CN101870969A

CN101870969A - 稳定的α-半乳糖苷酶水性组合物及其相关方法

Info

Publication number: CN101870969A
Application number: CN201010170755A
Authority: CN
Inventors: W·霍尔克; R·米勒; M·施米特; H·索贝克; J-P·萨尔霍弗
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2030-04-21
Also published as: ES2395232T3; US20100273235A1; EP2243793A1; JP5249987B2; JP2010252793A; CA2697999A1; CA2697999C; CN101870969B; US8476053B2; EP2243793B1

Abstract

本发明涉及稳定的α-半乳糖苷酶水性组合物及其相关方法。本发明提供包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物。本发明还提供了使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，以及制备包含所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的纯化的水性组合物的方法。

Description

稳定的α-半乳糖苷酶水性组合物及其相关方法

技术领域

本发明涉及水性组合物，该水性组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白。本发明还涉及使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，以及制备包含所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的纯化的水性组合物的方法。

背景技术

于1900年发现的ABO血型系统，在人类的输血中发挥重要作用，并因此在输血药物中发挥重要作用。ABO血系统是基于是否分别存在或不存在A和B血型抗原。对应的血型碳水化合物结构(被称为ABH)被发现于红细胞表面，特别是糖蛋白和糖脂的寡糖链的末端。也就是说，在A型血红细胞上发现的A抗原由末端的α-1，3连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)确定，而B型血上的B抗原由末端的α-1，3连接的半乳糖(Gal)单糖(作为免疫显性的单糖)确定。

对碳水化合物有活性的酶在自然界中广泛分布并在很多生物技术和制药学过程中具有应用(Davies等人，2005)。通过酶作用除去ABO血型抗原而产生通用的红血细胞是最初于超过25年之前提出的先驱性观点。因此，分别从A型血和B型血细胞上通过酶作用除去α-1，3连接的N-乙酰半乳糖胺和α-1，3连接的半乳糖单糖提供了改善输血安全性和总体血液供给的有吸引力的方式。最初预想是通过使用外切糖苷酶选择性除去免疫显性的A和B三糖抗原的α-GalNAc和α-Gal残基，从而通过酶作用分别将红血细胞上的A和B抗原转化为H抗原。特别地，α-N-乙酰-半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶在A、B和AB血型红血细胞的酶式转化中具有特别的意义(WO 03/027245A2)。外切葡萄糖苷酶α-N-乙酰-半乳糖胺酶(A-zyme)特异性水解A型红血细胞上的末端α-1，3-GalNAc残基，外切葡萄糖苷酶α-半乳糖苷酶(B-zyme)特异性水解B型红血细胞上的末端α-1，3-半乳糖残基。两种酶反应均引起在O型红血细胞上发现的普遍的H结构的形成。

为了转化B型红血细胞，首先使用了源自绿咖啡豆的α-半乳糖苷酶。证明红血细胞的酶式转化是可行的，并且此外还证明转化的血细胞可以在输血中发挥作用，由于需要大量的酶，所以不可能用于临床应用。最近描述了使用来自海洋细菌假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas spec.)的α-半乳糖苷酶从B型血的红细胞中除去α-1，3-结合的半乳糖残基(Bakunina等人，1998)。另外，报道了两种细菌半乳糖苷酶基因家族，其提供能够在中性pH以低消耗重组酶而有效除去A和B抗原的酶(Liu等人，2007)。在这些酶之中有一种是源自细菌生物脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的α-半乳糖苷酶的重组N-末端片段。

自从在20世纪70年代出现以来，重组DNA技术已经使生物化学发生改革。在一个方面，由于最近发展的与基因克隆和聚合酶链反应(PCR)提供的扩增相结合的微化学技术的敏感性，来自任何种类的细胞或组织的内源性蛋白及其对应的信使RNA可以作为分离和克隆其各自基因的起点。在另一个方面，重组DNA技术为有效地大规模生产所鉴定和分离的基因铺平了道路，因为重组DNA技术能够将编码目的蛋白的DNA引入宿主生物或引入为了重组蛋白表达的目的而生长于培养物中的细胞。特别地，细菌被认为是基因扩增和基因表达的理想宿主，因为它们代表了用于生产众多的原核和真核蛋白的容易操作的工厂。但是，细菌宿主细胞中表达重组异源蛋白的表达经常会引起包涵体(其含有聚集和不可溶形式的目标蛋白)的形成，结果是所表达的蛋白不能进行进一步的生物化学纯化。在这种情况下，重组蛋白的回收需要包涵体的溶解并需要蛋白重新折叠成其活性结构。

α-半乳糖苷酶(其被国际生物化学联合会酶委员会分类为EC 3.2.1.22)由众多微生物、植物和动物内源表达。但是，由于在水性溶液中储存时α-半乳糖苷酶的活性迅速下降，所以在体外提供水性酶组合物是非常困难的。特别地，本领域的一个普遍问题是，在没有盐的情况下(即在具有低电导率的缓冲液中)重组表达的α-半乳糖苷酶形成不溶性的沉淀。这种沉淀发生得迅速，最终变得不可逆，并且在高蛋白浓度的情况下尤甚。但是，已知的低蛋白浓度时(以防止沉淀)的α-半乳糖苷酶的纯化方法不是经济上有用的生产过程的合适选择。到目前为止，通常是通过加入合适浓度的盐来防止酶的沉淀。因此，含有高浓度盐的缓冲液对于溶液中酶的稳定是不可或缺的。例如，一种通常用于储存α-半乳糖苷酶的缓冲液由25mM磷酸钠和0.3M NaCl组成，pH为7.0。但是，这样的高盐缓冲液条件不允许进行一些可能想要的生物化学纯化方法，例如，如阳离子交换层析，其需要低盐条件下蛋白与柱的结合。阳离子交换层析代表了为了达到实质上纯的α-半乳糖苷酶组合物的重要工具，因为它是有效除去降解产物和/或其它污染性蛋白的最有利的方法。

或者，目标蛋白可以通过阴离子交换层析的方法而纯化。也就是说，具有酸性pH范围的等电点的蛋白可以在碱性pH值与阴离子交换树脂结合。但是，α-半乳糖苷酶，特别是Liu等人(2007)所报道的来自脆弱拟杆菌的具有pI 6.72的等电点的α-半乳糖苷酶，在碱性pH值(例如在约≥9.0或更高的pH)的缓冲液中是可溶的但是不稳定。因此在具有碱性pH的缓冲液中孵育酶会造成不可逆转的酶活性的损失。因此，在约pH≥9.0的pH值通过阴离子交换层析的方法纯化蛋白似乎不是α-半乳糖苷酶(在本发明上下文中也称为B-zyme)的纯化策略的选择。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种方法，所述方法使包含具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的水性组合物稳定从而提供用于储存和进一步处理的稳定的α-半乳糖苷酶组合物，本发明还提供所述组合物的制备方法。

在第一个方面，本发明提供了包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物，其特征在于所述组合物包含浓度大于(above)100mM，特别是浓度为至少150mM的精氨酸。

在另一个方面，本发明提供了一种使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：向所述组合物中加入精氨酸至终浓度大于100mM，特别是至少150mM。

在另一个方面，本发明提供了一种制备纯化的水性组合物的方法，该组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的组合物，

(b)在存在浓度大于100mM、特别是至少150mM的精氨酸时，浓缩步骤(a)的组合物，和

(c)通过阳离子交换层析纯化步骤(b)的组合物。

附图说明

图1显示了使用标准凝胶电泳在4-20％Tris/甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离之后，根据本发明的方法获得的纯化的α-半乳糖苷酶蛋白。通过使用考马斯蓝(SimplyInvitrogen，CA，USA)将凝胶染色而显示纯化的蛋白。电泳缓冲液：Mes 1x；标记：Mark

(Invitrogen，CA，USA)。

泳道1：分子量标记(Mark

Invitrogen，CA，USA)

泳道2：3μg的α-半乳糖苷酶(B-zyme)

泳道3：4.5μg的α-半乳糖苷酶(B-zyme)

泳道4：9μg的α-半乳糖苷酶(B-zyme)

图2显示了纯化的α-半乳糖苷酶蛋白(B-zyme)的HPLC分析。

将100μg的蛋白样品(1.5mg/ml蛋白)置于TSK 3000(Tosoh BioscienceGmbH，Stuttgart，Germany)柱。

图3显示了来自生物脆弱拟杆菌的α-半乳糖苷酶片段(fragA)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其总长度为572个氨基酸(aa)。

