CN101864361A

CN101864361A - 可放大的细胞培养装置

Info

Publication number: CN101864361A
Application number: CN201010165728.1A
Authority: CN
Inventors: 王昱麒; 张景明; 何昇龙
Original assignee: Cesco Bioengineering Inc
Current assignee: Yishike Cell Technology Co ltd
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-04-16
Also published as: US20100267142A1; CN101864361B

Abstract

一种可放大的细胞培养装置，包括一基材槽、一混合槽、一连通装置、一驱动装置及一控制装置。基材槽具有多个多孔性基材设置于其内。混合槽具有一混合装置，用以混合一培养液。连通装置用以连通基材槽及混合槽。驱动装置用以驱动培养液于基材槽及混合槽之间流动。控制装置用以控制培养液在一高液面时浸没多孔性基材及在一低液面时露出多孔性基材。此外亦提供一种可放大的细胞培养装置的接种方法及细胞培养方法。本发明可减少一般填充床生物反应器所具有的细胞培养时曝气及含氧的限制、可以减少梯度效应及减少隧道效应。

Description

可放大的细胞培养装置

本发明请求于2009年4月16日提交的美国临时专利61/202,901，名称为“Scalable fixed-bed culture device”的优先权，并将其及此处所引用文件，或引用文件所引用文件以参考文件方式纳入。

技术领域

本发明是关于一种可放大的填充床细胞培养装置，特别是一种可放大的填充床细胞培养装置、接种方法及细胞培养方法。

背景技术

培养细菌、酵母菌及霉菌的大规模细胞培养制程已经广泛发展且行之有年，而上述物种因为都具有强韧的细胞壁及/或细胞外材质，因此具有较佳的弹性。这些弹性的微生物结构的正是这些微生物可快速进行高效细胞培养制程的重要因素。举例而言，细菌细胞可生长于利用激烈搅拌、培养翻动及打气技术的超大容积培养液中，以在生长期间达到良好的通气效果同时可维持培养细胞的生命力。相反地，由于真核细胞、动物细胞、哺乳类动物细胞及/或组织相较于微生物细胞为更加地细致及脆弱，因此培养这些细胞所需的技术往往更加困难。在一般生物反应器中微生物培养所需的激烈曝气及搅拌所造成的巨大剪力(shear force)很容易让这些细胞受损。

细胞培养系统的一般使用范例之一为滚瓶(roller bottle)。每个滚瓶可提供850-3000cm²的细胞培养面积。因此，在工厂之中需要同时处理数以千计的滚瓶，因此需要许多的劳力。自动化的滚瓶细胞培养细胞可以节省劳动，但是相当昂贵。

另一种细胞培养系统为搅拌槽(stir tank)。搅拌槽之中具有微型载体(microcarrier)，以便让细胞在其上生长。然而，在此范例之中，搅拌培养液以及对细胞通气显然仍会影响细胞生长。再者，当需要加大搅拌槽的容积时，需要改变操作条件。而改变操作条件会大大地延缓产品开发。

另一种细胞培养系统为中空纤维(hollow fiber)，其细胞密度可达到10⁸/ml。然而，在此范例之中，培养细胞的反应器为推流式(plug-flow type)。当细胞密度达到预定程度，反应器后端的细胞无法得到足够的养份，因而造成生长被抑制。为避免这种情形，反应器通常不会造得太大，而这就是中空纤维反应器的主要缺点。

填充床(Packed-bed)生物反应器包含可提供细胞生长及保护细胞避免剪力的多孔性基材(porous matrix)。由于多孔性基材具有大量的表面积，因此相较于其它系统可达到较高的细胞密度。通常每一毫升的基材可轻易地达到5～10×10⁷的细胞密度。然而，大部分的填充床生物反应器为沿着填充床进行单向的循环流，因而形成所谓的推流式模式。由于推流式模式的缘故，养分和氧气都会随着流动路径而减少，因此形成梯度(gradient)，并因此限制系统放大的能力。人们称此现象为「梯度效应(gradient effect)」。梯度效应在所有的推流式设计的装置(例如中空纤维生物反应器及填充床生物反应器)都会发生，因此造成这些系统在制程规模放大方面的限制。

