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CN101842479A - 用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣 - Google Patents

用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣 Download PDF

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CN101842479A
CN101842479A CN200880114429A CN200880114429A CN101842479A CN 101842479 A CN101842479 A CN 101842479A CN 200880114429 A CN200880114429 A CN 200880114429A CN 200880114429 A CN200880114429 A CN 200880114429A CN 101842479 A CN101842479 A CN 101842479A
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protein
laccase
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trichoderma
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Danisco USA Inc
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Abstract

本发明提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。方法包括步骤：(a)将第一核酸序列引入宿主细胞，所述第一核酸序列包括与所需的蛋白质序列有效连接的信号序列；(b)表达第一核酸序列；(c)共表达编码分子伴侣或折叠酶的第二核酸序列，所述分子伴侣或折叠酶选自bip1、ero1、pdi1、tig1、prp1、ppi1、ppi2、prp3、prp4、钙联接蛋白和lhs1；和(d)收集从宿主细胞分泌的所需蛋白质。第一核酸序列任选的包括在信号序列和所需的蛋白质序列之间的酶序列。

Description

用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣
发明领域
本发明提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。在一些实施方案中，本文提供的方法涉及与蛋白质有效连接的信号序列的用途。在一些实施方案中，与蛋白质有效连接的信号序列在宿主细胞中与至少一种分子伴侣组合表达。在一些实施方案中，蛋白质在丝状真菌细胞中表达。在其他实施方案中，本发明的方法涉及蛋白质与酶的催化结构域的融合，所述酶例如葡糖淀粉酶或CBH1。一些实施方案提供了信号序列、一个或多个分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶的组合，和/或蛋白质与催化蛋白质或结构域的融合。
发明背景
宿主细胞例如酵母、丝状真菌和细菌已长期用于表达盒分泌外源蛋白质。通常，这些外源或蛋白质在酵母、丝状真菌和细菌中的生产，涉及表达蛋白质以及从宿主细胞或生长细胞的培养基中部分或完全纯化蛋白质。尽管一些蛋白质需要从宿主细胞的胞内环境中纯化，如果蛋白质从细胞分泌到培养基中，则可以极大的简化纯化。
胞外蛋白质分泌是复杂的，也是多种细胞表达系统中蛋白质生产的重要方面。与蛋白质分泌相关的一个因素是正确的蛋白质折叠。在体外稀释浓度下，许多蛋白质可以可逆的解折叠和再折叠，因为指定紧密折叠结构所需要的全部信息都存在于蛋白质的氨基酸序列中。然而，体内的蛋白质折叠发生在浓缩的大量蛋白质的环境下，其中分子内的折叠过程与分子间的聚集反应相互竞争。这些复杂因素在真核表达系统中比在原核系统中更显著。
真核分泌通路的第一步是新生多肽以伸展的形式跨内质网(ER)膜的易位。多肽的正确折叠和装配通过分泌通路发生在ER中。然而，在多种情况下，虽然蛋白质大量过表达，但却分泌不佳。实际上，在多种情况下，应该有利于此类表达的分泌信号没有表现出实现所述功能。与其他蛋白质的相互作用使所需蛋白质的表达更加复杂化。当在一个物种、属或科中尝试表达从另一物种、属或科的生物中获得的蛋白质时，上述因素甚至更加重要。例如，担子菌(Basidiomycete)蛋白质(例如，漆酶)通常在子囊菌(Ascomycete)宿主(例如，木霉属(Trichoderma))中表达低下。实际上，尽管在真菌表达系统领域开展了大量工作，但仍然需要改良所需蛋白质的胞外表达。
发明概述
发明提供了改良蛋白质生产的方法和组合物。方法涉及使用与所需蛋白质有效连接的信号序列，所述蛋白质在宿主细胞中与至少一种分子伴侣组合表达。在一些实施方案中，在丝状真菌细胞中表达蛋白质。在其他实施方案中，本发明的方法涉及所需蛋白质与宿主蛋白质，例如葡糖淀粉酶或CBH1催化结构域的融合。
在一些实施方案中，本发明提供了增加丝状真菌宿主(例如，子囊菌)中的蛋白质生产的方法和组合物，通过组合分泌信号的应用和分子伴侣蛋白的表达，所述分子伴侣蛋白是从与蛋白质相同的生物体中获得的。在一些实施方案中，蛋白质是非子囊菌蛋白质，其与来自子囊菌宿主蛋白质的分泌信号融合。在其他一些实施方案中，至少一种分子伴侣蛋白可用于增加与子囊菌蛋白质的催化结构域融合的蛋白质的表达。
一些实施方案提供了用于在子囊菌宿主细胞中生产至少一种蛋白质的方法，通过向宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与来自和宿主相同的门、属和/或物种的信号序列有效连接的所需蛋白质；共表达来自与蛋白质相同的门、属和/或物种的分子伴侣；在适合蛋白质表达和生产的培养条件下培养宿主细胞；并生产蛋白质。方法任选的包括回收所产生的蛋白质。一些实施方案包括将蛋白质与来自子囊菌的酶的催化结构域融合。其它实施方案包括将蛋白质与来自子囊菌的全长的酶融合。在一些实施方案中，子囊菌宿主细胞是木霉属。在一些实施方案中，分子伴侣是下列中的至少一种：BIP1、ERO1、PDI1、TIG1、PRP1、PPI1、PPI2、PRP3、PRP4、钙联接蛋白和LHS1。
蛋白质的选择不限于，并可以包括来自任何属、物种和/或科的任何下列蛋白质：漆酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、颗粒淀粉水解酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、半纤维素酶、蛋白酶、氧化酶、漆酶及其组合。一些实施方案包括来自NSP24或CBH1基因的信号序列。在一些实施方案中，分子伴侣基因是bip1。方法的实施方案还可以包括子囊菌启动子。在一些实施方案中，宿主细胞和信号序列来自相同的子囊菌宿主。在一些实施方案中，启动子是来自木霉属的CBH1启动子。在一些实施方案中，蛋白质是担子菌蛋白质。在一些实施方案中，宿主细胞是子囊菌宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是担子菌宿主细胞且蛋白质是子囊菌蛋白质。
其它一些实施方案提供了用于在子囊菌宿主细胞中生产至少一种蛋白质的方法，通过向子囊菌宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与来自子囊菌的酶的催化结构域融合的所需蛋白质，其中所需蛋白质是担子菌蛋白质；共表达子囊菌的分子伴侣；在适合蛋白质表达和生产的培养条件下培养子囊菌宿主细胞；并生产蛋白质。在一些实施方案中，回收所产生的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质与子囊菌信号序列有效的连接。
附图简介
图1显示了木霉属表达质粒pTrex4-漆酶D opt的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1。
图2显示了木霉属表达质粒pTrex2g-Bip1的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：2。
图3显示了木霉属表达质粒pTrex2g-Pdi1的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：3。
图4显示了在木霉属表达质粒pTrex2g-Ero1中使用的Ero1序列的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：4。
图5显示了木霉属表达质粒pTrGA-漆酶D opt的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：5。
图6显示了木霉属表达质粒pKB408的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：6。
图7显示了木霉属表达质粒pKB410的示意图。多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：7。
图8-1至8-4显示了里氏木霉NSP24可读框(ORF)SEQ ID NO：8。信号肽是前20个氨基酸(SEQ ID NO：9)。
图9-1至9-2显示了里氏木霉CBH1 ORF(SEQ ID NO：10)。信号肽开始于碱基对210，结束于碱基对260(SEQ ID NO：11)。催化核心开始于碱基对261至碱基对1698(SEQ ID NO：12)，包括内含子1(从碱基对671至737)和内含子2(从碱基对1435至1497)。接头序列始于碱基对1699，止于碱基对1770(SEQ ID NO：13)。CBH1蛋白质序列显示为SEQID NO：14。
图10示例了漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌(c.unicolor)漆酶的编码基因和全长木霉属葡糖淀粉酶。菌株#8-2是CBH1漆酶融合体。菌株1066-9、1066-13和1066-15是TrGA漆酶融合体。
图11示例了在摇瓶中漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌(C.unicolor)漆酶的编码基因和CBH1或NSP24信号序列。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴显示了菌株(仅CBH融合体，或具有信号序列)。
图12示例了在发酵罐中漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌漆酶的编码基因和CBH1或NSP24信号序列。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴以小时显示了发酵时间。
