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CN101880246B - 取代苯甲酰脲类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

取代苯甲酰脲类化合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型的取代苯甲酰脲类化合物及其制备方法和药理用途。该类化合物的结构通式如式(I)所示，其中R1、R2和R3的定义如说明书中所述，此类化合物可作为亲环素A(Cyclophilin A，CypA)的小分子抑制剂。CypA是一类具有肽基脯氨酸顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性的蛋白，与体内蛋白质折叠、组装和转运有关。目前研究表明CypA参与了多种生理途径，如自身免疫抑制和HIV-1入侵感染等。因此，本发明涉及的化合物有望开发成为新的免疫抑制药或抗HIV-1药物。

Description

取代苯甲酰脲类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类作为亲环素A的小分子非肽类抑制剂的取代苯甲酰脲类化合物及其制备方法和药理用途，该类化合物可作为免疫抑制剂和抗HIV-1药物。
背景技术
亲环素(Cyclophilin，CyP)的发现与命名起源于它对环孢素(Cyclosporin A，CsA)的高度亲合性，CsA是临床上广泛使用的一种免疫抑制药物(Handschumacher RE等.Science，1984，226：544-547)。CyP是一个保守的蛋白质家族(Gothel SF，Marahiel MA.Cell Mo.Life Sci，1999，55：423-436)，从低等原核生物到哺乳动物都有这类蛋白。该组蛋白的共同特征是具有肽脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性(Takahashi N，HayanoT，Suzuki M.Nature，1989，337：473-475)。依据相对分子量以及亚细胞定位等特征，目前已知人CyP家族有CypA、CypB、CypC和CypD等16种成员，人亲环素A(hCypA)是最重要的，也是研究最广泛的成员(Braaren D，Luban J.EMBO J，2001，20：1300-1309)，它由165个氨基酸组成，相对分子量18,000，约占细胞蛋白总量的0.1％～0.4％，主要位于胞质内。除了作为CsA的体内结合蛋白，在体内外，hCypA都能结合蛋白质并催化加速它们的折叠、装配和转运，起分子伴侣的作用(Freskgard PO等.Science，1992，258：466)。
CypA包含八股反平行β片层，这些β片层组成一个桶状结构，在桶的上下口各有一段α螺旋将桶的两端封闭，CypA的配体结合口袋则位于该桶状结构的侧面(Kallen J等.Nature，1991，353：276-279)，主要由两个大的亚口袋组成：亚口袋A和亚口袋B。亚口袋A主要由Thr73、Gly74、Asn102、Ala103、Thr107、Gly109、Ser110和Gln111等残基组成，它们大部分为亲水性残基；亚口袋B为一深的疏水性凹槽，主要由Phe60、Met61、Phe113和Leu122等残基组成。
CypA与多种疾病密切相关，1993年，Luban等人发现CypA和CypB可以与I型爱滋病毒(HIV-1)的Gag蛋白特异性地结合，而CsA可以有效地抑制Gag-CypA之间的相互作用(Luban J等.Cell，1993，73：1067-1078)；1994年，Franke(Franke EK，Yuan HE.Nature，1994，372：359-362)和Thali等人(Thali M等.Nature，1994，372：363-365)分别在Nature上发表论文报道发现CypA特异性地掺入到HIV-1病毒颗粒中，阻断CypA的掺入，抑制HIV-1的复制，这说明CypA与Gag蛋白的结合是功能相关的(Luban J.Cell，1996，87：1157-1159)。HIV-1的Gag蛋白为一个多蛋白，它在病毒组装、成熟和出芽过程中起着决定性作用(Gamble TR等.Cell，1996，87：1285-1294)。CypA与Gag蛋白中的衣壳蛋白(Capsid，CA；231 residues)区域相结合，通过这一作用，CypA被特异性地包裹进HIV-1病毒颗粒中。但CypA的缺失并不影响病毒的组装、出芽和成熟，它在HIV-1生命周期的早期(病毒逆转录开始之前)是必需的。因此，CypA可能在病毒进入宿主细胞后的脱壳(Uncoating)过程中发挥作用，帮助病毒核心发生解装配(Viral CA core disassembly)。
中国科学院上海药物研究所蒋华良等人(Luo C等.Biochem Biophys ResCommun，2004，321：557-565)通过生物信息学的手段发现：虽然SARS-CoV并不编码CA蛋白，但SARS-CoV N蛋白的Val235～Pro369片断与HIV-1 CA蛋白的N端结构域(残基1～151)具有较高的序列相似性(36.7％)，因此推测SARS-CoV N蛋白可能也与CypA发生相互作用。之后，蛋白-蛋白结合活性实验证实了这一假设：SARS-CoV N蛋白和CypA具有很高的亲和性，KD值约为6～160nM；接下来的定点突变实验初步地确定了SARS-CoV N蛋白的Trp302～Pro310片断为与CypA结合的区域。以上结果说明CypA很有可能参与SARS-CoV的生命活动过程。
hCypA与配体形成的复合物对多重神经元具有保护作用，对于损伤后的轴突、髓鞘均有显著的促再生作用(Yoshimoto T，Siesjo BK.Brain Res，1999，839：283-291)。Andreeva等证实CypA是一种氧化应激诱导分泌的生长因子，介导活性氧介质对细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的激活和血管平滑肌细胞增殖，表明CypA在血管疾病发病机制中发挥重要作用(Andreeva L，Heads R，Green CJ.Int JExp Path，1999，80：305-315)。
除了具有上述生理效应，hCypA关于免疫抑制方面的作用是研究的最深入的。目前公认的免疫抑制作用机制是：hCypA与胞浆内的配体结合，形成的复合物然后与钙调磷酸酶(Calcineurin，CaN)结合并抑制CaN的磷酸化活性(Liu J等.Cell，1991，66：807-815)。CaN在淋巴细胞的活化过程中具有非常重要的作用，它通过脱磷酸化活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cell，NF-AT)，使之活化而移位进入核内，然后参与IL-2和其它一些因子的转录过程。抑制了CaN的磷酸化活性就抑制了具有免疫作用的细胞因子的释放，从而发挥免疫抑制作用。
鉴于CypA在多个生理途径中都发挥作用，因此有关它的抑制剂研究一直是个热点。按结构划分，CypA抑制剂分为三大类：天然产物及其类似物、肽类及拟肽化合物和有机合成小分子化合物。为了克服天然产物的毒副作用，以及肽类化合物的易代谢性，寻找选择性高、活性强的有机合成小分子CypA抑制剂成为必然。
活性分子从头设计法是指分子在合适的算法控制下，在受体结合位点内自动生长，最终形成完整的配体结构。与基于分子对接的虚拟筛选不同，活性分子从头设计法能够在更大的化合物空间进行取样，因此可获得结构全新的化合物结构。活性分子从头设计法在上世纪九十年代得到较大发展，如日本科学家于1992年开发出了LEGEND程序，中国科技大学刘海燕教授等于1999年发表了DycoBlock程序(Proteins 1999，36，462-470)，北京大学来鲁华教授课题组分别于1996年和2000年发表了用于全新结构设计的RASSE程序(J.Chem.Inf.Comput.Sci，1996，36，1187-1194)和LigBuilder程序(J.Mol.Model.2000，6，498-516)，并在此基础上，开发了LigBuilder2.0程序。新版本功能更齐全，完善了结合部位探测功能，并能对药物靶标进行初步的可设计性预测，增加了结构优化模块、锁钥匹配模块和可合成性分析模块，形成了完整的基于蛋白质结构的药物从头设计流程。特别是该程序加入了内置的化学反应数据库(目前包含465个反应)，可以在分子的产生及输出过程中用逆向合成原理对分子的可合成性进行分析，降低了从头药物设计得到的新化学实体的合成难度，突破了从头药物设计程序带来的分子难以合成这一瓶颈。