此外，沿着填充床截面流动的模式会造成不均匀的现象。培养液在流经较低填充密度而具有较高渗透性的区域的时候流动较快且较平顺，而在流经较高填充密度而具有较低渗透性的区域的时候流动较慢或是停止流动。此称为隧道效应(channeling effect)。隧道效应会阻碍细胞生长，并且造成在具有较高填充密度的区域之处的细胞死亡。

现有的接种方法为：将基材槽以培养液浸没，接着将具有高密度接种物的接种液注入基材槽之中。一驱动装置驱动接种物以单向流过填充床。由于填充床的作用为深度过滤器(depth filter)，接种物从填充床的顶部到底部被捉住，因此在接种的早期会造成填充床内细胞的梯度分布(gradient distribution)。减轻这些问题的可能方式为藉由增加培养液的流动速率，以减少细胞的梯度效率及不均匀分布。然而，较高的流动速率会对细胞造成剪力，并且沿着填充床垂直深度所逐渐增加的压力也会限制流速。

由于梯度效应、隧道效率及细胞在接种时期的不均匀分布，因此填充床生物反应器的大小相当受限。一般而言，填充床类型的生物反应器的大小限制在10到30公升之内。

然而，至少需要增加十倍才能使得填充床生物反应器在工业规模用途方面具有实用性。(参考资料：“Packed-bed bioreactors for mammalian cell culture：Bioprocess and biomedical applications，F.Meuwly et.al.Biotechnology AdvancesVol.25，Issue 1，January-February 2007，Pages 45-56)。

因此，大小限制成为填充床型生物反应器发展的主要瓶颈。因此，在合理的流速之下，减少养分/氧气梯度、隧道效应、及改善接种分布是解除填充床式生物反应器的大小限制的重要因素。现有设计的填充床细胞培养装置，例如Freedman等人的5,501,971号美国专利，名称为「Method and apparatus foranchorage and suspension cell culture」的专利，揭示一种反应器，其包括篮架式(basket-type)填充床及包括一搅拌器的一内部液体细胞生长液回流装置。这种现有设计会具有所有的上述缺点，例如梯度、隧道效应及细胞的梯度分布，因此使得填充床的大小限制在小于10L。

目前亦有其它部分方法试图解决填充床系统之中的氧气提供问题。举例来说，Liau等人的5,766,949号美国专利，名称为「Method and Apparatus forCultivating Anchorage Dependent Monolayer Cells」，叙述一种细胞培养系统，其中相对于生长基材上下振荡培养液，以试着增加细胞的含氧量。然而，Liau的发明具有许多缺点。此系统所具有缺点之一为相当复杂。Liau的系统需要两个外部的储存槽及一个具有数个直立基板的分离生长槽。需要具有数个蠕动泵将培养液由一储存槽经由生长槽，接着循环到另一储存槽，然到回到第一储存槽。由于Liau的装置相当复杂并且组件是位于培养槽之外(例如外部管线、储存槽及泵，因此很容易发生污染。另外，很难以及很费力才能进行灭菌，因为装置具有相对大量的零件及装置的大小。另外Liau的系统所具有的另一项问题为，流经系统的培养液会造成流动动力的剪力，因此很容易细胞从基板脱离及移位，因而减少细胞的生命力。此外，直立的基板也会使得细胞不易附着，因为无法立即附着到基板的细胞会因而掉落并累积在基板的底部，因此最后这些细胞大部分都无法存活。因此，培养细胞的存活率较低，因此蛋白质产生也随之减少，而这个系统会需要持续的重新开始，因此非常地没有效率及不具生产力。再者，因为此系统较复杂，收集任何的分泌蛋白质及细胞产物都会相当费事及费时。最后，当生长液降到相对于生长基板之下，细胞接触到空气，也就是直接接触到大气环境，因此造成细胞死亡。