图13示例了由CBH1信号序列加BIP1分子伴侣表达，所提供的漆酶产量的改善。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴以小时显示了发酵时间。
图14示例了通过在摇瓶中共表达分子伴侣和单色下皮黑孔菌，在3、4和5天对漆酶产量的改善。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴显示了菌株(KB410-13，或与bip共表达)。
图15示例了漆酶产量的改善，通过融合单色下皮黑孔菌漆酶的编码基因和CBH1信号序列、催化结构域和接头，以及与Bip1、pdi1或ero1分子伴侣共表达。Y轴以单位/ml显示了漆酶活性。X轴显示了菌株。
发明详述
除非另外指出，本发明的实践涉及在分子生物学、蛋白质工程、重组DNA技术、微生物学、细胞生物学、细胞培养、转基因生物学、免疫学和蛋白质纯化中普遍使用的常规技术，属于本领域技术人员掌握的范围。此类技术是本领域技术人员已知的，在多种文本和参考文献中都有描述。本文上下文中提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，都通过引用清楚地整合到本文中。
定义
术语“子囊菌”指一类属于子囊菌门(Ascomycota)的真菌。该门的成员的特征是存在子囊(即，含有子囊孢子的特化的囊样细胞)。
术语“担子菌”指一类属于担子菌门的真菌。该门的成员的特征是产生担孢子(即，位于特化的棒状末端细胞外部区域的有性孢子，所述特化细胞称为担子)。
“蛋白酶”意指具有在蛋白质骨架的一个或多个不同位置，催化肽键切割的能力的蛋白质或多肽的蛋白质或多肽结构域(例如，E.C.3.4)。可以从微生物(例如，真菌或细菌)、植物和/或动物中获得蛋白酶。
“酸性蛋白酶”指具有在酸性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。
如本文中使用的，术语“分子伴侣”或“分子伴侣蛋白”通过保护未折叠区域免受周围蛋白质(干扰)，而有利于蛋白质折叠，但不增加蛋白质折叠的速率。这可以包括帮助分泌蛋白在内质网(ER)中折叠和糖基化的蛋白质及其同源物。分子伴侣可以定位在ER中。示例性分子伴侣包括Bip(GRP78)、GRP94和酵母Lhs1p，以及通过与未折叠状态下暴露的疏水区域结合，防止不理想的相互作用，而帮助分泌蛋白折叠的蛋白质。分子伴侣还包括涉及蛋白质跨ER膜易位的蛋白质。
如本文中使用的，“陪伴蛋白”是利用ATP，帮助蛋白质折叠为天然状态(活性状态)的蛋白质。通常，蛋白质亚基装配在一起形成大环装配体(assemby)。例如，陪伴蛋白发挥作用是通过在中央腔中与非天然蛋白质结合，然后基于结合ATP，释放底物蛋白质到目前包封的腔，而有效折叠。
“折叠酶蛋白质”意指催化蛋白质折叠中的步骤，而增加蛋白质折叠速率的蛋白质。例如，它们可以帮助形成二硫键，以及帮助与脯氨酸残基相邻的肽链形成正确的构象。示例性的折叠酶包括蛋白质二硫键异构酶(pdi)及其同源物，和脯氨酰-肽基顺反异构酶及其同源物。
如本文中使用的，“NSP24家族蛋白酶”意指在其天然的或野生型类型具有蛋白酶活性的酶，并属于NSP24蛋白酶的家族。NSP24蛋白酶是酸性蛋白酶，例如酸性真菌蛋白酶。NSP24蛋白酶具有与SEQ ID NO：8的氨基酸序列及其生物学活性片段，至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。
如本文中使用的，术语“所需的蛋白质”意指目标蛋白质。在本申请中，所需的蛋白质和目标蛋白质是可互换的使用的。在一些实施方案中，所需的蛋白质是可商购的重要工业蛋白。术语意在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成的基因编码的蛋白质。所需的蛋白质可以是宿主细胞天然的蛋白质，或者对宿主细胞非天然的(异源的)蛋白质。
如本文中使用的，“衍生物”意指源自前体或亲本蛋白质(例如，天然蛋白质)的蛋白质，通过在C-和/或N-末端添加一个或多个氨基酸，在氨基酸序列的一个或多个不同位点取代一个或多个氨基酸，在蛋白质的一端或两端或者在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，或者在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸。
术语“重组”指不天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。重组分子可以包括以不天然存在的方式相互连接的两条或多条天然存在的序列。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换的使用的。
如本文中使用的，“百分比(％)序列同一性”在涉及氨基酸或核苷酸序列时，定义为在比对序列并且如果需要，为了获得最大百分比序列同一性而引入空位后，候选序列中与目标序列(例如，NSP24信号肽序列)中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分。
如本文中使用的，术语“α淀粉酶(例如，E.C.3.2.1.1类)”指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这类酶也被描述为影响含有1，4-α连接的D-葡萄糖单位的多糖中的1，4-α-D-糖苷键外切或内切水解的酶。用于描述这类酶的另一个术语是“糖原酶”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。
如本文中使用的，术语“葡糖淀粉酶”指淀粉葡糖苷酶类的酶(例如，EC.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用的酶，从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。酶还水解α-1，6-和α-1，3-键，尽管以远低于水解α-1，4-键的速率。
术语“启动子”意指涉及结合RNA聚合酶，起始基因转录的调控序列。
如本文中使用的，“异源启动子”指这样的启动子，其与基因或纯化的核酸处于相关联，但与所述基因或纯化的核酸不是天然相关的。
如本文中使用的，多肽的“纯化制品”和“基本纯的制品”意指已经与其天然存在的细胞、其它蛋白质、脂类或核酸分离的多肽。
如本文中使用的，“同源”指两个或多个多肽分子之间，或两个或多个核酸分子之间的序列相似性。当比较的序列位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据(例如，如果两条DNA分子中每一条的位置都被腺嘌呤占据)，则分子在该位置是同源的。两条序列之间的百分比同源性是两条序列共享的匹配或同源位置数除以位置数再乘以100的函数。例如，如果两条序列中的10个位置有6个是匹配或同源的，则两条序列是60％同源。作为示例，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％同源性。通常，当两条序列被比对以给出最大同源性时进行比较。在本文中，术语“％同源性”与术语“％同一性”可互换的使用的，指当使用序列比对程序进行比对时，在核酸序列或氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
如本文中使用的，术语“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
如本文中使用的，“表达载体”意指包括与合适的控制序列有效连接的DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够影响DNA在合适宿主中的表达。
术语“表达”意指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。
术语“共表达”意指在一个细胞内表达至少2个不同的基因。其可以是外源基因或内源基因。其可以整合到相同或不同质粒或从相同或不同的质粒中表达，并且可以从相同或不同的启动子表达。
如本文中使用的，“有效的连接的”意指调控区(例如，启动子、终止子、分泌信号或增强子区)与结构基因是关联的或连接的，并控制所述基因的表达。如果信号序列通过宿主细胞的分泌系统指导蛋白质，则它与蛋白质是有效连接的。
如本文中使用的，“微生物”指细菌、真菌、病毒、原生动物和其他微生物或微观生物体。
术语“丝状真菌”指本领域已知的真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形态。这类真菌的特征是营养菌丝体，其具有细胞壁，所述细胞壁含有壳多糖、纤维素和其他复杂多糖。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母不同。丝状真菌通过菌丝延长进行营养生长，碳代谢是专性好氧的。
如本文中使用的，术语“木霉属(Trichoderma)”和“木霉属物种(Trichoderma sp.)”指以前或现在分类为木霉属的任何真菌属。
如本文中使用的，术语“培养”指在合适条件下，在液体、半固体或固体培养基中生长微生物细胞群体。在一些实施方案中，如本领域已知的，在容器或反应器中进行培养。在一些实施方案中，培养导致淀粉底物(例如，包含颗粒淀粉的底物)发酵生物转化为终产物。
“发酵”指微生物对有机物质的酶促和厌氧降解，产生更简单的有机化合物。发酵通常在厌氧条件下发生，但该术语并非意在唯一限制为严格的厌氧条件，因为在氧气存在的条件下也可以发生发酵。
在将核酸序列插入到细胞内的语境中，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，包括指核酸序列向真核或原核细胞内的掺入，其中，核酸序列或者掺入到细胞基因组内(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变成自主复制子，或者瞬时的表达(例如，转染的mRNA)。
如本文中使用的，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因”用于指细胞时，意指细胞具有非天然的核酸序列，所述序列被整合到其基因组中，或者作为附加型质粒在多代中维持。
如本文中使用的，术语“异源的”用于指编码所需蛋白质的多肽或多核苷酸时，意指多肽或多核苷酸不是天然存在于宿主细胞内的。
术语“同源的”或“内源的”在涉及编码所需蛋白质的多肽或多核苷酸时，指多肽或多核苷酸是天然存在于宿主细胞内的，或由宿主细胞天然表达的。
术语“过表达”意指在宿主细胞中以大于野生型宿主细胞所产生的水平表达多肽的过程。在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸引入宿主细胞。在其他一些实施方案中，术语指同源多肽以这样的浓度表达，所述浓度大于野生型细胞表达的相同的同源多肽的表达。
如本文中使用的，发明的一个方面的特征是“基本纯的”核酸，所述核酸包括编码与蛋白质有效连接的NSP24信号肽或CBH1信号肽的核苷酸序列，和/或此类核酸的等价体。在这些实施方案中，核酸分离自其它核酸和/或细胞成分。
