CN101875976A - 一种鉴别牦牛肉干产品肉种来源的三重pcr-rflp方法 - Google Patents
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Abstract
快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法属于分子生物学检测领域，可用于牦牛肉干产品的来源追溯和物种成分的快速鉴别。它解决了目前牦牛肉、黄牛肉和水牛肉鉴别方法准确性低等缺陷，提供了一种牦牛肉、黄牛肉和水牛肉准确鉴别的PCR-RFLP方法。可将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别：提取样品DNA，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后利用HgaI、ApaI和PflMI限制性内切酶进行同步酶切和PCR-RFLP分析，即可快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉。本发明采用PCR-RFLP方法，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，涉及到牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP快速鉴别。
技术背景
牦牛是我国青藏高原特有的牛种，其肉质优良、味美、无污染，是天然的绿色食品。牦牛肉以高蛋白质和低脂肪而名列肉类前茅，牦牛肉产品在市场的占有率也在迅速地扩大，价格与其他牛肉存在较大差距。因此，市面上出现了很多用黄牛肉(包括瘤牛和普通牛)和水牛肉假冒牦牛肉产品的现象。为了确保广大消费者的权益，为执法人员提供技术支撑，需要对牦牛肉、黄牛肉和水牛肉进行快速、准确的鉴别。
对生鲜肉进行感官鉴别时，根据肉在颜色、气味、滋味和纤维粗细等方面的差异，借助“看、闻、摸”，综合三个要点得出的判断，对肉类来源进行感官鉴别。这在实际应用中存在如下问题：由于都是牛肉，所以很难通过感官手段进行准确鉴别。而免疫学检测是基于可溶性抗原与抗体的免疫反应，应用种间特异性抗原进行设计研究的方法，但利用这种方法，由于样品经过不同温度的加热处理会影响ELISA方法的检测准确性。特别是当样品经过高温深加工处理后，蛋白发生了变性，改变了特异抗原决定簇，因此很难鉴别和区分不同的动物物种。另外目前用于动物源性检测的试剂盒灵敏度较低，也不适于推广使用。
而PCR-RFLP技术快速、简便、廉价，在肉产品的种属鉴别方面已有相关报道，但未见有牦牛肉、黄牛肉和水牛肉快速鉴别的三重PCR-RFLP方面的报道。
发明内容
本发明的目的是解决牦牛肉干产品中肉种来源鉴别，提供一种快速牦牛肉、黄牛肉和水牛肉鉴别的三重PCR-RFLP方法，为打击用黄牛肉(包括瘤牛和普通牛)和水牛肉假冒牦牛肉干产品的不法行为提供技术支撑。
将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别：(1)1.5mL离心管中加入约100mg样品，用剪刀剪碎，加200μL TE溶液(pH 8.0)，旋涡混匀；(2)加入400μL裂解液，旋涡混匀；(3)加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(4)取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(5)取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(6)取上清液，加0.8倍体积异丙醇，12000rpm离心10min；(7)弃上清液，收集DNA，接着取70％乙醇清洗1次，再将其室温下自然干燥；(8)加100μL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后将其-20℃保存以备用。(9)PCR扩增及检测：用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAATAT CAT TCTG-3’和通用下游引物R：5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后再72℃继续延伸7min。取4μL PCR产物与1μL 6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7μL，然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三种限制性内切酶各0.5μL，NEB buffer 2.5μL，ddH209μL，37℃温浴3h。酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断：HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp，ApaI把普通牛样品酶切割为173bp和299bp，PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。
本发明在鉴别过程中采用PCR-RFLP方法，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。
附图说明
图1是具体实施方式一中步骤(9)牦牛肉(1、2)、黄牛肉(3、4)和水牛肉(5、6)产品扩增产物检测的凝胶电泳图；图2是具体实施方式一中步骤(10)用三重酶切对具体实施方式一中步骤(9)的PCR产物进行PCR-RFLP分析后检测的凝胶电泳图：M：Marker I，1：对照组，2：牦牛肉，3：黄牛肉，4：水牛肉，5：牦牛、黄牛和水牛混合肉样；6-11：牦牛肉干产品。
具体实施方式
具体实施方式一：将牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法进行鉴别：(1)1.5mL离心管中加入约100mg样品，用剪刀剪碎，加200μL TE溶液(pH 8.0)，旋涡混匀；(2)加入400μL裂解液，旋涡混匀；(3)加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(4)取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(5)取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(6)取上清液，加0.8倍体积异丙醇，12000rpm离心10min；(7)弃上清液，收集DNA，接着取70％乙醇清洗1次，再将其室温下自然干燥；(8)加100μL TE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后将其-20℃保存以备用。(9)PCR扩增及检测：用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAATAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R：5’-CCT CCTAGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后再72℃继续延伸7min。取4μL PCR产物与1μL 6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7μL，然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三种限制性内切酶各0.5μL，NEB buffer 2.5μL，ddH209μL，37℃温浴3h。酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断：HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp，ApaI把普通牛样品酶切割为173bp和299bp，PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。
Claims (3)
1.一种快速鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法，其特征在于可以把牦牛肉、黄牛肉和水牛肉按以下方法鉴别：(1)1.5mL离心管中加入约100mg样品，用剪刀剪碎，加200μLTE溶液(pH 8.0)，旋涡混匀；(2)加入400μL裂解液，旋涡混匀；(3)加入500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(4)取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(5)取上清液，加入等体积氯仿，剧烈振荡，12000rpm离心10min；(6)取上清液，加0.8倍体积异丙醇，12000rpm离心10min；(7)弃上清液，收集DNA，接着取70％乙醇清洗1次，再将其室温下自然干燥；(8)加100μLTE(pH 8.0)溶解提取的DNA，最后将其-20℃保存以备用。(9)PCR扩增及检测：用可扩增所有脊椎动物Cytb基因的通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R：5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCRBuffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 2μL，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后再72℃继续延伸7min。取4μLPCR产物与1μL 6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。(10)取Cytb基因片段的PCR产物7μL，然后依次加入HgaI、ApaI和PflMI三种限制性内切酶各0.5μL，NEB buffer 2.5μL，ddH209μL，37℃温浴3h。酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。然后依据酶切图谱进行判断：HgaI把牦牛样品酶切割为220bp和252bp，ApaI把普通牛样品酶切割为173bp和299bp，PflMI把水牛样品酶切割为69bp和403bp。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步骤八中的扩增引物为：
通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’
通用下游引物R：5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’
3.根据权利要求1所述的一种鉴别牦牛肉、黄牛肉和水牛肉的三重PCR-RFLP方法，其特征在于步骤(10)用HgaI、ApaI和PflMI三个限制性内切酶同步进行PCR-RFLP分析。
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