Chang等人的6,323,022号美国专利，名称为“Highly efficient cell-cultivatingdevice”，叙述一种细胞培养系统，包括多个培养槽及一驱动装置。培养槽彼此相通，并且在其内具有培养液。驱动装置使得培养液在培养槽之间流动，使得培养槽内的培养液的水位垂直振荡。Chang的系统的主要问题为填充床完全依靠在培养液流经时所自我形成的静态混合器而达到功效。这样会造成许多的问题，例如细胞在附着到培养基材之前即产生沉降现象，由于在培养槽内缺乏混合，因此会缺乏不均匀的养分条件因此可能影响细胞生长，难以藉由加入碱性溶液以调整pH值，难以量测培养液内的pH值及溶氧。由于培养液槽内缺乏混合及打气装置，因此造成有限的氧气供应，是此发明的另一问题。

King-Ming Chang的7,033,823 B2号美国专利，名称为“Cell-cultivatingdevice”，叙述一种细胞培养装置及方法。此装置包括一个中空的圆柱体，其中多孔性纤维基材位于一上篮及一下篮之间，用以作为细胞的垫层。在其上有一个上槽，在垫层基材之下有一下槽。下槽主要是由可压缩的风箱型(bellows-type)袋子，藉此可将液体细胞培养液回流到上槽。Chang的系统的主要问题是下槽具有很少的混合功能，因此会在接种期间造成细胞沉降的问题。由于没有混合的缘故，因此难以测量pH值以及调整培养槽的pH值。此外，可压缩的风箱型袋子设计可能会造成外漏，因而限制系统的可放大性。

有鉴于细胞及组织培养技术在生技研究、制药研究、学术研究及生技制药制造等领域的重要性，并以考虑到上述的现有技术所具有的缺陷、困难及限制，本发明试着解决现有技术的困难并减少现有技术的缺陷，本发明要提供一种细胞及组织培养设备，其可达成长久以来所需的新颖方法及设备，以达到更具可靠度、更低复杂性、更高效率、减少繁琐步骤，而可放大生产规模，并生产高产率的细胞产生的细胞副产品。

发明内容

本发明的一个目的为提供一种可放大的细胞培养装置、接种方法及培养方法，其易于放大制程并达成高细胞密度及高产率。

本发明的另一目的为提供一种可放大的细胞培养装置、接种方法及培养方法，其可减少一般填充床生物反应器所具有的细胞培养时曝气及含氧的限制、可以减少梯度效应及减少隧道效应。

依据另一实施例，本发明提供一种可放大的细胞培养装置，包括一基材槽、一混合槽、一连通装置、一驱动装置及一控制装置。基材槽具有多个多孔性基材设置于其内。混合槽具有一混合装置，用以混合一培养液。连通装置用以连通基材槽及混合槽。驱动装置用以驱动培养液在基材槽及混合槽之间流动。控制装置用以控制培养液在一高液面时浸没多孔性基材及在一低液面时露出多孔性基材。

依据另一实施例，本发明提供一种可放大的细胞培养装置的接种方法，其包括：提供一基材槽，其具有多个多孔性基材填充于其内，其中孔洞性基材之间形成多个孔隙；注入具有一接种物的一接种液于基材槽，其中接种液渗入孔隙，并浸没孔隙，使接种物散布于孔洞性基材的表面。

本发明的新颖接种方法与现有的接种方法之间最大的差异在于，在接种期间，现有接种方法为将基材槽填满培养液，而将高浓度的接种物从充满培养液的顶部注入；而新颖的接种方法则是一开始基材槽并未以培养液浸没，而直接将均匀的接种液注入到基材槽。

依据再一实施例，本发明提供一种可放大的细胞培养装置的接种方法，包括：提供一可放大的细胞培养装置；注入具有一接种物的一接种液于基材槽，其中接种液渗入孔隙，并浸没孔隙，使接种物散布于孔洞性基材的表面；以及于基材槽及混合槽进行双向的培养液流动及补充氧气。