术语“等价体”指编码功能性等价的多肽的核苷酸序列。等价的核苷酸序列涵盖了由于一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失而不同的序列，例如等位变体。例如，在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，等价的核苷酸序列包括这样的序列，所述序列不同于核苷酸序列SEQ ID NO：8，但导致产生与SEQ ID NO：8编码的多肽序列功能性等价的多肽。
本发明提供了生产所需蛋白质的方法。方法包括步骤：(a)将第一核酸序列引入宿主细胞，所述第一核酸序列包括与所需的蛋白质序列有效连接的信号序列；(b)表达第一核酸序列；(c)共表达编码分子伴侣或折叠酶的第二核酸序列，所述分子伴侣或折叠酶选自bip1、ero1、pdi1、tig1、prp1、ppi1、ppi2、prp3、prp4、钙联接蛋白和lhs1；和(d)收集从宿主细胞分泌的所需蛋白质。
在一个实施方案中，第一核酸序列还包括在信号序列和所需的蛋白质序列之间的酶序列。例如，酶序列获得自葡糖淀粉酶或CBH1酶。在一个实施方案中，酶序列是全长的酶序列，所述酶序列包括催化结构域、接头和结合结构域。在另一个实施方案中，酶序列包括催化结构域序列，其通过接头与所需的蛋白质序列相连。在一些实施方案中，酶是在其天然宿主中高表达和/或分泌的宿主蛋白质。
第一核酸序列还包括在信号序列上游的启动子。在一个实施方案中，启动子是宿主细胞天然的，且与所需的蛋白质序列不是天然相关的。
第二核酸序列与启动子有效的连接。在一个实施方案中，启动子是宿主细胞天然的，且与第二核酸序列不是天然相关的。
增加的蛋白质表达
本发明提供了用于在宿主细胞中生产所需蛋白质的方法。通过包括分泌信号(例如，NSP24信号肽或CBH1信号肽)，并结合分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶蛋白的共表达，增加蛋白质产量。在一些实施方案中，分泌信号来自子囊菌宿主蛋白质。在一些实施方案中，所需的蛋白质与酶的催化结构域融合。
本发明提供了显著的优点，特别是考虑到这样的事实，即，在子囊菌宿主中难以生产大量来自其它真菌家族的蛋白质。实际上，本领域技术人员已知，在真菌或细菌宿主中通常难以生产任何异源的真菌蛋白质。本发明提供了适合在合适的真菌或细菌宿主中，生产任何合适蛋白质的方法和组合物。在一些实施方案中，真菌宿主是子囊菌，蛋白质是担子菌蛋白质，而在其它实施方案中，真菌宿主是担子菌，而蛋白质是子囊菌蛋白质。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在宿主中增加蛋白质表达和/或分泌的方法，利用宿主信号肽与来自和蛋白质来源的相同生物体的一种或多种伴侣分子或折叠酶的共表达组合。因此，在一些实施方案中，利用担子菌宿主信号肽和子囊菌分子伴侣，在担子菌宿主中表达异源的子囊菌蛋白质。在一些备选的实施方案中，利用子囊菌信号肽和子囊菌或担子菌分子伴侣，在子囊菌宿主中表达异源的担子菌蛋白质。在一些实施方案中，子囊菌宿主是木霉属的成员。在一些实施方案中，木霉是里氏木霉，包括里氏木霉的多个菌株。在一些备选的实施方案中，担子菌是下皮黑孔属(Cerrena)的成员，包括但不限于单色下皮黑孔菌。
在本发明的一些实施方案中，通过将蛋白质与宿主酶融合，并与来自与所需蛋白质相同生物体的一种或多种分子伴侣外源共表达组合，来增加所需蛋白质的表达和/或分泌。通过同一质粒，或通过不同的质粒来实现共表达。
在其他实施方案中，通过将蛋白质与宿主酶的催化结构域连接，并组合将蛋白质与宿主信号序列有效的连接，以及一种或多种分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶的外源共表达，来增加所需蛋白质的表达和/或分泌，所述分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶优选的来自与蛋白质相同的生物体。
可以认为，本文提供的多个实施方案中论及的元件可以以任何合适的组合使用。因此，并非意在将实施方案限于本文提供的特定描述，因为各实施方案的方面可以彼此组合使用。
信号肽
本发明中使用的特定信号肽不是关键的，只要信号肽在宿主中是有效的。当与蛋白质有效连接的信号肽增加了宿主细胞内的蛋白质分泌时，就提供了“有效的信号肽”。在一些实施方案中，信号肽是从强分泌的蛋白质中获得的，和/或是强信号肽。“强信号肽”导致天然蛋白质被其天然宿主强分泌。在一些实施方案中，信号肽获得自与宿主细胞相同门的生物体。实际上，在一些实施方案中，这是有利的。在一些实施方案中，信号肽和宿主细胞来自相同的属，而在其它一些实施方案中，信号肽和宿主细胞来自(相同的)物种。例如，在一些实施方案中，宿主细胞是子囊菌宿主细胞，信号肽获得自子囊菌。在一些实施方案中，宿主细胞是木霉属，信号肽来自木霉属。在一些实施方案中，宿主细胞是里氏木霉，信号肽来自里氏木霉。在一些实施方案中，信号肽是强信号肽。在一些可选的实施方案中，宿主细胞是担子菌宿主细胞，信号肽获得自担子菌。可用于本发明的信号肽的一些实例包括但不限于CBH1和NSP24信号肽。信号肽可以在例如子囊菌门的门的其它成员中发挥作用，但在一些实施方案中，当信号肽在获得它的属中使用时，具有最优的用途(即，提供强分泌)。
如本文中使用的，“强分泌蛋白”是形成从细胞中分泌显著量的总蛋白的任何蛋白质。从细胞中分泌的总蛋白也称为“胞外蛋白”。例如，强分泌的蛋白质包括至少约2％的胞外蛋白，至少约3％，至少约4％，至少约5％，至少约6％，至少约7％，至少约8％，至少约9％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％。在一些实施方案中，强分泌蛋白包括在培养上清液中至少约5％的胞外蛋白质。
CBHI信号肽、接头和催化结构域
里氏木霉产生一些纤维素酶，包括纤维二糖水解酶I(CBHI)，其折叠成由延伸的接头区分隔的两个分离的结构域(即，催化和结合结构域)。外源多肽已经作为具有CBHI的催化结构域和接头区的融合体在里氏木霉中分泌(参见例如，Nyyssonen等人，Bio/Technol.11：591-595[1993])。长枝木霉(T.longibrachiatem)也生产CBHI，可用于融合体以及分离信号肽和/或接头。接头可用于连接酶的催化结构域和所需多肽。任何合适的接头都可用于本发明，只要它在独立折叠的结构域之间形成延伸的、半刚性的间隔区。在一些蛋白质中发现了此类接头区域，特别是在水解酶中(例如，细菌和真菌纤维素酶和半纤维素酶；参见例如，Libby等人，ProteinEngineering，Design and Selection(1994)第7卷，1109-1114)。
如图9所示，对于CBHI(SEQ ID NO：10)，信号序列始于碱基对210，止于碱基对260(SEQ ID NO：11)。催化核心始于碱基对261至碱基对1698(SEQ ID NO：12)，包括内含子1(从碱基对671至737)和内含子2(从碱基对1435至1497)。接头序列始于碱基对1699，止于碱基对1770(SEQID NO：13)。纤维素结合结构域始于碱基对1771至碱基对1878。可以通过expasy组织网址发现关于CBHI的序列和结构域信息，命名为uniprot/P62694。已经在多个其他木霉属物种和其他丝状真菌中鉴别了CBHI同源物，合适时可用于本发明。
NSP24信号肽和多核苷酸
NSP24基因是从里氏木霉中分离并测序的(参见例如，美国专利号7,429,476，其通过引用全文整合到本文中)。该基因测序鉴别了编码407个氨基酸可读框(SEQ ID NO：8)的序列，如图8所示。鉴别SEQ ID NO：8的前20个氨基酸(MQTFGAFLVSFLAASGLAAA；SEQ ID NO：9)是信号肽。已经在多个其他木霉属物种和其他丝状真菌中鉴别了NSP24同源物，合适时可用于本发明。在一些实施方案中，NSP24信号序列用于子囊菌生物体。在一些实施方案中，序列用于木霉属物种，在一些甚至更特别的实施方案中，用于里氏木霉。
因此，本发明提供了可用于分泌蛋白质的NSP24家族蛋白酶信号肽。在一些实施方案中，NSP24信号肽命名为“NSP24天冬氨酸蛋白酶信号肽”。
发明的多核苷酸
本发明提供了多种多核苷酸，包括但不限于编码所需蛋白质、信号肽、催化结构域、接头、分子伴侣、陪伴蛋白和折叠酶的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包括至少两种上述分子。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸包括至少三种上述分子。
在一些实施方案中，多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质包括至少一个氨基酸取代，例如使用L-氨基酸的“保守氨基酸取代”，其中，一个氨基酸被另一种生物学相似的氨基酸取代了。保守氨基酸取代是保留了被取代的氨基酸的一般电荷、疏水性/亲水性，和/或空间体积(steric bulk)的取代。保守取代的实例是下列组之间的取代：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr，和Phe/Trp/Tyr。在一些实施方案中，“衍生蛋白质”可用于本发明。在一些这类实施方案中，衍生蛋白质与“亲本”蛋白质序列相比，低至约1至约10个氨基酸残基不同，例如约6至约10个，少至约5个，少至约4个，约3个，约2个，或甚至1个氨基酸残基不同。表1提供了本领域认知的示例性保守氨基酸取代。在其他实施方案中，取代涉及一个或多个非保守氨基酸取代、缺失或插入，其不消除信号肽活性。
表1：保守氨基酸替换
  氨基酸   一字母码   用任意下列替换
  丙氨酸   A   D-Ala、Gly、β-Ala、L-Cys、D-Cys
  精氨酸   R   D-Arg、Lys、D-Lys、同型-Arg、D-同型-Arg、Met、Ile、D-Met、D-Ile、Orn、D-Orn
  天冬酰胺   N   D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
  天冬氨酸   D   D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
  半胱氨酸   C   D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr
  谷氨酰胺   Q   D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
  谷氨酸   E   D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
  氨基酸   一字母码   用任意下列替换
  甘氨酸   G   Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、b-Ala、Acp
  氨基酸   一字母码   用任意下列替换