综上所述，以CypA作为靶标，结合从头药物设计方法和各种水平的生物活性测试试验，设计并合成小分子化合物，对开发靶向CypA的免疫抑制药物或抗HIV-1药物具有重要的现实意义。
综合运用从头药物设计方法和酶抑制活性实验，发明人已经找到了一个取代苯甲酰脲化合物，运用合理药物设计方法针对此化合物进行结构修饰得到一类化合物，并测试了此类化合物在体外酶水平实验测试中抑制CypA的活性。结果证明本申请的化合物具有较强的CypA抑制活性。
发明内容
本发明的一个目的是提供具有抑制CypA作用的新型取代苯甲酰脲类化合物，其结构通式如式(I)所示。
本发明的另一个目的是提供上述取代苯甲酰脲类化合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供作为CypA抑制剂的取代苯甲酰脲类化合物在制备预防或治疗CypA介导的相关疾病(如移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病、自身免疫疾病和HIV-1入侵感染)方面的药物组合物中的应用。
本发明还提供包含治疗有效量的一种或多种上述取代苯甲酰脲类化合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。其中，上述取代苯甲酰脲类化合物占所述药物组合物总重量的0.001-99.9％，更优选占总重量的0.1-90％。
本发明提供具有如下通式(I)结构的取代苯甲酰脲类化合物：
其中：
R1和R2各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的烷基、烷氧基和烷硫基，羟基，硝基，氨基，卤素，氰基，三氟甲基和苄氧基。
R3选自以下结构II，III，IV，V，VI和VII：
Figure G200910050646XD00042
其中，X选自N、O和S；m是0～2的整数；n是1～3的整数；p是0～3的整数；
R4、R5和R6各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的烷基，C1-C4烷氧基，卤素，氰基，硝基，氨基，羟基，三氟甲基，羧基，巯基和C1-C4酰基；
芳香基Ar选自取代或未取代的苯基或萘基，其取代基是1～4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、羧基取代的C1-C6烷氧基、氰基、硝基、氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基和C1-C4酰基的基团。
优选地，通式(I)中，R3选自呫吨基，芴基，2，3-二氢-茚-1-基，R4取代的环己基，R5和R6取代的二苯甲基以及未取代或被1～2个选自卤素、C1-C6直链或支链烷基、羟基、C1-C4烷氧基、羧基、氰基、硝基、氨基、三氟甲基、三氟甲氧基和巯基的基团取代的萘基、苯基、苯甲基和苯乙基；其中，R4、R5和R6各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的烷基，C1-C4烷氧基，卤素，氰基，硝基，氨基，羟基，三氟甲基，羧基，巯基和C1-C4酰基中。
本发明式(I)化合物的第一个优选实施方案是化合物(IA)：
Figure G200910050646XD00051
其中，R3选自以下结构：
Figure G200910050646XD00052
其中，X选自N、O和S；m是0～2的整数；n是1～3的整数；p是0～3的整数；R4、R5和R6各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的烷基，C1-C4烷氧基，卤素，氰基，硝基，氨基，羟基，三氟甲基，羧基，巯基和C1-C4酰基；芳香基Ar选自取代或未取代的苯基或萘基，其取代基是1～4个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4不饱和烃氧基、羧基、羧基取代的C1-C6烷氧基、氰基、硝基、氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基和C1-C4酰基的基团。
本发明式(I)化合物的第二个优选实施方案是化合物(IB)：
Figure G200910050646XD00061
其中，R1和R2各自独立地选自氢，C1-C6直链或支链的烷基、烷氧基和烷硫基，羟基，硝基，氨基，卤素，氰基，三氟甲基和苄氧基。
本发明式(I)化合物的第三个优选实施方案是化合物(IC)：
Figure G200910050646XD00062
其中，R1为氨基或硝基；R2选自氢，C1-C6直链或支链的烷基、烷氧基和烷硫基，羟基，硝基，氨基，卤素，氰基，三氟甲基和苄氧基。
具体地，所述的取代苯甲酰脲类化合物为：
1-(1-呫吨基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-萘-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-苯乙基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-环己基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-苯基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-(4-氟苯基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-(2，3-二氢-茚-1-基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-二苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氰基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-甲氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-甲基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-三氟甲基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2，6-二氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(2，6-二氯苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟-6-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟-6-甲氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-甲氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟-6-苄氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-苄氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-硝基苯甲酰)脲或1-芴-3-(2-胺基苯甲酰)脲。
本发明还提供本申请要求保护的具有通式(I)结构的取代苯甲酰脲类化合物(具体为IA、IB和IC)及其中间体化合物VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV和XV的制备方法，具体合成方法如下。
方法一：IA的合成：
1)将苄醇钠和2，6-二氟苯腈溶于二甲亚砜中，快速升温至110～130℃后搅拌5～10小时。冷至室温，向反应液中加入冰水，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，得白色固体。用乙醇重结晶得白色片状晶体2，6-二苄氧基苯腈(VIII)。
