CN101844994B - 阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物及制备方法和应用，其消旋棉酚氨基酸衍生物结构通式如(I)，其制备方法为：(1)消旋棉酚或左旋棉酚溶于有机溶剂中；(2)将氨基酸与碱混合于有机溶剂中，搅拌；(3)将步骤(2)的反应液加入到步骤(1)的反应液中，搅拌回流，反应产物分离纯化，即得产品；阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用，价格低廉，制备方法简单，制备成本低，且其得率和产率均优于其他小分子HIV-1阻断抑制剂。

Description

阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物治疗领域，更具体涉及一种阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物，同时还涉及一种阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物的制备方法，还涉及一种阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物在制备艾滋病药物中的用途。

背景技术

人免疫缺陷病毒-I(HIV-1)在世界和我国流行，但至今尚未研制出高效的疫苗。因此高效价廉的治疗药物的研制仍是防治艾滋病的当务之急。在侵入抑制药物方面，二十世纪九十年代初，Wild及其同事于1992年首次报道了高效的HIV-1侵入抑制肽(Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：10537-41；Proc.Natl Acad Sci USA，1994，91：9770-74)次年姜世勃及其同事也发现抑制多肽，可阻断HIV-1侵入细胞(Nature 1993，365：113)。上述多肽系衍生于HIV-1gp41的7肽重复序列HR1(N端肽)和HR2(C端肽)，姜世勃等发现的C端肽中的一种-简称T20已于2003年被美国FDA批准上市，商品名为Fuzeon，成为第一种新型抗艾滋病毒的药物一一融合抑制剂。抗HIV-1多肽的作用机制的研究(Nat Struct Biol，1995，2：1075-82；Cell，1997，89：263-73；Nature，1997，387：426-28.)表明gp120结合到CD4辅助受体上后，gp41通过HR1和HR2相互作用发生构象变化，形成具有融合作用的6聚体核心结构。该结构将病毒膜和靶细胞膜结合起来导致病毒和细胞的融合。在上述中间状态时C端肽HR2可结合到病毒gp41的HR1上，阻止六螺旋束的形成，从而抑制病毒和靶细胞的融合(Curr Pharm Des，2002，8：563-80)。Fuzeon是由36个氨基酸组成的多肽，需经化学方法合成。因此其价格非常昂贵，是美国最贵的一种药物。一位艾滋病患者年用药费为25000美元以上，此外T20只能通过静脉注射用药，每天需注射两次。为了改进这类多肽药物价格高昂的生产途径，倪凌等报导了HIV-1gp41七肽重复序列的HR2、HR1和HR2(HR212)组成的三螺旋蛋白，企图使抑制剂的制备方法由化学合成改变为基因表达，用HR212的基因DNA克隆以各种载体表达的HR212。试验证明所表达的HR212与T20具有同等的抑制HIV-1的效果(Biochem.and Biophy.Res.Commun，2005，332：831-836)。其稳定性和抗蛋白酶降解的能力高于T20(Virology，2008，377：80-87)，但尚需解决HR212在人体内直接表达的途径。许多研究者致力于抗HIV-1侵入的小分子化合物的研制，姜世勃等曾研究了许多低分子化合物对HIV-1侵入细胞的抑制作用(Curr Pharm Des，2002，8：563-80)。瑞士辉瑞公司所研发的Maraviroc(Antimicrob Agents Chemother，2005，49(11)：4721-32)于2007年8月被美国FDA优先审批的小分子抗HIV-1侵入抑制剂。Maraviroc用于阻止以CCR5为辅助受体的HIV-1的侵入。Maraviroc的作用机理是通过阻断病毒侵入CCR5的联合受体来阻断其侵入健康细胞，而不是在血液癌细胞中(Drug Metab Dispos.，2005，33(4)：587-95)。因此，临床用药前，需进行CCR5的检测，以确定患者是否适用于Maraviroc作为侵入抑制剂，因此它不是对所有艾滋病人都有效的一种治疗药物，而且价格仍然昂贵，一名患者每年用药费用为10500美元。需要进一步的研制对所有艾滋病人有效的且价廉的低毒性的HIV-1侵入抑制剂。这正是本发明的研究目标。

本发明公布的新技术是氨基酸化的棉酚。曾报导棉酚在体外有抗HIV-1活性(Contraception 1989，579-587)，但其抑制活性不强。后来的研究发现不同旋光性的棉酚抗HIV活性表现出很大的差异，右旋棉酚几乎没有活性，在接近半数细胞毒性浓度下也没有明显的抗病毒作用；左旋棉酚能抑制HIV-1侵入细胞，其半数抑制浓度为2.0μM；左旋棉酚有较弱的细胞毒性，对H 9细胞的半数毒性浓度为5.2μM(Antimcicrob Agents Chemother 1989，2149-2151)。本发明所研制的氨基酸化的左旋棉酚对HIV-1的抑制活性比单独的左旋棉酚提高20倍，毒性只有左旋棉酚的十分之一，治疗指数提高了两百多倍。

