CN101880700B

CN101880700B - 一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法

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Publication number: CN101880700B
Application number: CN2010102306901A
Authority: CN
Inventors: 姚强; 高兴喜; 宫志远; 任鹏飞; 任海霞; 韩建东; 刘岩; 李瑾; 曲玲; 赵军胜
Original assignee: Soil and Fertilizer Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Soil and Fertilizer Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-20
Also published as: CN101880700A

Abstract

本发明涉及了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法。该方法是利用灵芝细胞的液体培养，通过在培养基中添加稀土元素镨、钕或镧，提高灵芝多糖的产量。所产灵芝多糖可用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备。

Description

一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种利用稀土元素提高灵芝多糖产量的液体发酵方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝菌属真菌。在中国古代被盛传为仙草，古代医学家发现灵芝通过扶正固本使人体处于平衡状态。灵芝多糖是灵芝最主要的生理活性物质，现代药理学研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、防止动脉硬化等作用。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝多糖的产量成为抑制其应用的限制因素，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，远不能满足人们的需要。研究发现从灵芝子实体或菌丝体得到的灵芝多糖在基本结构上是相同的。采用灵芝液体发酵的方法生产灵芝多糖因为具有生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。

但灵芝多糖的发酵水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展。目前，国内外学者对灵芝多糖的发酵研究主要集中在培养基组成、溶氧、pH值及产物提取分离等工艺层面上，对灵芝多糖发酵水平提高有限，还不能满足现代工业化发酵生产的需要。

稀土元素是化学元素周期表中镧系元素及两个相关元素钪和钇的总称，我国稀土资源丰富，占世界贮量的80％。目前，稀土元素的应用越来越广泛，不仅应用于各工业部门，其在农业、医药、微生物等生物学领域的应用研究也越来越活跃。近年来有关利用稀土元素提高微生物发酵产物的研究也有报道，如王怡平等.稀土元素对红酵母的生长及类胡萝卜素合成的影响.微生物学通报，1999，26(2)：117-119。稀土元素对红菇多糖深层发酵也具有一定的促进作用，参见李增利.稀土元素镨、钕、铒对红菇多糖深层发酵的影响.食品科学，2007，28(12)：312-316。目前，稀土元素在灵芝液体发酵上的应用研究尚未见报道。

CN1264743公开了一种液体发酵法生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺，是以灵芝属Ganodermalucidum(LeyssexFr.)Karst.的菌种接种于有培养基的摇瓶中，回旋培养，发酵4～12天，然后采用常规的方法从发酵产物中收集灵芝多糖和灵芝酸，培养基为常规的含有碳源、氮源、无机盐和维生素成分的培养基，浓硫酸-苯酚法测定胞内和胞外多糖总量为2.34g/L。该方法的不足之处是需要静置培养诱导合成产物的过程，发酵周期长，液体好氧发酵加上静置培养的总发酵时间需20天以上，而一般灵芝产品发酵时间为5～8天，因此其整体的生产效率较低。

发明内容

本发明旨在提供稀土元素在灵芝多糖液体发酵中的应用，同时提供稀土元素在灵芝多糖发酵中的使用方法，从而提供一种工艺简单、成本低廉、效果显著，利用稀土元素提高灵芝多糖产量的液体发酵方法，本方法可用于灵芝多糖的工业化生产。本发明所述灵芝多糖包括胞外多糖和胞内多糖。

本发明技术方案如下：

一种利用稀土元素提高灵芝多糖产量的液体发酵方法，包括以下步骤：

1、稀土元素母液的配制

称取硝酸镨、硝酸钕或硝酸镧中的一种，用蒸馏水配制成浓度1mol/L的溶液，作为稀土元素母液备用。

2、灵芝种子液制备

将灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行发酵培养，PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得到灵芝种子液。

所说的菌种为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCNo.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653。

3、将步骤1配制的稀土元素母液加入到与步骤2相同的PD液体发酵培养基中，制备含有浓度为0.001-0.1mmol/L稀土元素的PD液体培养基。所述稀土元素为镨Pr³⁺、钕Nd³⁺或镧La³⁺。

4、灵芝多糖液体发酵培养

将步骤2获得的灵芝种子液按2～8％体积比接种量接入到步骤3制备的含有浓度为0.001-0.15mmol/L稀土元素的PD液体培养基中，进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得发酵液和灵芝菌丝体。

按现有技术分离发酵液和灵芝菌丝体后，分别提取胞外多糖和胞内多糖。

优选的，上述步骤2中，所述的菌种为菌种编号为CGMCC No.5.644的泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)，菌种编号为CGMCC No.5.533的京大灵芝(Ganoderma lucidum)或菌种编号为CGMCC No.5.534的信州灵芝(Ganoderma lucidum)。其中最优选的菌种为菌种编号为CGMCC No.5.644的泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)。