该蛋白的计算分子量为64564.8Da，计算等电点为6.72。

具体实施方式

本领域中已知有多种促进从包涵体中回收蛋白并支持蛋白溶解和重折叠的试剂。其中，这些试剂包括，例如，离液序列高的(chaotropic)盐，尿素，和非去污性磺基甜菜碱(sulfobetain)。在本发明的上下文中，令人惊奇地发现在存在大于100mM浓度、特别是至少150mM浓度的精氨酸时，α-半乳糖苷酶在溶液中是稳定的。值得注意的是，在本发明上下文中所测试的各种浓度的任何其它试剂没有实现蛋白的稳定。

精氨酸已经被用于改善重折叠效率，或者抑制蛋白的聚集(Arakawa等人，2006；Ishibashi等人，2005)。此外，已经描述了精氨酸在热诱导的和稀释诱导的蛋白聚集中的作用(Shiraki等人，2002)。精氨酸还参与蛋白重折叠、溶解和纯化，已经报道：可以在用于通过透析或稀释进行蛋白重折叠的溶剂中包括0.1至1M的精氨酸。此外，0.5至2M浓度的精氨酸可用于从大肠杆菌细胞裂解后获得的不可溶性沉淀中提取有活性的、折叠的蛋白(Tsumoto等人，2004)。

以精氨酸进行稳定提供了清晰的技术上的优势，因为其允许酶的浓度在溶液中达到高水平而不会由于蛋白沉淀而损失材料。因此，以精氨酸进行稳定允许提供适合于长期储存和进一步处理的α-半乳糖苷酶组合物。其次，在精氨酸存在时的稳定允许经济地应用高产率纯化方案，包括离子交换层析，特别是阳离子交换层析。因此，在精氨酸存在时酶的稳定允许提供包含纯化的α-半乳糖苷酶的组合物。

在第一个方面，本发明提供了包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物，其特征在于所述组合物包含浓度大于100mM，特别是浓度为至少150mM的精氨酸。

本文所用的术语“水性组合物”是指任何种类的含有目标蛋白的基于水的溶液。基于水的溶液或水性溶液意思是溶剂主要是水(超过50％、60％、75％、80％，优选超过90％，更优选超过95％，或甚至100％的溶剂是水)。此外，可以存在一种或多种合适的增溶剂，例如DMSO、乙醇等。除了具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白之外，水性组合物中可以存在其它化合物，例如盐、其它蛋白、细胞组分、生长介质成分等。特别地，除了具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白之外，本发明的水性组合物可能包含任何种类的单价、二价或三价盐离子，包括但不限于，Na⁺，K⁺，Mg⁺⁺，PO₄ ^3-，Ca⁺⁺，Cl^-等，以及任何种类的细胞和/或核组分，包括例如细胞和/或核蛋白，细胞和/或核DNA，和细胞和/或核RNA分子。此外，本发明的水性组合物可以是源自含有目标蛋白的生物体的任何细胞提取物(其可以是纯化或非纯化形式)。这样的细胞提取物可以是源自生物体整体，源自所述生物体的特定组织，源自其众多的组织，或源自任何类型的细胞，例如在细胞培养物中培养的细胞。可以通过或不通过最初的分级分离(fractionation)和/或离心步骤从整个生物体或组织制备细胞提取物。此外，本发明的水性组合物还可能包含对于稳定目标蛋白和/或保护目标蛋白免受蛋白水解降解可能有帮助的任何添加剂，包括但不限于，例如，特异性蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物。对于蛋白的稳定发挥作用的合适的添加剂对于本领域技术人员是熟知的(参见例如Sucker等人，1991)，包括例如，生理盐水，Ringer右旋糖(dextrose)、Ringer乳酸盐(lactate)、去离子水、稳定剂、抗氧化剂、络合剂、和/或抗菌化合物。本发明的组合物还可以包含甘油、蔗糖、葡萄糖、维生素或还原剂，例如，如DTT或β-巯基乙醇。一种本发明的水性组合物例如实施例5中例示。

优选地，包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物是澄清的溶液，具有沉淀的溶液或乳白的(opal)溶液(其中沉淀或混浊源自具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白)将不被认为是根据本发明的包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物。

一种确定澄清度/混浊度的方法是通过目视检测，即通过肉眼检测。另一种测定方法是用光度计检测光的削弱。在此意义上，术语“光密度”(也称为“OD”)代表在特定波长λ对于给定长度的光学元件的透光度的无单位的测量值：

OD_λ＝log₁₀O＝-log₁₀T＝-log₁₀(I/I₀)

其中

O＝每单位不透明度

T＝每单位透射度

I₀＝入射光束的强度

I＝透射光束的强度

光密度越高，透射性越低。由于聚集在颗粒上的光束的散射，悬浮液或胶体的光密度相对于澄清溶液要升高。

一种优选的测定混浊度的方法是测定散射光。为此目的，通常使用光散射光度计。取决于检测和定量光散射所由来的方向，本领域已知存在几种类型的散射光度计。理论上讲，它们都可以用于液体样品中混浊度的定量检测。术语“光散射”概括性地包括了样品中颗粒引起的光波的散射以及样品中微粒物质所引起的反射。反散射定义为朝向光源90°以内。正散射定义为偏离光源90°以内，或者与光源大体上相同的方向。现在使用的测量的混浊度单位大多是基于90°侧向散射测量技术。

散射光的强度取决于非均匀混合物中非溶解性(微粒)物质的数量，可以通过下式描述：

F＝I₀·Φ·(2.303·ε·c·d)

其中

F是散射光的强度

I₀是入射光束的强度

Φ是发射/吸收的光子的比率

ε是混合物中微粒物质的摩尔吸收系数

c是小玻璃杯中每体积液体样品(非均匀混合物)的微粒物质的数量

d是小玻璃杯中空间的厚度

例如，为了测定本发明组合物的澄清度/混浊度，可以使用荧光光度计(例如CARY ECLIPSE仪器(Varian，Inc.Palo Alto，CA，USA))进行90°侧向散射测量。液体样品通常在标准的石英小玻璃杯中分析。入射光的波长可以是800nm；可以在相同的波长(即800nm)测定90°侧向散射。仪器的参数设定可以按如下：

仪器： Cary Eclipse

仪器系列号 EL06033429

数据模式：荧光

发射波长(nm) 800

激发波长(nm) 800

激发单元狭缝(nm) 5

发射单元狭缝(nm) 5

平均时间(秒) 0.1

激发滤波片自动

发射滤波片开启

PMT电压(V) 中级

Multicell holder Multicell

Multi zero 关闭

重复 1

样品平均关闭

为了本发明的目的，“澄清的”水性组合物的特征在于，其混浊度(按照上述所测定)与不含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白但是在其他方面具有相同的组成和各个成分浓度的溶液的混浊度大约相等(即大约等同)。优选地，按照上述条件以800nm波长的光以90°侧向散射测定，混浊度对应于0至0.40的范围，更优选为0至0.13，再更优选为0.05至0.130的范围。

在本发明上下文中，“具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白”一般是指任何种类的显示出α-半乳糖苷酶活性的蛋白。本发明的α-半乳糖苷酶活性的特征在于半乳糖苷酶残基的水解，特别是在于α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖和半乳甘露聚糖)中末端的α-D-半乳糖残基的水解。更特别地，本发明的α-半乳糖苷酶活性是指末端的1，3-连接的半乳糖苷酶残基的水解。本领域已良好地建立了α-半乳糖苷酶酶活性分析的检验，在例如Liu等人(2007)中有详细描述。这样的酶检验可以在体外装置中进行，并旨在通过分析合成底物(例如单糖Galα-pNP或B四糖-AMC底物)的催化切割而确定蛋白的酶活性。因此一单位的酶活性定义为在确定体积中存在一定数量的底物时，每分钟切割1μmole的底物所需要的酶的数量。然后通过确定基于反应体积中底物的完整切割的比活性而计算酶活性。例如，在Galα-pNP底物的情况下，在405nm的波长对p-硝基-苯酚(pNP)的形成进行定量。分析本发明所述α-半乳糖苷酶酶活性的测试在实施例1中进行了描述。