发明内容

本发明的目的在于是提供了一种阻断人免疫缺陷病毒入侵的棉酚氨基酸衍生物，它克服了多肽类抑制剂需静脉注射且价格昂贵的缺陷。它与小分子抑制剂马拉若韦(Maraviroc)相比，也具有明显的优越性。马拉若韦只能阻断以CCR5为辅助受体的HIV-1的侵入，因此它只适用于部分艾滋病患者；本发明的HIV-1阻断抑制剂适用于所有艾滋病患者，且价格低廉。其应用综合效果优于其他侵入抑制剂。

本发明的另一个目的是在于提供了一种阻断人免疫缺陷病毒侵入人体的棉酚氨基酸衍生物的制备方法，其优点在于其原料为天然植物产品，制备方法简单，只需一步反应就可以获得棉酚氨基酸衍生物。所采用的合成反应步骤少，易操作不象马拉若韦那样需经过十多步的化学合成；反应条件温和，易控制；合成原料和相关试剂易得，制备成本较低，且其得率和产率均优于其他小分子HIV-1阳断抑制剂。

本发明的再一个目的是在于提供了一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用，其主要优点是其化学稳定性高于多肽类抑制剂，因此可以制备成预防艾滋病性传播的各种缓释剂型对医务工作者和科研人员偶然接触艾滋病人血液应急处理的贴剂，其应用效果优于已有的阻断HIV侵入的药物。

一种阻断人免疫缺陷病毒侵入人体的棉酚氨基酸衍生物在预防艾滋病传播最为有效。在异性性传播中，可应用阴道缓释剂，在同性性传播中，使用纳米高效释放剂以阻断不断创伤所造成的艾滋病毒的高效传播。应用于治疗时，可制备成口服剂并根据艾滋病人病情以及是否产生耐药性以确定用药剂量或疗程并与其他核苷类逆转录酶抑制剂联合使用，以到达良好的效果。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物(化合物I)的合成方法)，其反应式如下：

1.消旋棉酚氨基酸衍生物合成反应式：

2.左旋棉酚氨基酸衍生物合成反应式：

其中：RNH₂为氨基酸盐或氨基酸，N为氮原子，HO或OH为羟基，O为氧原子，H为氢原子，Me为CH₃。

一种阻断人免疫缺陷病毒侵入人体的棉酚氨基酸衍生物的制备方法，包括以下步骤(以克分子浓度计算)：

(1)、1份消旋棉酚或左旋棉酚溶于1-5份有机溶剂中，20-60℃，搅拌。

(2)、将2份氨基酸与2份碱混合于1-5份有机溶剂中，室温(20-25℃以下相同)搅拌10-60分钟。

(3)、将步骤(2)的反应液加入到步骤(1)的反应液中，控制PH＝7.0-8.0，温度控制在60-100℃，搅拌回流1-3小时，反应产物可以适当选择结晶、重结晶、色谱法和制备型色谱法分离纯化，制得消旋棉酚氨基酸衍生物(I)或左旋棉酚氨基酸衍生物(II)。

所述的有机溶剂包括醇、丙酮、N，N’-二甲基甲酰胺，乙腈中的一种。

所述的碱可为氢氧化钠、碳酸钠，氢氧化钾、碳酸钾。

消旋棉酚氨基酸衍生物通式结构如下：

其中：RNH₂为氨基酸盐或氨基酸，N为氮原子，HO或OH为羟基，O为氧原子，H为氢原子。

左旋棉酚氨基酸衍生物通式结构如下

其中：RNH₂为氨基酸盐或氨基酸，N为氮原子，HO或OH为羟基，O为氧原子，H为氢原子，Me为CH₃。

所述的抗HIV-1的棉酚氨基酸衍生物：

其特征是氨基酸为中性，酸性和碱性氨基酸。

其特征是氨基酸为D-氨基酸，L-氨基酸和和DL-氨基酸。

其特征是氨基酸为α-氨基酸，β-氨基酸

其特征是含有脂肪烃直链或支链以及芳环、取代芳环、芳杂环的氨基酸。

其特征是氨基酸也可以是其他氨基烷酸化合物。

所述的抗HIV-1的棉酚氨基酸衍生物，其特征是氨基酸盐。

所述的抗HIV-1的棉酚氨基酸衍生物，其特征是氨基酸盐为氨基酸钠盐和钾盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为L-丙氨酸钠盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为L-缬氨酸钠盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为L-亮氨酸钠盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为L-异亮氨酸钠盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为L-色氨酸钠盐。

所述的抗HIV-1棉酚氨基酸衍生物，其RNH₂为人体非必须的2-甲基丙氨酸钠。优先保护的消旋棉酚氨基酸衍生物代表性化合物如下：

棉酚-L-色氨酸钠希夫碱(G-Trp，(±)-Gossypol bis-(L-tryptophan sodium salt)Schiff’s base，化合物1)

