CN101880662B - 东方白鹳的微卫星标记位点引物及遗传学个体识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及东方白鹳的微卫星标记位点引物以及利用微卫星标记位点对东方白鹳进行遗传学个体识别的方法。采集东方白鹳组织并提取基因组DNA；引入分子标记位点引物进行微卫星位点的PCR扩增；对微卫星位点PCR扩增产物的基因分型；利用基因分型结果对东方白鹳的个体进行分析。通过上述高精度的微卫星标记位点，不仅可以在遗传学水平上实现对东方白鹳的个体识别，还可以判断每一个东方白鹳个体之间遗传距离和亲缘关系的远近。本发明将成功运用于对东方白鹳这一濒危动物的繁育保护工作以及科学研究之中。
Description
技术领域
本发明涉及动物分子遗传学领域，特别涉及东方白鹳的微卫星标记位点引物的开发以及利用微卫星标记位点对东方白鹳进行遗传学个体识别的方法。
背景技术
东方白鹳(Ciconia boyciana)是鹳形目(Ciconiiformes)、鹳科(Ciconiidae)的大型涉禽。东方白鹳在历史上曾广泛分布于东亚的多个国家和地区(Collar et a1.，2001)，上世纪70年代以后由于生境片段化、栖息地丧失、过度捕猎等诸多因素影响，东方白鹳野生种群相继在日本、朝鲜、韩国等地灭绝(王岐山，1995；Murata，2004)。目前东方白鹳的全球野生种群数量仅3000只左右，且呈下降趋势(王岐山，杨兆芬，1995)，对该物种的保护已经刻不容缓。因此在IUCN红色物种名录中，被列入濒危(EN)物种，也是CITES附录I物种。
自20世纪80年代中后期起，多家动物园先后对东方白鹳进行了笼养繁殖，目前中国是东方白鹳人工繁殖数量最多的国家。然而在长期的笼养繁殖过程中常常遇到一些问题，如东方白鹳的谱系混乱， 个体之间的亲缘不明等，这也给东方白鹳的人工配对等繁育措施带来困难。对濒危物种的保护不仅要关注栖息地的保护恢复、种群复壮的人工繁育等工作，同时也要重视对其遗传背景的了解(Frankham etal.，2002)，进而制定出科学合理的保育对策。由于缺少高效有力的分子标记，目前对东方白鹳的遗传学的研究还是十分有限，急需从分子遗传学角度对东方白鹳进行保育生物学的研究。其中，通过分子标记来区分个体、实现个体识别，从而为该物种的保育提供技术支撑就变得非常关键。
微卫星(Microsatell ite)是目前在濒危动物保护遗传学研究最理想的一类分子遗传学标记( ，1998)，具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组、选择中性、可扩增、易于检测、重复性好等优势，目前已广泛应用于多种动物的遗传图谱构建、亲子鉴定、个体识别、群体遗传多样性分析等方面研究(Weigend，2001)。但微卫星分子标记具有高度的物种特异性，需要构建微卫星文库以筛选特异的微卫星位点并设计相应的PCR扩增引物。在本申请中，申请人通过构建东方白鹳微卫星文库并对该文库的筛选，获得了东方白鹳特异性的8个微卫星遗传标记，并设计相应的引物，并使用了这些微卫星遗传标记在东方白鹳中实现了分子水平上的个体识别，从而为东方白鹳的谱系分析、婚配计划的制定及遗传背景分析等提供了重要的技术支持。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了东方白鹳的微卫星标记位点引物以及利用微卫星分子标记位点对东方白鹳进行遗传学个体识别的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一目的是提供东方白鹳的微卫星标记位点引物：
Cbo 102-F：5’-AGCAGCTAAATAACCAG-3’
Cbo 102-R：5’-AGAGATTGTCCCCGAGATAC-3’
Cbo 108-F：5’-CCCAGGTCACAAATTATACG-3’
Cbo 108-R：5’-GAGCCTCACAAAGTTCCCTG-3’
Cbo 109-F：5’-GTGGTGTAGTCCAGTTTATG-3’
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Cbo 121-F：5’-CCACAATGGCAATTTTTCAC-3’
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Cbo 133-F：5’-GGACAAAAGGCGATTCTAGC-3’
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Cbo 151-F：5’-AATCTGGTCTTGGTCCTTTC-3’
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Cbo 235-F：5’-TGGCTAAACATCTCCAAAC-3’
Cbo 235-R：5’-TACAAGTAACGCAAGGGTAC-3’。
与所述引物相对应的微卫星位点的指标参数如下表：
本发明的第二目的是提供一种利用东方白鹳微卫星分子标记位点对东方白鹳进行遗传学个体识别的方法，其特征在于：采集东方白鹳组织样品；提取基因组DNA；引入如权利要求1或2所述的分子标记位点引物进行微卫星位点PCR扩增；对微卫星PCR扩增产物的基因分型；利用基因分型结果对东方白鹳的个体分析。
本发明的有益效果为：通过高精度微微卫星遗传标记位点，不仅实现了对东方白鹳这一物种的遗传学个体识别，同时还可以判断每一个东方白鹳个体之间遗传距离和亲缘关系的远近。本发明将成功运用于东方白鹳这一濒危动物的繁育保护工作以及科学研究之中，并将在东方白鹳个体基因身份证的建立、配对选育、家族谱系分析、遗传图谱构建、亲子鉴定、遗传多样性背景分析等多方面体现其价值。
具体实施方式
东方白鹳的微卫星分子标记方法的具体步骤如下：
1、东方白鹳DNA抽提
利用肌肉或者血液组织，提取东方白鹳的基因组DNA。基因组DNA的抽提采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径(Sambrook et al.，1999)。
2、东方白鹳微卫星富集文库的构建
利用提取基因组DNA，采用AFLP快速分离法(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats，FIASCO)来构建微卫星富集文库，具体过程如下：取基因组DNA 250ng左右，使用MseI消化，同时与MseI的AFLP受体接头(5’-TAC TCA GGA CTC AT-3’/5’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3’)进行连接。将消化产物稀释十倍以后，用AFLP受体特异的引物(5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’，简称MseI-N)做PCR扩增。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳30分钟后为大于200bp的弥散带。