2)将步骤1)得到的化合物VIII溶于苄醇中，并加入氢氧化钾和少量水，120～140℃下搅拌10～15小时。减压蒸馏除去溶剂，向残余物中加入冰水，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，得白色固体。将其用硅胶柱层析分离纯化，得到白色粉末状固体2，6-二苄氧基苯甲酰胺(IX)。
3)将三光气溶于1，2-二氯乙烷中，冰浴冷却至0～5℃，将溶于1，2-二氯乙烷的R3取代胺类化合物(R3-NH2)缓慢滴加入含有三光气的反应液中，加毕，继续冰浴冷却下搅拌反应30分钟，后升温至室温反应1小时，然后加热至回流，当反应液呈无色透明状时，将三乙胺加入反应液中，继续回流30分钟。减压蒸馏除去溶剂，加入甲苯，抽滤，滤液蒸干得到淡黄色固体，为R3取代的异氰酸酯(X)。
4)将步骤2)和步骤3)得到的化合物IX和X溶入甲苯中，加热至回流反应10～15小时。减压蒸除反应溶剂得到淡黄色固体，将其用硅胶柱层析分离纯化，得到1-R3取代-3-(2，6-二苄氧基苯甲酰基)脲(XI)。
5)将步骤4)得到的化合物XI加入45％的溴化氢醋酸溶液中，控温50～70℃下搅拌5～10小时。将反应液倾入冰水中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，得1-R3取代-3-(2，6-二羟基苯甲酰基)脲(IA)。
Figure G200910050646XD00071
其中，R3的定义同上。优选地，R3是呫吨基、萘基、苯甲基、苯乙基、环己基、苯基、4-氟苯基、2，3-二氢-茚-1-基或二苯甲基。
方法二：IB的合成：
1)将9-芴酮与盐酸羟胺加入70％乙醇水溶液中，回流搅拌2～5小时。将反应液倾入冰水中，析出大量黄色固体，抽滤，水洗，干燥，得黄色固体9-芴肟(XII)。
2)将步骤1)得到的化合物XII加入含少量水的醋酸溶液中，加热至回流。将Zn粉缓慢加入反应液中，继续反应1～3小时。将反应液乘热过滤，滤液经减压蒸馏除去大部分溶剂，抽滤，得9-芴胺醋酸盐。将其加入稀盐酸中，冰浴冷却下搅拌10～15小时。抽滤，得9-芴胺盐酸盐。将9-芴胺盐酸盐加入氨水中搅拌1～3小时，抽滤，氨水洗涤并干燥。用石油醚重结晶，得白色针状结晶9-芴胺(XIII)。
3)将三光气溶于1，2-二氯乙烷中，冰浴冷却至0～5℃，将溶于1，2-二氯乙烷的9-芴胺XIII缓慢滴加入含有三光气的反应液中，加毕，继续冰浴冷却下搅拌反应30分钟，后升温至室温反应1小时，然后加热至回流，当反应液呈无色透明状时，将三乙胺加入反应液中，继续回流30分钟。减压蒸馏除去溶剂，加入甲苯，抽滤，滤液蒸干得到淡黄色固体，为9-芴异氰酸酯(XIV)。
4)将步骤3)得到的化合物XIV和R1，R2-二取代苯甲酰胺溶入甲苯中，加热至回流反应10～15小时。减压蒸除反应溶剂得到淡黄色固体，将其用硅胶柱层析分离纯化，得到1-芴-3-(R1，R2-二取代苯甲酰基)脲(IB)。
Figure G200910050646XD00081
其中，R1和R2的定义同上。
优选地，R1为氢时，R2为2-氯、2-氰基、2-氟、2-甲氧基、2-甲基、2-三氟甲基、氢、2-甲巯基或2-苄氧基；
R1为2-氟时，R2为6-氟、6-甲巯基、6-甲氧基或6-苄氧基；
R1为2-氯时，R2为6-氯、6-氟、6-甲巯基或6-甲氧基。
方法三：IC的合成：
1)将2-硝基-R2取代-苯甲酰胺溶于干燥甲苯中，控温20～30℃，慢慢滴加草酰氯，待反应放热结束后，加热回流3-5小时，使悬浮固体全部溶解，反应液变澄清且无氯化氢气体放出，结束反应，将反应液减压蒸馏除去过量的甲苯和草酰氯，得2-硝基-R2取代-苯甲酰异氰酸酯(XV)。
2)将步骤1)得到的化合物XV和IB合成中步骤3)得到的9-芴胺(XIII)溶入甲苯中，加热至回流反应10～15小时。减压蒸除反应溶剂，将残余物用硅胶柱层析分离纯化，得到1-芴-3-(2-硝基-R2取代-苯甲酰基)脲(IC-1)。
3)将步骤2)得到的化合物IC-1，氯化铵和Fe粉投入到THF中，回流反应1～3小时。冷至室温，抽滤，滤液被减压蒸除溶剂，将残余物用硅胶柱层析分离纯化，得1-芴-3-(2-氨基-R2取代-苯甲酰基)脲(IC-2)。
Figure G200910050646XD00091
其中，R2的定义同上。优选地，R2是氢。
附图说明
图1为化合物IA-3对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图2为化合物IA-5对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图3为化合物IB-1对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图4为化合物IB-2对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图5为化合物IB-3对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图6为化合物IB-6对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图7为化合物IB-7对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图8为化合物IB-8对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图9为化合物IB-9对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图10为化合物IB-11对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图11为化合物IB-17对CypA酶活抑制的量效曲线图。
图12为化合物IC-1对CypA酶活抑制的量效曲线图。
具体实施方式
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。
实施例1 2，6-二苄氧基苯腈(中间体VIII)
Figure G200910050646XD00101
将0.5克苄醇钠溶于10毫升二甲亚砜中，搅拌下加入2，6-二氟苯腈。快速升温至115℃后继续搅拌8小时。冷至室温，将100毫升冰水倾入反应液中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，得白色固体。用乙醇重结晶得白色片状晶体中间体VIII。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.19(4H，s，-CH2)，6.60(2H，d，Ar-H)，7.30-7.35(3H，m，Ar-H)，7.38(4H，t)，7.45(4H，d)。
实施例2 2，6-二苄氧基苯甲酰胺(中间体IX)
Figure G200910050646XD00102
将0.4克2，6-二苄基苯腈(VIII)溶于7毫升苄醇中，并加入0.6克KOH和0.1毫升水，130℃下搅拌12小时。减压蒸馏除去溶剂，将100毫升冰水倾入反应液中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥，得白色固体。硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝12/1)，得到白色粉末状固体中间体IX。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.15(4H，s，-CH2)，6.60(2H，d，Ar-H)，7.18-7.48(12H，m，Ar-H)；EI-MS m/z 333.2(M+)，91.1(100％)。
实施例3 1-(1-呫吨基)-3-(2，6-二苄氧基苯甲酰)脲(中间体XI-1)
Figure G200910050646XD00103