棉酚-DL-丙氨酸钠希夫碱(G-Ala，(±)-Gossypol bis-(DL-alanine sodium salt)Schiff’s base，化合物2))

棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱(G-Gib，(±)-Gossypol bis-(2-Aminoisobutyric acidsodium salt)Schiff’s base，化合物3)

棉酚-DL-缬氨酸钠希夫碱(G-Val，(±)-Gossypol bis-(L-2-Amino-3-methylbutyic acidsodium salt)Schiff’s base，化合物4)

棉酚-L-异亮氨酸钠希夫碱(G-Ile，(±)-Gossypol bis-(L-isoleucine sodium salt)Schiff’s base，化合物5)

上述化合物1-5的制备可见实施例1。

优先保护的左旋棉酚氨基酸衍生物代表性化合物如下：

()棉酚-L-色氨酸钠希夫碱的制备((-)G-Trp，(-)-Gossypol bis-(L-tryptophansodium salt)Schiff’s base，化合物6)

()棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱的制备((-)G-Ala，(-)-Gossypol bis-(L-alanine sodiumsalt)Scbiff’s base，化合物7)

()棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱的制备((-)G-Gib，(-)-Gossypolbis-(2-Aminoisobutyric acid sodium salt)Schiff’s base，化合物8)

()棉酚-L-缬氨酸钠希夫碱的制备((-)G-Val，(-)-Gossypolbis-(L-2-Amino-3-methylbutyic acid sodium salt)Schiff’s base，化合物9)()-棉酚-L-异亮氨酸钠希夫碱的制备((-)G-Ile，(-)-Gossypol bis-(L-isoleucinesodium salt)Schiff’s base，化合物10)

上述化合物6-10的制备可见实施例2.

本发明合成的棉酚氨基酸衍生物用作制备治疗或预防艾滋病药物时，可以单独使用，或者与其他抗艾滋病药物组合使用，该组合药物含有0.1-99％的本发明棉酚氨基酸衍生物。本发明的衍生物用作艾滋病治疗药物时，可经口服和注射(静注，肌注)给药，剂型可选用胶囊剂，片剂，注射剂；本发明的棉酚氨基酸衍生物用作艾滋病预防药物时，可以制成栓剂，贴剂。所述的剂型可选用胶囊剂，片剂，注射剂、栓剂等可用常规技术制备。

当前艾滋病毒进入抑制剂主要是以T20为代表的多肽类和以马拉若韦为代表的小分子药物，他们的共同缺点是合成工艺复杂，成本高。多肽类药物只能注射，不能口服；马拉若韦仅对感染了R5嗜性艾滋病毒的病人有效。本发明和现有的这些技术相比，具有以下优点：(1)相对多肽类抑制剂，本发明合成的棉酚氨基酸衍生物体外稳定，因此其保存和运输在常温就可以，而多肽类药物需低温条件下进行。(2)本发明合成的棉酚氨酸衍生物不被肠道消化酶破坏，而且体内半衰期大于24小时，每天单次口服给药就可以维持很高的血药浓度，因此避免了长期注射给药的痛快和毒副作用；(3)本发明合成的棉酚氨基酸衍生物对R5和X4嗜性的艾滋病毒都有抑制作用，其对X4嗜性假病毒的半数抑制浓度低于0.4μM，其对R5嗜性病毒的半数抑制浓度为0.1μM，因此使用前无需对病人进行筛选，对所有的艾滋病人都有治疗效果。(4)本发明所需的原料在自然界有很广泛的来源，而且只需经过一步反应，一步纯化就可以得到纯度95％以上棉酚氨基酸衍生物，得率接近为50％。所需的试剂为常规试剂，反应的条件也很温和，适合大规模工业生产，其合成成本仅为多肽类抑制剂的三十分之一，是小分子马拉若韦(Maraviroc)的十分之一，因此其成本远远低于现有的艾滋病毒进入抑制剂。

附图说明

图1为(-)棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱对小鼠急性毒性测定结果

小鼠单次服用(-)棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱2g/kg，没有出现死亡；单次服用(-)棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱1g/kg，小鼠各方面正常，体重保持稳定。

图2为三种棉酚氨基酸衍生物对HIV-1侵入假病毒的抑制活性结果

1#棉酚-L-色氨酸钠希夫碱，2#棉酚-DL-丙氨酸钠希夫碱，3#棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱对HIV-1假病毒的半数抑制浓度分别为：0.33μM，0.16μM，0.42μM。

图3为(-)棉酚氨基酸衍生物抑制HIV-IIIB病毒活性结果

6#(-)-棉酚-L-色氨酸钠希夫碱，7#(-)棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱，8#(-)-棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱，9#(-)-棉酚L-缬氨酸钠希夫碱，10#(-)-棉酚-L-异亮氨酸钠希夫碱对HIV-IIIB病毒的半数抑制浓度均达0.1μM。

