CN101848928B - 葡激酶变异体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及优化的、具有血栓或纤维蛋白溶解活性的葡激酶变异体，所述葡激酶变异体具有低的T-细胞免疫原性且被能高水平表达的循环抗体清除的清除率较低。

Description

葡激酶变异体

发明领域

本发明涉及优化的具有血栓或纤维蛋白溶解活性的葡激酶变异体，所述葡激酶变异体具有低的T-细胞免疫原性且被能高水平表达的循环抗体清除的清除率较低。

背景技术

在心肌缺血症状出现早期给药纤维蛋白溶解剂能保护心肌组织、防止心肌梗死(充血性心力衰竭、心律失常等)引起的继发性并发症，且最重要的-挽救生命。目前最常用的两种纤维蛋白溶解剂是链激酶(SK)和重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)。尽管SK具有成本非常低的优点，但它在动脉通畅率和30天死亡率(该死亡率差别保持了至少两年)方面不如rtPA(或rt-PA的突变体)有效，并伴随有低血压、过敏反应和中和抗体。相反地，由于rtPA相当贵及已知的在死亡率上的微小效益(在30天的绝对差别为1％)，它目前还不是所有患者的首选药物。

因此，功效优于SK并相当于rtPA的可采用的纤维蛋白溶解剂是非常重要的。初始数据表明新型纤维蛋白溶解剂葡激酶(Sak)可能是这种药剂。它在诱导早期冠状动脉通畅方面的功效似乎至少类似于rtPA，且其安全性可能相当或更好。就如其它溶栓剂一样，Sak在等离子环境中溶解血块。然而，与SK或rtPA不同，服用Sak不会导致纤维蛋白原降解。Sak在血块表面起作用，且比SK或rt-PA更具有纤维蛋白特异性。与rt-PA不同，已经发现Sak不诱导促凝血活性。

由于Sak是来源于细菌的酶，人们曾致力于通过定点突变技术减少Sak的抗原性而不减少纤维蛋白溶解性能。尽管有这些努力，对于一种结合有(T-细胞)免疫原性和清除率降低(即抗体结合力降低)性能的Sak变异体且所述变异体可以足够高的水平制备以备广泛使用而言，仍然需要改进。显然，除了这些特征外，还应保持所需的纤维蛋白溶解性能。

发明概述

本发明一方面涉及分离的、具有纤维蛋白或血栓溶解活性的葡激酶变异体，其特征在于所述变异体中引入的氨基酸变异与葡激酶有关，更具体地讲，与选自Sak42D、SakCФc*和SakSTAR的野生型葡激酶有关，其中所述氨基酸变异包括选自如下的变异单中的一种或多种：E65D、K74Q、R77E、E80S、D82S、V112T、K130Y和E134R。一个具体实施方案中，所述变异包括V112T和E134R。更具体地讲，所述氨基酸变异包括E65D、K74Q、R77E、E80S、D82S、V112T、K130Y和E134R。一个实施方案中，本发明葡激酶变异体由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。另一实施方案中，可引入其它氨基酸变异S3C，例如来修饰葡激酶分子。所述修饰可为，例如聚乙二醇化。此外，本发明葡激酶中可存在其它N-末端蛋氨酸残基，是为了进行和/或由于重组表达而引入的。

本发明另一方面涉及包含本发明葡激酶变异体的、具有纤维蛋白或血栓溶解活性的蛋白质。

另一方面涉及组合物，所述组合物包含本发明葡激酶变异体和/或包含本发明包含葡激酶变异体的、具有纤维蛋白或血栓溶解活性的蛋白质，并包含至少一种溶剂、稀释剂或载体。

此外，本发明任一葡激酶变异体和/或包含它们的蛋白质可用于制备用于在患者体内溶解血块的药物。其中一个实施方案中，所述血块可与任一血栓性疾病或导管闭塞有关。

本发明还涉及分离的、包含编码本发明葡激酶变异体的核苷酸序列的核酸和重组载体，任选可操作连接到表达所述葡激酶变异体所需的调控的核苷酸序列上。

最后，本发明涉及重组制备本发明葡激酶变异体的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在合适宿主中表达本发明葡激酶变异体；和

(ii)将在(i)中表达的葡激酶变体从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中分离。

为了制备修饰的葡激酶变异体，上述制备方法可还包括如下步骤：

(iii)对在(ii)中分离的葡激酶变异体修饰。

一个实施方案中，所述对葡激酶变异体修饰的步骤包括葡激酶分子的聚乙二醇化。

附图简述

图1.葡激酶变体被人的抗血清吸收。

采用分别从40和18SakSTAR免疫的患者获得的两个抗血清池通过等离子共振(Biacore分析)对野生型SakSTAR和几种葡激酶变异体进行分析。该图表明：本发明葡激酶(SEQ IDNO：1)及包含S3C氨基酸变异的其它变体(SEQ ID NO：1S3C)在被抗体池识别方面不及野生型SakSTARare、引入S3C变异的SakSTAR(SakSTAR S3C)和聚乙二醇化的SakSTAR(SakSTARMP5)。尽管并不是所有引入本发明葡激酶中的变异在分子的表面，然而，它们都产生减少被在患者身体内循环的抗葡激酶抗体识别的有益效果。