将0.5克三光气溶于3毫升1，2-二氯乙烷中，冰浴搅拌至溶解。将0.25克呫吨胺溶于10毫升1，2-二氯乙烷中，并缓慢滴加入含有三光气的反应液中，反应液呈白色混浊。继续冰浴0.5小时后，升温至25℃反应1小时，然后回流加热至反应液呈无色透明状时，将1毫升三乙胺加入反应液中继续回流0.5小时。减压蒸馏除去溶剂，加入10毫升甲苯，抽滤，滤液不经后处理，向其中加入0.25克2，6-二苄氧基苯甲酰胺(IX)，回流反应10小时。减压蒸除溶剂，加水析出固体，将其用硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/4，得到白色固体产物中间体XI-1。收率44％；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.13(4H，s，-CH)，6.39(1H，d，Ar-H)，6.56(2H，t，Ar-H)，6.81(2H，d，Ar-H)，7.03(2H，d，Ar-H)，7.19(2H，t，Ar-H)，7.29(3H，t，Ar-H)，7.39-7.50(10H，m，Ar-H)，9.13(1H，d，-NH)。
实施例4 1-(1-呫吨基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-1))
Figure G200910050646XD00111
将0.3克1-(1-呫吨基)-3-(2，6-二苄氧基苯甲酰)脲(XI-1)加入4毫升45％溴化氢醋酸溶液中，60℃下搅拌6小时。反应液倾入150毫升冰水中，搅拌30分钟，析出大量固体，抽滤，水洗，干燥得灰白色固体，少量乙醚清洗，得白色固体化合物IA-1。收率40％；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：6.23(1H，d，Ar-H)，6.60(2H，t，Ar-H)，6.86(2H，d，Ar-H)，7.05(2H，d，Ar-H)，7.24(2H，t，Ar-H)，7.29(3H，t，Ar-H)，9.34(1H，d，-NH)；EI-MS m/z 376.1(M+)，180.1(100％)。
实施例5 1-萘-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-2))
将实施例3中的呫吨胺替换成1-萘胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得灰白色固体化合物IA-2。收率50％；Mp 203-208℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：6.46(1H，d，-CH)，7.26(1H，s，Ar-H)，7.47-7.64(5H，m，Ar-H)，7.66(1H，d，Ar-H，7.93-8.08(3H，m，Ar-H)，8.21(1H，d，Ar-H)；EI-MS m/z322(M+)，169.1(100％)。
实施例6 1-苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-3))
Figure G200910050646XD00121
将实施例3中的呫吨胺替换成苄胺，其余所需原料、试剂及制备方法同
实施例1～4，得灰白色固体化合物IA-3。收率52％；Mp 210-215℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：4.42(2H，d，-CH2)，6.42(2H，d，Ar-H)，7.18-7.33(6H，m，Ar-H)，8.34(1H，br，Ar-H)，10.54(1H，s，-NH)，11.74(2H，s，-OH)；EI-MS m/z286.1(M+)，136.0(100％)。
实施例7 1-苯乙基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-4))
Figure G200910050646XD00122
将实施例3中的呫吨胺替换成苯乙胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得土黄色固体化合物IA-4。收率67％；Mp 208-212℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.80(2H，t，-CH2)，3.44(2H，q，-CH2)，6.41(2H，d，Ar-H)，7.21-7.30(6H，m，Ar-H)，8.34(1H，br，Ar-H)，10.54(1H，s，-OH)，11.74(2H，s，-OH)；EI-MS m/z 300.1(M+)，136.0(100％)。
实施例8 1-环己基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-5))
Figure G200910050646XD00123
将实施例3中的呫吨胺替换成环己胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得灰白色固体化合物IA-5。收率41％；Mp＞300℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.52-1.68(10H，m，-CH2)，3.60(1H，d，-CH)，6.42(2H，d，Ar-H)，7.22(1H，s，Ar-H)，8.214(1H，br，Ar-H)，10.52(1H，s N-H)，11.68(2H，s，-OH)；EI-MS m/z 278.1(M+)，136.0(100％)。
实施例9 1-苯基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-6))
Figure G200910050646XD00124
将实施例3中的呫吨胺替换成苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得白色固体化合物IA-6。收率40％；Mp 251-255℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：7.02(2H，d，Ar-H)，7.10(2H，d，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.34(1H，t，Ar-H)，7.34-7.53(7H，m，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.78(1H，d，Ar-H)，7.81(2H，d，Ar-H)，8.69(1H，d，Ar-H)，11.23(1H，s，-OH)。EI-MS m/z 272.1(M+)，136.0(100％)。
实施例10 1-(4-氟苯基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-7))
Figure G200910050646XD00131
将实施例3中的呫吨胺替换成4-氟苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得灰白色固体化合物IA-7。收率49％；Mp 192-195℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：7.15(3H，t，Ar-H)，7.35(3H，dd，Ar-H)，8.8(1H，d，Ar-H)；EI-MS m/z 290.1(M+)，136.0(100％)。
实施例11 1-(2，3-二氢-茚-1-基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-8))
Figure G200910050646XD00132
将实施例3中的呫吨胺替换成2，3-二氢-茚-1-胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得浅褐色固体化合物IA-8。收率82％；Mp 250-252℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：1.65(2H，m，-CH2)，2.38(2H，m，-CH2)，2.76-2.87(4H，m，-CH2)，5.13(1H，dd，-CH)，6.15(1H，d，-CH)，6.38(1H，d，Ar-H)，7.17-7.30(7H，m，Ar-H)，8.54(1H，d，Ar-H)，11.65(1H，s，Ar-H)；EI-MS m/z312.1(M+)，132.1(100％)。