具体实施方式

实施例1：

阻断人免疫缺陷病毒的消旋棉酚氨基酸衍生物的制备

其步骤如下：

1、棉酚-L-色氨酸钠希夫碱(G-Trp，(±)-Gossypol bis-(L-tryptophan sodium salt)Schiff’s base，化合物1)

(1)100mg(1.930×10^-4mol)(±)-棉酚溶于10mL无水乙醇中，50℃，搅拌，得(±)棉酚的乙醇溶液。

(2)将78.8mg(3.861×10^-4mol)L-色氨酸与15.4mg氢氧化钠混合于10mL无水乙醇中，室温(20-25℃以下相同)搅拌30min得L-色氨酸钠的乙醇溶液。

(3)将上述L-色氨酸钠的乙醇溶液加入到棉酚乙醇溶液中，控制PH＝7.0-8.0，80℃搅拌3h，真空旋蒸法蒸去溶剂后所得固体以乙醇重结晶，抽滤，真空(-.1MPa)干燥，得黄绿色固体196.4mg的棉酚-L-色氨酸钠希夫碱(化合物1)，收率93.8％。mp 256-258℃.υ_max(KBr)/cm^-1：3476，3405(OH，NH)，1619(C₇＝O)，1600-1400(C＝C).¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.3357(2H，s)，10.9085(2H，d)，9.5885(2H，d)，8.4863(2H，broad s)，7.5111(2H，s)，7.3613(2H，d)，7.1944(2H，d)，7.0942(2H，d)，6.8817(2H，t)，6.8417(2H，t)，4.3140(2H，m)，3.5305(2H，sept)，3.0691(4H，d)，1.8829(6H，s)，1.4205(12H，d).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.1946，170.6328，160.5964，146.4607，136.1051，130.5258，127.3169，126.5437，125.4085，123.7013，120.5359，118.2901，118.0852，115.9856，110.1169，102.9202，64.7729，29.7325，26.4111，20.3618，20.1252.ESI-MS，：m/z933.3[M-H]^-.

2.棉酚-DL-丙氨酸钠希夫碱((±)-Gossypol bis-(DL-alanine sodium salt)Schiff’sbase，化合物2)

(1)、100mg(1.930×10^-4mol)(±)-棉酚溶于10mL无水乙醇中，50℃，搅拌，得(±)-棉酚的乙醇溶液。

(2)、将34.4mg(3.861×10^-4mol)DL-丙氨酸与15.4mg氢氧化钠混合于10mL无水乙醇中，室温搅拌30min得DL-丙氨酸钠的乙醇溶液。

(3)、将DL-丙氨酸钠的乙醇溶液加入到棉酚乙醇溶液中，控制PH＝7.0-8.0，80℃搅拌3h，真空旋蒸法蒸去溶剂后所得固体以丙酮重结晶，抽滤，真空(-0.1MPa)干燥，得黄绿色固体127.2mg的棉酚-DL-丙氨酸钠希夫碱(化合物2)，收率93.5％。mp 243-246℃(分解).υ_max(KBr)/cm^-1：3500-3300(OH，NH)，1620(C₇＝O)，1600-1400(C＝C).¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.3377(2H，s)，9.7909(2H，d)，8.5287(2H，broad s)，7.3998(2H，s)，3.8618(2H，m)，3.6776(2H，sept)，1.9247(6H，s)，1.4381(12H，d)，1.3872(6H，d).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ173.0510，170.7650，159.6236，149.8542，146.4333，130.6368，126.4209，125.6601，121.0031，116.6009，116.1537，103.1950，58.7080，26.4482，20.3469，20.2337，20.0696.ESI-MS：m/z 659.1[M-2Na+H]^-。

3.棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱(Gossypol bis-(2-Aminoisobutyric acid sodiumsalt)Schiff’s base化合物3)

本化合物3制备方法与化合物1的制备方法相同。收率90.7％，棕黄色固体，mp 236℃(分解).υ_max(KBr)/cm^-1：3500-3300(OH，NH)，1617(C₇＝O)，1600-1400(C＝C).¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.7008(2H，s)，9.8761(2H，d)，8.5683(2H，broad s)，7.4924(2H，s)，3.7132(2H，sept)，1.9589(6H，s)，1.4295(12H，d)，1.3583(6H，d).ESI-MS：m/z 687.1[M-2Na+H]^-。

4.棉酚-L-缬氨酸钠希夫碱((±)-Gossypol bis-(L-2-Amino-3-methylbutyic acidsodium salt)Schiff’s base，化合物4)