  异亮氨酸   I   D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
  亮氨酸   L   D-Leu、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
  赖氨酸   K   D-Lys、Arg、D-Arg、同型-Arg、D-同型-Arg、Met、D-Met、Ile、D-Ile、Orn、D-Orn
  甲硫氨酸   M   D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
  苯丙氨酸   F   D-Phe、Tyr、D-Th r、L-Dopa、His、D-His、Trp、D-Trp、反式-3，4或5-苯基脯氨酸，顺式-3、4或5-苯基脯氨酸
  脯氨酸   P   D-Pro、L-I-噻唑烷-4-羧酸、D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸
  丝氨酸   S   D-Ser、Thr、D-Thr、别-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、L-Cys、D-Cys
  苏氨酸   T   D-Thr、Ser、D-Ser、别-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、Val、D-Val
  酪氨酸   Y   D-Tyr、Phe、D-Phe、L-Dopa、His、D-His
  缬氨酸   V   D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met
在一些实施方案中，发明的多核苷酸是天然序列。在一些实施方案中，天然序列分离自自然界，而在其它实施方案中，它们是通过重组或合成方式生产的。术语“天然序列”特别涵盖了天然存在的截短的或分泌的形态(例如，生物活性片段)，以及天然序列的天然存在的变体形态。
由于遗传密码的简并性，特定氨基酸可以使用一个以上的密码子来编码。因此，在一些实施方案中，不同的DNA序列用于编码任意多肽，例如信号肽、蛋白质、催化结构域和/或分子伴侣。实际上，本发明意在涵盖编码相同多肽的不同多核苷酸序列。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下，单链形态的核酸可以与其它核酸退火时，则核酸与另一核酸序列是可杂交的。在低、中、高和非常高严格条件下用于杂交的杂交和洗涤条件是本领域熟知的。通常，杂交涉及核苷酸探针和同源DNA序列，其通过互补多核苷酸的广泛的碱基配对，形成稳定的双链杂交体。在一些实施方案中，在2X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.5％SDS中，在约60℃(中等严格)、65℃(中等/高严格)、70℃(高严格)和约75℃(非常高严格)下，洗涤具有探针和同源序列的滤膜(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，1989，6.3.1-6.3.6，通过引用整合到本文中)。
本发明涵盖了等位变体、天然突变体、诱导突变体，由这样的DNA编码的蛋白质，所述DNA在高或低严格条件下与编码漆酶、NSP24信号序列、CBHI信号序列、催化结构域、分子伴侣、陪伴蛋白和折叠酶的核酸杂交。本发明的核酸和多肽包括由于公开序列的测序错误而与本文公开的序列不同的序列。
“DNA序列的同源性”是通过两条DNA序列之间相同的程度来确定的。通常使用计算机程序来确定多肽序列和/或核苷酸序列的同源性或“百分比同一性”。实施序列比对和确定序列同一性的方法是本领域技术人员熟知的，不需要过多实验就可以实施，并且可以确定的获得同一性值的计算。本领域技术人员可获得且已知多种算法，用于比对序列和确定序列同一性。使用这些算法的计算机程序也是本领域可获得且已知的，包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或WU-BLAST-2、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、TFASTA和CLUSTAL。本领域技术人员已知如何确定用于测量比对的合适参数，包括在比较的序列全长获得最大比对所需的算法。可以利用程序确定的缺省参数来确定序列同一性。在一些实施方案中，通过MSPRCH程序(Oxford Molecular)执行的Smith-Waterman同源性检索算法(Smith Waterman，Meth.Mol.Biol.，70：173-187[1997))来确定序列同一性，所述MSPRCH程序使用具有下列检索参数的仿射空位检索：空位开发罚分为12，空位延伸罚分为1。可以使用Genetics Computer Group，Inc.(Madison，WI)的GCG序列分析软件包的GAP程序进行成对的氨基酸比较，运用blosum62氨基酸取代矩阵，具有空位权重12和长度权重2。关于两条氨基酸序列的最优比对，变体氨基酸序列的连续区段相对于参照氨基酸序列，可以具有额外的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的连续区段可以包括至少约20个连续的氨基酸残基，可以是约30个、约40个、约50个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，通过设定空位罚分对与在衍生氨基酸序列中包括空位相关的增加的序列同一性进行校正。
在一些实施方案中，本发明涵盖的蛋白质、信号肽、酶催化结构域、分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶是源自细菌或真菌，例如丝状真菌。示例性丝状真菌包括曲霉属物种(Aspergillus spp.)和木霉属物种(Trichodermaspp.)。一种示例性的木霉属物种是里氏木霉。然而，在一些实施方案中，本发明提供的信号肽和/或编码信号肽的DNA是源自真菌的另一属或物种，包括但不限于犁头霉属物种(Absidia spp)；支顶孢属物种(Acremoniumspp)；蘑菇属物种(Agaricus spp)；Anaeromyces spp；曲霉属物种(Aspergillus spp)，包括但不限于：棘孢曲霉(A.aculeatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、A.fumaricus、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidium spp；下皮黑孔属物种(Cerrena spp)；Cephalosporum spp；头孢属物种(Cephalosporium)；毛壳属物种(Chaetomium spp)；鬼伞属物种(Coprinus spp)；Dactyllum spp；指孢霉属物种(Dactylium spp)；镰孢属物种(Fusarium spp)，包括F.conglomerans、多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、爪哇镰孢(F.javanicum)、亚麻镰孢(F.lini)、尖镰孢(F.oxysporum)和腐皮镰孢(F.solani)；粘帚霉属物种(Gliocladiumspp)；腐质霉属物种(Humicola spp)，包括特异腐质霉(H.insolens)和H.lanuginosa；毛霉属物种(Mucor spp)；脉孢菌属物种(Neurosporaspp)，包括粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食脉孢霉(N.sitophila)；Neocallimastix spp；Orpinomyces spp；青霉属物种(Penicillium spp)；Phanerochaete；射脉菌属物种(Phlebia spp)；Piromyces spp；根霉属物种(Rhizopus spp)；裂褶菌属物种(Schizophyllum spp)；葡萄穗霉属物种(Stachybotrys spp)；栓菌属物种(Trametes spp)；木霉属物种(Trichoderma spp)，包括里氏木霉(T.reesei)、(长枝)里氏木霉(T.reesei(longibrachiatum))和绿色木霉(T.viride)；和接霉属物种(Zygorhynchus spp)。
催化结构域融合体
将所需蛋白质与酶融合通常能增加所需蛋白质的表达和/或分泌。通常，在构建体中，酶序列位于所需蛋白质序列的上游。例如，酶是从葡糖淀粉酶或从CBH1酶中获得的。在一个实施方案中，酶序列是全长的酶序列，包括催化结构域、接头和结合结构域。在另一个实施方案中，酶序列包括催化结构域序列，其通过接头或部分接头与所需蛋白质序列连接。在一些实施方案中，酶是在其天然宿主中高表达和/或分泌的宿主蛋白质。例如，当宿主细胞是木霉属宿主细胞时，酶是来自木霉属蛋白质。然而，可以理解，多种丝状真菌蛋白可用于与蛋白质融合，并可成功用于其它的丝状真菌宿主。
分子伴侣、陪伴蛋白和折叠酶
可用于本发明包括的方法和多核苷酸中的特定分子伴侣、陪伴蛋白和折叠酶不是关键的。此外，当本文中描述分子伴侣、陪伴蛋白和折叠酶的用途时，它们在方法中是可互换使用的。例如，当描述方法使用分子伴侣时，应理解为折叠酶和/或陪伴蛋白也可以取代所述分子伴侣或与其累加的使用。适合本发明的分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶是在宿主细胞中有活性的，并且发挥了增加所需蛋白质表达的作用的那些。
在一些实施方案中，分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶来自与蛋白质相同门的生物体，也可以来自相同的属，还可以来自相同的属和物种。在一些实施方案中，分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶来自担子菌，蛋白质是担子菌蛋白质。在一些实施方案中，分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶是组合使用的。在一些实施方案中，可以使用具有与全长分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶基本相同功能的分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶的片段。示例性的分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶包括在美国专利申请60/919,332和WO2008/115596中公开的，其通过引用全文整合到本文中。示例性的分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶包括但不限于：BIP1、CLX1、ERO1、LHS1、PRP3、PRP4、PRP1、TIG1、PDI1、PPI1、PPI2、SCJ1、ERV2、EDEM和SIL1。