优选的，上述步骤1中，所述硝酸镨、硝酸钕和硝酸镧的纯度均为99％。

根据上述方法，本发明进一步优选如下：

步骤(2)所述的稀土元素优选为镨Pr³⁺或钕Nd³⁺，最优选的稀土元素为镨Pr³⁺。

步骤(2)所述的稀土元素在PD液体培养基中的浓度优选为镧La³⁺0.01-0.10mmol/L、钕Nd³⁺0.01-0.10mmol/L或镨Pr³⁺0.001-0.01mmol/L。

从发酵液和灵芝菌丝体分别提取胞外多糖和胞内多糖的方法按现有技术，本发明提供以下说明：

胞外多糖提取：取50mL除去灵芝菌丝体的发酵液，加入4倍体积的95％乙醇，混匀后，10000rpm离心10min，取沉淀，用6mL 1N NaOH 60℃溶解1h，即为胞外多糖溶液。

胞内多糖提取：称取0.1g(干重)灵芝菌丝体，用1.0N的NaOH于60℃浸提1h。12000r/min，离心5min，取上清液为胞内多糖溶液。

灵芝多糖的测定，采用本领域通用的浓硫酸-苯酚法测定胞内、胞外多糖。

从上述的胞外多糖测定溶液、胞内多糖测定溶液中分别取样品，按以下方法测定：

从各个样品中吸取5μL于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL水。分别加入5％苯酚试液1.0mL，再迅速滴加浓硫酸各5.0mL，摇匀，冷至室温，测OD 490nm。根据标准曲线计算多糖含量。

本发明所产灵芝多糖可用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备。

本发明与已有技术相比有如下优点：

1、本发明将稀土元素镨Pr³⁺、钕Nd³⁺或镧La³⁺用于灵芝多糖的液体发酵，大幅度提高灵芝多糖的产量，胞内多糖产量可达772.56mg/L，胞外多糖产量可达452.76mg/L，具有很好的工业化应用前景。

2、本发明采用液体好氧发酵方法，周期短，一般为5～8天，无需静置培养诱导合成产物的过程，生产效率较高。

3、本发明所述稀土元素Pr³⁺、钕Nd³⁺或镧La³⁺来源广泛，均具有很好的促进效果，实验方法简便，重复性好。

4、本发明所采用的灵芝液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，更为重要的是整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产。

附图说明

图1是实施例1稀土元素对灵芝胞外多糖产量的影响曲线。

图2是实施例2稀土元素对灵芝胞内多糖产量的影响曲线。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作详细说明：

纯度为99％的硝酸镨、硝酸钕和硝酸镧，天津市光复精细化工研究所购得。

所有灵芝菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

实施例1：

灵芝菌种为泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)，菌种编号为CGMCC No.5.644。

一种利用稀土元素提高灵芝多糖液体发酵方法，具体步骤为：

1、稀土元素母液的配制

分别称取纯度为99％的硝酸镨、硝酸钕和硝酸镧，用蒸馏水分别配制成浓度1mol/L的溶液。作为稀土元素母液备用。

2、灵芝种子液制备

将灵芝菌种CGMCC No.5.644接种到PD液体发酵培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间6天，得到灵芝种子液。

3、取步骤1配制的3种稀土元素母液各3份，分别加入到与步骤2相同的PD液体发酵培养基中，制备含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素的PD液体培养基系列。所述稀土元素为镨Pr³⁺、钕Nd³⁺或镧La³⁺。

4、液体发酵培养

将上述步骤2获得的灵芝种子液按5％(V/V)的接种量分别接入到步骤3制备的含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素的系列PD液体培养基中，分别进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间7天，得发酵液和灵芝菌丝体

5、在15000rpm下离心分离步骤4的产物，得到灵芝菌丝体和除去菌丝体的发酵液。分别按现有技术提取胞外多糖和胞内多糖。

为了考察稀土元素对灵芝胞外多糖产量的影响，进行如下测定：

胞外多糖溶液的制备：取50mL除去菌体的发酵液，加入4倍体积的95％乙醇，混匀后，10000rpm离心10min，取沉淀，用6mL 1N NaOH 60℃溶解1h，即为胞外多糖溶液。

多糖的测定：从各个样品中吸取5.0μL上清液于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL水。分别加入5％苯酚试液1.0mL，再迅速滴加浓硫酸各5.0mL，摇匀，冷至室温，测OD 490nm。根据标准曲线计算多糖含量。结果如图1所示。