本化合物4制备方法与化合物1的制备方法相同。收率85.2％，黄绿色固体，mp＞285℃.υ_max(KBr)/cm^-1：3300-3400(OH，NH)，1614(C＝O)，1600-1400(C＝C).¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.3519(2H，s)，9.6831(2H，d)，8.5588(2H，broads)，7.4109(2H，s)，3.7734-3.7172(4H，m)，1.9101(6H，s)，1.3635(12H，d)，0.8763(6H，d).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.6126，171.5987，161.5303，150.2198，146.9255，138.7984，127.0388，126.3646，120.4490，116.9809，116.5476，103.6300，56.4916，31.9667，26.8221，20.8154，20.0121，18.9350.ESI-MS，：m/z715.2[M-2Na+H]^-。

5.棉酚-L-异亮氨酸钠希夫碱((±)-Gossypol bis-(L-isoleucine sodium salt)Schiff’sbase，化合物5)

本化合物5制备方法与化合物1的制备方法相同。收率86.0％，黄绿色固体，Mp 225℃(分解).υmax(KBr)/cm^-1：3489，3384(OH，NH)，1617(C＝O)，1600-1400(C＝C).¹H-NMR(400MHz，DMSO-d⁶)δ13.3847(2H，s)，9.7109(2H，d)，8.5473(2H，broad，s)，7.4090(2H，s)，3.8029(2H，m)，3.6870(2H，sept)，1.9183(2H，m)，1.9049(6H，s，)，1.4276(12H，d)，1.0973(4H，m)，1.0555(6H，m)，0.8907(6H，m).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.6594，171.6203，161.4640，150.1408，146.9563，138.7993，127.0328，126.4196，121.4477，116.7225，116.6785，103.7168，56.4399，26.8802，24.6013，20.8006，20.7390，19.0191，16.3899，12.0402.ESI-MS：m/z 743.2[M-2Na+H]^-。

实施例2：

阻断人免疫缺陷病毒的左旋棉酚氨基酸衍生物的制备

其步骤如下：

2.1(-)-棉酚(左旋棉酚)的制备(黄浩，姜海霞，曹新星，姜标.高纯度光学活性(-)-棉酚或(+)-棉酚的制备方法.中国.公开号CN101020626A[P].2007-08-22)

2.1.1(-)-棉酚-L-色氨酸甲酯希夫碱的制备((-)-Gossypol bis-(L-tryptophanmethyl ester)Schiff’s base)

取200mg(3.861×10^-4mol)棉酚溶于10ml乙醇中，45℃，搅拌，得棉酚乙醇溶液。取197mg(7.722×10^-4mol)L-色氨酸甲酯盐酸盐和30.8mg(7.722×10^-4mol)粒状氢氧化钠，在10ml乙醇中搅拌30min后加入到棉酚乙醇溶液中，反应4h。反应完全后，有黄色固体析出，抽滤，乙醇洗涤，真空(-0.1MPa)干燥，制得104.5mg的(-)-棉酚-L-色氨酸甲酯希夫碱，收率58.9％。[α]²⁰ _D：-720°(c 0.02，CH₃OH)，mp：178-180℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.47(dd，J＝11.5，8.2Hz，2H)，11.12(s，2H)，9.78(d，J＝12.5Hz，2H)，8.46(s，2H)，7.85(s，2H)，7.55-7.41(m，4H)，7.32(d，J＝8.0Hz，2H)，7.15(d，J＝1.9Hz，2H)，7.03(t，J＝7.5Hz，2H)，6.94(t，J＝7.6Hz，2H)，4.81(dd，J＝13.6，6.8Hz，2H)，3.78-3.58(m，8H)，3.47-3.34(m，4H)，1.93(s，6H)，1.43(d，J＝6.7Hz，12H).ESI-MS：m/z 920.2[M+H]^-

2.1.2(-)-棉酚(-)-Gossypol

取100mg(1.088×10_-4mol)的(-)-棉酚-L-色氨酸甲酯希夫碱溶于10ml乙醚中，加入1ml冰醋酸，50℃，搅拌。加入30μL浓盐酸(37％)，搅拌2h。反应结束后，过滤除去不溶性白色粉末，乙醚层用水洗至PH≈7，乙醚液用无水硫酸钠干燥后，浓缩乙醚液，加入石油醚(30-60℃)，析出黄色固体，抽滤，石油醚洗涤，真空(-0.1MPa)干燥后约35mg的(-)-棉酚，收率62.1％。[α]²⁰ _D：-436°(c0.05，CHCl₃)，mp：145-147℃，¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ14.97(s，2H)，11.12(s，2H)，7.79(s，2H)，6.37(s，2H)，6.17(s，2H)，3.91(s，2H)，2.17(s，6H)，1.57(d，J＝6.9Hz，12H)。ESI-MS：m/z 517.55[M-H]^-

2.2阻断人免疫缺陷病毒的左旋棉酚氨基酸衍生物的制备

2.2.1(-)-棉酚-L-色氨酸钠希夫碱((-)-Gossypol bis-(L-tryptophan sodium salt)Schiff’s base，化合物6)