本发明上述及其它方式、特性及优势可由附图及实施例的说明而可更加了解。

附图说明

图1至图4为示意图，显示依据本发明较佳实施方式的细胞培养装置。

图5a至5e为示意图显示本发明之细胞接种方法及其使用装置。

图6为柱状图，显示使用本发明的新颖接种方法所得到的细胞分布结果。

图7为柱状图，显示使用现有接种方法所得到的细胞分布结果。

图8为折线图，显示使用本发明的可放大细胞培养装置的葡萄糖消耗。

图9为图形，显示使用本发明的可放大细胞培养装置的pH值分布。

图10为图形，显示使用本发明的可放大细胞培养装置的溶氧量分布。

图11为散点图，显示10L填充床基材槽在病毒感染之前，在垂直方向由上到下的细胞分布。

图12为折线图，显示使用本发明的可放大细胞培养装置的病毒生产分布。

具体实施方式

下列藉由实施例方式的详细说明，并非要用以将本发明限制为任何特定的叙述实施方式。这些详细说明可藉由结合附图的方式而更加容易了解，在此以参考资料方式纳入。为避免造成对先前叙述的非必要限制，下列叙述是以特定较佳实施方式讨论本发明。

本发明的实施方式可用以培养任何细胞，例如真核细胞及原核细胞，特别是动物细胞及/或哺乳类细胞。本发明的实施方式可用以生产由细胞所产生的任何产品，例如重组蛋白质、酶及/或病毒。

在一本发明的较佳实施例之中，一种细胞培养装置包含两个腔室：一混合槽及一基材槽。

混合槽包含多个开口，其可用以引入或是移除培养液或可作为其它用途。作为入气口或是出气口的开口会包含空气滤净器。在混合槽之内或之外设置有混合装置。混合槽内的混合装置较佳为螺旋桨或是搅拌叶片(stir blade)。混合槽外的混合装置较佳为摇动器(shaker)或是摇臂(rocker)。混合槽较佳为具有弹性及可抛弃式的；然而其也可以是硬质的金属、玻璃或是塑料容器。可选择性地设置打气装置，以提供额外的溶氧能力。打气装置可藉由搅动方式进行表面曝气及/或额外地以气泡进行打气，藉以增加混合槽之中的溶氧量。此外，基材槽也可进行间歇曝气或曝露于氧气以增加基材槽的溶氧量。混合槽及基材槽之间具有至少一管子(连通装置)以进行通连。混合槽可以一平台支撑，平台提供温度控制及混合功能以均匀化混合槽中的培养液。混合槽亦可设置pH、溶氧及温度探针以进行监控及制程控制。

基材槽具有作为入气口及出气口的开口，基材槽的上方具有开口，用以注入细胞、培养液及缓冲液。作为入气口及出气口的开口设置空气滤净器。基材槽内设置有多孔性基材。基材槽及/或混合槽可以一平台支撑，平台具有驱动装置以在垂直方向上下移动基材槽及/或混合槽，以调整基材槽及混合槽之间的相对高度。基材槽也可固定于稳定平台之上，而利用其它的驱动装置驱动培养液流动，例如空气压缩器、空气泵及压力/真空泵。可藉由一外部装置控制基材槽的温度。

