CN101899409B - 一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌及其应用 - Google Patents
一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌，其分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CLW17，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010158。本发明还公开了上述南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌在南方红豆杉促生长中的应用。本发明菌株在液体摇瓶培养的情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝、江苏锦屏磷矿粉和羟基磷灰石具有较强溶解效果；该菌株制成菌剂分别接种于南方红豆杉扦插苗和实生苗，结果表明，该菌剂能明显促进两者的生长发育。因此，本发明能为将来开发南方红豆杉专用微生物肥料提供优良的菌株资源。
Description
技术领域
本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌及其应用。
背景技术
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)属红豆杉科红豆杉属的一个种，是第四世纪冰川遗留下来的世界珍稀濒危树种。1999年国务院批准将其列为国家一级保护珍贵树种(于永福，1999)。南方红豆杉零星分布于黄河以南地区，包括广东、广西、四川、重庆、山西、湖南和台湾等17个省市区。
自上世纪70年代以来，红豆杉属植物因可提取特效抗癌活性成分紫杉醇而倍受世人的关注。紫杉醇是目前世界上最好的抗癌药物之一。现阶段紫杉醇的生产大多利用红豆杉属天然林提供原料，但该属树种自然繁殖更新能力较低，野生资源十分稀少，远远不能满足市场上的需求。由于长期严重砍伐，造成南方红豆杉天然林数量剧减，目前已处于濒危状态(潘标志，2004；王昌腾，2005)。通过营造大面积的南方红豆杉人工林，能够有效保护该珍贵树种和改善生态环境，满足目前市场所需和紫杉醇产业的可持续发展。但由于该属植物对环境要求较严，传统的人工栽培成活率较低，且生长缓慢远远不能满足市场的需求。金国庆等(2007)研究发现施用化肥能显著促进人工营造南方红豆杉幼林生长。然而，随着全球能源危机和化肥使用量的迅速增加，其负面影响日益显见。因此，探寻新的肥料，尤其是生物质肥料，以替代或部分替代化肥的研究倍受关注。
在营造南方红豆杉人工林过程中，磷素供应不足是突出而具普遍性的问题。磷是植物生长发育的必需营养元素之一，但土壤中95％以上的磷素与土壤中Ca2+、Fe2+和Al3+等金属离子结合而丧失有效性。土壤的磷素循环是以微生物活动为中心的，其对土壤磷的转化和有效性影响很大。早在20世纪初，人们就开始关注微生物与土壤磷素之间的关系。Sackett(1908)首次发现一些原本不溶的磷酸盐和天然磷矿石能被一些细菌所溶解利用。此后，利用根际微生物对难溶性磷的溶解作用来促进植物生长和改善植物磷营养状况的研究得到广泛开展。
研究表明，土壤中存在的某些细菌和部分真菌是最有效的解磷微生物，它们通过溶解和矿化作用能将土壤中难溶性无机磷和有机磷转化为有效态磷，供植物所吸收利用(Whitelaw et al.，1999)。据不完全统计，目前全世界共筛选出30属89种解磷微生物，其中对解磷细菌开展的研究较多。解磷细菌作为土壤磷循环中一类重要的微生物，能够改善南方红豆杉的磷素供应，使南方红豆杉生长的更快、更好。目前，有关南方红豆杉根际高效解磷细菌菌株的筛选及应用研究未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
从山西省长治市长治林业局院内30年生南方红豆杉根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CLW17。保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2010158，保藏日为2010年6月24日。
CCTCC NO：M 2010158菌株的主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，颜色浅黄，圆形、边缘整齐；菌体直杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.43×0.64μm～1.89×2.00μm，无芽孢，极生一根或三根鞭毛；好氧，氧化酶反应阳性，接触酶试验阳性，淀粉水解阴性，尿酶试验阳性，精氨酸双水解酶阳性；发酵葡萄糖，M.R.和吲哚试验阴性，V.P.试验阳性；明胶液化阳性，硝酸还原试验阴性，产氨和硫化氢试验阴性，柠檬酸盐生长试验阳性；对青霉素不敏感；产荧光色素；不产类胡萝卜素和脓青素；在KB培养基平板上培养24h后，菌落在366nm波长紫外光下发绿色荧光，菌体在荧光显微镜下自发荧光。
CCTCC NO：M 2010158菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明：菌株CCTCCNO：M 2010158与假单胞菌属(Pseudomonas)同源性都很高，与P.fluorescens的相似度为99％。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
CCTCC NO：M 2010158菌株可将土壤中难溶性无机磷转变为有效态磷供南方红豆杉吸收，促进南方红豆杉生长。
有益效果：本发明的南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌在液体摇培的情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙(Ca3(PO4)3)、磷酸铁(FePO4·4H2O)、磷酸铝(AlPO4)、江苏锦屏磷矿粉和羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)具有较强的溶解效果，与对照(CK)相比，差异极显著；本发明的南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌制成菌剂接种南方红豆杉实生苗。结果表明，该菌剂能明显促进南方红豆杉的生长发育，因此，本发明为将来开发南方红豆杉专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。
附图说明
荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CLW17，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2010158，保藏日为2010年6月24日。
图1为CLW17菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝、江苏锦屏磷矿粉和羟基磷灰石的溶解能力。
具体实施方式
根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：CLW17菌株实验室解磷试验。
解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca3(PO4)35g，MgCl25g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO40.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
解磷培养基B：用羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3，其它成分和含量相同。
解磷培养基C：用磷酸铁(FePO4·4H2O)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3，其它成分和含量相同。
解磷培养基D：用磷酸铝(AlPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3，其它成分和含量相同。
解磷培养基E：用江苏锦屏磷矿粉代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3，其它成分和含量相同。
将活化的CLW17菌株接种NA培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，28℃振荡培养18～24h作为种子液，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到装有50mL解磷培养基A、B、C、D和E的100mL三角瓶中，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理三个重复，28℃，180r/min培养3d后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见图1。
从图1中可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸三钙(Ca3(PO4)3)、磷酸铁(FePO4·4H2O)、磷酸铝(AlPO4)、江苏锦屏磷矿粉和羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)为唯一磷源，培养3d后，CLW17发酵液中可溶性磷含量均高于对照。以上表明，菌株JW-JS1对五种难溶性磷源均具有较强的溶解能力。
实施例2：CLW17温室盆栽试验：
将菌株CLW17活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mLNA培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)的100mL三角瓶中，29℃，200r/min振荡培养48h。发酵液(4℃，6000r/min)离心5min，无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液(108cfu/mL)制成接种剂。接种南方红豆杉(苗龄60天)，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为实生苗5mL/株。每处理6个重复，置于温室统一管理，光照为12h/天，适时浇水。
南方红豆杉接种后150天生长情况见表1，可以看出，接种CLW17能够显著促进南方红豆杉实生苗的生长。与对照(CK)相比，接种CLW17的处理在苗高和茎粗上的增长率分别达到了18.45％和7.54％，促生效果显著。
表1CLW17对南方红豆杉实生苗生长的影响
注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著
Claims (2)
1.一种南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CLW17，其特征在于，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2010158，2010年6月24日在中国典型培养物保藏中心保藏。
2.权利要求1所述的南方红豆杉根际高效解磷荧光假单胞菌在促进南方红豆杉生长中的应用。
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