本文所用的术语“精氨酸”代表α-氨基酸精氨酸(也简称为Arg或R)，优选为L-精氨酸或D-精氨酸，或其混合物，特别是L-精氨酸。精氨酸是自然界最常见的20种氨基酸之一。α-氨基酸由中心碳原子(称为α-碳，与氨基基团相连)、羧酸基团、氢原子和不同的R基团(通常称为侧链)组成。精氨酸由4-碳脂肪族侧链组成，其末端由胍基团加帽。胍基团的pKa值为12.48，其在中性、酸性、甚至是最碱性的环境中带正电，因此削弱了分子的碱性化学性质。在DNA水平，精氨酸分别由密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG编码。术语“精氨酸”也包括任何其盐形式的氨基酸。

如本发明上下文中所证明，在存在大于100mM、特别是至少150mM和更高浓度的精氨酸时，包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的组合物是稳定的。这些浓度包括任何浓度。从以其它蛋白进行的实验中得出结论：精氨酸的浓度可以升高直至2M而不影响蛋白的结构和/或功能。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物包含浓度为150mM至2M的精氨酸。体积摩尔浓度(单位为mol/L、摩尔或M)或摩尔浓度代表每升溶液中给定物质的摩尔数。大写字母M用于单位mol/L的缩写。

如上所述，精氨酸的浓度大于100mM，包括精氨酸的浓度为至少，例如110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、200mM、220mM、250mM、275mM、300mM、320mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM或500mM，优选为至少110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、200mM、220mM或250mM，特别是至少150mM、200mM、220mM或250mM。

如上所述，精氨酸的浓度可以升高至高达2M，包括精氨酸的浓度为至多，例如200mM、220mM、250mM、275mM、300mM、320mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、1M或1.5M，优选为至多400mM、320mM或200mM，特别是至多320mM。

在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物包含浓度为200至400mM的精氨酸。

在本发明的上下文中已经证明：在存在浓度为250mM至320mM，特别是在存在310mM的精氨酸时，包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的组合物是稳定的。

因此，在另一个更优选的实施方式中，本发明的组合物包含浓度为250mM至320mM，最优选浓度为约310mM的精氨酸。在本发明的上下文中所用的术语“约”意思是：所指明的数值±10％，优选±5％，特别是±4％、3％、2％或1％。

含有离子的水性溶液导电。因此，测定溶液的电导是研究溶液是否含有解离的离子以及溶液中的任何化学反应是否产生或消耗离子的合适的方法。但是，任何溶液(甚至是含有离子的溶液)具有阻止电流通过其中的相当大的电阻性。电导率是所述电阻的倒数。也就是说，高电阻意味着低电导率，而低电阻意味着高电导率。通过使用溶液完成电路而测定溶液的电导率是本领域的标准方法，通常是通过向电路中插入一对电极，并将电极浸入溶液中。电导传感器测定通过1厘米水传导多少电。比电导率表示为姆欧每厘米(M/cm)，也称为西门子每厘米(S/cm)。因为姆欧(或西门子)是非常大的单位，所以通常使用微姆欧(微西门子)或毫姆欧(毫西门子)(mS/cm)。由于电导率随温度变化，所以需要根据温度变化校正读数。多数仪器具有针对温度自动补偿的电路，并将读数校正至标准的25℃。在标准条件下测定电导率的合适的方法对于本领域技术人员是已知的，这些方法中的一种在实施例3中例示。

如上文所详述，除了精氨酸之外，本发明的组合物可以包含适合于建立对目标蛋白有利的环境的任何种类的盐离子、缓冲液成分和/或化学试剂。在本发明的上下文中，发现在存在精氨酸且不存在高盐浓度时(即在低盐条件下)，具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白是稳定的。这样的低盐条件包括但不限于，单价、二价或三价盐离子的浓度为至多0.5M，更优选为至多450mM、400mM、350mM、300mM、250mM、200mM、150mM、100mM、50mM、25mM或10mM，特别是至多50mM。应该注意上述浓度值不包括组合物中存在的精氨酸。

在优选的实施方式中，本发明的组合物包含浓度为约310mM的精氨酸和终浓度为至多50mM的单价、二价或三价盐离子。在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物包含终浓度为至多350mM的单价、二价或三价盐离子。所述单价、二价或三价盐离子可以包括但不限于Na⁺、K⁺、Mg⁺⁺、PO₄ ^3-、Ca⁺⁺、Cl^-等。

因此，对应于所用的精确的盐浓度，本发明的组合物的电导率为5mS/cm至50mS/cm。

在优选的实施方式中，本发明的组合物的电导率为至多40mS/cm。在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物的电导率为15mS/cm至25mS/cm，更优选为18mS/cm至22mS/cm。

本文所用的术语“mS/cm”是指以毫西门子/厘米溶液表示的电导率单位，S是指单位的国际标准单位制(SI)名称。如上文所详述，水性溶液的电导率可以通过本领域技术人员已知的标准方法测定。用于测定电导率的设备可以从商业渠道获得，可以从几个供应商购买，包括例如，Sartorius(

，Germany)。在本发明的上下文中，术语“mS/cm”定义为包括+/-0.1mS/cm的偏差。本发明的组合物的电导率在例如本申请的表2中例示(见实施例3)。

如上所述，溶液中α-半乳糖苷酶的稳定还取决于含有蛋白的组合物的pH值。也就是说，重组α-半乳糖苷酶(特别是源自脆弱拟杆菌的α-半乳糖苷酶)在具有碱性pH值(即pH值≥9.0)的缓冲液中是不稳定的，这产生不可逆的酶活性的损失。如在本发明上下文中所证明(参见例如实施例3)，本发明的α-半乳糖苷酶在碱性pH值(即pH值为9.0和9.5)时保持在溶液中。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物具有pH 5至pH 7.5的pH值。在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物具有pH 5.5至pH 7，更优选为pH 5.8至pH 6.5的pH值。

本文中所用的术语“pH”是指溶液中H⁺离子的浓度，其定义为pH＝log10(1/[H⁺])＝-log10[H⁺]。对本发明组合物的pH值的分析是标准方法，对于本领域技术人员是熟知的。用于测定溶液的pH的设备可以从各供应商由商业渠道获得，包括例如Mettler-Toledo(Giessen，Germany)。应该注意在本发明上下文中使用的术语“pH”定义为包括+/-0.2pH值的偏差。

如上文所详述，编码目标蛋白的特定DNA可以被引入合适的宿主细胞中以通过重组方式产生各个蛋白。这些宿主细胞可以是任何种类的合适的细胞，优选为细菌或真核细胞，例如在培养物中生长的细胞。在第一个步骤，该方法可以包括将各个基因克隆进入合适的质粒载体。质粒载体广泛用于基因克隆，可以被容易地被引入(即转染)那些已经对DNA为瞬间通透的细菌细胞。当蛋白在各自宿主细胞中表达以后，可以收获细胞并将细胞作为制备含有目标蛋白的细胞提取物的起始材料。含有目标蛋白的细胞提取物通过细胞的裂解而获得。通过化学的或机械的细胞裂解制备细胞提取物的方法对本领域技术人员是熟知的，包括但不限于，例如低渗盐处理、匀浆、杜恩斯处理(douncing)或超声处理。

在本发明的上下文中，已经证明在存在大于100mM、特别是至少150mM浓度的精氨酸时，包含具有α-半乳糖苷酶活性的源自细菌宿主细胞的蛋白的组合物是稳定的。包含具有α-半乳糖苷酶活性的源自细菌宿主细胞的蛋白的组合物是指宿主细胞的任何种类的裂解液，任选为经过处理之后的，例如通过离心、层析、透析或超滤，如下所述。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物源自细菌宿主细胞。在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物源自细菌菌株大肠杆菌(E.coli)。

本文所用的术语“细菌宿主细胞”是指适合应用于重组DNA技术的任何种类的细菌生物，包括所有已知的细菌菌株，特别是可以用作表达一种或多种重组蛋白的宿主细胞的那些菌株。细菌菌株大肠杆菌(E.coli)经过了良好鉴定，且代表了用于迅速并经济地产生重组蛋白的最常使用的表达系统。众多的大肠杆菌细菌宿主细胞对本领域技术人员是已知的，包括但不限于，菌株例如DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101或XL-1blue，这些可从商业渠道从各供应商购买，包括例如Stratagene(CA，USA)、Promega(WI，USA)或Qiagen(Hilden，Germany)。一种合适的宿主细胞和根据本发明的源自大肠杆菌的组合物在如本发明实施例5中所示。

