CN101883842A - 在栅栏内用短期连接体形成细胞结构 - Google Patents

Abstract

在形成细胞结构的方法中，向被栅栏部分围绕的体积部分提供细胞和短期连接体。所述连接体有利于相邻细胞的最初粘附，以形成细胞集合体。所述栅栏构成了其大小能留住所述细胞集合体的分布式开口。向所述体积部分提供包含细胞培养基的流体。通过开口从所述体积部分收回流体。培养在所述体积部分内留住的聚集细胞，以形成细胞结构。提供一种细胞培养装置，其包括管道和管道内的栅栏。流体在所述管道内流动。所述流体包含细胞、短期连接体和细胞培养基。所述栅栏留住了在所述流体内形成的聚集细胞，并构成了允许所述流体流经的分布式开口。

Description

在栅栏内用短期连接体形成细胞结构

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2007年10月11日提交的第60/960,743号美国临时申请的优先权，将该申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及细胞结构的形成，具体而言，涉及用于形成三维(3D)细胞结构的方法和装置。

背景技术

由于三维(3D)细胞结构能够比2D细胞培养物更接近地模拟体内的细胞行为，因此其十分重要。例如，对体内组织具有高逼真度的3D体外组织模型在组织工程学和病理性模型的建立中具有重要的应用价值，并且能将其用于研究和测试潜在的治疗制剂的作用和机理。

在常规技术中形成3D细胞培养物的困难为通过3D细胞结构的内部区域来提供物质(如细胞培养基)的有效输送。由于通常是用灌注通过细胞结构来输送物质，因此当细胞结构具有较大体积时，通过该细胞结构输送物质就更加困难。在一些常规技术中，为了形成微型细胞结构，将细胞包被在细胞外支撑物内，例如包被在为细胞结构提供3D细胞外基质(ECM)支撑物的水凝胶或薄层基质中。该细胞外支撑物形成了限制向细胞输送物质的屏障。

发明内容

因此，需要在有利于通过细胞结构输送物质的环境中形成细胞结构。已经发现，用短期连接体(transient linker)和流体管道内的栅栏能够有效地形成微型细胞结构。最初，短期连接体连接细胞，以形成细胞集合体，但不会形成限制向细胞或从细胞输送物质的永久性屏障。栅栏留住了聚集的细胞但具有分布式开口以利于通过在形成的细胞结构内的不同区域来输送物质。栅栏可包括大致排列成U型图形的多个微型柱体，其中，相邻柱体间的间隙允许流体交通，但间隙的大小能留住聚集的细胞。

根据本发明的一个方面，其提供了一种形成细胞结构的方法。该方法包括向被栅栏部分围绕的体积部分(volume)提供细胞和短期连接体。连接体有利于相邻细胞的最初粘附，以形成细胞集合体。栅栏构成了分布式开口，开口的大小能留住细胞集合体。向该体积部分提供包含细胞培养基的流体。通过开口从该体积部分收回流体。培养保留在该体积部分内的聚集细胞，以形成细胞结构。在向该体积部分提供流体前，可将细胞悬浮在流体中并可将连接体溶解在流体中。可以保持通过该体积部分的流体的流动。流体中的细胞的密度可为约5百万至约6百万个细胞/mL，并且流体中的短期连接体的浓度可为约6μM至约8μM。所述开口可以为分布式的，以利于通过细胞结构灌注细胞培养基。可将栅栏设置在管道内，并且流体可以流经该管道。管道可包括底部和从底部延伸的相对的侧壁。栅栏可包括从底部延伸并在侧壁之间的多个突起物。该突起物可包括微型柱体。可将该微型柱体大致排列成U型的图形。两个相邻的微型柱体间的间隙可为约10微米至约50微米。连接体可包含聚乙烯亚胺主链和与主链键合的酰肼基。连接体的分子量可为约2000道尔顿至约20000道尔顿。细胞可包括HepG2细胞或大鼠骨髓干细胞。细胞可包含醛基。细胞可包括已经被修饰而在修饰的细胞的表面上形成醛基的细胞。通过在分布式开口的下游施加抽吸力可以驱使流体的流动。

根据本发明的另一个方面，其提供了一种细胞培养装置。该装置包括：管道；在该管道内流动的流体，该流体包含细胞、短期连接体和细胞培养基，该连接体有利于相邻细胞的最初粘附，以形成细胞集合体；以及用于留住在流体中形成的聚集细胞的管道内的栅栏，该栅栏构成了允许流体流过的分布式开口。栅栏可包括大致排列成U形图形的多个突起物。突起物可包括微型柱体。管道可具有底部和从底部延伸的相对的侧壁，并且突起物可从底部延伸。流体中的细胞的密度可为约5百万至约6百万个细胞/mL，并且流体中的短期连接体的浓度可为约6μM至约8μM。细胞可悬浮在流体中。连接体可溶解在流体中。连接体可包含聚乙烯亚胺主链和与主链键合的酰肼基。连接体的分子量可为约2000道尔顿至约20000道尔顿。细胞可包含醛基。细胞可包括HepG2细胞或大鼠骨髓干细胞。通过在分布式开口的下游施加抽吸力可以驱使流体的流动。

