CN101851648A - 利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，它是将将巨大芽孢杆菌接种于斜面培养基培养后，再接入种子培养基培养，然后将种子培养液接入转化培养基。待巨大芽孢杆菌在转化培养基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，经巨大芽孢杆菌对雷帕霉素的转化，获得巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液，转化液中包含29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。本发明的优点是采用微生物转化技术获得雷帕霉素衍生物。具有对环境污染小、作用条件温和、无需基团保护等优点，并可通过对微生物及其转化雷帕霉素条件的改良提高雷帕霉素衍生物的转化率。
Description
技术领域
本发明涉及一种去甲基雷帕霉素的制备方法。
背景技术
雷帕霉素(Rapamycin；西罗莫司，Sirolimus)是吸水链霉菌AY B-994和吸水链霉菌FC904发酵产生的具有免疫抑制、抗真菌、抗增殖和抗肿瘤活性的大环内酯化合物(图1)，哺乳动物雷帕霉素靶位(mammalian target of rapamycin C1，简称mTORC1)抑制剂。已作为肾移植抗排斥药物、预防和治疗支架植入后冠状动脉再狭窄的雷帕霉素涂层支架应用于临床；正作为抑制mTOR信号传导途径的抗肿瘤药物(抗白血病、乳腺癌、胃癌、肠癌、肝癌等)进行研究或临床试验；最新研究表明，雷帕霉素具有延长老龄小鼠生命周期的作用。
作为mTORC1抑制剂雷帕霉素衍生物的化学半合成研究也取得成效。雷帕霉素43位分别被乙二醇、乙氧基、四氮唑取代的半合成衍生物依维莫司(Everolimus，RAD001)、比奥莫司(BiolimusA9)、Zotarolimus均已作为药物支架的涂层应用于临床。依维莫司、替西罗莫司(Temsirolimus，CCI-779，43位被丙二酯取代)已由FDA分别于2007年8月和2009年3月批准应用于晚期肾癌的治疗，对其他癌症的治疗也已进入临床试验阶段；Deforolimus(AP23573，43位由亚磷酸取代)抗癌作用已进入临床试验阶段，如已完成肉瘤III期、乳腺癌II期的临床试验。
采用与本发明类似的技术获得去甲基雷帕霉素的报道极为有限。游动放线菌ATCC63771(Actinoplanes sp.ATCC 63771)将雷帕霉素转化为7-O-去甲基雷帕霉素和42-O-去甲基雷帕霉素(US PATENT，5849730，1998年12月15日)；链霉菌NCIMB40515(Streptomyces sp.NCIMB40515)转化雷帕霉素为42-O-去甲基雷帕霉素；龟裂链霉菌ATCC 28893(Streptomyces rimosus ATCC 28893)转化雷帕霉素为7-O-去甲基雷帕霉素、29-O-去甲基雷帕霉素和42-O-去甲基雷帕霉素(Enzyme and Microbial Technology，21：405～412，1997)；Streptomyces toyocaensis ATCC 39471转化雷帕霉素为42-O-去甲基雷帕霉素(Journal of Antibiotics，48：657～666，1995)。已报道的对雷帕霉素具有转化能力的微生物菌株还有：Gliocladium celiquescens ATCC10097，Trichothecium roseum ATCC 12519、Syncephalastrum nigricans ATCC 12266、Syncephalastrum racemosus ATCC 1332B、Absidiaglauca ATCC 7852、Aspergillus alliaceus ATCC 10060、Cunninghamella baineri ATCC 36252、Botrytis elliptica ATCC 11787、Cheatomium cochliodes ATCC 10195、Thamnidium elegansATCC 8997、Streptomyce aureofaciens ATCC 10762、Streptomyce lavandulae ATCC 55209、Nocardia asteroids ATCC 3318、Saccharopolyspora eythrea ATCC 1163、游动放线菌ATCC53771、Bacillus subtilis ATCC 55060(Enzyme and Microbial Technology，21：405～412，1997)及游动放线菌ATCC 12065(海峡药学，20：98～101，2008)。