在本发明的上下文中，发现本发明组合物的蛋白浓度通常在20-30mg/ml的范围内(参见例如实施例5)。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物具有至少20mg/ml的蛋白浓度。

本文中所用的术语“蛋白浓度”一般是指本发明组合物的总的蛋白含量，按每体积计算(例如mg/ml)。这个定义还可以包括任何指称源自原核或真核细胞且包含本发明蛋白的总细胞提取物的蛋白浓度，或可以等价地指称包含本发明蛋白(以部分或实质上纯化的形式存在)的组合物的蛋白浓度。因此，本文中所指称的蛋白浓度可以涉及在本发明提供的α-半乳糖苷酶的方法之中或之后的任何步骤中所测定的任何蛋白含量。用于测定特定组合物的蛋白浓度的方法对本领域技术人员是熟知的，包括例如使用Bradford检验，或通过简单地测定蛋白溶液在280nm的吸光度。

将组合物中的蛋白浓缩可以通过各种标准方法进行，包括例如，使用离心超滤装置。这样的过滤装置提供甚至是稀的(ng至μg/mL)蛋白溶液的高回收(通常＞95％)，应用截留值范围在3,000、10,000、30,000、50,000至100,000NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)的过滤膜。离心超滤装置可以从不同的供应商通过商业渠道购买，例如从Millipore(MA，USA)。

在本发明的上下文中，α-半乳糖苷酶的酶活性进一步通过生物化学方法确定。如实施例(参见例如实施例1)所证明，相对于组合物的总蛋白含量，本发明的蛋白大体上显示出0.5至0.8单位/毫克的α-半乳糖苷酶酶活性。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物的特征在于α-半乳糖苷酶酶活性为0.5-0.8单位/毫克总蛋白。

如上文所详述，本领域中已经良好地建立了用于测定α-半乳糖苷酶酶活性的检验，在例如Liu等人(2007)中有详细描述。这些检验应用人工底物(例如，单糖Galα-pNP或B四糖-AMC底物)的切割。因此，一单位的酶活性定义为使用确定的反应体积，在存在确定数量的底物时，每分钟切割1μmole的底物所需要的酶的数量。然后通过确定基于反应体积中底物完全切割的比活性而计算酶活性。可以根据如实施例1中的例示测定酶活性。

本文所定义的术语“单位/毫克”一般是指每1毫克总蛋白含量(按照生物化学方法测定，以毫克表示，亦如上所述)中的酶活性的单位数。所述总蛋白含量可以源自含有本发明的酶活性的完整细胞提取物，或者可以源自包含具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的纯化的组合物。

在优选的实施方式中，本发明的蛋白具有EC 3.2.1.22的底物特异性。在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物包含水解末端α-1，3-半乳糖基部分的蛋白。

如上文所详述，术语“EC 3.2.1.22”是指国际生物化学联合会酶委员会根据酶的酶式反应活性的类型为α-半乳糖苷酶的酶类所分配的系统编号。特别地，系统编号EC 3.2.1.22指明了α-半乳糖苷酶的催化机理为水解α-D-半乳糖苷中的末端α-D-半乳糖残基。在本发明的上下文中，α-半乳糖苷酶的催化机理特别是指末端α-1，3-半乳糖苷酶残基(如在例如B型红血细胞中发现的那些，其构成B型血抗原)的水解。

α-半乳糖苷酶被发现存在于众多生物中。

因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，其特征在于，所述蛋白是天然产生的蛋白。或者，本发明的蛋白是所述天然产生的蛋白的功能活性片段或衍生物。

在另一个优选的实施方式中，本发明的蛋白源自选自人、动物、植物、真菌和细菌的生物。

本发明上下文所指称的“天然产生的蛋白”一般是指在任何种类的活体生物中天然发现的蛋白，其可以从所述生物的组织、液体和/或任何种类的单个细胞中分离。此外，所述天然产生的蛋白还可以从生物的整体中分离，例如通过提供包含所述蛋白的生物的完全细胞提取物。所述天然产生的蛋白所可能来源的生物包括但不限于人，动物(包括昆虫)，植物例如咖啡植物，真菌(包括酵母)，以及细菌例如假交替单胞菌属或拟杆菌属。

本文所用的术语“功能活性片段或衍生物”是指任何种类的这样的蛋白，其显示出α-半乳糖苷酶的酶活性，且包含具有α-半乳糖苷酶活性的天然产生的蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列为任意部分取代的或修饰的形式。

也就是说，本发明的功能活性片段可能包含这样的蛋白结构域，其源于具有α-半乳糖苷酶活性的天然产生的蛋白，且显示出与其所源自的野生型蛋白相同的酶活性。这样的功能活性片段可能由目标的任何N-末端、C-末端或中心蛋白结构域构成，或由目标的任意组合所构成。

此外，与野生型序列相比，功能活性衍生物还可包含另外的氨基酸，其可以作为例如N-或C-末端延伸和/或内部蛋白结构域的一部分而存在。

功能活性片段的特征可能还在于其结构特性。因此，在本发明的一个优选实施方式中，功能活性片段由具有α-半乳糖苷酶酶活性的天然产生的蛋白(例如，如来自脆弱拟杆菌(菌株ATCC 25285(美国模式培养物保藏中心，Manassas，Virginia USA)，也称为NCTC 9343(国家模式培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures)，London，UK))的α-半乳糖苷酶)的至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，再更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选99％组成。这样的片段的一个例子是如SEQ ID N0：1所示的蛋白。如上所定义的功能活性片段可以源自经过一个或多个氨基酸删除的蛋白。删除可以是C-末端的、N-末端的和/或中间的。

序列同一性百分率可以通过例如序列比对来确定。用于比较的序列比对的方法在本领域是熟知的。已经描述了各种程序和比对算法，例如Smith和Waterman(1981)，或Pearson和Lipman(1988)。

NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，1990)可以从几个来源(包括National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD)或者互联网)获得，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。

具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的功能活性衍生物可通过蛋白中序列改变(一个或多个氨基酸删除、取代和/或添加)而获得，其中具有序列改变的蛋白仍然保持未改变的蛋白的功能，即其从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的能力。这样的序列改变可以包括但不限于，保守性取代、删除、突变和插入。但是，功能活性衍生物表现出α-半乳糖苷酶的酶活性。功能活性片段或衍生物的这种特性可按照例如实施例1中的详细记录而测定。

此外，本发明的功能活性衍生物可能包含一个或多个修饰的氨基酸，包括但不限于，例如磷酸化、乙酰化、泛素化和/或sumolylated的残基。本发明的功能活性衍生物还可能包含任何种类的化学标记物，例如，如荧光标记部分。如上文所详述，天然产生的α-半乳糖苷酶的功能活性片段或衍生物可以通过标准检验方法鉴别并进行生物化学的鉴定，其中，蛋白的酶活性通过观察人工底物的切割而确定。这样的检验在本领域是熟知的，在例如Liu等人(2007)中有描述。

术语“功能活性衍生物”包括天然产生的等位基因变体，以及突变体或其它任何非天然产生的变体。如本领域已知，等位基因变体是(多)肽的替代性形式，其特征在于具有实质上不改变多肽生物学功能的一个或多个氨基酸的取代、删除或添加。“生物学功能”是指多肽在天然产生该多肽的细胞中的功能，即使该功能对于细胞的生长或存活不是必需的。例如，孔蛋白(porin)的生物学功能是允许细胞外介质中存在的化合物进入细胞。生物学功能与抗原性功能不同。多肽可以具有不止一种生物学功能。

在本发明的上下文中，如果功能活性片段或衍生物的活性相当于无序列改变的蛋白活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，再更优选至少80％，尤其是至少90％，特别是至少95％，最优选至少99％的话，则功能活性片段或衍生物具有α-半乳糖苷酶的酶活性。

在优选的实施方式中，天然产生的蛋白经氨基酸交换、删除或插入获得的功能活性衍生物或片段也可能保留酶活性，或更优选改善了酶活性。

在本发明的更优选的实施方式中，具有α-半乳糖苷酶酶活性的天然产生的蛋白的功能活性衍生物与所述蛋白具有至少50％，尤其是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，再更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，并且优选是通过保守性取代蛋白而得到。保守性取代是那些发生于与侧链和化学特性相关的氨基酸家族内的取代。这样的家族的例子为具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香族侧链、具有无电荷极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。在一个实施方式中，在肽中包括一个保守性取代。在另一个实施方式中，在肽中包括两个或更少的保守性取代。在另一个实施方式中，在肽中包括三个或更少的保守性取代。