实施例12 1-二苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲(化合物IA的一种(IA-9))
Figure G200910050646XD00133
将实施例3中的呫吨胺替换成二苯甲胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1～4，得土黄色固体化合物IA-9。收率70％；Mp 222-224℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：6.08(1H，d，-CH)，6.24(2H，d，Ar-H)，7.11(1H，t，Ar-H)，7.10-7.12(2H，m，Ar-H)，7.32-7.37(8H，m，Ar-H)，9.19(1H，d，Ar-H)；EI-MS m/z 361.1(M+)，302.1(100％)
实施例13 9-芴肟(中间体XII)
Figure G200910050646XD00141
将5克9-芴酮与5克盐酸羟胺加入到50毫升70％乙醇溶液中，回流搅拌3小时。将反应液倾入100毫升冰水中，析出大量黄色固体，抽滤，水洗，干燥得黄色固体产物中间体XII(4.9g，90％)。EI-MS m/z 195.1(M+)，179.1(100％)。
实施例14 9-芴胺(中间体XIII)
Figure G200910050646XD00142
将3克9-芴肟(XII)加入到50毫升95％醋酸水溶液中，加热至回流。将6克Zn粉缓慢加入反应液中，继续反应1小时。将反应液乘热过滤，滤液经减压蒸馏除去大部分溶剂，抽滤，得晶状醋酸盐固体。继续加入60毫升5N盐酸，于冰浴下搅拌12小时。将反应液过滤，得白色9-芴胺盐酸盐固体。将9-芴胺盐酸盐加入100毫升氨水中搅拌2小时，抽滤，氨水洗涤并干燥。用石油醚重结晶，得白色针状结晶中间体XIII。1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：4.91(d，2H，Ar-H)，7.32(t，2H)，7.45(t，2H，Ar-H)，7.71(d，2H，Ar-H)，7.79(d，2H，Ar-H)，7.71(m，1H)；EI-MS m/z 180.1(M+)，180.1(100％)。
实施例15 1-芴-3-(2-氯苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-1))
Figure G200910050646XD00143
将0.5克三光气溶于3毫升1，2-二氯乙烷中，冰浴搅拌至溶解。将0.25克9-芴胺(XIII)溶于10毫升1，2-二氯乙烷中，并缓慢滴加入含有三光气的反应液中，反应液呈白色混浊。继续冰浴0.5小时后升温至25℃反应1小时，然后加热回流至反应液呈无色透明状时，将1毫升三乙胺加入反应液中后继续回流0.5小时。减压蒸馏除去溶剂，加入10毫升甲苯过滤。向滤液中加入0.15克2-氯苯甲酰胺，回流反应12小时。减压蒸除溶剂，将其用硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/2，干燥。得到白色固体产物化合物IB-1。收率41％；Mp 203-205℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.97(1H，d，C-H)，7.37-7.57(8H，m，Ar-H)，7.64(2H，d，Ar-H)，7.88(1H，d，Ar-H)，8.66(1H，d，N-H)，11.61(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 362.2(M+)，180.1(100％)。
实施例16 1-芴-3-(2-氰基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-2))
Figure G200910050646XD00151
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氰基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-2。收率45％；Mp224-226℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.97(1H，d，C-H)，7.29-7.47(4H，m，Ar-H)，7.56-7.71(3H，m，Ar-H)，7.75-7.91(5H，m，N-H)，8.55(1H，d，N-H)，11.47(1H，s，Ar-H)；EI-MS m/z 353.2(M+)，207.1(100％)。
实施例17 1-芴-3-(2-氟苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-3))
Figure G200910050646XD00152
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氟苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-3。收率49％；Mp 272-275℃；1H-NMR (400Hz，DMSO-d6)δ：6.19(1H，d，C-H)，7.22(1H，q，Ar-H)，7.28-7.36(3H，m，Ar-H)，7.41-7.45(2H，t，Ar-H)，7.58(1H，m，Ar-H)，7.70(2H，d，Ar-H)，7.73(2H，d，Ar-H)，8.02(1H，td，Ar-H)，8.71-8.75(2H，m，N-H)；EI-MS m/z346.2(M+)，180.1(100％)。
实施例18 1-芴-3-(2-甲氧基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-4))
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-甲氧基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-4。收率37％；Mp206-209℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.92(3H，s，-OCH3)，6.00(1H，d，C-H)，7.03(1H，q，Ar-H)，7.19(1H，d，Ar-H)，7.34-7.38(2H，d，Ar-H)，7.40-7.47(2H，m，Ar-H)，7.57(2H，t，Ar-H)，7.63(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.88(1H，s，N-H)，10.43(1H，d，N-H)；EI-MS m/z 358.2(M+)，180.1(100％)。
实施例19 1-芴-3-(2-甲基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-5))
Figure G200910050646XD00162
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-甲基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-5。收率47％；Mp206-209℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.43(3H，s，-CH3)，5.99(1H，d，C-H)，7.27(2H，d，Ar-H)，7.38(3H，m，Ar-H)，7.46(3H，t，Ar-H)，7.65(2H，m，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，，8.86(1H，d，N-H)，11.25(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 342.2(M+)，180.1(100％)。