基材槽之中的多孔性基材可形成宽松填充的基材，以作为培养液移动时捕捉细胞的深度过滤器，藉以尽可能地捕捉、固定及/或包埋细胞。藉由当多孔性基材由培养液浮出时，提供很薄的气体/培养液界面，多孔性基材也可尽可能地增加气体及培养液之间的接触。多孔性基材可具有任何大小及形状的多孔性基板，例如板状、颗粒状或条状，并可以任何架构方式建构。多孔性基材在基材槽内为随机地设置，并形成宽松填充的深度过滤器。每个多孔性基材都作为一个用以捕捉细胞的小型过滤器，或是作为细胞贴附的基板。然而，每个多孔性基材之间具有够大的孔隙空间以避免在培养液流动的过程之中造成细胞的堵塞及缠结。多孔性基材可包括织物载体、无纺布载体、板材、多孔陶瓷载体、其它高分子材质的多孔体、或是组织工程支架。更加特定而言，多孔性基材的较佳材料为无纺布纤维基材，因为其可作为捕捉细胞的过滤器。更加特定而言，多孔性基材具有巨大孔洞，其孔径大小为50um到200um，其孔洞性大于70％。更加特定而言，依据本发明较佳实施方式的多孔性基材可提供最大的表面积，以使捕捉细胞、进行贴附、生长及获得氧气。依据本发明较佳实施方式的系统可提供简单的方式进行收集具有细胞产回的培养液，而无需损失细胞，因为大部分的细胞都已经被多孔性基材所捕捉。依据本发明较佳实施方式的细胞培养装置也可保护细胞免于直接曝露到任何空气、气泡或是由于空气注入所产生的剪力，因此避免对细胞造成伤害的方式。

接着请参照图式以作为本发明的范例，这些图式并非用以限制本发明的范围。请参照图1及图2，其为侧视图，显示本发明较佳实施例的一细胞培养设备。请参照图式。基材槽1001包含具有空气滤净器的开口1003，以及在基材槽1001底部的开口1009，以藉由一管子或水管1010连接到混合槽1002。在管子1010之上设置开关阀1002以控制基材槽1001及混合槽1002之间的流动。于基材槽1001之中填充多孔性基材1005。将基材槽1001固定于由加热板1004所环绕的支撑物1023，将基材槽1001装设于驱动装置1007。图中的驱动装置1007是油缸或是气缸，双层感应器1008为设置于缸体之上，以控制缸体移动上限及下限。混合槽1002为弹性袋，其具有一个开口1011，并且由管子或水管1010连接到基材槽1001。二个开口连接空气滤净器1016、1019以作为进气口及出气口，并且用以在混合时进行培养液的曝气。管子1021连接混合槽1002及一储存槽或进料容器1038。于连接储存槽1038及混合槽1002的管子1021设置蠕动泵1039以便将培养液输送到混合槽1002。另一条管子1020连接到储存槽或是收集容器1037。于连接储存槽1037及混合槽1002的管子1020设置蠕动泵1040以便自混合槽1002收集培养液。将混合槽1002固定于具有容器1013、加热板1014、摇动器1015的平台上，加热板1014为用以提供正确的温度环境，摇动器1015为用以绕着轨道旋转或是振荡容器1013以将混合槽1002内的培养液进行混合。此外，可设置接种装置以将接种液注入多孔性基材1005。

在图1之中，基材槽1001是位于相对于混合槽1002之中液面1012的下限液面，因此培养液可自混合槽1002经由管子1010流到基材槽1001，并且浸没基材槽1001之中的多孔性基材1005，并且将基材槽1001之中的液面1006提高到上限。

请参照图2，其显示图1相同的本发明较佳实施方式的细胞培养装置，除了基材槽1001是位于相对于混合槽1002之中液面1012的上限液面，如此使得培养液可自基材槽1001经由管子1010流到混合槽1002，并且露出基材槽1001之中的多孔性基材1005。

请参照图3，其为本发明一较佳实施方式的细胞培养装置，其中混合槽1002具有设置于槽内的螺旋桨1017。基材槽1001为固定，而用以驱动混合槽及基材槽之间培养液流动的驱动装置是气动装置1034，气动装置1034为一气体/真空泵，其具有设置于连接空气滤净器的管子1003上的电磁阀或是时间控制器，藉以利用压力及真空控制混合槽1002与基材槽1001之间的培养液流动。可利用测压组件1035更加控制基材槽1001的培养液液面，其中测压组件1035亦可为液面传感器。混合槽1002于槽内设置磁性搅拌叶片或是电磁搅棒1017，并由混合槽1002外的电磁搅拌器1033所驱动。