发明内容
本发明的目的在于提供更方便、环保、有效的去甲基雷帕霉素，特别是双去甲基雷帕霉素的制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：将巨大芽孢杆菌接种于斜面培养基培养后，再接入种子培养基培养，然后将种子培养液接入转化培养基。待巨大芽孢杆菌在转化培养基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，经巨大芽孢杆菌对雷帕霉素的转化，获得巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液，转化液中包含29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。
本发明的优点是采用微生物转化技术制备雷帕霉素衍生物。该技术与采用化学半合成技术进行雷帕霉素衍生物的制备相比具有对环境污染小、作用条件温和、无需基团保护等优点，并可通过对微生物及其转化雷帕霉素条件的改良提高雷帕霉素衍生物的转化率。此外，采用化学半合成技术难以获得的29，42-O-双去甲基雷帕霉素，采用本发明可以很容易获得。
附图说明：
图1是本发明采用的巨大芽孢杆菌的电子显微镜扫描图。
图2是本发明采用的巨大芽孢杆菌的进化树。
具体实施方式：
本发明公开29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素的制备方法。本发明包含采用巨大芽孢杆菌，在雷帕霉素存在下微生物转化雷帕霉素合成上述3个雷帕霉素衍生物以及分离、纯化获得上述3个化合物的方法及HPLC检测方法。
本发明公开的巨大芽孢杆菌系分离自福建省福州市土壤样品中的微生物，经形态特征、生理生化特性和16srDNA序列分析鉴定为巨大芽孢杆菌(表1，附图1，2)。
表1本发明采用的巨大芽孢杆菌的形态特征和生理生化特性
本发明公开利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其步骤如下：
(1)将巨大芽孢杆菌接种于斜面培养基，生长pH5.5～7.5，生长温度20～40℃，生长时间15～24h；
(2)将斜面培养物接入种子培养基培养，pH6.0～8.0，培养温度20～40℃，培养时间：一级种子15～24h，二级种子8～12h，种子培养过程摇瓶机转速220rpm；
(3)将种子培养液接入转化培养基。巨大芽孢杆菌在pH5.0～6.5，26～32℃，摇瓶机转速220rpm条件下繁殖15～24h，加入转化底物雷帕霉素。在上述条件下，巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素48～96h，获得巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液。转化液包含29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。
本发明采用的巨大芽孢杆菌在营养琼脂、沙保罗琼脂及高氏1号琼脂、精氨酸琼脂、ISP3琼脂等培养基中均能生长，最适的琼脂培养基为营养琼脂；生长pH5.5～8.0，最适生长pH6.5～7.5；生长温度20～40℃，最适生长温度28～37℃；培养时间15～24h。
能够使巨大芽孢杆菌生长的培养基均可作为该菌株的种子培养基，如营养肉汤、沙保罗液体培养基等。为了使转化效率提高，可以使用与转化培养基相同的培养基进行种子培养(见下文)。种子培养过程采用的pH6.0～8.0，最适pH6.5～7.5；种子培养温度20～40℃，最适温度28～35℃；种子培养时间：一级种子15～24h，二级种子8～12h，种子培养过程摇瓶机转速220rpm；移种量1～5％。
巨大芽孢杆菌微生物转化雷帕霉素在以碳、氮源及无机离子的有机培养基中进行。碳源(2～5克/100毫升培养基)可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等任意一种或2～3种任意量(相互搭配的每种碳源使用数量不限，只要混合后的总量在2-5克/100毫升培养基的范围即可)搭配使用，最适的碳源为葡萄糖和可溶性淀粉组合。氮源(0.5～2克/100毫升培养基)可以为黄豆粉、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、棉籽粉等任意一种或2～3种搭任意量(相互搭配的每种氮源使用数量不限，只要混合后的总量在0.5～2克/100毫升培养基的范围即可)搭配使用，最适氮源为酵母浸出物和蛋白胨组合。无机盐(0.1～0.2克/100毫升培养基)选择硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、氯化镁、氯化铵、硝酸铵、钼酸铵、硫酸锌、硫酸镁、碳酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等任意一种或2～3种任意量(相互搭配的每种无机盐使用数量不限，只要混合后的总量在0.1～0.2克/100毫升培养基的范围即可)搭配使用，最适无机盐为磷酸氢二钾和硫酸镁组合。转化过程采用的pH5.0～6.5，最适pH5.5～6.0；转化过程温度26～32℃，最适温度28℃；转化过程使用的的摇瓶机转速为220rpm；根据不同的培养基及培养条件，转化时间48～96h。
巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适种子和转化培养基均为(克/1000毫升培养基)：可溶性淀粉24、葡萄糖1、蛋白胨3、酵母浸出汁粉3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5，pH自然。在此培养基中，种子培养和巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适温度均为28℃，摇瓶机转速220rpm；种子培养最适pH6.5～7.5，一级种子培养时间15h，二级种子培养时间8h；巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适pH5.5～6.0，巨大芽孢杆菌在转化培养基中培养15h时加入雷帕霉素，转化时间64h。
转化底物雷帕霉素母液的溶解介质为二甲亚砜、甲醇、乙醇等；母液溶度20～10mg/ml，最适溶度15mg/ml；转化培养基中雷帕霉素的终浓度100～200μg/ml(即转化培养基中雷帕霉素的浓度)，最适终浓度125μg/ml。
为提高巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的效率，在转化培养基中可适当添加表面活性剂0.01～1克/100毫升培养基，如聚乙烯醇、水溶性维生素E、吐温80、吐温20、泊洛沙姆等中的任意一种，最适浓度为0.05～0.2克/100毫升培养基。此外，也可采用双水相系统，如聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分别与磷酸盐组成的双水相系统；聚乙二醇系列与聚乙烯吡咯烷酮组成的双水相系统。聚乙二醇浓度5～20克/100毫升培养基，最适浓度为10克/100毫升培养基；磷酸盐浓度为1～3克/100毫升培养基，最适浓度为2克/100毫升培养基；聚乙烯吡咯烷酮浓度5～15克/100毫升培养基，最适为10克/100毫升培养基。
采用岛津LC-2010CHT型号的高效液相色谱仪(HPLC)，全波长扫描，二甲基18碳硅烷(ODS C18)色谱柱(5μm)，乙腈∶甲醇∶水(55∶5∶40)为流动相，在柱温50℃、流速1ml/min的条件下，转化液中3个去甲基雷帕霉素：29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素与雷帕霉素的相对保留时间(RRT)分别为0.53、0.67和0.76。该检测方法可以将这3个去甲基雷帕霉素及它们与雷帕霉素很好地分离。
巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素转化液用乙酸乙酯以1∶1～2体积比萃取2次，每次20分钟后，将萃取液50～55℃减压浓缩至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50～55℃减压浓缩至干。从转化液中将3个去甲基雷帕霉素分离开来，可以用葡聚糖凝胶LH-20为填料进行柱层析，氯仿洗脱；也可用ODSC18反向硅胶为填料进行柱层析，乙腈/水系统洗脱，出峰顺序为29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素。通过上述柱层析，收集到的3个去甲基雷帕霉素纯度均可达90％以上。接着，以硅胶(300～400目)为填料，以丙酮/正己烷为流动相进行柱层析，获得纯度＞98％的3个去甲基雷帕霉素。通过波谱分析确证了3个去甲基雷帕霉素的化学结构。
本发明制得的29，42-O-双去甲基雷帕霉素理化性质见表2，与雷帕霉素主要构型的NMR谱化学位移对比见表3，确定的化学结构式如下所示。以下是与本发明有关的3个雷帕霉素衍生物及雷帕霉素化学结构式。
R1 R2
雷帕霉素 OCH3 OCH3
29，42-O-去双甲基雷帕霉素 OH OH
29-O-去甲基雷帕霉素 OCH3 OH
42-O-去双甲基雷帕霉素 OH OCH3
表229，42-O-双去甲基雷帕霉素的理化性质
表329，42-O-双去甲基雷帕霉素与雷帕霉素主要构型的NMR化学位移对比(in CDCl3)