(1)取100mg(1.9305×10^-4mol)的(-)-棉酚溶于10ml乙醇中，45℃，搅拌，得(-)-棉酚乙醇溶液；(2)取78.85mg(3.861×10^-4mol)L-色氨酸和15.44mg(3.861×10^-4mol)粒状氢氧化钠，在10ml乙醇中搅拌30min得L-色氨酸钠的乙醇溶液；(3)将L-色氨酸钠的乙醇溶液加入到(-)-棉酚乙醇溶液中，搅拌4h后，浓缩乙醇液，加入乙醚，析出棕黄色固体，抽滤，乙醚洗涤，真空(-0.1MPa)干燥后得126.9mg的(-)-棉酚-L-色氨酸钠希夫碱(化合物6)，收率70.3％。[α]²⁰ _D：-880.8°(c 0.125，CH₃OH)，mp：246-248℃，υ_max(KBr)/cm^-1：3479，3415(OH，NH)，1616(C₇＝O)，1600-1400(C＝C).¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.28(s，2H)，10.91(s，2H)，9.70-9.47(m，2H)，8.48(s，2H)，7.50(d，J＝7.1Hz，2H)，7.36(s，2H)，7.19(d，J＝7.2Hz，2H)，7.09(d，J＝1.7Hz，2H)，6.86(dd，J＝8.8，7.1Hz，4H)，4.07(s，2H)，3.72-3.63(m，2H)，3.45-3.30(m，4H)，3.15(d，J＝8.6Hz，1H)，2.09(s，3H)，1.88(s，6H)，1.42(dd，J＝6.8，3.9Hz，12H).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.1946，170.6328，160.5964，146.4607，136.1051，130.5258，127.3169，126.5437，125.4085，123.7013，120.5359，118.2901，118.0852，115.9856，110.1169，102.9202，64.7729，26.4111，20.3618，20.1252，18.5158..ESI-MS，m/z889.2[M-2Na+H]^-.

2.2.2(-)-棉酚-L-丙氨酸钠希夫碱((-)-Gossypol bis-(L-alanine sodium salt)Schiff’sbase，化合物7)

本化合物7制备方法与化合物6的制备方法相同。收率86.5％，棕黄色固体，[α]²⁰ _D：-90°(c 0.02，CH₃OH)，mp：243-246℃，υ_max(KBr)/cm^-1：3500-3300(OH，NH)，1621(C₇＝O)，1600-1400(C＝C).¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.35(m，2H)，9.79(d，J＝10.1Hz，2H)，8.53(m，2H)，7.39(s，2H)，3.84(d，J＝6.4Hz，2H)，3.68(d，J＝7.0Hz，2H)，1.93(m，6H)，1.42(m，12H)，1.09(m，6H).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ173.0510，170.7650，159.6236，149.8542，146.4333，130.6368，126.4209，125.6601，121.0031，116.6009，116.1537，103.1950，58.7080，26.4482，20.3469，20.2337，20.0696.ESI-MS：m/z 659.1[M-2Na+H]^-。

2.2.3(-)-棉酚-2-甲基丙氨酸钠希夫碱((-)-Gossypol bis-(2-Aminoisobutyric acidsodium salt)Schiff’s base，化合物8)

本化合物8制备方法与化合物6的制备方法相同。收率73.2％，棕黄色固体，([α]²⁰ _D：-60°(c 0.025，CH₃OH))，mp：281-283℃，υ_max(KBr)/cm^-1：3300-3400(OH，NH)，1620(C＝O)，1600-1400(C＝C).¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.90(t，J＝14.3Hz，2H)，9.66(s，2H)，8.49(s，2H)，7.35(s，2H)，7.16(s，2H)，3.69(s，2H)，2.00-1.89(m，6H)，1.42(d，J＝7.0Hz，12H)，1.26(s，6H)，1.09(t，J＝6.9Hz，6H)。ESI-MS：m/z 686.7[M-2Na+H]^-。

2.2.4(-)-棉酚-L-缬氨酸钠希夫碱((-)-Gossypol bis-(L-2-Amino-3-methylbutyicacid sodium salt)Schiff’s base，化合物9)

本化合物9制备方法与化合物6的制备方法相同。收率75.9％，棕黄色固体，[α]²⁰ _D：-270°(c 0.02，CH₃OH)，mp：285℃(分解)，υ_max(KBr)/cm^-1：3300-3400(OH，NH)，1612(C＝O)，1600-1400(C＝C).¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ13.22(m，2H)，9.76(m，2H)，8.53(s，2H)，7.36(s，2H)，3.69(s，2H)，2.23(s，2H)，1.93(s，6H)，1.43(d，J＝5.9Hz，12H)，1.10(m，2H)，0.89(d，J＝6.4Hz，6H)，0.85(d，J＝6.4Hz，6H).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.6126，171.5987，161.5303，150.2198，146.9255，138.7984，127.0388，126.3646，120.4490，116.9809，116.5476，103.6300，56.4916，26.8221，20.8154，20.0121，18.9350，17.6298.ESI-MS，：m/z715.2[M-2Na+H]^-。