表2提供了多种可用于本发明的分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶的序列。
Figure GPA00001126067600191
分子生物学——启动子和表达载体
本发明利用了重组遗传性领域的常规技术，是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，本发明提供了包括基因启动子序列(例如，来自丝状真菌)的异源基因，其通常在转化宿主细胞(例如，里氏木霉细胞)用于复制和/或表达前，克隆到中间载体中。这类中间载体通常是原核载体(例如，质粒或穿梭载体)。
通常，以任何合适的启动子实现所需蛋白质的表达。在一个实施方案中，对宿主非天然的启动子与编码所需蛋白质的多核苷酸有效的连接，所述蛋白质对宿主是天然或非天然的。在另一个实施方案中，对宿主天然的启动子与编码所需蛋白质的多核苷酸有效的连接，所述蛋白质对宿主是天然或非天然的。在一些实施方案中，以异源启动子表达所需蛋白质，所述异源启动子与所需蛋白质基因不是天然相关联的。而在其他一些实施方案中，以组成型或诱导性启动子表达所需蛋白质。在一些实施方案中，在具有纤维素酶启动子(例如，cbh1启动子)的木霉属表达系统中表达所需蛋白质。
如本文中使用的，术语“启动子”指发挥指导下游基因转录的功能的核酸序列。启动子可以包括靠近转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在II型聚合酶启动子的情况下的TATA元件。启动子以及其它的转录和翻译调控核酸序列，统称为“调控序列”，控制基因的表达。通常，调控序列包括但不限于：启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子或激活子序列。调控序列通常适合宿主并被其识别，所述宿主中表达下游基因。在一些实施方案中，使用的启动子来自与宿主细胞相同的门，在其他实施方案中，启动子来自与宿主细胞相同的属，在一些实施方案中，来自与宿主细胞相同的属和种。
“组成型启动子”是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“可诱导的”或“可抑制的启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。在一些实施方案中，由于环境因素的改变，启动子是可诱导的或可抑制的，如本领域已知的，所述因素包括但不限于：碳、氮或其他营养的可利用性、温度、pH、渗透性、重金属的存在、抑制剂浓度、压力，或前述的组合。在其他一些实施方案中，启动子是可以被代谢因素诱导或抑制的，如本领域已知的，例如一些碳源的水平、一些能量源的水平、一些分解代谢产物的水平，或前述的组合。
合适的启动子的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1和xyn2，产黄青霉(P.chrysogenum)的可抑制的酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见，Graessle等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：753-756[1997])，葡萄糖抑制性PCK1启动子(参见，Leuker等人，Gene 192：235-240[1997])，麦芽糖诱导性、葡萄糖抑制性MRP1启动子(参见，Munro等人，Mol.Microbiol.，391414-1426[2001])，甲硫氨酸抑制性MET3启动子(参见，Liu等人，Eukary.Cell 5：638-649[2006])，pKi启动子和cpc1启动子。
在本发明的一些实施方案中，报告基因构建体的启动子是温度敏感型启动子。在一些实施方案中，升高的温度抑制温度敏感型启动子的活性。在一些实施方案中，启动子是分解代谢产物抑制性启动子。在一些实施方案中，渗透性的改变抑制启动子。在一些实施方案中，启动子可以被培养基中存在的多糖、二糖或单糖水平诱导或抑制。
可用于本发明的诱导型启动子的实例是里氏木霉的cbh1启动子，其核苷酸序列以登录号D86235储存在GenBank中。其它示例性启动子包括在编码纤维素酶的基因调控中涉及的启动子，包括但不限于：cbh2、egl1、egl2、egl3、egl5、xyn1和xyn2。
在本发明的一些实施方案中，为了获得克隆基因的高水平表达，异源基因有利的位于与天然存在的基因中距启动子大概相同距离的位置。然而，如本领域已知的，在不丧失启动子功能的条件下，该距离可以进行适应的一些改变。
在一些实施方案中，通过替换、取代、添加或消除一个或多个核苷酸所修饰的天然启动子可用于本发明，只要所述修饰不改变启动子的功能。实际上，本发明意在涵盖，但并不限于启动子的此类改变。
表达载体/构建体通常含有转录单位或表达盒，所述转录单位或表达盒含有异源序列表达所需的所有额外的元件。因此，典型的表达盒含有与异源核酸序列有效连接的启动子，和转录物有效多聚腺苷酸化所需的信号，核糖体结合位点，以及翻译终止。盒内的其它元件可以包括增强子，以及如果使用基因组DNA作为结构基因，可以包括具有功能性剪接供体和受体位点的内含子、分泌前导肽、前导序列、接头和切割位点。
本发明的实践不受遗传构建体中启动子的选择限制。如上文指出的，示例性的启动子是里氏木霉的cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl5、xln1和xln2启动子。可用于本发明的其它启动子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)的那些(参见，Nunberg等人，Mol.Cell Biol.，4：2306-2315[1984])和来自构巢曲霉乙酰胺酶的启动子。用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)载体的示例性启动子是AprE启动子；用于大肠杆菌的示例性启动子是Lac启动子，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用的示例性启动子是PGK1，在黑曲霉中使用的示例性启动子是glaA，且用于里氏木霉的示例性启动子是cbhI。然而，本发明并非意在限于这些特定的细胞或这些特定的启动子，其它细胞和启动子也可以用多个实施方案中。
在一些实施方案中，除启动子序列外，表达盒还含有位于结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。在一些实施方案中，终止区是从和启动子序列相同的基因中获得的，而在其他实施方案中，其获得自不同的基因。
虽然任何合适的功能性真菌终止子都可用于本发明，一些示例性的终止子包括但不限于来自以下基因的终止子：构巢曲霉trpC基因(参见，Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474(1984)；Mullaney等人，(Molecular Genetics and Genomics[MGG]199：37-45(1985))，泡盛曲霉或黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(参见，Nunberg等人，Mol.Cell Biol.，4：2306-2315(1984)；Boel等人，EMBO J.，3：1581-1585(1984))，米曲霉的TAKA淀粉酶基因，米黑毛霉(Mucor miehei)的羧基蛋白酶基因(欧洲专利公开号0215594)和里氏木霉的CBH1基因。
并非意在将用于转运遗传信息进入宿主细胞的表达载体限于任何特定的载体。可认为，任何用于在真核或原核细胞中表达的常规载体都可用于本发明。标准的细菌表达载体包括但不限于：噬菌体λ和M13，以及质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，和融合的表达系统，例如MBP、GST和LacZ。在一些实施方案中，在重组蛋白质中添加表位标签，提供分离的常规方法(例如，c-myc)。合适的表达和/或整合载体的实例是本领域技术人员熟知的(参见例如，Bennett和Lasure(编著)More GeneManipulations in Fungi，Academic Press第70-76页和第396-428页(1991)；美国专利号5,874,276)。多种销售商(例如，Promega，Invitrogen，等)提供有效的载体，如本领域技术人员已知的。一些特别有效的载体包括但不限于pBR322、pUC18、pUC100、pDONTM201、pENTRTM、
Figure GPA00001126067600231
3Z和
Figure GPA00001126067600232
4Z。然而，本发明意在涵盖其它发挥等价功能并且是或成为本领域已知的表达载体。因此，多种宿主/表达载体组合可用于表达本发明的DNA序列。在一些实施方案中，有效的表达载体包括染色体区段、非染色体和/或合成的DNA序列(例如，多种已知的SV40衍生物)和已知的细菌质粒(例如，来自大肠杆菌的质粒，包括col E1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC 19、pSL1180及其衍生物)，更广宿主范围质粒(例如，RP4)、噬菌体DNA(例如，噬菌体λ的多种衍生物如NM989，和其他DNA噬菌体，如M13，以及丝状单链DNA噬菌体)，和酵母质粒(例如，2μ质粒或其衍生物)。
在一些实施方案中，表达载体包括可选择性标记。可选择性标记的实例包括赋予抗微生物剂抗性的标记。营养标记也可用于本发明，包括本领域已知的标记，如amdS、argB和pyr4。用于转化木霉属的标记是本领域已知的(参见例如，Finkelstein，in Biotechnology of Filamentous Fungi，Finkelstein等人，(编著)Butterworth-Heinemann，Boston MA，第6章(1992))。在一些实施方案中，表达载体还包括复制子，编码抗生素抗性的基因(使能够选择具有重组质粒的细菌)，和/或在质粒非必需区域的独特的限制性位点(使能够插入异源序列)。其旨在任何合适的抗生素抗性基因都可用于本发明。在一些里氏木霉是宿主细胞的实施方案中，优选的选择原核序列，使其不干扰DNA在里氏木霉中的复制或整合。
在一些实施方案中，表达载体只包括报告基因，或任选的作为与目标蛋白质的融合体。报告基因的实例包括但不限于，荧光报告子、颜色可检测的报告子(例如，β-半乳糖苷酶)和生物素化的报告子。在一些实施方案中，当表达报告分子时，其被用于鉴别信号肽在宿主细胞中是否有活性。如果信号肽是活性的，则从细胞分泌报告分子。在一些实施方案中，信号肽首先与报告子有效的连接，从而鉴别从特定宿主细胞中的分泌作用。备选的方法例如使用对目标蛋白质和/或信号肽特异的抗体的方法，也可用于确定是否分泌目标蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的转化方法导致全部或部分转化载体稳定的整合到宿主细胞的基因组中，例如丝状真菌宿主细胞。然而，也考虑导致维持自我复制的染色体外转化载体的转化。