请参照图4，其显示图3相同的本发明较佳实施方式的细胞培养装置，除了用以驱动基材槽及混合槽之间培养基流动的驱动装置为气动装置，其为气体泵，具有电磁阀及时间控制器1034设置于连接基材槽1001上的空气滤净器1003及混合槽1002上的空气滤净器1003’的管子，以藉由利用压力控制基材槽1001及混合槽1002之间的培养液流动。可利用测压组件1035更加控制基材槽1001的培养液液面，其中测压组件1035亦可为液面传感器。混合槽1002于槽内设置磁性搅拌叶片或是电磁搅棒1017，并由混合槽1002外的电磁搅拌器1033所驱动。

请参照图5a及图5b，其分别为接种装置1050的侧视图及上视图，接种装置1050具有多个接种孔1051以进行接种。较佳者，接种装置1050为环型，而接种装置1050的接种孔1051为对称，但不以此为限。

请参照图5a及图5c，在一较佳实施例之中，本发明的细胞接种及细胞培养方法包括下列步骤：对混合槽(未显示)及包含多孔性基材1005的基材槽1001进行预先灭菌；将混合槽固定于具有温度控制及混合装置的平台，混合装置可均匀化包含的培养液；无菌填充培养液到混合槽，将基材槽1001固定于具有温度控制的另一平台；将基材槽1001以一控制器连接空气及二氧化碳；无菌地连接基材槽1001及混合槽；以具有细胞的培养液作为接种液注入基材槽1001中，较佳为从多孔性基材1005上方的孔隙空间注入，直到接种液流经多孔性基材之间的孔隙空间(通常大于1mm)并浸没孔隙空间；间歇地以短的垂直距离上下移动培养液，较佳为小于或是等于多孔性基材1005的平均高度，以散布细胞并使细胞平均贴附到多孔性基材1005上；经过一段时间，在细胞固定于多孔性基材1005之后，起动驱动装置(未显示)使得培养液在混合槽及基材槽1001之间间歇及交替流动，使得多孔性基材1005可以以任何期望周期的循环浸没或露出。藉此使得当浸没基材1005的时候，需要的二氧化碳及养分可以被传送及混合，而细胞所得到的养分浓度可被控制，并且使得当露出基材1005的时候，氧气可藉由培养液薄膜接收而不会直接接触到空气。

请参照图5d及图5e，在本发明之另一较佳实施例之中，接种装置1050具有至少一导管1052，导管1052具有多个孔洞1053并插入多孔性基材1005。接种液是经由导管1052的孔洞1053流出并浸没多孔性基材1005。由于接种液中的接种物较不易被多孔性基材1005所阻隔，因此形成较少的垂直阻塞。

本发明的新颖接种方法与现有的接种方法之间最大的差异在于，在接种期间，现有接种方法为将基材槽填满培养液，而将高浓度的接种物从充满培养液的顶部注入；而新颖的接种方法则是一开始基材槽并未以培养液浸没，而直接将均匀的接种液注入到基材槽。因此，可将均匀的接种液注入基质槽而不受信道效应所干扰。此外，接种液中均匀的水平分布可形较低的水平梯度。再者，接种液中的接种物经设置于多孔性基材的导管流动，因此不易被由多孔性基材所形成的深度过滤器所阻塞，因此可达到更均匀的垂直分布。

实施例1使用新颖细胞接种方法所得到的细胞分布

准备高度为54cm、半径为6cm的圆筒。以BioNOC II基材(CESCOBioengineering Co.，Ltd.的产品，www.cescobio.com.tw)填充圆筒。准备包含良好混合1.1×10⁶个细胞/ml细胞的细胞培养液，并将其置放于具有出口与连接1/8”硅胶管的2L玻璃容器。将包含细胞的培养液自右上方藉由蠕动泵注入，直到培养液填满多孔性基材之间的孔隙。将圆筒放入二氧化碳培育箱并使其静置3小时。3小时后，自圆筒的上方，每9cm的垂直距离及每3cm的水平距离采集基材样本。为进行比较，使用公知方法进行另一项实验，包括将浓缩的接种液注入到40cm高、以BioNOC II基材填充并填满培养液的基材槽。接着将此培养液开始由上往下循环流动3小时。自圆筒的上方，每3cm的垂直距离采集基材样本。图6显示使用本发明的新颖接种方法所得到的细胞分布结果。图7显示使用现有接种方法所得到的细胞分布结果。结果显示在圆筒之中在垂直距离部分没有明显的梯度分布。然而，现有的方法在容器之中在垂直距离部分具有明显的细胞分布的梯度。这代表本发明的接种方法可以减轻现有方法在填充床生物反应器之中的梯度分布。

