCAGATACC-3′

F2：5′-GGTTCTCCAGGTTCCGGTGGCTCATTCACTGAGGTGC-3′

R2：5′-CAGCTCGAGTTAGAACCTGCAGCAGACACCAC-3′

其中F1、R1配对扩增大黄鱼hepcidin基因，F2、R2配对扩增黑鲷hepcidin2基因，F1、R2配对，与相应模板反应可扩增的hepcidins串联目的产物；35个PCR反应后，分别得到大黄鱼hepcidin基因、黑鲷hepcidin2基因和hepcidins串联基因，琼脂糖凝胶电泳分别显示大小为：212bp、222bp和416bp；

(2)将回收的hepcidins PCR产物和pET32a载体用NcoI和XhoI进行双酶切，得到具有与处理好的预连接DNA片段和pET32a线性载体，通过基因克隆常规方法进行连接、转化和单克隆筛选及鉴定，酶切和测序结果显示hepcidins串联序列成功插入到表达载体并且读码正确；

2)pET32/hepcidin重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达

用热击法将pET32a空质粒和pET32/hepcidins重组质粒分别转化至BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达，以pET32a空质粒转化的BL21(DE3)为对照，采用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达量；

3)pET32/hepcidins重组质粒融合表达产物的纯化

(1)hepcidins融合表达产物的可溶性分析

将pET32/hepcidins重组质粒在大肠杆菌中的表达产物离心收集菌体，用PBS悬浮菌体，超声破碎；离心超声液取上清进行SDS-PAGE电泳，确认表达产物的可溶性；

(2)亲和层析法纯化hepcidins串联基因

将具有较高可溶性表达hepcidin的菌株大量诱导表达后收集菌体，采用金属鏊合层析柱进行亲和层析，金属鏊合层析填料为chelating sepharose fast flow，所用层析试剂为：

溶液A：200mM硫酸镍；

溶液B：25mM NaH₂PO₄+500mM NaCl pH 4.0；

溶液C：50mM磷酸缓冲液+200mM NaCl+40mM咪唑pH 8.0；

溶液D：50mM磷酸缓冲液+150mM NaCl+400mM咪唑pH 8.0；

所述溶液A为Ni²⁺金属离子，溶液B洗去多余的Ni²⁺，溶液C平衡层析柱，将经0.45μm滤膜过滤后的表达菌超声上清液上柱，溶液C过柱洗去未结合的蛋白，溶液D过柱洗脱目标蛋白，收集洗脱峰，经SDS-PAGE电泳鉴定即为hepcidins融合表达产物；

(3)融合蛋白的酶切反应和不带标签hepcidins多肽的纯化

将融合蛋白于20mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 8.0 Tris-Cl缓冲液中低温透析，充分透析后按照带6×His重组肠激酶操作手册对该融合蛋白进行酶切，因为融合蛋白酶切后能得到不带标签序列和融合蛋白的hepcidins多肽，而未完全切割和载体蛋白及重组肠激酶均有6×His标签，酶切后混合物用酶切缓冲液适当稀释后以1.5ml/min流速过Ni²⁺亲和层析柱，收集穿过峰后，便得到目的多肽；Hepcidins多肽从缓冲液E缓慢更换透析液至超纯水中，去除多肽中盐类成分；再以0.22μm膜过滤除菌后-80℃低温冰箱冻存至低温冷冻干燥而浓缩目的多肽，冷冻干燥处理后的样品置于-20℃冰箱保存；所述缓冲液E为50mM Tris-Cl、50mM NaCl pH8.0；

(4)Hepcidins串联多肽抗菌活性的测定

a.微滴定肉汤稀释方法：通过测定最小抑菌浓度来评价hepcidins串联多肽的抗菌活性；

b.以最小抑菌浓度10倍MIC浓度剂量hepcidins多肽对金黄色葡萄球菌进行杀灭分析，设定固定的时间间隔从培养孔中吸取相等的体积，进行同样的稀释后接种到普通琼脂板，次日计数每板克隆。

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