实施例20 1-芴-3-(2-三氟甲基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-6))
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-三氟甲基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得土黄色固体化合物IB-6。收率44％；Mp 272-275℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.97(1H，d，C-H)，7.37-7.46(4H，m，Ar-H)，7.60(2H，d，Ar-H)，7.69(2H，d，Ar-H)，7.70-7.82(2H，m，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.60(1H，d，N-H)，11.25(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 396.2(M+)，180.1(100％)。
实施例21 1-芴-3-(2，6-二氟苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-7))
Figure G200910050646XD00171
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2，6-二氟苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得土黄色固体化合物IB-7。收率68％；Mp252-255℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.94(1H，d，C-H)，7.20(2H，d，Ar-H)，7.36-7.60(4H，m，Ar-H)，7.87(3H，m，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.54(1H，d，N-H)，11.44(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 464.2(M+)，180.1(100％)。
实施例22 1-芴-3-(2，6-二氯苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-8))
Figure G200910050646XD00172
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2，6-二氯苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得浅黄色固体化合物IB-8。收率42％；Mp240-242℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.99(1H，d，C-H)，7.27-7.50(6H，m，Ar-H)，7.50-7.72(3H，m，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.58(1H，d，N-H)，11.51(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 396.2(M+)，180.1(100％)。
实施例23 1-芴-3-(2-氯-6-氟苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-9))
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氯-6-氟苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得浅黄色固体化合物IB-9。收率46％；Mp236-238℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.99(1H，d，C-H)，7.27-7.50(6H，m，Ar-H)，7.50-7.72(3H，m，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.58(1H，d，N-H)，11.51(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 380.2(M+)，180.1(100％)。
实施例24 1-芴-3-(苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-10))
Figure G200910050646XD00181
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-10。收率80％；Mp 241-243℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.97(1H，m)，6.40(4H，m，Ar-H)，7.22(1H，t，Ar-H)，7.35(3H，t，Ar-H)，7.45(3H，t，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.68(1H，dd，Ar-H)；EI-MS m/z 328.2(M+)，180.1(100％)。
实施例25 1-芴-3-(2-氟-6-甲巯基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-11))
Figure G200910050646XD00182
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氟-6-甲巯基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得灰白色固体化合物IB-11。收率32％；Mp 241-243℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.9(3H，s，-SCH3)，5.99(1H，d，C-H)，7.13(1H，t，Ar-H)，7.24(1H，d，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.43-7.52(3H，m，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.78(1H，d，N-H)，11.03(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 392.2(M+)，180.1(100％)。
实施例26 1-芴-3-(2-氟-6-甲氧基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-12))
Figure G200910050646XD00183
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氟-6-甲氧基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-12。收率45％；Mp 112-114℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.75(3H，s，-OCH3)，5.89(1H，d，C-H)，6.87(1H，t，Ar-H)，6.97(1H，d，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.41-7.48(3H，m，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.89(2H，d，Ar-H)，8.78(1H，d，N-H)，11.03(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 376.2(M+)，180.1(100％)。
实施例27 1-芴-3-(2-氯-6-甲巯基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-13))