本发明可使用多种标准的转染方法，产生表达大量蛋白质的细菌和丝状真菌(例如，曲霉属或木霉属)细胞系。用于将DNA构建体引入木霉属的纤维素酶-生产菌株的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，Lorito等人，Curr.Genet.，24：349-356[1993]；Goldman等人，Curr.Genet.，17：169-174[1990]；Penttila等人，Gene 6：155-164[1987]；美国专利号6.022,725；美国专利号6,268,328；Nevalainen等人，“The Molecular Biologyof Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologousand Heterologous Genes”in Molecular Industrial Mycology，Leong和Berka(编著)，Marcel Dekker Inc.，NY[1992]第129-148页；Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474[1984]；Bajar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212[1991]；Fernandez-Abalos等人，Microbiol.，149：1623-1632[2003]；和Brigidi等人，FEMS Microbiol.Lett.，55：135-138[1990])。
然而，本发明可以使用任何熟知的程序，用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞。如本领域技术人员熟知的，这类方法包括但不限于使用磷酸钙转染、Polybrene、原生质体融合、电穿孔、生物射弹、脂质体、显微注射、质粒载体、病毒载体，和任何其他用于引入克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料到宿主细胞的熟知方法。还可使用农杆菌介导的转染方法(参见例如，美国专利号6,255,115)。只需要所使用的特定遗传工程方法能够成功的将至少一个基因引入到能表达基因的宿主细胞中。在一些实施方案中，发明提供了生产蛋白质的方法，包括下述步骤：向宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与编码蛋白质的核酸连接的NSP24信号肽；在适合蛋白质表达和生产的培养条件下培养宿主细胞；并生产所述蛋白质。在一些实施方案中，从宿主细胞分泌蛋白质。在一些备选的实施方案中，本发明提供了生产蛋白质的方法，包括步骤：向宿主细胞引入多核苷酸，所述多核苷酸包括与编码蛋白质的核酸有效连接的CBH1信号肽；在适合蛋白质表达和生产的培养条件下培养宿主细胞；并生产所述蛋白质。在一些实施方案中，从宿主细胞分泌蛋白质。
在将表达载体引入宿主细胞后，在有利于基因表达的条件下，在基因启动子序列的控制下，培养转染或转化的细胞。在一些实施方案中，培养大批转化的细胞。在一些实施方案中，使用标准技术，从细胞中收获和/或从培养物中回收产物(即，蛋白质)。
因此，本文中的发明提供了所需蛋白质的表达和增强的分泌，它的分泌是通过信号肽序列、融合DNA序列和多种异源构建体，以及分子伴侣、陪伴蛋白和/或折叠酶的表达而增强的。发明还提供了表达和分泌高水平的此类所需多肽的方法。
所需蛋白质
术语“所需蛋白质”意指任何目标蛋白质。所需蛋白质可以是宿主细胞天然的蛋白质，或者宿主细胞非天然(异源)的蛋白质。在一些实施方案中，所需蛋白质是真菌蛋白质。在一些实施方案中，宿主是子囊菌宿主，蛋白质是除子囊菌蛋白质以外的任何蛋白质。在一些实施方案中，宿主是担子菌宿主，蛋白质是除担子菌蛋白质以外的任何蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是除木霉属蛋白质以外的任何蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是除曲霉属蛋白质以外的任何蛋白质。
本发明并非意在限定任何特定类型的蛋白质。实际上，本发明意在涵盖任何目标蛋白质。所需蛋白质的一些非限制性实例包括但不限于葡糖淀粉酶、α淀粉酶、颗粒淀粉水解酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、半纤维素酶、蛋白酶、氧化酶、漆酶及其组合。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶是从丝状真菌来源获得的野生型葡糖淀粉酶，所述来源例如曲霉属、木霉属或根霉属的菌株。然而，在其他实施方案中，葡糖淀粉酶是蛋白质改造的葡糖淀粉酶(例如，黑曲霉葡糖淀粉酶的变体)。在其他一些实施方案中，本发明的组合物还包括至少一种蛋白酶和至少一种α淀粉酶。在一些实施方案中，α淀粉酶是从细菌来源(例如，芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.))或真菌来源(例如，曲霉属物种)获得的。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种蛋白酶、和/或至少一种葡糖淀粉酶，和/或至少一种α淀粉酶。在一些实施方案中，蛋白质是漆酶，例如从担子菌获得的漆酶，在一些实施方案中，从下皮黑孔属(例如单色下皮黑孔菌)获得的漆酶。这类酶的商业来源是已知的，可从例如Genencor International，Inc.和Novozymes A/S获得。
漆酶知漆酶相关的酶
在一个优选的实施方案中，漆酶和漆酶相关的酶是所需蛋白质。本发明并非意在限定任何特定的漆酶，因为涵盖了属于酶分类(EC 1.10.3.2)中的任何漆酶。在一些实施方案中，漆酶是从微生物或植物来源获得的。在一些实施方案中，微生物漆酶源自细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。虽然本发明并非意在限制特定的漆酶，合适的实例包括源自以下的漆酶：曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)、柄孢壳属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytisi)、金钱菌属(Collybia)、下皮黑孔属、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、革耳属(Panus)(例如，野生革耳(Panusrudis))、梭孢壳属(Thieilava)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)(例如，长绒毛栓菌(T.villosa)和变色栓菌(T.versicolor))、丝核菌属(Rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌(R.solani))、鬼伞属(Coprinus)(褶纹鬼伞(C.plicatilis)和灰盖鬼伞(C.cinereus))、小脆柄菇属(Psatyrella)、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉(M.thermonhila)、Schytalidium、射脉菌属(Phlebia)(例如，射脉菌(P.radita)；参见例如，WO 92/01046)、革盖菌属Coriolus)(例如，毛革盖菌(C.hirsutus)；参见例如，JP 2--238885)、绵皮孔菌属(Spongipellis)、多孔菌属(Polyporus)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、粗皮灵芝(Ganoderma tsunodae)和木霉属。
在一些实施方案中，漆酶包括来自CBS115.075菌株的下皮黑孔属漆酶A1、B1和D2，来自CBS154.29菌株的下皮黑孔属漆酶A2、B2、C、D1和E，来自ATCC20013菌株的下皮黑孔属漆酶B3(参见例如，美国公开号2008/0196173，通过引用全文整合到本文中)。这类漆酶的其他优化版本也可用于本发明。
在另一个实施方案中，漆酶包括在木霉属中表达的下皮黑孔属漆酶D的成熟蛋白质；其氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：45)：
AIGPVADLHIVNKDLAPDGVQRPTVLAGGTFPGTLITGQKGDNFQLNVIDDLTDDRM
LTPTSIHWHGFFQKGTAWADGPAFVTQCPIIADNSFLYDFDVPDQAGTFWYHSHLST
QYCDGLRGAFVVYDPNDPHKDLYDVDDGGTVITLADWYHVLAQTVVGAATPDSTLI
NGLGRSQTGPADAELAVISVEHNKRYRFRLVSISCDPNFTFSVDGHNMTVIEVDGVN
TRPLTVDSIQIFAGQRYSFVLNANQPEDNYWIRAMPNIGRNTTTLDGKNAAILRYKNA
SVEEPKTVGGPAQSPLNEADLRPLVPAPVPGNAVPGGADINHRLNLTFSNGLFSINNA
SFTNPSVPALLQILSGAQNAQDLLPTGSYIGLELGKVVELVIPPLAVGGPHPFHLHGHN
FWVVRSAGSDEYNFDDAILRDVVSIGAGTDEVTIRFVTDNPGPWFLHCHIDWHLEAG
LAIVFAEGINQTAAANPTPQAWDELCPKYNGLSASQKVKPKKGTAI
宿主细胞
本发明提供了用本文描述的DNA构建体和载体转化的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了用DNA构建体转化的宿主细胞，所述DNA构建体编码所需蛋白质和如本文所述有效连接NSP24或CBHI信号肽。在一些实施方案中，发明提供了编码至少一种所需蛋白质的DNA构建体，所述蛋白质例如蛋白酶、漆酶、α淀粉酶、葡糖淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶，其中构建体引入了宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了在基因启动子的控制下，蛋白质基因的表达和/或蛋白质基因的过表达，所述启动子在细菌和/或真菌宿主细胞中是功能性的。