a1H和13℃NMR分别在500MHz和125MHz进行检测
实例1
1、将牛奶冷冻保藏的巨大芽孢杆菌接入营养琼脂斜面，35℃培养15h，斜面菌苔丰满，挑取-铂环接入种子培养基(30ml/250ml三角瓶，克/1000毫升培养基)：可溶性淀粉24、葡萄糖1、酵母浸出汁粉3、蛋白胨3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5，pH自然，28℃、220rpm振荡培养15h后，以2.5％的接种量接入种子培养基(80ml/500ml三角瓶，配方同上)，28℃、220rpm振荡培养8h后以相同接种量接入转化培养基(60ml/500ml三角瓶，配方同上)，28℃、220rpm振荡培养15h，加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使终浓度为125mg/ml。接着在相同温度和转速下进行雷帕霉素的转化培养，64h转化结束，收集转化液。
2、取转化液，以转化液∶乙酸乙酯(1∶1)的比例萃取2次，每次20分钟。收集乙酯相，50℃减压浓缩去除乙酯，加入乙醇溶解，采用岛津LC-2010CHT HPLC检测仪，全波长扫描，ODSC185μm柱，乙腈∶甲醇∶水(55∶5∶40)为流动相，在柱温50℃、流速1ml/min的条件下进行检测，转化液中3个去甲基雷帕霉素：29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素与雷帕霉素的比例大致为9∶10∶6∶19。
3、5L转化液用1.5倍的乙酸乙酯全液萃取2次，每次10分钟，50℃减压浓缩乙酯相后加入100ml丙酮溶解出脂溶性成分，4#砂芯漏斗过滤去除不溶物，50℃减压浓缩。该浓缩液重新用2倍体积的乙酸乙酯萃取，50℃减压浓缩获得3ml粗品。该粗品进行反向硅胶柱层析(YMC-C18，50μm，2×60cm)，乙腈∶水(50∶50～55∶45V/V)梯度洗脱，HPLC检测，收集所需的组分。各组分层析液分别于50℃减压浓缩，去除乙腈，水层用2倍乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，50℃减压浓缩。经过反向硅胶柱层析后，分别得到纯度为92％的29，42-O-双去甲基雷帕霉素58mg(以雷帕霉素为标准品，外标法计算)，94％的42-O-去甲基雷帕霉素78mg(以雷帕霉素为标准品，外标法计算)和91％的29-O-去甲基雷帕霉素32mg(以雷帕霉素为标准品，外标法计算)。各组分浓缩液分别加入少量丙酮∶正己烷(25∶75)溶解，进行硅胶柱(300目)层析，丙酮∶正己烷(25∶75～33∶67V/V)梯度洗脱，TLC和HPLC跟踪检测，收集所需组分，50℃减压浓缩至干。最终获得纯度达96％的29，42-O-双去甲基雷帕霉素36mg、纯度达98％的42-O-去甲基雷帕霉素56mg，纯度达95％的29-O-去甲基雷帕霉素21mg。
实例2
1、将牛奶冷冻保藏的巨大芽孢杆菌接入营养琼脂斜面，28℃培养24h，斜面菌苔丰满，挑取-铂环接入种子培养基(30ml/250ml三角瓶，克/1000毫升培养基)：玉米淀粉30、蔗糖10、黄豆粉10、蛋白胨2、氯化钠1、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5，pH自然，28℃、220rpm振荡培养24h，以3％的接种量接入转化培养基(60ml/500ml三角瓶，配方同上)，28℃、220rpm振荡培养18h，加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使终浓度为125mg/ml。接着在相同温度和转速下进行雷帕霉素的转化培养，72h转化结束，收集转化液。
2、取转化液，以转化液∶乙酸乙酯(1∶1)的比例萃取2次，每次20分钟。收集乙酯相，50℃减压浓缩去除乙酯，加入乙醇溶解，采用岛津LC-2010CHT HPLC检测仪，全波长扫描，ODSC185μm柱，乙腈∶甲醇∶水(55∶5∶40)为流动相，在柱温50℃、流速1ml/min的条件下进行HPLC检测，转化液中3个去甲基雷帕霉素：29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素与雷帕霉素的比例大致为6∶10∶6∶26。
实例3
1、将牛奶冷冻保藏的巨大芽孢杆菌接入营养琼脂斜面，32℃培养18h，斜面菌苔丰满，挑取-铂环接入种子培养基(30ml/250ml三角瓶，g/L)糊精30、果糖5、花生饼粉10、蛋白胨1、酵母浸汁粉3、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5，pH自然，28℃、220rpm振荡培养24h，以2％的接种量接入转化培养基(60ml/500ml三角瓶，配方同上)，28℃、220rpm振荡培养24h，加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使终浓度为125mg/ml。接着在相同温度和转速下进行雷帕霉素的转化培养，72h转化结束，收集转化液。