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氯-6-甲巯基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得类白色固体化合物IB-13。收率56％；Mp 230-235℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.34(3H，s，-SCH3)，5.99(1H，d，C-H)，7.30-7.51(9H，m，Ar-H)，7.58-7.62(2H，d，Ar-H)，7.92(2H，d，Ar-H)，8.68(1H，d，N-H)，11.33(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 408.2(M+)，180.1(100％)。
实施例28 1-芴-3-(2-氯-6-甲氧基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-14))
Figure G200910050646XD00192
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氯-6-甲氧基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得类白色固体化合物IB-14。收率44％；Mp 258-260℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：3.75(3H，s)，5.89(1H，d，C-H)，7.02(2H，d，Ar-H)，7.10(2H，d，Ar-H)，7.38(2H，t，Ar-H)，7.34(1H，t，Ar-H)，7.34-7.53(7H，m，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.78(1H，d，Ar-H)，7.81(2H，d，Ar-H)，8.69(1H，d，N-H)，11.23(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 392.2(M+)，180.1(100％)。
实施例29 1-芴-3-(2-氟-6-苄氧基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-15))
Figure G200910050646XD00193
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-氟-6-苄氧基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得类白色固体化合物IB-15。收率36％；Mp 242-244℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.15(2H，s，-OCH2)，5.97(1H，d，C-H)，6.95(2H，d，Ar-H)，7.24-7.73(13H，m，Ar-H)，7.42-750(3H，m，Ar-H)，7.54(1H，d，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.78(1H，d，N-H)，11.03(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 542.3(M+)，206.1(100％)。
实施例30 1-芴-3-(2-甲巯基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-16))
Figure G200910050646XD00201
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-甲巯基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得白色固体化合物IB-16。收率46％；Mp204-207℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：2.40(3H，s，-SCH3)，5.99(1H，d，C-H)，7.22(2H，d，Ar-H)，7.35-7.40(3H，m，Ar-H)，7.42-750(3H，m，Ar-H)，7.54(1H，d，Ar-H)，7.62(2H，d，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.78(1H，d，N-H)，11.03(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 374.2(M+)，180.1(100％)。
实施例31 1-芴-3-(2-苄氧基苯甲酰)脲(化合物IB的一种(IB-17))
Figure G200910050646XD00202
将实施例15中的2-氯苯甲酰胺替换成2-苄氧基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例13～15，得浅黄色固体化合物IB-17。收率43％；Mp204-207℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.27(2H，s，-CH2)，5.98(1H，d，-CH)，7.06(1H，q，Ar-H)，7.28(1H，d，Ar-H)，7.32-7.46(7H，m，Ar-H)，7.53(3H，d，Ar-H)，7.63(2H，d，Ar-H)，7.65(2H，dd，Ar-H)，7.88(2H，d，Ar-H)，8.79(1H，s，N-H)，10.54(1H，d，N-H)；EI-MS m/z 434.3(M+)，180.1(100％)。
实施例32  邻硝基苯甲酰异氰酸酯(中间体XV)
Figure G200910050646XD00203
将1.66克邻硝基苯甲酰胺溶于10毫升干燥甲苯中，室温下慢慢滴加2.52克草酰氯，待反应放热结束后，加热回流5小时，使悬浮固体全部溶解，反应液变澄清且无氯化氢气体放出，结束反应，将反应液减压蒸馏除去过量的甲苯和草酰氯，得淡黄色油状液体中间体XV，无须进一步纯化，立即用于下一步反应或密封保存备用。
实施例33 1-芴-3-(2-硝基苯甲酰)脲(化合物IC的一种(IC-1))
Figure G200910050646XD00211
将0.2克邻硝基苯甲酰异氰酸酯(XV)和0.18克9-芴胺(XIII)加入到10毫升甲苯中，回流反应10小时。减压蒸除溶剂，残余物用硅胶柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)，得到黄色固体产物化合物IC-1。收率37％；Mp 230-232℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：5.96(1H，d，C-H)，7.36(2H，t，Ar-H)，7.43(2H，t，Ar-H)，7.60(2H，d，Ar-H)，7.84-8.16(3H，m，Ar-H)，8.16(1H，d，Ar-H)，8.53(1H，d，N-H)，11.28(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 373.2(M+)，180.1(100％)。
实施例34 1-芴-3-(2-胺基苯甲酰)脲(化合物IC的一种(IC-2))
Figure G200910050646XD00212
在25毫升茄型瓶中加入35毫克的1-芴-3-(2-硝基苯甲酰)脲(IC-1)，0.75毫克氯化铵，50毫克Fe粉，在10毫升THF中回流反应1小时。反应完过滤，滤液蒸干，用少量乙醚洗涤，得淡黄色固体化合物IC-2。收率90％；Mp 194-197℃；1H-NMR(400Hz，DMSO-d6)δ：6.02(1H，d，C-H)，6.49(1H，t，Ar-H)，6.72(1H，d，Ar-H)，7.18(1H，t，Ar-H)，7.21(2H，t，Ar-H)，7.35(2H，d，Ar-H)，7.63(2H，d，Ar-H)，7.70(1H，d，Ar-H)，7.87(2H，d，Ar-H)，8.95(1H，d，N-H)，10.56(1H，s，N-H)；EI-MS m/z 353.2(M+)，207.1(100％)。