图2.葡激酶治疗后的体内肺动脉栓塞溶栓。

通过葡激酶注入治疗后测量仓鼠体内的肺动脉栓塞的溶栓。制备蛋白质并同时进行纯化，且在同系列试验中得到结果。A组：本发明葡激酶变异体(SEQ ID NO：1；三角形)和野生型Sak42D葡激酶(菱形)比较。B组：具有聚乙二醇化的S3C变异的本发明葡激酶变异体(矩形)和野生型SakSTAR葡激酶(圆形)比较。结果表明：在该体内模型中，本发明葡激酶变异体和野生型葡激酶一样有效。

发明详述

通过以下说明书包括试验和权利要求书对本发明进行说明。说明书和实施例并非用于对本发明进行限定，应该清楚的是：未包含在下文中的本发明领域内的公知常识都属于本说明书的一部分。此外，下文中没有进行解释的常用术语和方法具有其通常意义或解释。

得到本发明的工作部分基于WO 01/40281和Warmerdam等(J.Immunol.168，155-161(2002)；Thromb.Haemost.87，666-673(2002))中已经公开的葡激酶氨基酸变异。这些文献突出了一些葡激酶区域(和这些区域内各氨基酸)在引起T-细胞反应中的重要性。此外，为消除葡激酶的大部分T-细胞反应性，提出了几种氨基酸变异和氨基酸变异组合。

其它工作目前已经确定了具有血栓/纤维蛋白溶解活性的葡激酶变异体(参见描述体外和体内血栓/纤维蛋白溶解活性的实施例)，所述变异体不仅展示T-细胞抗原性降低，还显示出如下非常需要的优点：

(i)与在患者体内循环的抗体的结合减少；和

(ii)具有高水平表达的能力。

这种葡激酶变异体如SEQ ID NO：1所示且具有以下与野生型SakSTAR葡激酶(SEQ IDNO：2，其本身已被Collen等(Fibrinolysis 6，203-213(1992))公开)相关的氨基酸变异：E65D、K74Q、R77E、E80S、D82S、V112T、K130Y和E134R。其中可引入相同的氨基酸变异的其它野生型葡激酶为Sak42D(参见DD245444)和SakCФc*(参见EP0077664)。任选，为了对本发明葡激酶分子进行修饰如聚乙二醇化(pegylation)，可引入其它氨基酸变化(S3C)。聚乙二醇化可采用任何合适类型的聚乙二醇(PEG)进行，如PEG-5000或PEG-20000，且可按照例如Collen等(Circulation 102，1766-1772(2000))所述进行。此外，本发明葡激酶中可存在其它N-末端蛋氨酸残基，是为了进行和/由于重组表达而引入的。

结合到在患者体内循环的(已有)抗体的减少在给药到所述患者时对于防止葡激酶的快速清除和/或失活/中和而言是重要的。或者，换句话说，本发明葡激酶变异体主题的这种性能可限制给予待诊患者所需的活性化合物的量。自然，这增加了产品的耐受性和安全性，例如通过阻止过敏反应(White，Br.Med.J.302，429-430(1991))。本发明葡激酶变异体的这个方面已在图1中展示。

氨基酸变异E65D不能从WO 01/40281或Warmerdam等(J.Immunol.168，155-161(2002)；Thromb.Haemost.87，666-673(2002))中得到。最初的葡激酶变异体(K74Q、R77E、E80S、D82S、V112T、K130Y和E134R)中，不存在这种变异，但是这种变异体的产生由于发酵和/或随后纯化过程中作为不溶物质的表达产物聚集及蛋白降解/截断而受到很大的阻碍。除了减少产量和使得纯化过程大大变得困难以外，所述降解包括截断3-位置上的氨基末端丝氨酸(或任选半胱氨酸)，从而阻止还带有S3C突变的本发明葡激酶变异体的聚乙二醇化。这个问题通过改变单一氨基酸，即改变天冬氨酸盐(E65D)中65-位置的野生型谷氨酸盐来解决。

本发明葡激酶变异体可结合到较大分子中或可经过修饰(如聚乙二醇化)，条件是保持结合的葡激酶变异体的最初的免疫反应活性和纤维蛋白或血栓溶解活性。这种较大分子包括，例如标记了的葡激酶变异体。任一上述变化的目的可为，例如减慢给药给待诊患者的葡激酶变异体的转换。