2.2.5(-)-棉酚-L-异亮氨酸钠希夫碱((-)-Gossypol bis-(L-isoleucine sodium salt)Schiff’s base，化合物10)

本化合物10制备方法与化合物6的制备方法相同。收率66.4％，棕黄色固体，[α]²⁰ _D：-100°(c 0.02，CH₃OH)，mp：225-232℃(分解)，¹H NMR(400MHz，DMSO)δ13.27(dd，J＝12.0，7.7Hz，2H)，9.68(d，J＝13.2Hz，2H)，8.53(s，2H)，7.41(s，2H)，3.67(s，2H)，3.59(s，2H)，1.91(s，6H)，1.55(s，2H)，1.43(t，J＝6.7Hz，12H)，1.08(td，J＝6.9，3.4Hz，4H)，0.87(d，J＝6.9Hz，6H)，0.83(d，J＝7.3Hz，6H).¹³C-NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ172.6594，171.6203，161.4640，150.1408，146.9563，138.7993，127.0328，126.4196，121.4477，116.7225，116.6785，103.7168，56.4399，26.8802，24.5233，20.8006，20.7390，19.0064，16.3899，12.0402.ESI-MS：m/z 743.2[M-2Na+H]^-。

实施例3：

棉酚氨基酸衍生物对小鼠急性毒性实验和抗雄性生育活性测定：

本实施例以(-)-棉酚-L丙氨酸钠希夫碱为例，但不局限于此。选雌性健康小鼠，体重20-25克。将实施例2中制备的(-)-棉酚-L丙氨酸钠希夫碱用生理盐水制成混旋剂，灌胃给药。实验前12小时，只给实验小鼠喂水不喂食。实验设一个空白对照组，其余三组分别按照500mg/kg，1000mg/kg，2000mg/kg体重给药。给药后连续对小鼠的体重，毛色，行为，精神，代谢进行监测20天。在给药后的观测中，三个剂量组均没有出现死亡，而且小鼠毛色，行为和精神方面的正常，小鼠体重也保持稳定(见图1)。

将实施例2中制备的(-)-棉酚-L丙氨酸钠希夫碱用生理盐水制成混悬剂，给雄性小鼠每天给药一次，剂量为50mg/kg，实验设一个空白对照组，一个消旋棉酚阳性对照组，每个实验组设10只小鼠。持续给药9周后，将每只雄性小鼠与两只雌性小鼠合笼，将检测到有阴道栓的雌鼠培养一周后处死，解剖并统计怀胎数及畸胎数。

以上实验表明棉酚氨基酸衍生物单次高剂量给药没有毒性，而且长期给药也没有抗雄性生育作用。

实施例4：

棉酚氨基酸衍生物HIV-1假病毒的抑制实验：

采用人工包装得到单复制能力的HIV假病毒感染GHOST-CXCR4细胞的实验，以细胞内荧光素酶活性为指标的定量检测HIV的侵入活性。GHOST-CXCR4细胞膜可以稳定表达HIV-1的受体CD4和辅助受体CXCR4，是HIV-1的易感细胞株。HIV-1假病毒基因组上的膜蛋白基因已替换成了荧光素酶基因，被HIV假病毒感染的细胞可以表达荧光素酶。通过检测细胞中荧光素酶的活性，可以判断感染进入细胞的病毒量。该方法用于检测化合物抑制细胞中荧光素酶的活性，表明该化合物能抑制HIV病毒侵入靶细胞的数量。该实验是棉酚氨基酸衍生物为膜融合抑制剂的主要证据之一。

实验时，将HIV-1假病毒与药物混合加入到GHOST-CXCR4(美国健康研究院赠送)细胞中(60％〔面积比〕铺满)，待病毒吸附细胞2小时后，吸去病毒和药物的混合物，加入新鲜培养基(DMEM，90％〔体积比〕，胎牛血清，10％〔体积比〕，G418，500ug/ml；潮霉素，100ug/ml其中的百分含量为体积百分含量)继续培养，每个稀释度做8个重复孔。37°孵育48小时后，检测细胞中荧光素酶的活性。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表实验组中荧光素酶的活性，“P”代表阳性组中荧光素酶的活性，“N”代表阴性组中荧光素酶的活性。化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)作为化合物抗病毒活性的指标。

棉酚氨基酸衍生物的HIV假病毒抑制实验表明，棉酚的各类氨基酸衍生物都表现出抑制HIV病毒活性，所有左旋棉酚氨基酸衍生物的活性都比消旋棉酚活性强，且丙氨酸，色氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，2-甲基丙氨酸化消旋棉酚衍生物的半数抑制浓度(IC₅₀)均小于0.4μM。附图2为部分棉酚氨基酸衍生物抑制HIV-1假病毒活性。