保守性氨基酸取代的例子包括但不限于下列所示：

最初残基保守性取代

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln；His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

His Asn；Gln

Ile Leu，Val

Leu Ile；Val

Lys Arg；Gln；Asn

Met Leu；Ile

Phe Met；Leu；Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp；Phe

Val Ile；Leu

本发明的蛋白还可以与表位标签融合，表位标签提供了抗-标签物质可以选择性结合的表位。本文标签一般被置于肽的氨基或羧基末端，但是如果生物学活性允许，可以作为内部插入或取代而引入。可以使用物质例如针对标签化肽的抗体来检测这样的表位标签化形式的肽的存在。同样，提供表位标签使得能够使用抗-标签抗体或另一种与表位标签结合的亲和基质通过亲和纯化而容易地将肽纯化。各种标签多肽及其各自的抗体在本领域是熟知的。例子包括聚-组氨酸(poly-his)、聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签、HA标签多肽、c-myc标签、Strep标签和FLAG标签。

本发明上下文中所指称的术语“细菌”可能包括微生物细胞的所有变体，其例子包括但不限于，专性厌氧革兰氏阴性微生物，优选为选自拟杆菌属的微生物，例如粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、吉氏拟杆菌(Bacteroidesdistasonis)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、脆弱拟杆菌、屎拟杆菌(Bacteroides merdae)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)和普通拟杆菌(Bacteriodes vulgatus)。

在优选的实施方式中，本发明的组合物包含具有α-半乳糖苷酶活性的源自细菌生物脆弱拟杆菌的蛋白，更优选为任何天然产生的形式的脆弱拟杆菌α-半乳糖苷酶。

在本发明的上下文中，具有α-半乳糖苷酶活性的源自脆弱拟杆菌的蛋白可能是脆弱拟杆菌中发现的两种α-半乳糖苷酶同源物中的任何一种。这两种同源物，即α-半乳糖苷酶A和α-半乳糖苷酶B，分别由基因galA和galB编码。(这两种)酶各自由605和595个氨基酸构成。具有α-半乳糖苷酶活性的源自脆弱拟杆菌的蛋白既除去B型血抗原的支链α-1，3-连接的半乳糖残基又除去直链α-1，3-连接的半乳糖结构。所述蛋白的催化活性包括末端的非还原直链α-1，3-连接的半乳糖残基的水解，末端的非还原支链α-1，3-连接的半乳糖残基的水解，以及α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖和半乳糖水解酶)中的末端的非还原α-D-半乳糖残基的水解。

在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物包含源自脆弱拟杆菌的α-半乳糖苷酶的片段，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方式中，组合物包含其任何功能活性衍生物或片段。

本文中所指称的术语“SEQ ID NO：1”表示如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(也在图3中描述)，其代表在脆弱拟杆菌NCTC(国家模式培养物保藏中心，London，UK)9343(菌株ATCC 25285(美国模式培养物保藏中心，Virginia USA)，也称为fragA)中发现的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。SEQ IDNO：1的氨基酸序列由EMBL(European Molecular Biology Laboratory，Heidelberg，Germany)核苷酸序列数据库登录号AM109955所识别。

在该上下文中，术语“其功能活性衍生物或片段”一般是指如上文详述的定义。特别地，所述的是指包含SEQ ID NO：1的氨基酸或由SEQ ID NO：1的氨基酸组成的任何种类的片段或衍生物，包括但不限于，每个显示出α-半乳糖苷酶酶活性的较小的片段，或任何包含另外的氨基酸的片段，如上面针对具有α-半乳糖苷酶活性的天然产生的蛋白的片段和衍生物所定义的那样。所述另外的氨基酸可以存在于N-末端、C-末端或作为蛋白内部结构域的一部分。所述另外的氨基酸还可以包含，但不限于，亲和纯化标签，包括，例如6个His-、GST-、NusA-、NusB-或蛋白A-标签。这样的亲和标签对本领域技术人员是公知的，在重组蛋白表达领域是常规使用的。此外，SEQ IDNO：1的功能活性衍生物或片段包括任何这样的蛋白，其由SEQ ID NO：1所示的氨基酸或其一部分组成，或者包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸或其一部分，并且其包含一个或多个修饰的氨基酸或任何种类的其它化学修饰。如上文所详述，功能活性衍生物或片段的酶活性可以通过本领域技术人员已知的标准方法来确定(参见例如Liu等人，2007)。

优选地，本发明的组合物的特征可在于其包含：

(i)天然产生的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，优选为根据SEQ IDNO：1的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，和

(ii)浓度为250mM至320mM的精氨酸，并且其特征在于其具有

(iii)20mS/cm±0.1mS的电导率。

在另一个优选的实施方式中，本发明的组合物的特征可在于其包含：

(ii)浓度为250mM至320mM的精氨酸，并且其特征在于其具有

(iii)5.8至6.2的pH。

更优选地，本发明的组合物的特征可在于其包含：

(ii)浓度为250mM至320mM的精氨酸，并且其特征在于其具有

(iii)20mS/cm±0.1mS的电导率，和

(iv)5.8至6.2的pH。

最优选地，本发明的组合物的特征可在于其包含：

(ii)浓度为250mM至320mM的精氨酸，优选浓度为310mM的精氨酸，和

(iii)浓度为至多50mM的单价、二价或三价盐离子，并且其特征在于其具有

(iv)20mS/cm±0.1mS的电导率，和

(v)5.8至6.2的pH。

针对以上所述的实施方式，同样优选的是本发明的组合物包含天然产生的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的功能活性片段或衍生物，或如SEQ IDNO：1的蛋白的功能活性片段或衍生物。

在本发明的上下文中，还证明了向蛋白组合物中加入精氨酸引起α-半乳糖苷酶的稳定。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：向所述组合物中加入精氨酸至终浓度大于100mM，特别是至少150mM。

在本文上下文中，术语“水性组合物”、“具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白”、“精氨酸”和“浓度”应被理解为如上文所详述的那样。

本发明上下文中所用的术语“稳定(stabilizing或stabilization)”包括促进和/或能够使目标蛋白在溶液中稳定或保持在溶液中的任何种类的过程，包括促进和/或能够使目标蛋白在任何温度(例如在4℃至37℃)增溶(solubilisation)的任何过程。蛋白的增溶和/或稳定包括但不限于，不出现沉淀和/或聚集产物，这些产物的存在和/或不存在可以通过本领域已知的标准方法来分析，例如通过目视检测的方法分析，通过光密度测定的方法(包括例如测定含有稳定的蛋白的各个组合物的总蛋白含量)和/或通过使用标准生物化学技术的蛋白分析方法(例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。术语“稳定”还包括蛋白催化酶反应的可行性(feasibility)。特别地，在本发明的上下文中，根据本发明方法的稳定的蛋白显示出α-半乳糖苷酶的酶活性，更特别地，水解1，3-连接的半乳糖苷酶残基的酶活性。如上文已经描述的，所述酶活性可以通过本领域技术人员已知的标准生物化学检验方法来确定和评价(参见例如Liu等人，2007)。此外，根据本发明所述的蛋白的稳定还包括在溶液中将目标蛋白浓缩至浓度为至少20mg/ml但不由于沉淀和/或聚集而损失蛋白的可行性。

在优选的实施方式中，所述稳定的组合物的特征如在以上本发明的水性组合物的上下文中所详细记载的任何实施方式所描述。

在本发明的上下文中，还证明了，当具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白在浓度大于100mM、优选浓度为至少150mM的精氨酸存在下被稳定时，可以通过离子交换层析的方法、特别是使用阳离子交换层析来纯化所述蛋白。在本发明上下文中阳离子交换层析的使用仅通过如本发明所述稳定蛋白而成为可能。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种制备纯化的水性组合物的方法，该组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，所述方法包括以下步骤：

(c)通过阳离子交换层析纯化步骤(b)的组合物。

在该上下文中，术语“水性组合物”、“具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白”、“精氨酸”和“浓度”应被理解为如上文所详述的那样。