本发明葡激酶变异体(或其修饰体)通常以组合物的形式例如溶液给药给待诊患者。其中，本发明药物可与至少一种溶剂、稀释剂或载体一起配制。具体地讲，所述溶剂、稀释剂或载体是药学上可接受的(如可从例如药典上得知)。所述溶剂、稀释剂或载体可包括能有效将药物给予待诊患者的任何物质，如盐、缓冲剂、(多)糖类、(多元)醇类、DMSO等。

本发明葡激酶变异体(或其修饰体)还可用于制备用于溶解患者体内血块的药物。

需要血栓/纤维蛋白溶解治疗的患者可能遭受任何血栓疾病如(急性)心肌梗死、冠状动脉血栓形成、闭塞性中风、缺血性中风、深静脉血栓形成、外周动脉疾病、肝静脉血栓形成、衰弱性血栓形成、窦血栓形成、静脉血栓形成、动脉血栓形成和动静脉转流术的闭塞。或者，在例如将任何物质注入到患者体内过程中，在此过程中用于输送治疗剂的导管被血块堵塞，发生血栓性疾病。

本发明葡激酶变异体可以单一或多剂量或大剂量给药给待诊患者，通过常规注入、加速注入，或可在血栓附近或直接在血栓内给药。也可选择任意这些给药方式的组合。

通常，为了溶解静脉内、动脉内或冠状动脉内血块和为了恢复血管的通畅性，本发明葡激酶变异体可以1μg-1mg/kg体重或0,1-100mg的量给药。此量可以单次剂量或分成多次剂量，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次给药，每次用合适的时间例如15、30或45秒，或1-10分钟间隔。或者，通过静脉内或动脉内治疗或注入输送药物，或通过导管输送到血管或冠状动脉血栓，输送时间取决于待引入血管系统中的液体中的药物浓度。本发明葡激酶变异体的通常注入时间为5-60分钟。或者，先快速注入1-10分钟，后正常注入直到60分钟的总注入时间。不管采用何种给药路径，给药的总剂量可为1-100mg、1-90mg、1-80mg、1-70mg、1-60mg、1-50mg、1-40mg、1-30mg、1-20mg或1-10mg本发明葡激酶变异体。通常，总剂量可达0.1、0.5、1、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5或100mg。

导管闭塞如中心静脉导管闭塞(CVC)的情况下，本发明葡激酶变异体的给药总剂量可达0.1、0.15、0.3、0.45、0.5、0.6、0.75、0.8、0.9、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、4、5、6、7、7.5、8、9或10mg，该总剂量可以单次剂量给药，或者分成2、3、4或5次剂量给药，间隔例如15、30或45秒，或1-10分钟，例如间隔2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。CVC的情况下，本发明葡激酶通常局部给药到闭塞的导管中。

本发明还涉及包含或由编码本发明葡激酶的核苷酸序列组成的任一核酸或重组载体(例如表达载体)。任选，所述核苷酸序列可操作连接到调控的核苷酸序列，例如启动子和/或终止子序列，使得编码葡激酶能够表达。对调控的核苷酸序列和编码本发明葡激酶的核苷酸序列的所有合适结合进行研究。调控的核苷酸序列包括编码蛋氨酸的ATG密码子，其可位于待表达蛋白质的N-末端。

最后，本发明涉及重组制备本发明葡激酶变异体的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在合适宿主中表达本发明葡激酶变异体；和

(ii)将在(i)中表达的葡激酶变异体从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中分离。

为了制备修饰的葡激酶变异体，上述制备方法可还包括如下步骤：

(iii)对在(ii)中分离的葡激酶变异体进行修饰。

一个实施方案中，所述对葡激酶变异体进行修饰的步骤包括葡激酶分子的聚乙二醇化。

考虑所有合适宿主或宿主细胞和伴随的宿主细胞培养基。非限定性宿主细胞示例包括：大肠杆菌、酵母属(如啤酒酵母)、裂殖酵母属(如粟酒裂殖酵母)、汉森酵母属(如polymorpha)、昆虫细胞(如草地贪夜蛾)和哺乳动物细胞(如COS细胞、CHO细胞)。

实施例

葡激酶变异体制备

基本如EP0525252A1、WO 93/13209、WO 96/21016和WO 99/40198中任一详细描述的进行葡激酶及其变异体的分子克隆、表达、(重组)制备和纯化。

体外纤维蛋白/血栓溶解活性

SEQ ID NO：1所示的葡激酶在发色溶栓分析中确定的比活度为55±15kU/mg，这大大低于野生型SakSTAR(153±33kU/mg)的比活度。发色分析基本上按照WO 99/40198中实施例2.5中所述采用S2403作为发色底物进行。