由图1可以看出：稀土元素镨、钕和镧均明显促进了灵芝胞外多糖的合成，其中稀土元素镨促进效果最明显，当镨在浓度0.001mmol/L时，灵芝胞外多糖产量为452.76mg/L，是不加稀土元素的对照组(148.45mg/L)的3.05倍；其次，稀土元素钕对灵芝胞外多糖生产促进效果最好，在浓度为0.01mmol/L时，产量达到355.74mmol/L，是对照的2.40倍；而稀土元素镧在浓度为0.01mmol/L时也具有较好的促进作用，产量为186.24mg/L，是对照的1.25倍。图1中稀土元素浓度为0mmol/L时的产量即为空白对照值。

实施例2：

1、稀土元素母液的配制

2、灵芝种子液制备

将灵芝菌种CGMCC No.5.644接种到PD液体发酵培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)中进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间7天，得到灵芝种子液。

4、液体发酵培养

将上述步骤2获得的灵芝种子液按7％(V/V)的接种量分别接入到步骤3制备的含有浓度为0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L稀土元素的系列PD液体培养基中，分别进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间7天，得发酵液和灵芝菌丝体。

为了考察稀土元素对灵芝胞内多糖产量的影响，进行如下测定：

胞内多糖测定溶液的制备：称取0.1g(干重)灵芝菌丝体，用1.0N的NaOH于60℃浸提1h。12000r/min，离心5min，取上清液，作为胞内多糖待测溶液。

多糖的测定：从各个样品中吸取5.0μL上清液于试管中，用蒸馏水定容至1.0mL，摇匀。空白对照为1.0mL水。分别加入5％苯酚试液1.0mL，再迅速滴加浓硫酸各5.0mL，摇匀，冷至室温，测OD 490nm。根据标准曲线计算多糖含量。结果如图2所示。

由图2可知：稀土元素镨Pr³⁺对灵芝胞内多糖的产量促进效果最显著，当镨在浓度为0.01mmol/L时，胞内多糖产量达到772.56mg/L，是对照组的4.67倍；其次是稀土元素钕Nd³⁺，在浓度0.1mmol/L时，胞内多糖产量达到514.12mg/L，是对照的3.10倍；稀土元素镧La³⁺诱导效果，在0.001mmol/L时，胞内多糖产量达到235.40mg/L，仅为对照的1.40倍。图2中稀土元素浓度为0mmol/L时的产量即为空白对照值。

实施例3：如实施例1所述，所不同的是灵芝菌种为京大灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.533；步骤3中所述稀土元素为镨Pr³⁺，结果灵芝胞外多糖产量可达435.22mg/L。

实施例4：如实施例2所述，所不同的是灵芝菌种为京大灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.533；步骤3中所述稀土元素为镧La³⁺，结果灵芝胞内多糖产量可达682.31mg/L。

实施例5：如实施例1所述，所不同的是灵芝菌种为信州灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.534；步骤3中所述稀土元素为钕Nd³⁺，结果灵芝胞外多糖产量可达417.36mg/L。

实施例6：如实施例2所述，所不同的是灵芝菌种为信州灵芝(Ganoderma lucidum)菌种编号为CGMCC No.5.534；步骤3中所述稀土元素为镨Pr³⁺，结果灵芝胞内多糖产量可达702.25mg/L。

Claims

1.一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法，包括以下步骤：

(1)称取硝酸镨、硝酸钕或硝酸镧，用蒸馏水配制成浓度1mol/L的溶液，作为稀土元素母液备用；

(2)将灵芝属Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行发酵培养，PD液体发酵培养基组成为马铃薯200g、葡萄糖20g和蒸馏水1000mL，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得到灵芝种子液；

所说的菌种为CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCNo.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653；

(3)将步骤(1)配制的稀土元素母液加入到与步骤(2)相同的PD液体发酵培养基中，制备含有浓度为0.001-0.1mmol/L稀土元素的PD液体培养基；所述稀土元素为镨Pr³⁺、钕Nd³⁺或镧La³⁺；

(4)将步骤(2)获得的灵芝种子液按2～8％体积比接种量接入到步骤(3)制备的含有浓度为0.001-0.1mmol/L稀土元素的PD液体培养基中，进行发酵培养，培养条件为摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得发酵液和灵芝菌丝体；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的菌种为菌种编号为CGMCCNo.5.644的泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)或菌种编号为CGMCC No.5.533的京大灵芝(Ganoderma lucidum)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的菌种为菌种编号为CGMCCNo.5.644的泰山赤灵芝(Ganoderma lucidum)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的稀土元素在PD液体培养基中的浓度为镧La³⁺0.01-0.10mmol/L、钕Nd³⁺0.01-0.10mmol/L或镨Pr³⁺0.001-0.01mmol/L。