实施例5：

棉酚氨基酸衍生物对HIV-1真病毒的抑制实验：

HIV-IIIB(美国健康研究院赠送)是经典的HIV药物筛选实验毒株，TZM-bl(美国健康研究院赠送)细胞是经改造过的Hela(美国典型物保藏中心购买)细胞株，细胞膜稳定表达HIV受体和辅助受体，细胞核稳定整合了艾滋病毒长末端重复序列启动的荧光素酶基因。HIV-IIIB感染TZM-b1细胞后，病毒表达的TAT蛋白可以激活细胞中荧光素酶基因的表达，通过检测细胞中荧光素酶的活性，可判断感染进入细胞的病毒量。通过检测药物处理后细胞中荧光素酶，可精确定量药物抑制HIV-1病毒侵入靶细胞的活性。

实验时，将HIV-IIIB病毒与药物混合加入到TZM-bl细胞中(60％(面积比)铺满)，待病毒吸附细胞2小时后，吸去病毒和药物的混合物，加入新鲜培养基(DMEM，90％(体积比)，胎牛血清，10％(体积比)，G418，500ug/ml；潮霉素，100ug/ml；嘌呤霉素，1ug/ml.其中的百分含量为体积百分含量)继续培养，每个稀释度做8个重复孔。37°孵育24小时后，检测细胞中荧光素酶的活性。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表实验组中荧光素酶的活性，“P”代表阳性组中荧光素酶的活性，“N”代表阴性组中荧光素酶的活性。化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)作为其抗病毒活性的指标。

化合物抑制HIV-IIIB侵入实验表明，各消旋棉酚的氨基酸衍生物均具有抑制HIV-1病毒侵入细胞的作用，其半数抑制浓度(IC₅₀)均达1μM，而左旋棉酚衍生物活性高于消旋棉酚衍生物的活性，部分左旋棉酚氨基酸衍生物的半数抑制浓度(IC₅₀)达0.1μM。附图3为部分左旋棉酚氨基酸衍生物抑制HIV-IIIB活性。

实施例6：

棉酚氨基酸衍生物细胞毒性的测定

黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状甲臜结晶并沉积在细胞中，结晶物可被20％(质量比体积)SDS溶解，用酶联免疫检测仪在595nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

实验时，将TZM-bl(美国健康研究院赠送)细胞传至96孔板中，24小时后将化合物按一定的稀释度加入细胞在37度培养72小时后，吸走上清100ul，加入20ulMTT，37度继续培养4小时后，加入100ul 20％SDS培养18小时后，用酶标仪测定595nM波长下的OD值。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表给药组的OD值，“P”代表未给药组的OD值，“N”代表空白组OD值。化合物的半数抑制浓度(CC₅₀)作为该化合物细胞毒性的指标。

化合物的MTT细胞毒性实验表明，氨基酸衍生物的细胞毒性远远小于单独棉酚，左旋棉酚氨基酸衍生物毒性远远小于消旋棉酚，左旋棉酚氨基酸衍生物的细胞毒性略小于右旋棉酚氨基酸衍生物。部分左旋棉酚氨基酸衍生物的半数细胞毒性浓度达50μM。

表1：棉酚和(-)棉酚及其衍生物的细胞毒性CC₅₀的测定(单位：μM)

Claims (4)

1.一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物，其特征在于：消旋棉酚氨基酸衍生物结构通式如下：

其中：RNH₂为L-丙氨酸钠盐、L-缬氨酸钠盐、L-亮氨酸钠盐、L-异亮氨酸钠盐、L-色氨酸钠盐或2-甲基丙氨酸钠，N为氮原子，HO或OH为羟基，O为氧原子，H为氢原子。

2.一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物，其特征在于：左旋棉酚氨基酸衍生物结构通式如下：

其中：RNH₂为L-丙氨酸钠盐、L-缬氨酸钠盐、L-亮氨酸钠盐、L-异亮氨酸钠盐、L-色氨酸钠盐或2-甲基丙氨酸钠，N为氮原子，HO或OH为羟基，O为氧原子，H为氢原子，Me为CH₃。

3.权利要求1或2所述的一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物包括消旋棉酚氨基酸衍生物(I)和左旋棉酚氨基酸衍生物(II)的制备方法，其步骤是：

(1)、1份消旋棉酚或左旋棉酚溶于1-5份有机溶剂中，20-60℃，搅拌；

(2)、将2份氨基酸与2份碱混合于1-5份有机溶剂中，室温搅拌10-60分钟；

(3)、将步骤(2)的反应液加入到步骤(1)的反应液中，控制pH＝7.0-8.0，温度控制在60-100℃，搅拌回流1-3小时，反应产物选择结晶、重结晶、色谱法和制备型色谱法分离纯化，制得消旋棉酚氨基酸衍生物(I)或左旋棉酚氨基酸衍生物(II)；

所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、N，N’-二甲基甲酰胺和乙腈中的一种；

所述的碱为氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾。

4.权利要求1或2所述的一种阻断人免疫缺陷病毒的棉酚氨基酸衍生物在制备治疗或预防艾滋病药物中的应用。

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