实施例35  本发明化合物对CypA肽基脯氨酰顺反异构酶百分抑制活性的测定
(1)CypA蛋白的表达和纯化
将构建好的质粒PET15b-CypA转入大肠杆菌BL21中得到表达工程菌，将工程菌培养于含100μg/mL氨苄青霉素的10mL LB培养基中培养过夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)。然后按1∶100转接入1L含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃ 220转/分培养。当OD600达到约0.8时，加入IPTG(异丙基β-D硫代半乳糖苷，1M溶液)至终浓度0.5mM，同时将温度降到25℃培养5小时进行蛋白的诱导表达。4000转/分离心30分钟收集菌体，收集好后放于-80℃超低温冰箱保存过夜。将菌体用20mL的结合缓冲液(20mM Tris-Cl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH8.0)悬起，将悬浮液冰浴上超声波破碎(300W，工作30分钟，一次5秒，中间间隔10秒)。破碎后得到的细胞匀浆在4℃以10000转/分离心30分钟，保留上清。之后该蛋白粗提液注入预先用结合缓冲液平衡好的Ni-NTA树脂中，在4℃充分结合1小时，再分别用10倍柱体积的结合缓冲液和10倍柱体积的清洗缓冲液(20mM Tris-Cl，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH8.0)冲洗树脂，去除与树脂有非特异性吸附的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-Cl，0.5M NaCl，100mM咪唑，pH8.0)10mL洗脱树脂，收集洗脱的hCypA。用SDS-PAGE检测蛋白的分子量和纯度。透析好的蛋白即可进行酶活测定。
(2)本发明化合物对CypA抑制活性的测定
依据标准糜蛋白酶偶联试验(Biochemistry 1991，30(25)：6127-6134)，测定目标物的肽脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性。整个试验在恒温4℃下进行，酶作用底物为Suc-Ala-Ala-cis-Pro-Phe-pNA，用含有400mM LiCl的四氢呋喃溶解成3.8mM的母液。糜蛋白酶溶解到1mM的HCl溶液中，配成3mg/mL的母液。首先向519μL反应缓冲液(50mM HEPES，100mM NaCl)中加入30μL hCyPA蛋白母液(终浓度10μg/ml)和溶于DMSO的待测化合物溶液(终浓度为10μM)，在冰上预冷，将它们加到石英杯中，再加入15μL糜蛋白酶，最后加入12μL底物起始反应。4℃下390nM处通过U-2010分光光度计每隔0.1秒检测光吸收强度的变化并收集数据，1分钟之后，反应结束。每个反应重复3次。利用反应前6秒的线性增长的斜率(K)来表示CypA酶的活力大小。用下列公式得出待测化合物在10μM下百分抑制率，
计算公式为：
(阳性对照组K值-实验组K值)/(阳性对照组K值-阴性实验组K值)×100％
其中阳性对照组K值为不加待测化合物所测值，阴性对照组K值为不加待测化合物和CypA所测值。
(3)化合物活性测试结果
表1  取代苯甲酰脲类化合物对CypA抑制率数据
Figure G200910050646XD00231
由表1可以看出，本发明的具有结构通式(I)的取代苯甲酰脲类化合物大部分具有较强的CypA抑制活性，说明本发明的化合物为CypA抑制剂。
实施例36  本发明部分化合物对CypA半数有效抑制浓度(IC50)的测定
选取10μM抑制率在50％以上的化合物测IC50，选择合适的化合物浓度梯度，实验方法和体系如实施例35。根据化合物在不同浓度下对CypA酶活的反应速率K，计算化合物在不同浓度下对CypA酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin软件进行拟合得到化合物的IC50值，结果见表2和附图。
表2  取代苯甲酰脲类化合物对CypA酶活抑制IC50值
由表2可以看出，本发明的具有结构通式(I)的部分取代苯甲酰脲类化合物具有纳摩级(nM)的CypA蛋白酶抑制活性，说明本发明的化合物为CypA抑制剂。
化合物IA-3、IA-5、IB-1、IB-2、IB-3、IB-6、IB-7、IB-8、IB-9、IB-11、IB-17和IC-1对CypA酶活抑制的量效曲线图见图1～图12。由量效曲线图可以看出，这12个抑制剂对CypA酶的抑制活性具有较好的浓度依赖性。
产业上利用的可能性
本发明的取代苯甲酰脲类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。
本发明的取代苯甲酰脲类化合物在从头药物设计以及在CypA抑制试验中均显示了阳性结果，印证了其药理作用机制。因此，本发明的化合物可用于制备CypA抑制剂并发展为免疫抑制药物或抗HIV-1药物。

Claims (5)

1.一种取代苯甲酰脲类化合物，其特征在于，所述化合物为：
1-(1-呫吨基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-萘-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-环己基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-(4-氟苯基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-(2，3-二氢-茚-1-基)-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-二苯甲基-3-(2，6-二羟基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氰基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-甲氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-三氟甲基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2，6-二氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(2，6-二氯苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-氟苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氟-6-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-氯-6-甲氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-甲巯基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-苄氧基苯甲酰)脲、1-芴-3-(2-硝基苯甲酰)脲或1-芴-3-(2-胺基苯甲酰)脲。
2.权利要求1所述的取代苯甲酰脲类化合物在制备预防或治疗CypA介导的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CypA介导的疾病包括移植排斥反应、由移植引起的宿主疾病、自身免疫疾病和HIV-1入侵感染。
4.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含治疗有效量的一种或多种权利要求1所述的取代苯甲酰脲类化合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的取代苯甲酰脲类化合物占该药物组合物总重量的0.001-99.9％。
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