当结合附图回顾对本发明的具体实施方式的下列描述时，对本领域普通技术人员而言，本发明的其他方面和特点将变得清晰。

附图说明

在仅以示例的方式说明了本发明的实施方式的附图中，

图1为用于形成细胞培养结构的流体管道(本发明的示例性实施方式)的透视图；

图2和3为图1的流体管道在使用过程中的俯视平面图；

图4为根据本发明的实施方式形成的代表性3D细胞集合体的共聚焦图像；

图5为根据本发明的实施方式形成的代表性3D细胞集合体的扫描电子显微照片(SEM)；

图6为根据本发明的实施方式在微型流体通道内形成的代表性细胞结构的透射光图像；

图7为在图6的微型流体通道内但在不同的条件下形成的对照细胞结构的透射光图像；

图8至11为在不同流速下形成的代表性细胞结构的共聚焦图像；

图12为显示活细胞百分比与流速的相关性的柱形图；

图13为在根据本发明的实施方式形成的流体通道内灌注HepG2细胞的细胞培养物的共聚焦图像；

图14为图13的细胞培养物的透射光图像；

图15为在根据本发明的实施方式形成的流体通道内灌注原代大鼠骨髓干细胞的细胞培养物的共聚焦图像；

图16为图15的细胞培养物的透射光图像；

图17为说明用于形成细胞培养物的可选择性的流体管道的示意图，其为本发明的实施方式的示例；以及

图18为用于形成细胞培养物的另一个流体管道的透视图，其为本发明的实施方式的示例。

具体实施方式

图1、2和3显示了用于形成和培养细胞结构的流体管道100，该流体管道为本发明的实施方式的示例。流体管道100可以形成流体装置或者为该装置内用于提供流体通道的那部分。该装置可具有未在图1、2和3中显示的其他部件或特征，用于提供在特殊应用中使用该装置可能需要的功能。

流体管道100具有底部102、从底部102延伸的相对的侧壁104、入口106、出口108和盖子(未显示)。入口106与流体来源(未显示)流通用于向管道100提供流体。出口108与流体接受器(未显示)流通用于从管道100收回流体。入口106和出口108也可以通过不同的输入和输出管道(未显示，但参见图17)分别与其他流体提供器或接收器流通。盖子覆盖管道100的顶部以提供外壳。

由管道100限定的流体通道的形状和大小可根据具体的应用(包括要形成的细胞培养结构的形状和大小)来选择。为了形成微型细胞培养物，管道100内的流体通道的宽度和高度可小于1mm。例如，在一些实施方式中，管道100通常可具有高度从约50微米至约500微米变化的矩形横截面。

根据具体的应用，管道100可由任何适合的材料形成。例如，底部102和侧壁104(和顶部)可由玻璃、塑料或聚合物材料或者其组合来形成。适合的聚合物可包括聚碳酸酯、聚丙烯酸、厚-光刻胶环氧树脂(例如，由美国，马萨诸塞州的MicroChem公司生产的SU-8系列中的化合物)、聚甲醛、聚酰胺、聚对苯二酸聚丁二醇酯(polybutylenterephthalate)、聚亚苯基醚、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酯薄膜、聚氨基甲酸酯、聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、氟聚硅氧烷或其组合物或混合物。使用适合的可聚合材料可形成所述聚合物，适合的可聚合材料包括单体、构成低聚物的嵌段或任何适合的前体分子。管道100的不同部分可由相同或不同的材料形成。

将大致排列成U-型图形并与侧壁104间隔一定距离的多个微型柱体110设置在管道100内。U-型图形的开口端朝向入口106，而该U-型图形的部分封闭端朝向出口108。相邻的微型柱体110间的间隙可为约10微米至约50微米。可选择间隙的大小以提供所需的通过该间隙的灌注速度，这将在下文中进一步说明。微型柱体110可具有任何适合的横截面形状。微型柱体110的宽度可以变化，例如在10微米至50微米的范围内。可根据要形成的所需细胞结构来选择柱体的高度。在一些实施方式中，例如，柱体高度可从约10微米至约500微米变化。在一些实施方式中，柱体可以延伸超过管道100的全高。

微型柱体可由与管道100相同的材料或与其不同的材料形成。

微型柱体100构成了如图1和2中由虚线勾画出的部分封闭的体积部分或细胞生长区112。

非必须地，柱体100可延伸到管道100的顶盖。或者，可设置横条(未显示)来连接相对的成对柱体110的顶端，并且该横条可与管道100的顶盖间隔一定距离。

在一个实施方式中，底部102由玻璃制成，而包括侧壁104、柱体110和顶盖的管道100的其他部分由相同的聚合物形成。侧壁104、柱体110和顶盖可作为整体单元形成。在这种情况下，柱体110从顶盖向下延伸至玻璃底部102。管道110的聚合物部分可通过浇铸形成。模具可为微细加工的硅模具。聚合物部分可与玻璃底部102紧密连接以形成封闭的流体通道。聚合物和玻璃可通过永久性化学结合或使用可移动的紧固件(如夹子)来彼此附着。