使用探针(AC)12或者(AG)12与酶切连接液PCR扩增片段进行杂交后，使用磁珠进行吸附洗脱，即可获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以MseI-N为引物进行双链DNA恢复。PCR反应体积为50μL，反应体系组成为：dNTP 5μL，Buffer 5μL，r Taq 0.5μL，MseI-N Primer 2μL，磁珠洗脱液5μL。PCR的循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec，进行5个循环；进行另外92℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec的30个循环，72℃延伸10min。
PCR产物经PCR清洁试剂盒(Axygen)纯化，并用2％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带则视为成功。将纯化后的双链恢复产物与pMD19-T载体(Takara)连接后转化于DH5-α感受态细胞(Takara)中。将已转化的感受态细胞涂布于添加0.5mM IPTG和0.5μg/mL X-Gal的Amp+LB平板上，在37℃下培养13h，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。
3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计
挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养(37℃，5h)。采用三引物PCR法(Zane et al.，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通用引物(M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针(AC)12/(AG)12进行反应。如果产物出现两条或两条以上的条带即可认为该单克隆含有目的序列，反之则认为无目的序列。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子107个，对这些重组子进行测序。
4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选
检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件(TandemRepeats Finder，Version3.2.1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列(Benson，1999)。使用PRIMER5软件(Lalitha 2000；Singh etal.，1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将目的片段设置为100-200bp之间。共选择28个微卫星重复位点作为备 选标记。
5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得
对初选出的28个微卫星位点的单侧引物5’端进行荧光标记(FAM/HEX/TAMRA)，然后使用23个野生东方白鹳个体的DNA对上述微卫星位点进行筛选，过程如下：首先对待选位点的PCR扩增，循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，Tm温度下退火60sec，72℃延伸60sec，反应30个循环；72℃延伸10min。扩增产物使用Tamara350荧光分子量标准在ABI 377DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用Genescan 2.0软件进行读取。基因分型结果的分析，去除下列备选位点：无基因分型结果的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在23个野生东方白鹳中等位基因在两个以下的位点。经过筛选后，最终获得8个稳定的微卫星位点，位点名称及该位点的引物序列如下表所示：
6、通过8个位点的微卫星基因分型实现对东方白鹳的个体识别
使用上述8个微卫星位点，对23个野生东方白鹳的基因分型结果，如下表所示。通过个体区分分析，在表中的23个个体中，等位基因差异最小的为4个等位基因，占全部16个等位基因的25％，这些4个等位基因差异的个体对为：1号对13号、7号对19号、13号对15号、17号对23号、21号对23号。其它个体之间的等位基因差异均在4个等位基因以上。表中23个野生东方白鹳个体通过这8个微卫星全部区分，从而实现了分子遗传学水平上的个体识别。
<110>安徽大学
<120>东方白鹳的微卫星标记位点引物及遗传学个体识别方法
<140>201010203786.9
<141>2010-06-21
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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tacaagtaac gcaagggtac
Claims (2)
1.东方白鹳的微卫星标记位点引物，其特征在于所述的微卫星标分子标记位点引物序列如下，并且所述微卫星标记位点引物组合使用：
Cbo102-F：5’-AGCAGCTAAATAACCAG-3’
Cbo102-R：5’-AGAGATTGTCCCCGAGATAC-3’
Cbo108-F：5’-CCCAGGTCACAAATTATACG-3’
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Cbo235-F：5’-TGGCTAAACATCTCCAAAC-3’
Cbo235-R：5’-TACAAGTAACGCAAGGGTAC-3’。
2.利用东方白鹳微卫星分子标记位点对东方白鹳进行遗传学个体识别的方法，其特征在于：采集东方白鹳组织样品；提取基因组DNA；引入如权利要求1所述的分子标记位点引物进行微卫星位点PCR扩增；对微卫星PCR扩增产物的基因分型；利用基因分型结果对东方白鹳的个体分析。
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Patent Citations (3)
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