相反，SEQ ID NO：1所示的葡激酶诱导人血浆中50％血块溶解所需的浓度类似于所需的SakSTAR浓度(SEQ ID NO：1的浓度为360±30ng/mL而SakSTAR的浓度为343±35ng/mL)。该分析基本上如Amery等(Thromb.Diath.Haemorrh.9，175-188(1963))中概括及如EP0525252A1实施例3中所述进行。

体内纤维蛋白/血栓溶解活性：仓鼠肺栓塞模型

实验动物：对体重为80-120g的远系繁殖的仓鼠(245，Pfd，Gold，University of Leuven，Belgium)用1.25mg/kg阿托品腹腔注射进行麻醉前用药并通过腹腔注射50mg/kg的戊巴比妥钠(Mebumal Vet，ACO Lakemedel)使之麻醉。体温保持在37℃。在进行药动学研究中，将导管(Portex blue，Hythe)插入颈静脉以进行给药，和插入股静脉以进行采血。该实验按照国际止血和血栓学会的指南进行(Giles，Thromb.Haemost.58，1078-1084(1987))。

溶栓效力：如Stassen等(Fibrinolysis 4(Suppl.2)，15-21(1990)；Circulation 83(suppl.IV)，IV65-IV72(1991))所述在仓鼠肺栓塞模型采用TX 174和SakSTAR所得的剂量-效应曲线中确定诱导50％血块溶解的剂量。简单地讲，在体外制备50-μL 125I-纤维蛋白-标记的人血浆块并注射到肝素化仓鼠的颈静脉中。60分钟内通过静脉注入溶栓剂或盐水，输入结束30分钟后根据最初结合到血块中的放射性和实验末肺和心脏中残余的放射性的差异确定血块溶解程度。在注入结束时和实验结束时，如上所述收集血样。

结果：在体内仓鼠肺栓塞动物模型中SEQ ID NO：1所示的葡激酶与SakSTAR一样有效(SEQID NO：1的IC50为52μg/kg而SakSTAR的IC50为55μg/kg)。这在图2中有进一步展示，其中将Sak42D(参见专利DD245444)与SEQ ID NO：1所示的葡激酶比较。

序列表

<110>凝血基因公司

<120>葡激酶变异体

<130>TG-035_PCT

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>136

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>葡激酶变异体

<400>1

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

            20                  25                  30

Asp Ser Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro

        35                  40                  45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

    50                  55                  60

Asp Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Glu Val Val Ser

65                  70                  75                  80

Leu Ser Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Thr

            100                 105                 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

        115                 120                 125

Thr Tyr Val Val Ile Arg Lys Lys

    130                 135

<210>2

<211>136

<212>PRT

<213>金黄色酿脓葡萄球菌

<400>2

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

            20                  25                  30

Asp Gly Lys Arg Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro

        35                  40                  45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

    50                  55                  60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

            100                 105                 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

        115                 120                 125

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

130                 135

Claims (11)

1.一分离的、具有纤维蛋白溶解活性的葡激酶变异体，其特征在于：引入所述变异体中的氨基酸变异与选自SakSTAR的野生型葡激酶有关，其中所述氨基酸变异包括E65D、K74Q、R77E、E80S、D82S、V112T、K130Y和E134R；所述葡激酶变异体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:1S3C所示。

2.根据权利要求1所述的葡激酶变异体，其特征在于：所述葡激酶变异体的氨基末端有附加的蛋氨酸残基。

3.根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体，其特征在于：所述葡激酶变异体经过修饰，所述修饰是通过聚乙二醇化修饰。

4.一种用于溶解患者体内血块的组合物，其特征在于：所述组合物由根据权利要求1-3中任一项所述的葡激酶变异体，和至少一溶剂、稀释剂或载体组成。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的葡激酶变异体在制备用于溶解患者体内血块的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述血块与血栓性疾病或导管闭塞有关。

7.一分离的核酸，所述核酸是编码根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体的核苷酸序列，所述序列任选可操作连接到表达所述葡激酶变异体所需的调控的核苷酸序列。

8.一重组载体，所述重组载体包括编码根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体的核苷酸序列。

9.重组制备根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在合适宿主内表达根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体；和

(ii)将(i)中表达的葡激酶变异体从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中分离。

10.制备根据权利要求3所述的葡激酶变异体的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)在合适宿主内表达根据权利要求1或2所述的葡激酶变异体；

(ii)将(i)中表达的葡激酶变异体从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中分离；和

(iii)对(ii)中分离的葡激酶变异体进行修饰。

11.根据权利要求10所述的方法，其中对所述葡激酶变异体进行修饰的步骤是聚乙二醇化。

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