在另一实施方式中，管道100可以作为整体形成完整的单元。该单元可由塑料、聚合物等形成。

流体管道100和微型柱体110可采用任何适合的微细加工技术来加工。可采用已知的技术来处理流体管道100和微型柱体的表面，以提高在特定应用中的性能。例如，可采用如显微机械加工、复制浇铸(replica moulding)、软刻蚀、反应离子刻蚀(RIE)或深反应离子刻蚀(DRIE)等的微细加工技术来加工包括微型柱体110的流体管道100。

在一个实施方式中，可使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)来形成管道100。首先，通过深反应离子刻蚀来形成硅模板。然后，在该硅模板内浇铸PDMS材料。接着可将浇铸的PDMS结构在氧等离子体中氧化，例如约1分钟，以使PDMS结构与如玻璃盖片的盖板(未显示)化学结合。在使用前可将该装置灭菌。

如在图2和3中更好地说明，在使用时流体114流经管道100和细胞生长区112。

流体114含有细胞培养基和用于最初连接细胞以形成细胞集合体的短期连接体。短期连接体将仅与细胞暂时地粘附并将在相邻细胞形成细胞集合体后与细胞分离。连接体可为短期细胞间聚合物(TIP)连接体。连接体可溶解在流体144中。将用于形成所需细胞结构的细胞116悬浮在流体114中。流体114可包含用于溶解并运送在其中的TIP和其他成分的运送溶剂。使用本领域技术人员已知的任何适合的制备技术可以制备流体114。

所述细胞培养基可含有用于培养所用特定细胞的任何适合材料，这是本领域技术人员能够理解的。例如，培养基可包含细胞生长和培养需要的或理想的营养素。例如，细胞培养基可含有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、最低基础培养基(MEM)、F-10营养素混合物、F-12营养素混合物、由Roswell Park Memorial研究所研制的培养基(RPMI培养基)、伊思考夫氏改良杜尔贝可培养基(IMDM)、葡萄糖、胎牛血清(FCS)、青霉素/链霉素、CO₂、生长因子或其他物质。

细胞116可为通过短期连接体能够形成细胞集合体的细胞，并可包括一种以上类型的细胞。例如，能够通过NaIO₄修饰的含有唾液酸残基的细胞是适合的。在一些实施方式中，可使用具有唾液酸较高表达的细胞。例如，如HepG2人肝脏细胞系、A549人肺上皮细胞系、HeLa人宫颈细胞系、人神经胶质瘤细胞系U87和U251等的细胞系是适合的。如大鼠骨髓间质干细胞和猪的肝细胞的原代细胞也是适合的。

可以选择细胞以使当流体114在流经管道100时它们能够被接种到细胞生长区112内。细胞116可以是表面修饰的以使它们通过短期连接体会聚集。例如，细胞116可为含有醛基或已经经过修饰而含有醛基的细胞。细胞116可由HepG2细胞(人肝脏细胞系)、原代大鼠骨髓干细胞(BMSC)、A549人肺上皮细胞系、HeLa人宫颈细胞系、人神经胶质瘤细胞系U87和U251、原代猪(pig)肝细胞或其他类型的细胞被修饰。

为了培养HepG2和BMSC细胞，细胞培养基可包含DMEM、10％FCS和葡萄糖。对于HepG2细胞，细胞培养基中的葡萄糖含量可以较高，例如，约4.5g/L；而对于BMSC细胞，可以较低，例如约1.0g/L。

在一个实施方式中，可能需要防止细胞与壁表面的牢固粘附，以便可以在管道100内保持所需的流速。通过选择不与特定壁表面粘附的细胞或者通过调节管道100内的流体流速可以避免粘附从而不出现牢固的粘附。

所述培养基可以是成骨性的并可由含有100nM地塞米松、0.05mM抗坏血酸2-磷酸酯和10mM β-磷酸甘油的基础培养基来制备。

选择短期连接体以使其能够最初连接细胞116以使它们彼此粘附并形成细胞集合体122。可选择连接体以使其能够在细胞间建立直接接触并使细胞聚集而形成3D细胞集合体。连接体分子仅与细胞116暂时地结合并能够在细胞已彼此粘附后从粘附细胞分离。与细胞表面粘附的连接体的半衰期可在约1天至约5天的范围内。在一个实施方式中，半衰期可为约12小时或更短。

例如，对于具有表面醛基的细胞，连接体可含有酰肼末端基团，该基团可与醛基反应引起细胞的聚集。在一个实施方式中，酰肼基团可与如聚乙烯亚胺(PEI)主链的聚合物主链共轭或键合。在不同的实施方式中，可以使用其他线性聚合物连接体、树形连接体、两步连接体(two-step linker)等。例如在下列文献中披露了一些适合的短期连接体：Zhao等人，“Dendrimer hydraidesas multivalent transient inter-cellular linkers，”Biomaterials，29(2008)3693-3702；和De Bank等人，“Surface engineering of living myoblasts via selective periodateoxidation，”Biotechnology and bioengineering，vol.81，2003，pp.800-808。