本发明上下文中所用的术语“提供组合物”是指适合于制备包含目标蛋白的组合物的所有种类的程序。这些程序包括但不限于，制备源自任何种类的包含目标蛋白的生物的完整细胞提取物，制备来自特定细胞种(例如在培养物中生长的)并且包含目标蛋白的总细胞提取物，包括但不限于，制备源自表达重组目标蛋白的细菌宿主细胞的总细胞提取物，或通过其它任何方法制备蛋白组合物。如上文所详述，细胞提取物的制备可以包括，通过例如各种离心和/或分级分离步骤从培养物中收获细胞的所有必需步骤，或通过机械或化学方法(包括但不限于，多次冷冻和/或解冻循环和/或超声处理细胞)而裂解细胞的步骤。

优选地，所述组合物是水性组合物。术语“水性组合物”应被理解为如上文所详述的那样。

本文所用的术语“浓缩组合物”是指增加组合物和/或溶液中给定蛋白的浓度。这样的增加可以通过标准生物化学方法的方式进行。这样的方法对本领域技术人员是熟知的，包括例如透析和/或通过使用离心超滤装置进行的超滤(即渗滤)。如上文所详述，这样的过滤装置应用截留值范围在3,000、10,000、30,000、50,000至100,000NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)的过滤膜，可以从不同的供应商通过商业渠道购买，例如从Millipore(MA，USA)。

一般地，可以基于蛋白的特性例如溶解性、大小、电荷和特异性结合亲和力而纯化蛋白。也就是说，通常通过离子交换层析基于蛋白的净电荷而分离蛋白。

本发明上下文中所用的术语“阳离子交换层析”一般是指所有这样的程序，其中带正电的蛋白(即在中性pH带有净正电荷的阳离子蛋白，如本发明的蛋白)能够与带负电的树脂(含有羧酸盐基团例如羧甲基纤维素(CM-纤维素)或羧甲基-琼脂(CM-琼脂)结合。然后与这样的树脂结合的带正电的蛋白可以通过增加洗脱缓冲液中氯化钠或另一种盐的浓度而被洗脱，因为钠离子与蛋白表面带正电的基团为结合至树脂而竞争。通过阳离子交换层析的方式，本领域技术人员能够通过将目标蛋白与特定的树脂结合而将其与其它蛋白分离开来，其程序包括洗涤所结合的蛋白并在存在增加的盐浓度时洗脱蛋白。因此，根据本发明所述的阳离子交换层析能使本领域技术人员通过生物化学方式将具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白在其天然状态下纯化至高产率。根据本发明所述的阳离子交换层析在如本发明的实施例6中所示。

在优选的实施方式中，步骤(b)的组合物如以上所述的任何实施方式中所定义。

通常，蛋白混合物进行一系列分离步骤，每个步骤基于不同的特性，以产生纯的蛋白。

因此，在另一个优选的实施方式中，本发明的方法包括在(i)步骤(b)之前和/或之后，和/或(ii)步骤(c)之前和/或之后，包括一个或多个另外的纯化步骤。

本文中所用的术语“另外的纯化步骤”是指支持目标蛋白的纯化和/或能够纯化目标蛋白的任何种类的生物化学方法。这样的标准方法对本领域技术人员是熟知的，包括例如，盐析、透析、(超)滤、(超)离心、凝胶-过滤层析、阴离子交换层析，和/或亲和层析。

具体地说，盐析是基于以下效应：多数蛋白在例如高盐浓度时溶解性较低。一种蛋白沉淀时的盐浓度与另一种蛋白是不同的。因此，盐析可以用于将蛋白彼此分级并因此分离开来，例如通过使用硫酸铵。盐析也可用于浓缩蛋白的稀释溶液，包括从其它纯化步骤获得的活性级分。

透析可用于通过半透膜(例如具有确定尺寸的孔的纤维素膜)的方式将蛋白从例如小分子中分离开。尺寸比孔直径大的分子被保留在透析袋内，而较小的分析和离子穿过这样的膜的孔。

(超)滤可用于例如从组合物的其它成分中进一步分离蛋白。可以使用的过滤膜材料包括硝酸纤维素、醋酸纤维素、PVC、Teflon或陶瓷膜，例如由氧化锆制成的。过滤膜可以是单个的膜或在膜系统中组装，例如，如，组件。组件可以是管状组件、螺旋组件或卷式组件或中空纤维组件。过滤膜可以具有直至大约5μm，优选为4μm，更优选为3μm，最优选为1μm的孔尺寸。用于超滤的过滤膜的孔尺寸优选为不超过100000NMGT(NominalMolecular Weight Limit)，更优选为不超过75000NMGT，再更优选为不超过50000NMGT，最优选为不超过30000NMGT。用于无菌过滤的过滤膜的孔尺寸优选为不超过0.8μm，更优选为不超过0.6μm，再更优选为不超过0.4μm，最优选为不超过0.22μm。用于过滤或超滤的过滤装置可从各供应商通过商业渠道获得，包括例如(

，Germany)或Millipore(MA，USA)。

凝胶-过滤层析可用于基于蛋白大小而实现蛋白分离。蛋白被置于柱的顶端，柱由多孔珠子组成，珠子由不可溶但高度水化的聚合物(例如葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺)制成。常规使用的这些珠子的商售制备物包括但不限于Sephadex、Sepharose和Biogel，直径通常为100μm。

阴离子交换层析可用于通过将蛋白与带正电的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)树脂和/或膜结合而分离带负电的蛋白(阴离子蛋白)。适合用于提供根据本发明的纯化的组合物的阴离子交换层析的例子在如实施例6中所示。

亲和层析是利用很多蛋白对特异性化学基团的高度亲和性这一优势的技术，可有效地用于分离识别特定基团的蛋白，其是通过(1)将所述基团或其衍生物与柱共价结合，和(2)向该柱加入蛋白混合物，然后以缓冲液洗涤柱以除去未结合的蛋白，和(3)通过加入高浓度的可溶形式的所述基团或改变条件以降低结合亲和性而洗脱所需要的蛋白。一般地，当蛋白与用作饵的分子之间的相互作用为高度特异性时，亲和层析是最有效的。

此外，在本发明方法的每个步骤中，可以进一步分析本发明的组合物，例如，为了在进行样品的进一步处理之前确定其精确的蛋白浓度。

在本发明的优选的实施方式中，本发明的组合物实质上按照实施例5中的描述制备。也就是说，在合适的宿主细胞(例如大肠杆菌HB101)中表达或过度表达α-半乳糖苷酶(例如B-zyme或SEQ ID NO：1的蛋白)。裂解宿主细胞(例如通过解冻和/或通过APV高压装置的方式)并通过纯化分离蛋白。为了这个目的，可以将裂解物：

(i)处理以除去核酸，例如通过聚乙烯亚胺(polymin)沉淀；

(ii)在存在精氨酸时浓缩，例如通过离心和/或在含有精氨酸(例如250至320mM的精氨酸)的缓冲液中超滤；和/或

(iii)通过层析方法纯化，例如通过阳离子交换层析的方式和，任选地，通过阴离子交换层析的方式。

在更优选的实施方式中，将裂解物：

(i)处理以除去核酸，例如通过聚乙烯亚胺沉淀；

(ii)在存在精氨酸时浓缩，例如通过离心和/或在含有精氨酸(例如250至320mM的精氨酸)的缓冲液中超滤；和

以下附图和实施例是为了解释本发明的各个实施方式。因此，所讨论的具体变化方式不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员明显的是，可以不脱离本发明的范围而产生各种等价物、改变和修饰，因此应该理解这样的等价实施方式包含在本文之内。

实施例

实施例1：α-半乳糖苷酶的酶活性测试

α-半乳糖苷酶的酶活性基本上按照以前所描述的进行测定(Liu等人，2007)。作为合成底物，使用了4-硝基苯基-α-D-半乳糖苷。在26℃，pH为6.8的反应缓冲液(含有100mM磷酸钠、50mM氯化钠)中在波长为405nm观测对硝基苯酚的释放。

实施例2：添加物的筛选

测试了多种添加物以改善部分纯化的α-半乳糖苷酶的溶解性。聚乙烯亚胺(polymine)沉淀步骤(见下面的实施例5)的上清液用作样品。

具体来说，制备含有缓冲物质(50mM Tris、20mM氯化钠，pH 7.0)和不同浓度的添加物的多种缓冲液(表1)。在室温以各个缓冲液将含有约20mg/ml蛋白的上清液的等分试样进行渗滤。在渗滤步骤中，通过目视检测样品监测α-半乳糖苷酶溶液的外观。在多数样品中，在渗滤时发生α-半乳糖苷酶的沉淀。