2、取转化液，以转化液∶乙酸乙酯(1∶1)的比例萃取2次，每次20分钟。收集乙酯相，50℃减压浓缩去除乙酯，加入乙醇溶解，采用岛津LC-2010CHT HPLC检测仪，全波长扫描，ODSC185μm柱，乙腈∶甲醇∶水(55∶5∶40)为流动相，在柱温50℃、流速1ml/min的条件下进行HPLC检测，转化液中3个去甲基雷帕霉素：29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素与雷帕霉素的比例大致为7∶10∶8∶40。
Claims (11)
1.一种利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法。其特征在于：将巨大芽孢杆菌接种于斜面培养基培养后，再接入种子培养基培养，然后将种子液接入转化培养基；待巨大芽孢杆菌在转化培养基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，经过巨大芽孢杆菌对雷帕霉素的转化，获得巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液，转化液中包含29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。
2.根据权利要求1所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培养基为营养琼脂、沙保罗琼脂、高氏1号琼脂、精氨酸琼脂和ISP3琼脂；巨大芽孢杆菌在斜面培养基中的生长条件为pH5.5～8.0，生长温度20～40℃，培养时间15～24小时。
3.根据权利要求1所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的种子和转化培养基均为：碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基中含碳源2～5克；氮源可以为黄豆粉、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、棉籽粉等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基含氮源0.5～2克；无机盐选择硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、氯化镁、氯化铵、硝酸铵、钼酸铵、硫酸锌、硫酸镁、碳酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基中无机盐0.1～0.2克；种子培养过程采用的pH6.0～8.0，培养温度20～40℃；转化过程采用的pH5.0～6.5，温度26～32℃；移种量为1～5％。
4.根据权利要求2或3所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适种子和转化培养基均为1000毫升培养基含可溶性淀粉24克、葡萄糖1克、蛋白胨3克、酵母浸出物3克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克，pH自然。
5.根据权利要求4所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适种子培养条件为pH6.5～7.5，温度28℃，培养时间：一级种子15～18小时，二级种子8～10小时，移种量为2～3％。
6.根据权利要求5所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适转化培养条件为pH5.5～6.0，温度28℃，加入转化底物雷帕霉素后，转化周期63～65小时。
7.根据权利要求6所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素时使用的转化底物雷帕霉素事先溶解在二甲亚砜、甲醇或乙醇中，雷帕霉素母液浓度10～20mg/ml，最适终浓度为125μg/ml。
8.根据权利要求7所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：在100毫升转化培养基中添加表面活性剂0.01～1克，所述的表面活性剂为聚乙烯醇、水溶性维生素E、吐温80、吐温20、泊洛沙姆等的任意一种；或采用双水相系统，所述的双水相系统为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分别与磷酸盐组成的双水相系统；聚乙二醇系列与聚乙烯吡咯烷酮组成的双水相系统；聚乙二醇浓度5～20％；磷酸盐浓度为1～3％；聚乙烯吡咯烷酮浓度5～15％。