其旨在任何合适的宿主细胞都可用于本发明。本发明并非意在限制任何特定的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是这样的细胞，在所述细胞中，信号肽在分泌目标蛋白质中有活性。例如，可使用里氏木霉信号肽的宿主细胞包括但不限于真菌和细菌细胞。宿主细胞包括丝状真菌细胞，包括但不限于木霉属物种(例如，绿色木霉(T.viride)和里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形态，原分类为长枝木霉(T.longibrachiatum))、青霉属物种、腐质霉属物种(例如，特异腐质霉和灰腐质霉(H.grisea))、曲霉属物种(例如，黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉和泡盛曲霉)、镰孢属物种(例如禾赤镰孢(F.graminum))、脉孢菌属物种、肉座菌属物种(Hypocrea spp)和毛霉属物种。备选的宿主细胞包括但不限于：芽孢杆菌属物种(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothremophilus)和短芽孢杆菌(B.brevis))和链霉菌属物种(Streptomyces spp.)(例如，天蓝色链霉菌(S coelicolor)和浅青紫链霉菌(S.lividans))。
本领域已知多种方法用于鉴别蛋白质是否从宿主细胞分泌，或停留在细胞质内。其旨在任何合适的方法都可用于鉴别信号序列具有活性的宿主细胞。
蛋白质表达
通过培养用载体转化的细胞来生产本发明所需的蛋白质，所述载体例如包含基因的表达载体，通过NSP24或CBH1信号肽序列、折叠酶、陪伴蛋白和/或分子伴侣增强所述基因的分泌。本发明对于增加胞内和/或胞外蛋白质的生产特别有效。如本领域技术人员已知，生产蛋白质的优化条件可以随宿主细胞和待表达的蛋白质的选择而改变。本领域技术人员易于确定此类条件。
在一些实施方案中，在表达后分离或回收和纯化目标蛋白质。用于蛋白质分离和纯化的多种方法是本领域技术人员已知的。任何合适的方法都可用于本发明。例如，可用于本发明的标准纯化方法包括但不限于：电泳的、分子、免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和和反相HPLC色谱，以及色谱聚焦。例如，在一些实施方案中，使用标准的抗体柱纯化目标蛋白质，所述抗体柱包括针对目标蛋白质的抗体。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩组合，也可用于一些实施方案中。如本领域技术人员已知的，纯化所需的程度应该根据目标蛋白质的用途改变。实际上，在一些实施方案，不需要进行任何纯化。
在一些实施方案中，如本发明提供的，利用本领域技术人员已知的常规程序从培养基中回收通过转化宿主细胞所生产的目标蛋白质。这些方法包括但不限于通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞。在一些实施方案中，破裂细胞并从细胞级分和碎片中移出上清液。在一些实施方案中，在澄清后，通过盐(例如，硫酸铵)的方式沉淀上清液或滤液的蛋白质组分。然后，溶解沉淀的蛋白质，在一些实施方案中，通过任何合适的方法进行纯化，包括色谱程序(例如，离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱和其他本领域已知的程序)。
在其他一些实施方案中，通过免疫动物(例如，兔或小鼠)产生针对利用本发明所生产的肽和蛋白质的抗体，使用本领域已知的任何合适方法回收抗蛋白和/或NSP24信号肽抗体。在其他一些实施方案中，使用本领域已知的任何合适方法产生单克隆抗体。
在一些实施方案中，本领域技术人员已知的测定可用于本发明，包括但不限于在WO 99/34011和美国专利号6,605,458中描述的那些，均通过引用全文整合到本文中。
融合体
在一些实施方案中，以融合蛋白生产所需的蛋白质。在其他一些实施方案中，所需蛋白质与丝状真菌有效分泌的蛋白质融合，并与酶催化结构域融合，所述酶来自与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同的门、属和/或种。在一些实施方案中，所需蛋白质与CBHI多肽或其部分融合。在其他一些实施方案中，所需蛋白质与经过改变最小化或消除了催化活性的CBHI多肽或其部分融合。在其他一些实施方案中，所需蛋白质与木霉属葡糖淀粉酶多肽或其部分融合。在其他一些实施方案中，所需蛋白质与经过改变最小化或消除了催化活性的木霉属葡糖淀粉酶或其部分融合。在其他一些实施方案中，所需蛋白质与多肽融合以增加分泌、便于后续纯化和/或增加稳定性。
通常，在本发明表达宿主中的第一、第二和/或第三多核苷酸是遗传插入或整合到表达宿主的基因组构成中的(例如，整合到表达宿主的染色体中)。然而，在一些实施方案中，它是染色体外的(例如，以表达宿主内的复制载体存在)。在其他一些实施方案中，染色体外多核苷酸在针对位于载体上的选择标记的合适选择条件下表达。
分泌水平测定
如本文所述，使用任何合适方法确定所需多肽在表达宿主中的分泌水平。例如，在一些实施方案中，分泌水平是基于多种因素(例如，宿主的生长条件)等。然而，在一些实施方案中，在宿主中表达的所需多肽的分泌水平高于在不存在分泌增强蛋白条件下表达的所需多肽的分泌水平。在一些实施方案中，当宿主以分批发酵模式在摇瓶中生长时，所需多肽(例如，在表达宿主如里氏木霉中的单色下皮黑孔菌的漆酶)的分泌水平是至少约1mg/升，约2mg/升，约3mg/升，约4mg/升，或约5mg/升，或者，当宿主在具有受控的pH、补料速率等(例如，补料分批发酵)发酵罐环境中生长时，所述分泌水平是至少约50mg/升，约100mg/升，约150mg/升，约200mg/升，约250mg/升，约500mg/升，约1000mg/升，约2000mg/升，约5000mg/升，约10,000mg/升，或约20,000mg/升。
例如，为了评估可分泌多肽的表达和/或分泌，在蛋白质水平、RNA水平，和/或通过使用适用于分泌性多肽活性和/或产量的功能性生物测定来进行测定。用于分析分泌性多肽表达和/或分泌的示例性测定包括但不限于，Northern印迹、点渍法(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)，或原位杂交，使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)，常规的Southern印迹和放射自显影。
在一些实施方案中，直接在样品中测量可分泌多肽的生产、表达和/或分泌。在一些实施方案中，利用针对酶活性、表达和/或生产的测定来进行测量。在一些实施方案中，通过免疫学方法(例如，免疫组化染色细胞和/或组织切片，或通过Western印迹或ELISA方法免疫测定组织培养基)评估蛋白质表达。此类免疫测定可用于定量和/或定性的评估可分泌多肽的表达。这些方法是本领域技术人员已知的。实际上，有多种可用于此类方法的可商购试剂盒和试剂。
在一些实施方案中，本发明还提供了从用于生长表达宿主的培养基中获得的提取物(例如，固体或上清液)。在一些实施方案中，上清液不含可观量的表达宿主，而在一些备选的实施方案中，上清液不含任何量的表达宿主。
细胞培养
如本领域已知的，可以在常规营养培养基中培养本发明的宿主细胞和转化细胞。然而，在一些实施方案中，当合适的，修饰用于转化宿主细胞的培养基，从而激活启动子和选择转化体。特定的培养条件，例如温度、pH等，通常是用于就表达所选定的宿主细胞的那些，并且对本领域技术人员是显而易见的。用于宿主细胞的培养基和条件是本领域技术人员已知的。应该注意到，在培养中，真菌宿主细胞(例如，木霉属细胞)的稳定转化体通常与不稳定的转化体是可区分的，通过其更快的生长速率或在固体培养基上形成具有光滑而非粗糙轮廓的环状克隆。
组合物
在一些实施方案中，本发明提供了使用NSP24或CBH1信号序列、构建体和载体，表达所需蛋白质的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了包括酶的组合物，所述酶包括但不限于漆酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、颗粒淀粉水解酶、纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶、木聚糖酶、角质酶、半纤维素酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、植酸酶、角蛋白酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、氧化还原酶、还原酶、过水解酶(perhydrolases)、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶(ligninases)、tannanases、支链淀粉酶、戊聚糖酶(pentosanases)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶(arabinosidases)、透明质酸酶、软骨素酶(chondrointinases)、甘露聚糖酶、酯酶、酰基转移酶，及其组合。
应用
本发明生产的所需蛋白质可用于任何适合该蛋白质的应用。蛋白质(例如，酶)应用的实例包括但不限于：用于改善饲料摄入和饲料效率的动物饲料(例如蛋白酶)、食物蛋白质水解物(例如，用于具有损伤的消化系统的个体)、皮革处理、蛋白质纤维(例如，羊毛和丝)的处理、清洁、蛋白质加工(例如，去除苦味肽、增加食物滋味，和/或生产乳酪和/或可可)、个人护理产品(例如、头发组合物)、甜味剂(例如，生产高麦芽糖或高果糖糖浆)、发酵和生物乙醇(例如，用于处理谷类发酵生产生物乙醇的α淀粉酶和葡糖淀粉酶)。漆酶应用的实例包括但不限于：纸浆和纸的漂白、纺织品漂白、废水处理、废纸脱墨、芳香化合物或蛋白质的多聚化、放射介导的多聚化和交联反应(例如，涂料(paint)、涂层(coating)、生物材料)、染料激活，和偶联有机化合物。漆酶还可用于清洁组合物，包括但不限于洗衣用和其它洗涤剂。
实施例
提供下列实施例用于示例，而并非限制要求保护的发明。在不脱离发明范围的条件下，可以实施对材料和方法的多种修饰，这对本领域技术人员是显而易见的。
在下文公开的实验内容中使用以下缩写：M(摩尔)；μM(微摩尔)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg和ug(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl和ul(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；h和hr(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)；V(伏特)；xg(时间重力)；°F(华氏度)；amdS(乙酰胺酶，从构巢曲霉中获得的选择性标记)；lccD(漆酶)；BioRad(BioRadLaboratories，Hercules，CA)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Calbiochem(Calbiochem商标，由EMD Chemicals Inc.，San Diego，CA拥有)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Spectronic(SpectronicDevices，Ltd.，Bedfordshire，UK)；Advanced Kinetics(Advanced Kineticsand Technology Solutions，Switzerland)。