短期连接体将会在细胞形成了集合体后与细胞分离。合适的是，短期连接体不会在细胞周围形成永久性屏障。这就允许向细胞或者从细胞有效地输送物质。此外，这使得细胞建立天然的细胞-细胞相互作用，分泌ECM，并建立细胞-基质相互作用，这可能是3D细胞间支撑需要的。

连接体可基于无毒的低分子量PEI。在一个实施方式中，连接体的分子量可为约2000道尔顿至约20000道尔顿。在PEI臂上的伯胺基可被改变来生成酰肼，酰肼能够与化学修饰的细胞表面上的醛突起反应而聚集细胞。连接体可以在细胞表面短期存留，其半衰期为约2天。可以选择连接体以使依赖贴壁细胞(anchorage-dependent cell)产生它们自己的用于3D支撑的天然环境而无需掺入潜在地阻碍物质输送的外源性生物材料。这样，细胞能够分泌并积累其自身的用于支撑的ECM。

一些细胞需要由基板支撑或锚着于基板上才能存活、生长和繁殖，这些细胞被称为依赖贴壁细胞。例如，哺乳动物细胞(原代细胞和细胞系)就是依赖贴壁的。只要依赖贴壁细胞已经聚集并局限在细胞生长区内，就可以在本发明的实施方式中方便地使用这些细胞，它们通过相邻的细胞来支撑。因此，无需将该细胞固定在如凝胶的外部基质支撑物上。

可将流体的温度保持在适于培养特定细胞的水平。在一个实施方式中，温度可为约37℃。使用加热装置(未显示)和温度控制器(未显示)可以控制管道100内的温度。在一些实施方式中，可将加热器(未显示)埋置在其上设置有管道100的流体装置内。

控制流体流经管道100的流速以使细胞116形成通过TIP连接体最初连接的细胞集合体118。为了保持细胞的成活力(viability)，应该选择流量(每单位面积的流体流动速度)来减少由流体流动对细胞产生的冲击力或使其最小化，同时保持对由微型柱体110俘获的聚集细胞的细胞培养基的充足供应。在一些实施方式中，如果通过在由微型柱体110构成的分布式开口的下游施加抽吸力来驱动流体的流动就可以减少流动冲击作用。例如，通过出口108可以施加有效的抽吸力，如使用流体泵，而不是在入口106施加推动力。

应该理解的是，流体在管道100内流动的局部流量可以是不一致的，并且在通道内的不同区域中和在不同的时间时也可以不同。例如，当细胞集合体在细胞生长区112内聚集时，流入细胞生长区112或流经微型柱体110之间的间隙的流体可能会随着时间减速。如果保持通过管道100的总流速恒定，则流出细胞生长区112的流体可能会随着时间变快。然而，在一些实施方式和应用中，仍然可以通过调节经过管道100的总流速或流量来控制细胞生长区112内或柱体110间的间隙内的物质输送或扩散速度。

能够理解的是，更高的流量可以在生长区内提供更快的扩散，但这也可能增加对细胞的剪切力。因此，可以调节并最优化总流量来实现所需的平衡。

可以使流速或流量以及其他可操作的参数最优化，以使在原位形成的细胞集合体足够大而被柱体110限制，并且足够小而防止流体通道的阻塞。通过流体内的细胞密度和细胞间连接体浓度可以调节细胞集合体的大小。在一些实施方式中，细胞密度可为约5百万至约6百万个细胞/mL，而细胞间连接体浓度可为约6μM至约8μM。在一个实施方式中，细胞密度可为约6百万个细胞/mL，而细胞间连接体浓度可为约6μM。如果细胞密度和连接体浓度太高，则在入口106可能会出现严重的堵塞。如果细胞密度和连接体浓度太低，则细胞聚集太慢而难以在细胞生长区112内有效地俘获细胞。

选择微型柱体110间的间隙大小以使流体114和单个细胞116流过，但是在细胞生长区112内留住细胞集合体118。已经发现在约10微米至约50微米范围内的间隙适于一些细胞。

当流体114流经管道110并通过微型柱体110间的间隙时，细胞集合体118继续生长并最终形成细胞结构120，该细胞结构具有通常由微型柱体110的位置和形状限制并与细胞生长区112一致的形状和尺寸。能够理解的是，可将微型柱体110用于限制细胞集合体，以形成与其尺寸一致的细胞结构。

根据具体应用，可将细胞结构120培养所需的一段时间，例如最多为数周。在形成和培养过程的不同阶段可以调整输入流体114和细胞培养基的含量。

可以观察或监控管道100内的细胞生长。例如，在培养期间可以拍摄细胞集合体或细胞结构的图像。为此目的，管道100的至少一侧可以是透明的。细胞的图像可采用任何适合的技术来获得，例如共聚焦成像、透射光成像、SEM等。