9.根据权利要求8所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液用乙酸乙酯以1∶1～2体积比萃取2次，每次10～20分钟，将萃取液50～55℃减压浓缩至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50～55℃减压浓缩至干；从转化液中将3个去甲基雷帕霉素分离开来，用葡聚糖葡聚糖凝胶LH-20为填料进行柱层析，氯仿洗脱；也可用0DSC18反向硅胶为填料进行柱层析，乙腈/水系统洗脱，出峰顺序为29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素；通过上述柱层析，收集到的3个去甲基雷帕霉素纯度均可达90％以上；接着，以300～400目硅胶为填料，以丙酮/正己烷为流动相进行柱层析，获得纯度＞98％的3个去甲基雷帕霉素。
10.根据权利要求1或2或3所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：
A.制备巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液
将牛奶冷冻保藏的巨大芽孢杆菌接入营养琼脂斜面，35℃培养15h，斜面菌苔丰满，挑取-铂环接入种子培养基：每100毫升培养基含可溶性淀粉2.4、葡萄糖0.1、酵母浸出物0.3、蛋白胨0.3、磷酸氢二钾0.1、硫酸镁0.05，pH自然，28℃、220rpm振荡培养15h后，以2.5％的接种量接入与上述配方相同的种子培养基，28℃、220rpm振荡培养8h后以相同接种量接入与上述配方相同的转化培养基，28℃、220rpm振荡培养15h，加入用乙醇配制的15mg/ml雷帕霉素母液，使终浓度为125mg/ml；接着在相同温度和转速下进行雷帕霉素的转化培养，64h后转化结束，收集转化液；
B.转化液的提取与检测
取转化液，以转化液∶乙酸乙酯为1∶1的比例萃取2次，每次20分钟；收集乙酯相，50℃减压浓缩去除乙酯，加入乙醇溶解，采用岛津LC-2010CHT型号的高效液相色谱仪，全波长扫描，ODSC18 5μm色谱柱，以乙腈∶甲醇∶水为55∶5∶40比例的溶媒为流动相，在柱温50℃、流速1ml/min的条件下进行HPLC检测，转化液中3个去甲基雷帕霉素：29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素与雷帕霉素的比例大致为9∶10∶6∶19；
C.转化产物的提取和纯化
5L转化液用1.5倍的乙酸乙酯全液萃取2次，每次10分钟，50℃减压浓缩乙酯相后加入100ml丙酮溶解出脂溶性成分，4#砂芯漏斗过滤去除不溶物，50℃减压浓缩，该浓缩液重新用2倍体积的乙酸乙酯萃取，50℃减压浓缩获得3ml粗品；该粗品进行填料为YMC-C18，50μm，径高分别为2和60cm反向硅胶柱层析，用体积比为50∶50～55∶45的乙腈∶水进行梯度洗脱，HPLC检测，收集所需的组分；各组分层析液分别于50℃减压浓缩，去除乙腈，水层用2倍乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，50℃减压浓缩；经过反向硅胶柱层析后，分别得到纯度为92％的29，42-O-双去甲基雷帕霉素58mg，94％的42-O-去甲基雷帕霉素78mg和91％的29-O-去甲基雷帕霉素32mg；各组分浓缩液分别加入少量体积比为25∶75的丙酮∶正己烷溶解，进行300目硅胶柱层析，用体积比为25∶75～33∶67丙酮∶正己烷进行梯度洗脱，TLC和HPLC跟踪检测，收集所需组分，50℃减压浓缩至干；最终获得纯度达96％的29，42-O-双去甲基雷帕霉素36mg、纯度达98％的42-O-去甲基雷帕霉素56mg，纯度达95％的29-O-去甲基雷帕霉素21mg。
11.根据权利要求10所述的利用巨大芽孢杆菌制备的去甲基雷帕霉素，其特征在于：所述的去甲基雷帕霉素的名称为29，42-O-双去甲基雷帕霉素，其理化性质见表2，与雷帕霉素主要构型的NMR化学位移对比见表3，确定的化学结构式：
表229，42-O-双去甲基雷帕霉素的理化性质
表329，42-O-双去甲基雷帕霉素与雷帕霉素主要构型的NMR化学位移对比(in CDCl3)
a1H和13CNMR分别在500MHz和125MHz进行检测。
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