实施例2细胞培养及病毒生产

所采用的培养装置是依据图3所建构，除了混合槽是置放在摇动器之中的弹性袋，而非使用磁性搅拌器。也就是，混合槽为50L的弹性培养液袋，置放于具有转速及温度控制的恒温摇动器；基材槽为填充BioNOC II基材的10L玻璃槽。将混合槽及基材槽以1/2”硅胶管连接，并夹住以停止培养液在两槽之间的流动。培养液的流动控制是藉由具有时间控制器的空气泵及真空泵，并以硅胶管连接到基材槽。在泵和基材槽之间设置0.22um空气滤净器以避免污染。有50L弹性培养液袋中填以40L培养液，也就是DMEM/5％FBS。将具有包含1×10⁶个细胞/ml的MDCK细胞于7L培养液的玻璃容器由入口上方接种到填充BioNOC II基材的10L基材槽，直到基材槽填满培养液。接着将硅胶管上的夹子打开，以使两槽相连。将混合槽中的1L的培养液通到基材槽并停留30秒。接着将1L的培养液从基材槽送回混合槽并停留30秒。此循环持续4小时，直到所有的细胞固定于基材槽之中的基材上。在4小时之后，将基材槽中的培养液完全推到混合槽，并将基材自培养液露出，并曝露至大气以增加溶氧。从进料容器及收集容器进料及收集新鲜及处理后的培养液。进料及收集速率是依照葡萄糖消耗速率，并将最低葡萄糖控制为不低于1.0g/L。此循环持续6日，直到基材槽的细胞浓度达到1×10⁷个细胞/ml。沿着垂直方向采集基材样本以检查细胞分布。利用结晶紫及柠檬酸打破细胞，并使细胞核从基材释放出来。利用血球计数器计算细胞核。接着将10⁶个H1N1病毒连同最后浓度为2ug/ml的TPCK处理的胰蛋白酶接种到混合槽。继续进行培养直到细胞被打破而释放出病毒。每日采样以进行病毒效价测量。结果显示于图8-12。图8显示使用细胞培养装置的葡萄糖消耗。藉由灌流及补充浓缩液将葡萄糖浓度控制于1.0g/L以上。图9显示使用细胞培养装置的pH值分布。pH值为控制在7.1到7.2。图10显示使用细胞培养装置的溶氧量分布。藉由从混合槽或是基材槽注入空气或是氧气将溶氧控制在25％以上。图11显示10L填充床基材槽在病毒感染之前，在垂直方向由上到下的细胞分布。结果显示不会产生梯度分布。图12显示使用细胞培养装置的病毒生产分布。在感染72小时之后，病毒的效价可以达到1024HA/50ul。藉由本发明可使在一个10L基材槽之中细胞浓度达到1×10¹¹的细胞，而H1N1病毒效价可达到1024HA/50ul。

综合上述，本发明提供一种细胞培养装置、接种方法及培养方法，其可减少一般填充床生物反应器所具有的细胞培养时曝气及含氧的限制、可以减少梯度效应及减少隧道效应。本发明的接种方法可增加大型填充床生物反应器之中细胞分布的均匀度。因此，本发明提供一种细胞培养装置、接种方法及培养方法，其易于放大到实际生产规模，因为具有特殊设计以提供足够的氧气供应，减少现有填充床细胞培养装置的梯度效应及隧道效应，并提供改良的接种方法。

以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以之限定本发明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。