为了成像、标记或其他目的，可将细胞染色，例如通过丝状肌动蛋白染色、上皮细胞钙粘蛋白的免疫染色、冯库萨染色等。通过改变输入流体114的内含物，包括向输入流体114加入适当的染色材料，可以在原位进行染色。

在细胞培养过程中使用的细胞培养基可非必须地再循环。可以设置闭路循环系统(未显示)并且可使用多通道振动泵来循环运送细胞培养基的流体。

根据上述步骤形成的有代表性的细胞集合体和细胞结构的图像和试验结果显示在图4至16中，并在下文中进一步描述。

能够理解的是，可以方便地利用微型柱体110间的开口或间隙来通过细胞结构120内的不同区域灌注培养基，从而增加向该结构及在该结构内的物质输送。

有效的是，微型柱体110在流体管道100内形成栅栏用于留住在流体114内形成的聚集细胞118。

在其他实施方式中，可以形成不同的用于留住聚集细胞的栅栏。例如，栅栏可由柱体、条、线等或其组合来形成。栅栏可以具有一个以上的开口侧。在任何情况下，体积部分都是被栅栏部分围绕的。该体积部分将基本上限定由留住的细胞形成的细胞结构的形状。栅栏应该限定分布式开口以允许流体流经，并有利于通过该体积部分灌注物质。然而，从栅栏收回流体经过的开口的大小至少应该能留住聚集细胞。分布式开口应该设置在栅栏的两个以上的侧面。设置栅栏的形状以使其围绕的体积部分具有所需的形状。在一些实施方式中，如图1所示，栅栏可以具有开口侧。在其他实施方式中，栅栏可以是在所有侧面都至少被部分封闭的。栅栏的一个以上的侧面可以完全封闭(参见，例如图1中管道100的底部102)。能够理解的是，可以通过部分封闭侧面的分布式开口或通过栅栏的开口侧向围出的体积部分提供细胞、短期连接体和细胞培养基。在一些实施方式中，可以通过在栅栏底部或顶部的开口向体积部分提供输入流体。

在一些实施方式中，栅栏可由刚性材料形成。在其他实施方式中，部分栅栏可由柔性材料形成。例如，栅栏的一侧可由如网或膜的柔性材料形成。在一些应用中，当受到流体流动和保留在栅栏内的聚集细胞的挤压时，所述网或膜可具有预先确定的轮廓。

栅栏可具有完全或部分封闭的顶部。

栅栏可以在管道内形成或设置在管道内。管道可具有通道或腔室等的形状。具有分布式开口的栅栏的侧面可以与管道的壁间隔一定距离以允许流体通过开口有效交通。栅栏可以完全或部分浸入运送细胞培养基的流体内。

现在能够理解的是，可以改进在图1至3中显示的排列而仍能实现在本申请提及的一些益处或优点。

例如，图17显示了流体管道200，其具有底部202、侧壁204、入口106、出口208和柱体210。如同前面描述的流体管道100，流体214也流经管道200。这样细胞218形成细胞集合体218并最终形成细胞结构220。入口206与3个输入管道相连，即中间的管道222和两侧的管道224。类似地，出口208与3个输出管道相连，即中间的管道226和两侧的管道228。

在一个实施方式中，管道200的长度可为约10mm，宽度为约0.6mm，且高度为约0.1mm。每个微型柱体210可具有显示的椭圆形横截面，其长轴为约0.5mm而短轴为约0.03mm。相邻柱体间的间隙可为约0.02mm宽。U-型图形的封闭端与开放端间的距离可为约0.2mm。对于这样的排列，根据细胞的大小，接种流体内的细胞密度可为约一百五十万至约一千万个细胞/mL。细胞越大，最佳的细胞密度可以越低。

椭圆形柱体在一些应用中可能具有优势。然而，在不同的应用或实施方式中，柱体可以具有其他的横截面形状。

在使用中，中间的管道222可以与细胞收集器(未显示)连接，用于向管道200提供细胞216。侧面的管道224可与培养基来源连接，用于向管道200提供培养基。短期连接体可溶解在培养基中。可在入口206设置4向阀(未显示)，用于控制流体流动并向管道200输送不同的物质。例如，最初可以开放与中间的管道222连接的阀，然后在已经向管道200提供了足够的细胞后将其关闭。

当向管道200提供细胞时，可以通过侧面的管道228，例如使用注射器泵(未显示)，从管道200抽取流体214。在培养细胞结构220的过程中，可以从所有的管道226和228抽取流体214。

在图1中显示的实施方式的其他变化中，微型柱体110可被限定部分封闭的体积部分和分布式开口的栅栏结构代替。例如，如图18中所示，可以设置其内带有间隔的狭槽或开口的栅栏壁而不是柱体。

图18中显示的流体管道300与图1的流体管道100类似，流体管道300具有底部302、侧壁304、入口306和出口308。设置栅栏壁310来代替柱体110用于留住聚集细胞。在壁310内设置分布式开口312以使培养基流过。