常见的添加物例如去污剂、尿素和糖不能使酶溶解。如表1所示，发现L-精氨酸是使酶保持在溶解状态的优选添加物。

表1添加物对α-半乳糖苷酶溶解性的影响

添加物浓度外观

甘油[％] 1.0 白色沉淀(wp)

3.0 wp

5.0 wp

10.0 wp

MgCl₂[mM] 1.0 wp

5.0 wp

10.0 wp

20.0 wp

Glycopon[％] 0.1 wp

1.0 wp

5.0 wp

10.0 wp

DTT[mM] 1.0 wp

5.0 wp

10.0 wp

20.0 wp

聚乙烯亚胺P[％] 0.01 wp

0.1 wp

0.5 wp

1.0 wp

Tween 20[％] 0.1 wp

0.5 wp

1.0 wp

2.0 wp

诺乃洗涤剂

(Nonidet)P40[％] 0.1 wp

0.5 wp

1.0 wp

2.0 较少沉淀

BSA[μg/ml] 1.0 wp

10.0 wp

100.0 wp

1000.0 较少沉淀

尿素[mM] 1.0 wp

10.0 wp

50.0 wp

100.0 wp

棉子糖 0.25 wp

0.5 wp

1.0 wp

2.0 wp

蔗糖 0.1 wp

0.5 wp

1.0 wp

2.0 wp

D，L-甘氨酸[mM] 1.0 wp

10.0 wp

50.0 wp

100.0 wp

L-精氨酸[mM] 0.1 wp

1.0 wp

10.0 wp

100.0 轻微乳白的溶液

150.0 澄清溶液

200.0 澄清溶液

表1中显示的结果证明：只有在存在终浓度大于100mM，例如至少150mM的精氨酸时，α-半乳糖苷酶被稳定。

实施例3：缓冲液条件的筛选

为了表征α-半乳糖苷酶的溶解性，研究了不同的缓冲液条件。为此目的，聚乙烯亚胺沉淀步骤(见实施例5)的上清液用作样品。在50mM磷酸钠缓冲液中测试了pH 4.5至pH 9.5的范围。

如表2所示，还研究了不同的电导率。通过向各个缓冲溶液中加入氯化钠贮存液的等分试样而调节电导率。通过目视检测样品监测α-半乳糖苷酶溶液的外观。如表2所示，在酸性和中性缓冲液条件(pH 7.5以下的pH值)时酶出现沉淀。在更高的pH值时其保持在溶解状态。在所测试的条件下缓冲液的电导率不影响溶解性。

表2显示pH和电导率对α-半乳糖苷酶溶解性的影响

pH 电导率[mS] 外观

4.50 6.00 白色沉淀

5.50 6.00 白色沉淀

6.50 6.00 白色沉淀

7.50 6.00 白色沉淀

7.50 15.00 白色沉淀

8.00 6.00 乳白的溶液

8.00 15.00 乳白的溶液

8.50 15.00 乳白的溶液

9.00 6.00 澄清溶液

9.50 15.00 澄清溶液

表2中显示的结果表明：在pH为9.0或9.5时蛋白保持在溶解状态。但是，发现在更高的pH值时蛋白失去活性。

实施例4：蛋白测定

通过测定蛋白在280nm的吸收值来确定各个级分和级分池(pools)的蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法是本领域中已知的标准方法。对于重组α-半乳糖苷酶，使用1.279的分子消光系数来计算酶的浓度。

实施例5：α-半乳糖苷酶(B-zyme)的制备

使用过度表达重组α-半乳糖苷酶的大肠杆菌HB 101细胞作为起始材料来制备α-半乳糖苷酶(B-zyme)的稳定组合物。在细胞裂解和分离核酸后通过超滤的方法和之后的透析步骤来进行制备。制备过程产生了重组α-半乳糖苷酶(B-zyme)的稳定组合物，可以储存或用于进一步纯化程序。

使用了下列缓冲液：

缓冲液A：50mM Tris/HCl，20mM NaCl，pH 7.5+/-0.2(6mS/cm+/-0.1)

缓冲液B：50mM磷酸钠，310mM L-精氨酸，pH 6.0+/-0.2(20mS/cm+/-0.1)

细胞裂解：

向260g冷冻的大肠杆菌细胞(干重；等于约1000g湿重)中加入3.6升缓冲液A。将细胞解冻并悬浮。然后将细胞悬浮液冷却于冰上，并通过APV高压装置(在750-800bar)裂解细胞。后续纯化步骤在室温进行。

核酸的沉淀：

细胞裂解之后，通过聚乙烯亚胺沉淀的方式将存在于粗提物中的核酸除去。为此目的，向提取物中加入一部分3M的氯化钠(体积的10％)至终浓度为300mM。如果需要的话，使用4N的NaOH或4N的HCl将pH值调节至pH 7.5±0.2。然后，逐步加入聚乙烯亚胺P溶液(10％)直至达到核酸的完全沉淀。然后，在5000rpm将溶液离心10分钟。任选地，在进一步浓缩步骤之前，获得的上清液储存于4℃过夜。

浓缩&超滤(即渗滤)：

离心步骤后获得的澄清的上清液(即聚乙烯亚胺P上清液)通常具有20-30mg/ml的蛋白浓度。使用Amicon Ultra(Millipore，MA，USA)膜将上清液进行浓缩。任选，将浓缩的聚乙烯亚胺P上清液储存于4℃。然后通过超滤装置对上清液进行渗滤。为此目的，使用30kDa膜(例如Pellicon 2，Millipore，MA，USA)。首先使用30kDa膜(例如Pellicon 2，Millipore，USA)将溶液浓缩，然后以5倍体积的缓冲液B(以25％HCl调节pH)进行完全透析(渗滤)。透析步骤的结果是具有0.5-0.8U/mg的比活性的α-半乳糖苷酶的稳定组合物。

由于精氨酸的加入，使得包含α-半乳糖苷酶的组合物的渗滤成为可能而无蛋白沉淀。上述步骤也使得能够在

HS 50(Applied Biosystems，Darmstadt，Germany)上通过离子交换层析进行蛋白的进一步纯化。

实施例6：α-半乳糖苷酶(B-zyme)的纯化

通过层析方法进行纯化。进行两个连续的层析。在第一次层析步骤中，α-半乳糖苷酶结合至阳离子交换树脂并通过高盐处理从柱上洗脱。在第二个层析步骤中，将酶加入到阴离子交换树脂并从流过液(flow through)中获得。纯化过程产生高纯度的重组α-半乳糖苷酶。

使用了以下缓冲液：

缓冲液C：50mM磷酸钠，0.043M L-精氨酸，pH 6.0+/-0.2(7mS/cm+/-0.1)

缓冲液D：50mM磷酸钠，0.043M L-精氨酸，350mM NaCl；pH 6.0+/-0.2(40mS/cm+/-0.1)

缓冲液E：20mM Tris/HCl，60mM NaCl，pH 8.0+/-0.2(7.5mS/cm+/-0.1)

缓冲液F：25mM磷酸钠，0.3M NaCl，pH 7.0+/-0.2(＞30mS/cm)。

所有标示的pH值定义为包含+/-0.2pH单位的偏差。

HS 50上进行的层析(阳离子交换层析)：

以缓冲液C将

HS 50柱(5升，Applied Biosystems，Darmstadt，Germany)进行平衡。将按照实施例5中的描述获得的稳定的α-半乳糖苷酶的组合物装载于柱子。本发明中所用的

HS 50柱可以装载0.2-1g蛋白/33ml离子交换材料。

以缓冲液C洗涤柱子。洗涤步骤之后，使用缓冲液D将酶洗脱。酶以单一峰被洗脱。确定相关级分中的酶活性和蛋白浓度。含有重组α-半乳糖苷酶的级分被富集为级分池(pool)。

超滤：

通过超滤装置对将含有酶的级分池进行渗滤。使用30kDa膜(例如Pellicon 2，Millipore，MA，USA)。以缓冲液E将蛋白溶液完全透析。任选，在进一步处理之前，将蛋白溶液储存于4℃。