Claims

1.一种可放大的细胞培养装置，包括：

一基材槽，其具有多个多孔性基材设置于其内；

一混合槽，其具有一混合装置，用以混合一培养液；

一连通装置，用以连通该基材槽及该混合槽；

一驱动装置，用以驱动该培养液于该基材槽及该混合槽之间流动；以及

一控制装置，用以控制该培养液在一高液面时浸没该些多孔性基材及在一低液面时露出该些多孔性基材。

2.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该驱动装置包含空气压缩机、空气泵、油压或气压泵。

3.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该驱动装置是用以垂直移动该混合槽或该基材槽，以改变该基材槽及该混合槽之间的相对高度。

4.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该混合槽还包含一打气装置，用以增加该培养液的含氧量。

5.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该控制装置包含液位传感器或时间控制器。

6.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该基材槽更包含一接种装置，其用于将一接种液注入该些多孔性基材。

7.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该接种装置包含至少一导管，其具有多个孔洞并且插入该些多孔性基材。

8.如权利要求1所述的可放大的细胞培养装置，其特征在于，该些多孔性基材为织物载体、无纺布载体、板材、多孔陶瓷载体、其它高分子材质的多孔体、或细胞工程支架。

9.一种可放大的细胞培养装置的接种方法，包括：

提供一基材槽，其具有多个多孔性基材填充于其内，其中该些孔洞性基材之间形成多个孔隙；以及

注入具有一接种物的一接种液于该基材槽，其中该接种液渗入该些孔隙，并浸没该些孔隙，使该接种物散布于该些孔洞性基材的表面。

10.如权利要求9所述的可放大的细胞培养装置的接种方法，更包括：

上下振荡该接种液一段时间。

11.如权利要求9所述的可放大的细胞培养装置的接种方法，其特征在于，该接种液的注入是经由位于该些孔洞性基材的顶部的至少一该些孔隙。

12.如权利要求9所述的可放大的细胞培养装置的接种方法，其特征在于，该些多孔性基材为织物载体、无纺布载体、板材、多孔陶瓷载体、其它高分子材质的多孔体、或细胞工程支架。

13.如权利要求9所述的可放大的细胞培养装置的接种方法，其特征在于，该接种物包括真核细胞、原核细胞、动物细胞或哺乳类细胞。

14.如权利要求9所述的可放大的细胞培养装置的接种方法，其特征在于，该接种液的注入是经由至少一导管，其具有多个孔洞并且插入该些多孔性基材。

15.一种可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，包括：

提供一可放大的细胞培养装置，其包括：

一基材槽，其具有多个多孔性基材设置于其内，其中该些孔洞性基材之间形成多个孔隙；

一混合槽，其具有一混合装置，用以混合一培养液；

一连通装置，用以连通该基材槽及该混合槽；

一控制装置，用以控制该培养液在一高液面时浸没该些多孔性基材及在一低液面时露出该些多孔性基材；以及

注入具有一接种物的一接种液于该基材槽，其中该接种液渗入该些孔隙，并浸没该些孔隙，使该接种物散布于该些孔洞性基材的表面；以及

于该基材槽及该混合槽进行双向的培养液流动以浸没及露出该些多孔性基材。

16.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，更包含：

上下振荡该接种液一段时间。

17.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该接种液的注入是经由位于该些孔洞性基材的顶部的至少一该些孔隙。

18.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该些多孔性基材为织物载体、无纺布载体、板材、多孔陶瓷载体、其它高分子材质的多孔体、或细胞工程支架。

19.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该接种物包括真核细胞、原核细胞、动物细胞或哺乳类细胞。

20.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该驱动装置包含空气压缩机、空气泵、油压或气压泵。

21.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该驱动装置是用以垂直移动该混合槽或该基材槽，以改变该基材槽及该混合槽之间的相对高度。

22.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该混合槽更包含一打气装置，用以增加该培养液的含氧量。

23.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该控制装置包含液位传感器或时间控制器。

24.如权利要求15所述的可放大的细胞培养装置的细胞培养方法，其特征在于，该接种液的注入是经由至少一导管，其具有多个孔洞并且插入该些多孔性基材。