在另一实施方式中，栅栏结构可包括围栏样的筛子或其他类型的过滤装置，用于在允许流体通过筛子或过滤装置被收回的同时留住聚集细胞。

也可以用从管道的底壁延伸的其他突起物来代替微型柱体。例如，可以将在WO 2006/052223(Yu等人，题目为“Cell Culture Device”，2006年5月18日公开)中披露的用于制作微型流体装置的微型柱体排列和技术改良并应用于形成在本发明的实施方式中使用的适合的装置中。将与制作流体装置相关的WO 2006/052223的内容通过引用方式并入本申请。

其中放置栅栏的管道或通道在不同的实施方式中可具有不同的形状和大小。例如，侧壁104并非必须是平行的。

在一些实施方式中，管道可以具有腔室的形状。该腔室通常可具有矩形、圆柱形或球形的形状。也可以将管道的形状或大小设置成能容纳除保留栅栏外的其他流体部件或装置。可以在腔室内的任意所需位置设置管道的入口和出口。还可以在例如底壁、侧壁或顶壁的壁上设置流体进出口来为流体交通提供可选择的或另外的入口/出口。

为了促进使用短期连接体来形成细胞集合体，细胞可以在细胞表面上具有或经修饰而具有反应突起。短期连接体可具有用于与反应突起反应的相应的末端基团来将细胞“粘”在一起。细胞表面可通过酶处理被遗传性修饰或被化学修饰而生成反应突起。例如在下列文献中披露了用于修饰细胞表面的示例性技术：B.Kellam等人，“Chemical modification of mammalian cellsurfaces，”Chem.Soc.Rev.，2003，vol.32，pp.327-337；E.Saxon等人；“Chemical and biological strategies for engineering cell surface glycosylation，”Annu.Rev.cell.Dev.Biol.，2001，vol.17，pp.1-23；S-M.Ong等人，“Transientinter-cellular polymeric linker，”Biomaterials，2007，vol.28，pp.3656-3667(以下称作“Ong”)，将这些文献的全部内容以引用方式并入本申请。

在Ong中披露了用于形成TIP连接体的适合技术。也可以使用其他TIP连接体或用于形成TIP连接体的技术。

在此讨论的实施方式和改进仅为了说明目的而没有穷尽。其他的改进也是可以的。

在此描述的示例性实施方式能够有利地用在多种应用中。

例如，当结合使用短期连接体和微型柱体排列时，可以快速形成3D细胞结构(如在约5分钟内)，并具有精确的形状和尺寸。能够相对容易地实施形成步骤。

因为没有使用永久性的细胞外基质或大块材料来支撑细胞，所以可以通过细胞结构内的不同区域充分并有效地输送物质。由于流体通过柱体间的间隙交通，因此在形成细胞结构期间或之后都可以通过该细胞结构连续灌注。由于没有永久性的外部支撑(例如包被细胞的水凝胶基质)，而流体流动又是连续的，因此使得能够将如氧气和营养质的物质输送到细胞并从细胞输送走如代谢废物的物质。

在如药物试验或生物学研究的特定应用中，改善的物质输送对于向细胞构造递送生物学制剂可能是有用的。

通过使细胞分泌并积聚其自己的ECM从而产生天然的微环境可以实现高水平的仿生学，而无需加入外源性生物材料也无需利用模拟体内血管形成的灌注培养。潜在地，更高级的仿生学能够有助于从体内细胞反应(例如在药物试验或生物学研究中)采集更多预判性结果。

根据本发明的实施方式形成的微型3D细胞结构与大型细胞结构相比能够显示出许多优势。例如，微型3D细胞结构大小更紧密，可具有更高的可处理性，能够提供更快且相关的分析，并且能够减少许多应用中需要的试剂体积。

本申请的实施方式可以使用用于药物试验应用的仿生微芯片。通过在微通道内聚集一种或多种细胞类型可以形成多种组织。使用短期细胞间连接体代替用于细胞支撑的永久性水凝胶能使细胞分泌并聚集用于支撑的天然ECM，而不是依赖外源性生物材料。因此该细胞结构更好地模拟体内的细胞行为。

例如在药物试验中，可以设置多个流体通道来提供高通过量。微通道可以与梯度产生器连接从而能够对不同微通道内的细胞结构同时进行一个浓度范围的药物测试。可将梯度产生器设计成线型、反曲型(sigmoidal)或指数型，因此根据使用者的需要提供多功能性。这样的多元性可能对于改进现有的集成流体回路是有益的，从而为药物试验应用的高通过量提供有效的处理。

可以顺序连接多种流体芯片来进行本申请描述的方法。不同的芯片可用于培养代表不同组织类似物的不同细胞类型。或者，可以在一种芯片上在由微型流体通道连接的不同腔室内培养不同的细胞类型。治疗剂可以通过组织类似物循环并且能够在系统水平上检测它们的作用。这样的排列对基于系统反应评测候选治疗剂是有潜在的益处的，系统反应的等级高于组织反应。潜在地，这种排列可用在许多不同的微型流体装置中。