Q

快流(fast flow)上进行的层析(阴离子交换层析)：

将经透析的级分池加至Q

快流柱(500ml，AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)，该柱经2倍于柱体积的缓冲液E平衡。最大来讲，对于每毫升的离子交换树脂可以向柱子加入蛋白的最大浓度为40mg。以缓冲液E洗涤柱子。收集级分并监测其α-半乳糖苷酶的活性。取出级分的等分试样，分析其活性并以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。重组α-半乳糖苷酶在流过液中洗脱。将显示出α-半乳糖苷酶纯带(具有64.5kDa的分子量)的级分富集成池并以贮存缓冲液(缓冲液F)进行透析。如SDS凝胶电泳所示，酶制备物是纯的(图1)。在HPLC分析中确定了酶制备物的纯度为＞99％(图2)。

实施例7：SDS凝胶电泳

使用商售凝胶(4-20％，Invitrogen，CA，USA)进行SDS凝胶电泳。在跑胶后，通过使用考马斯蓝(Simply

Invitrogen，CA，USA)染色来检测蛋白。使用分子量标记(MarkInvitrogen，CA，USA)确定蛋白的表观分子量。结果如图1所示。

实施例8：分析性HPLC

使用分析性HPLC确定蛋白级分和级分池的纯度。将等分试样(100μl)加至TSK G3000SW(Tosoh Bioscience GmbH，Stuttgart，Germany)。在合适的缓冲液(50mM Tris/HCl，100mM NaCl，pH 7.5)中运行柱。通过测定280nm处的吸收值检测蛋白。结果如图2所示。

参考文献

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Tsumoto等人(2004)，Biotechnol.Prog.20，1301-1308.

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

<120>稳定的α-半乳糖苷酶水性组合物及其相关方法

<130>R66370EP

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>572

<212>PRT

<213>脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)

<400>1

Met Arg Val Tyr Asp Ile Ser Gln Phe Gly Leu Lys Ala Asn Ser Lys

1 5 10 15

Lys Asn Ala Ser Pro Val Val Arg Lys Ala Ile Ala Lys Ile Lys Ala

20 25 30

Glu Cys Arg Asp Gly Glu Lys Val Ile Leu Arg Phe Pro Ala Gly Arg

35 40 45

Tyr Asn Phe His Glu Ala Gly Ser Thr Val Arg Glu Tyr Tyr Ile Ser

50 55 60

Asn His Asp Gln Asp Asn Pro Lys Lys Val Gly Ile Ala Leu Glu Asp

65 70 75 80

Met Lys Asn Leu Thr Ile Asp Gly Gln Gly Ser Glu Phe Val Phe Tyr

85 90 95

Gly Arg Met Ile Pro Val Ser Leu Leu Arg Ser Glu Asn Cys Val Leu

100 105 110

Lys Asn Phe Ser Ile Asp Phe Glu Gln Pro His Ile Ala Gln Val Gln

115 120 125

Val Val Glu Asn Asp Pro Glu Lys Gly Ile Thr Phe Glu Pro Ala Pro

130 135 140

Trp Val Asp Tyr Arg Ile Ser Lys Asp Ser Val Phe Glu Gly Leu Gly

145 150 155 160

Glu Gly Trp Val Met Arg Tyr Ser Trp Gly Ile Ala Phe Asp Gly Lys

165 170 175

Thr Lys His Val Val Tyr Asn Thr Ser Asp Ile Gly Cys Pro Thr Lys

180 185 190

Gly Ala Phe Glu Val Ala Pro Arg Arg Ile Cys Ser Pro Lys Trp Lys

195 200 205

Asp Ala Arg Leu Val Pro Gly Thr Val Val Ala Met Arg Gly Trp Gly

210 215 220

Arg Pro Thr Pro Gly Ile Phe Met Ser His Asp Val Asn Thr Ser Leu

225 230 235 240

Leu Asp Val Lys Val His Tyr Ala Glu Gly Met Gly Leu Leu Ala Gln

245 250 255

Leu Cys Glu Asp Ile Thr Leu Asp Gly Phe Gly Val Cys Leu Lys Gly

260 265 270

Asp Asn Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Thr Gln Ala Asp Ala Thr His Phe

275 280 285

Ser Gly Cys Lys Gly Lys Ile Val Ser Lys Asn Gly Leu Tyr Glu Gly

290 295 300

Met Met Asp Asp Ala Ile Asn Val His Gly Thr Tyr Leu Lys Val Ile

305 310 315 320

Lys Arg Val Asp Asp His Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Met His Asp Gln

325 330 335

Ser Trp Gly Phe Glu Trp Gly Arg Pro Gly Asp Asp Val Gln Phe Val

340 345 350

Arg Ser Glu Thr Met Glu Leu Ile Gly Lys Gln Asn Gln Ile Thr Ala

355 360 365

Ile Arg Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Ile Arg Gly Ala Arg Glu Phe Ser

370 375 380

Ile Thr Phe Lys Glu Ala Ile Asp Pro Ala Ile Asn Glu Lys Ser Gly

385 390 395 400

Phe Gly Ile Glu Asn Leu Thr Trp Thr Pro Glu Val Leu Phe Ala Gly

405 4l0 415

Asn Thr Ile Arg Asn Asn Arg Ala Arg Gly Thr Leu Phe Ser Thr Pro

420 425 430

Lys Lys Thr Val Val Glu Asp Asn Leu Phe Asp His Thr Ser Gly Thr

435 440 445

Ala Ile Leu Leu Cys Gly Asp Cys Asn Gly Trp Phe Glu Thr Gly Ala

450 455 460

Cys Arg Asp Val Thr Ile Arg Arg Asn Arg Phe Ile Asn Ala Leu Thr

465 470 475 480

Asn Met Phe Gln Phe Thr Asn Ala Val Ile Ser Ile Tyr Pro Glu Ile

485 490 495

Pro Asn Leu Lys Asp Gln Gln Lys Tyr Phe His Gly Gly Lys Asp Gly

500 505 510

Gly Ile Val Ile Glu Asp Asn Glu Phe Asp Thr Phe Asp Ala Pro Ile

515 520 525

Leu Tyr Ala Lys Ser Val Asp Gly Leu Ile Phe Arg Asn Asn Val Ile

530 535 540

Lys Thr Asn Thr Glu Phe Lys Pro Phe His Trp Asn Lys Asp Arg Phe

545 550 555 560

Leu Leu Glu Arg Val Thr Asn Val Lys Ile Ser Glu

565 570

Claims

1.一种包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物，其特征在于，所述组合物包含浓度大于100mM、特别是浓度为至少150mM的精氨酸。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含浓度为150mM至2M，更优选为200至400mM，最优选为250至320mM的精氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物的电导率为至多40mS/cm，优选为15mS/cm至25mS/cm，更优选为18mS/cm至22mS/cm。

4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为pH 5至pH 7.5，优选为pH 5.5至pH 7，更优选为pH 5.8至pH 6.5。

5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物来源于细菌宿主细胞，优选来源于大肠杆菌。

6.根据权利要求1至5任一项所述的组合物，其特征还在于，所述组合物的总蛋白含量为至少20mg/ml。

7.根据权利要求1至6任一项所述的组合物，其特征还在于，α-半乳糖苷酶的酶活性为0.5至0.8单位/毫克总蛋白。

8.根据权利要求1至7任一项所述的组合物，其特征在于，所述蛋白具有EC 3.2.1.22的底物特异性，优选地其中所述蛋白水解末端α-1，3-半乳糖基部分。

9.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白是天然产生的蛋白或其功能活性衍生物或片段，优选为来源于选自人、动物、植物、真菌和细菌的生物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述蛋白来源于细菌生物脆弱拟杆菌，优选地其中所述蛋白是来自脆弱拟杆菌的α-半乳糖苷酶的片段，或其任何功能活性衍生物或片段，所述来自脆弱拟杆菌的α-半乳糖苷酶的片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。

11.一种使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向所述组合物中加入精氨酸至终浓度大于100mM，特别是至少150mM。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物的特征进一步如权利要求2至10任一项所限定。

13.一种制备纯化的水性组合物的方法，该组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白，所述方法包括以下步骤：

(a)提供含有所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的组合物，

(c)通过阳离子交换层析纯化步骤(b)的组合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的步骤(b)的组合物的特征进一步如权利要求2至10任一项所限定。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征还在于，所述方法在

(i)步骤(b)之前和/或之后，和/或

(ii)步骤(c)之前和/或之后，

包括一个或多个另外的纯化步骤。