用透明的管道材料(例如玻璃底部)，在微通道内形成的微米级3D细胞培养物能够用现有的成像形式以高分辨率容易地成像。例如，细胞培养物可以使用相位对比度显微镜、共聚焦激光扫描显微镜或双光子激光显微镜来成像。这使在生理性3D微环境(例如，用于多种动态细胞过程的研究，如上皮细胞极化、蛋白质运输、胞吞作用、跨细胞作用、增殖、凋亡等)中培养的细胞的实时成像成为可能。具体而言，它使在用于包括药物试验的多种应用的3D微环境中的一种细胞的高内涵筛选(high-content screening)成为可能。本发明的实施方式能够使在控制围绕细胞的微环境流体流动的同时以3D培养的哺乳动物的成像成为可能。

本发明的实施方式也可以用于多种疾病的体外模型的建立，例如，癌症形成、肝和肺纤维化或病毒感染。通过引入不同的细胞类型或致病因素，能够建立代表疾病预后的不同阶段的一系列模型。这样的模型对研究疾病形成的潜在机制和测试用于疾病治疗的潜在治疗剂是有用的。

实施例

实施例I

通过向试管中的细胞悬液加入NaIO₄并将得到的混合物温育15分钟，用NaIO₄修饰HepG2细胞(人肝脏细胞系)的细胞表面而在细胞表面上生成醛的突起。

将修饰的细胞悬浮在培养基中。细胞密度为约5百万至6百万个细胞/mL。该培养基包含DMEM、葡萄糖、FCS和青霉素/链霉素。

将TIP连接体也溶解在培养基中。该TIP连接体为与聚乙烯亚胺(PEI)主链连接的多个酰肼形成的聚合物分子。连接体浓度为约6μM至约8μM。

在室温下，使含有细胞和TIP连接体的培养基溶液通过图17中显示的微通道。微型流体通道的大小为1cm(长度)×0.6mm(宽度)×0.1mm(高度)。该微型流体通道具有两个入口和一个出口。一列间隙为0.02mm的0.03mm×0.05mm的椭圆形微型柱体位于微型流体通道的中心部，其构成了宽度为0.2mm的细胞驻留间隔(生长区)。

溶液以不同的流速通过通道。通过在微通道的出口端抽吸流体来驱动流体流动。

观察到在细胞生长区内形成的细胞集合体。在图4中显示了代表性的细胞集合体的共聚焦图像。为了显示细胞表面上的连接体的存在，使用与荧光染料结合的连接体。在图4中的连接体显示为围绕细胞的白色圆形区域。如图4中所示，许多细胞被连接体分子包被并且这些包被细胞中的一些彼此接触，这表明连接体影响了三维细胞间的支撑。

在图5中显示了细胞集合体的SEM图像，其中存在短期连接体，但肉眼看不到。

约5分钟后，在由微型柱体限定的细胞生长区内形成了细胞结构。在图6中显示了在约0.03mL/h的流速下在微通道内形成的代表性细胞结构的透射光图像。

在已经完成接种后，使不含有TIP连接体和细胞的培养基流过流体通道。形成了横截面通常为矩形的条形细胞结构。

实施例II

除了聚集条件不同外，与实施例1相同地形成对比细胞结构。具体而言，对于给定的细胞密度和TIP连接体浓度而言，该流速相对较慢。图7显示了这种细胞结构的透射光图像。能够看到的是，在这些条件下，柱体间的间隙被细胞集合体堵塞。结果，形成的结构不具有界限清楚的形状和尺寸。

实施例III

除了改变流速以确定用于特定装置和细胞测试样品的最佳灌注流速外，与实施例1相同地形成细胞结构。

用1天时间使细胞培养基以选自0.01、0.03、0.06或0.22mL/hr的流速流动形成各种细胞结构。

用荧光活性染色(fluorescence viability staining)评价得到的结构。活细胞被钙黄绿素AM染色。死细胞被碘化丙啶(propidium iodide)染色。

图8、9、10和11显示了分别在0.01、0.03、0.06和0.22mL/hr的流速下形成的代表性的细胞结构的共聚焦图像。

图12中显示了在不同流速下细胞的成活力。能够看出，对于这种特定的排列和这些细胞，在0.03mL/hr的流速下成活力最高(约80％)。在其他流速下，成活力约为50％。

不局限于任何特定的理论，可以预期的是在过高的流速下，施加在细胞上的高剪切力或压力能够造成成活力的降低；而在过低的流速下，物质(营养素)输送的不足能够引起成活力的降低。

实施例IV

以与实施例I中描述的类似步骤使用依赖贴壁细胞(HepG2和大鼠骨干细胞)来形成细胞结构，其中流速为0.03mL/hr，并培养3或14天。观察到用最多为2周的时间在微通道内形成了被充分支撑的3D细胞结构。

使用荧光活性染色来评价细胞的成活力。使用丝状肌动蛋白染色评价结构的3D形态的保持。

在分别培养3或14天后，结果显示了优异的细胞成活力和3D形态的保持。

图13为在培养3天后HepG2细胞形成的代表性细胞结构的共聚焦图像。图14为在微通道内的相同细胞结构的SEM图像。

图15为在培养14天后原代大鼠BMSC细胞形成的代表性细胞结构的共聚焦图像。图16为在微通道内的相同细胞结构的SEM图像。

样品细胞结构的肌动蛋白染色的共聚焦图像(未显示)还显示了在样品结构中的皮层肌动蛋白的分布为典型的3-D形态。

本领域技术人员从本说明书和附图能够理解在上文中未提及的本申请描述的实施方式的其他特征、益处和优点。

当然，上述实施方式仅是为了解释说明绝不是为了限制。所述的实施方式容易进行形成、部件排列、细节和操作顺序的许多改变。本发明意欲在由权利要求限定的范围内涵盖所有这样的改变。

Claims (30)

1.一种形成细胞结构的方法，其包括：

向被栅栏部分围绕的体积部分提供细胞和短期连接体，所述连接体有利于相邻细胞的最初粘附，以形成细胞集合体，所述栅栏构成了其大小能留住所述细胞集合体的分布式开口；

向所述体积部分提供包含细胞培养基的流体；

通过所述开口从所述体积部分收回所述流体；以及

培养在所述体积部分内留住的聚集细胞，以形成细胞结构。

2.权利要求1所述的方法，其中，在向所述体积部分提供所述流体前，将所述细胞悬浮在所述流体中并将所述连接体溶解在所述流体中。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其包括使通过所述体积部分的所述流体保持流动。

4.权利要求3所述的方法，其中，在所述流体中的所述细胞的密度为约5百万至约6百万个细胞/mL，并且在所述流体中的所述短期连接体的浓度为约6μM至约8μM。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述开口为分布式，以有利于通过所述细胞结构灌注所述细胞培养基。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，将所述栅栏设置在管道内，并且所述流体流经所述管道。

7.权利要求6所述的方法，其中，所述管道包括底部和从所述底部延伸的相对的侧壁。

8.权利要求7所述的方法，其中，所述栅栏包括从所述底部延伸并在所述侧壁之间的多个突起物。

9.权利要求8所述的方法，其中，所述突起物包括微型柱体。

10.权利要求9所述的方法，其中，将所述微型柱体大致排列成U-型图形。

11.权利要求10所述的方法，其中，两个相邻的所述微型柱体间的间隙为约10微米至约50微米。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述连接体包含聚乙烯亚胺主链和与所述主链键合的酰肼基团。

13.权利要求12所述的方法，其中，所述连接体的分子量为约2000道尔顿至约20000道尔顿。

14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述细胞包含醛基。

15.权利要求14所述的方法，其中，所述细胞包括已经过修饰而在所述修饰细胞的表面上形成醛基的细胞。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括HepG2细胞或大鼠骨髓干细胞。

17.权利要求3或权利要求4所述的方法，其中，通过在所述分布式开口的下游施加抽吸力来驱使所述流体的所述流动。

18.一种细胞培养装置，其包括：

管道；

在所述管道内流动的流体，所述流体包含细胞、短期连接体和细胞培养基，所述连接体有利于相邻细胞的最初粘附，以形成细胞集合体；以及

在所述管道内的栅栏，所述栅栏用于留住在所述流体内形成的聚集细胞，所述栅栏构成了允许所述流体流经的分布式开口。

19.权利要求18所述的装置，其中，所述栅栏包括大致排列成U-型图形的多个突起物。

20.权利要求19所述的装置，其中，所述突起物包括微型柱体。

21.权利要求19或权利要求20所述的装置，其中，所述管道具有底部和从所述底部延伸的相对的侧壁，所述突起物从所述底部延伸。

22.权利要求18至21中任一项所述的装置，其中，在所述流体中的所述细胞的密度为约5百万至约6百万个细胞/mL，并且在所述流体中的所述短期连接体的浓度为约6μM至约8μM。

23.权利要求18至22中任一项所述的装置，其中，将所述细胞悬浮在所述流体中。

24.权利要求18至23中任一项所述的装置，其中，将所述连接体溶解在所述流体中。

25.权利要求18至24中任一项所述的装置，其中，所述连接体包含聚乙烯亚胺主链和与所述主链键合的酰肼基团。

26.权利要求25所述的装置，其中，所述连接体的分子量为约2000道尔顿至约20000道尔顿。

27.权利要求18至26中任一项所述的装置，其中，所述细胞包含醛基。

28.权利要求27所述的装置，其中，所述细胞包括已经过修饰而在所述修饰细胞的表面上形成醛基的细胞。

29.权利要求18至28中任一项所述的装置，其中，所述细胞包括HepG2细胞或大鼠骨髓干细胞。

30.权利要求18至29中任一项所述的装置，其中，通过在所述分布式开口的下游施加抽吸力来驱动所述流体。

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