实施例中大部分的表达载体都是基于pSL1180质粒骨架生产的，数据库中提供了它的序列，标识符为U13865。使用本领域已知的多接头和/或PCR方法添加标记例如amdS标记、分子伴侣或折叠酶、漆酶(lccD)、信号序列、TrGA融合体和终止子。
质粒上的位点鉴别如下：cbh1——纤维二糖水解酶；Tcbh1——来自cbh1的终止子；TrGA木霉属的葡糖淀粉酶；lccD——漆酶D；amdS标记——自养的选择性标记；pSL1180——质粒骨架；漆酶D opt——漆酶D基因的优化版本，使用在宿主(木霉属)中表达优化的密码子选择进行构建；Pcpc-1——来自粗糙脉孢霉的交叉通路控制-1基因的启动子；bla——β-内酰胺酶基因(即，来自大肠杆菌的选择性标记)；和HphR——潮霉素抗性基因(来自大肠杆菌的选择性标记)。
为了构建表达质粒，设计引物并用于含有DNA模板的Herculase PCR反应(Stratagene)。
实施例1.构建表达载体pTrex4-漆酶D opt
该实施例描述了构建表达载体pTrex4-漆酶D opt中涉及的步骤。产生的质粒用于表达密码子优化的单色下皮黑孔菌的漆酶D基因，使用CBH1启动子和CBH1信号序列。该表达载体含有与CBH1(纤维二糖水解酶)核心/接头融合的漆酶D密码子优化基因，并从CBH1启动子表达。图1提供了木霉属表达质粒的示意图。pTrex4-漆酶D opt质粒的序列显示为SEQ ID NO：1。在构建pTrex4-漆酶D opt时，组装下列DNA区段(参见，图1)。将里氏木霉基因组DNA的片段插入到质粒pSL1180载体中，所述片段代表了CBH1启动子、CBH1信号序列和CBH1核心/接头。插入单色下皮黑孔菌的漆酶D基因的密码子优化拷贝(漆酶D opt)，使其在接头区与CBH1有效的连接。
来自里氏木霉的CBH1终止子与漆酶D基因有效的连接。添加amdS基因作为选择性自养标记。pSL1180载体中存在bla基因(编码β-内酰胺酶，获得自大肠杆菌的选择性标记)。
实施例2.构建表达载体pTrex2g-Bip1
产生pTrex2g/Bip1质粒用于表达里氏木霉的bip1分子伴侣。图2提供了木霉属表达质粒pTrex2g-Bip1的示意图；质粒的序列提供为SEQ IDNO：2。在构建pTrex2g-Bip1中，组装下列DNA区段。将2276bp的里氏木霉bip1片段插入到质粒pSL1180载体中，与Ppki启动子(里氏木霉的丙酮酸激酶)有效的连接。木霉属cbh1终止子与bip1基因有效的连接。包括来自大肠杆菌的HphR选择性标记用于选择，其与Pcpc-1启动子(来自粗糙脉孢霉的交叉通路控制-1基因)和trpC终止子(来自构巢曲霉的色氨酸合成基因C)有效的连接。
实施例3.构建表达载体pTrex2g-Pdi1
以与pTrex2g-Bip1相同的方式(参见实施例2)，产生pTrex2g-Pdi1质粒，用于表达分子伴侣pdi1，除了插入里氏木霉pdi1分子伴侣基因(2465bp)取代bip1分子伴侣基因。图3提供了木霉属表达质粒pTrex2g-Pdi1的示意图；质粒的序列提供为SEQ ID NO：3。
实施例4.构建表达载体pTrex2g-Ero1
以与pTrex2g-Bip1相同的方式(参见实施例2)，产生pTrex2g-Ero1质粒，用于表达分子伴侣ero1，除了插入里氏木霉ero1分子伴侣基因(2465bp)取代bip1分子伴侣基因。图4提供了ero1在木霉属表达质粒pTrex2g-Ero1中的ero1的示意图。ero1的序列提供为SEQ ID NO：4。
实施例5.构建表达载体pTrGA-漆酶D opt
以与实施例1相似的方式产生pTrGA-漆酶D opt质粒，除了pTrGA-漆酶D opt表达里氏木霉的全长葡糖淀粉酶和密码子优化的单色下皮黑孔菌漆酶D的融合体。图5提供了木霉属表达质粒pTrGA-漆酶D opt的示意图；多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：5。
实施例6.构建表达载体pKB408
生产pKB408质粒用于表达与里氏木霉NSP-24信号肽有效融合的单色下皮黑孔菌漆酶D opt。以与图1所示相似的方式构建质粒，除了漆酶D构建体是与NSP24信号肽有效连接的，插入其替换与CBH1信号序列、催化结构域和接头连接的漆酶D opt。图6提供了木霉属表达质粒pKB408的示意图；多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：6。
实施例7.构建表达载体pKB410
如实施例6中所述产生pKB410质粒，除了使用里氏木霉CBH1信号序列取代NSP-24信号肽。图7提供了木霉属表达质粒pKB410的示意图；多核苷酸序列显示为SEQ ID NO：7。
实施例8.转化里氏木霉并分析表达
在该实施例中，稳定的重组里氏木霉菌株源自RL-P37(参见，Sheir-Neiss and Montenecourt，Appl.Microbiol.Biotechnol.，20：46-53(1984))，并如Bower等人(参见，Bower等人，Carbohydrases FromTrichoderma reesei and Other Micro-organisms，Royal Society of Chemistry，Cambridge，第327-334页(1998))所述删除了cbh1、cbh2、egl1和egl2基因，所述菌株用于转化单独或以各种组合的实施例1-14的质粒。如下文所述，使用生物射弹和电穿孔方法转化质粒。
生物射弹转化
通过DNA测序验证表达质粒，并生物射弹转化到木霉属菌株中。根据生产商的说明(参见，WO 05/001036和美国专利申请公开号2006/0003408)，使用
Figure GPA00001126067600361
PDS-1000/he Particle Delivery System(Bio-Rad)实施通过生物射弹转化方法的木霉属菌株的转化。选择转化体，并转移到含有乙酰胺(MMA)的基本培养基的平板上，在28-30℃生长4天。将包含孢子和菌丝体的单菌落的小栓转移到30ml含有1mM铜的NREL乳糖确定成分肉汤(pH 6.2)中。培养物在28℃生长5天。离心培养肉汤，如下文所述针对漆酶活性使用ABTS测定分析上清液。
电穿孔
如美国专利申请号：60/931,072所述实施电穿孔，其通过引用全文整合到本文中。里氏木霉菌株在Potato Dextrose琼脂平板(Difco)上生长大约10-20天，并产生孢子。用水从平板表面洗去孢子，并通过Miracloth(Calbiochem)过滤纯化。离心(3000xg，12min)收集孢子，在冰水中洗涤1次，以及冰冷的1.1M山梨糖醇洗涤1次。将孢子沉淀重悬在少量体积的冷1.1M山梨糖醇中，每100μl孢子悬液与约8μg自质粒DNA(pKB408和pKB410，图6和7)分离的凝胶纯化的DNA片段混合。将混合物(100μl)置于电穿孔小池(1mm间隔)中，使用下列电穿孔参数进行电脉冲：电压6000-20000V/cm，电容＝25μF，电阻＝50Ω。在电穿孔后，将孢子稀释约100倍，成为1.1M山梨糖醇与YEPD(1％酵母提取物，2％Bacto-蛋白胨，2％葡萄糖，pH5.5)的5∶1混合物，置于摇瓶中，在轨道摇床上孵育16-18小时(28℃和200rpm)。通过离心再一次收集孢子，重悬在约10倍沉淀体积的1.1M山梨糖醇中，涂板在两个15cm的含有amdS改良培养基的培养皿上(乙酰胺0.6g/l，氯化铯1.68g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾15g/l，七水合硫酸镁0.6g/l，二水合氯化钙0.6g/l，硫酸亚铁(II)5mg/l，硫酸锌1.4mg/l，氯化亚钴(II)1mg/l，硫酸锰(II)1.6mg/l，琼脂20g/l和pH 4.25)。在28-30℃孵育约1周后出现转化体。
如下实施ABTS测定：制备在水中含有4.5mM ABTS的ABTS储液(ABTS；Sigma Cat#A-1888)。制备含有0.1M醋酸钠pH 5.0的缓冲液。然后，将1.5ml缓冲液和0.2ml的ABTS储液添加到小池(10×4×45mm，No./REF67.742)中，混合均匀。制备1个额外的小池作为空白。然后，将50μl各种待测试的酶样品(使用各种稀释度)加入到混合物中。
如下使用ABTS动力学测定程序设定(Advanced Kinetics)，在Genesys2仪器(Spectronic)中测量ABTS活性：波长420nm，间隔时间(秒)2.0，总运行时间(秒)14.0，因子1.000，下限-000000.00，上限999999.00，反应顺序为第一种。
程序涉及向小池中添加1.5mL的NaOAc(120mM NaOAc缓冲液pH5.0)，然后添加0.2mL的4.5mM ABTS(然后向空白小池中)，向小池中加入0.05mL的酶样品，迅速混合均匀，最后，测量420nm处的吸光度改变，每2秒测量一次共计14秒。1个ABTS单位定义为每分钟A420的改变(不考虑样品稀释)。ABTS U/mL的计算：(Δ420/分的变化＊稀释因子)。
实施例9.分析里氏木霉转化体中漆酶/葡糖淀粉酶融合基因的表达
通过离心(16000xg，10min)将如实施例8所述获得并培养的转化体的培养基与菌丝体分离，分析上清液的ABTS活性。结果显示在图10中。表3提供了图10描述的菌株。图10示例了通过编码单色下皮黑孔菌漆酶和全长木霉属葡糖淀粉酶的融合的漆酶产量的改善。结果显示，当与木霉属的葡糖淀粉酶融合时，漆酶的表达比与CBH1融合时增加了24-29％。
表3.图10中使用的菌株
  菌株标识编号   菌株类型
  #8-2   CBH1漆酶融合体
  1066-9   TrGA漆酶融合体
  1066-13   TrGA漆酶融合体
  1066-15   TrGA漆酶融合体
实施例10.分析使用NSP24和CBH1信号序列的漆酶产量
当里氏木霉CBH1信号序列与漆酶基因有效的连接时，在摇瓶中的表达比单独的初始CBH1融合体菌株#8-2增加了4-5倍，而在14升发酵罐中则增加了5-6倍，如图11(摇瓶)和12(发酵罐)提供的结果所示。当使用里氏木霉NSP24信号序列时，在摇瓶中的表达增加了3-4倍，而在14升发酵罐中则增加了4-5倍。在摇瓶中分析关于CBH1信号序列的3个克隆(#7、#10和#13)，以及分析关于NSP24信号序列的2个克隆(#7和#25)，在第3(第1条)、4(第2条)和5天(第3条)分析表达。在14升发酵罐中分析各个单克隆，结果如图12所示。在该图中，菱形表示与漆酶D有效的连接的NSP24信号序列，方形表示与漆酶D有效的连接的CBH1信号序列，而三角形表示单独的CBH1融合体。
实施例11.分析在发酵罐中的利用CBH1信号序列和bip1共表达的 漆酶产量
将CBH1信号序列质粒(与漆酶有效的连接)与里氏木霉Bip1质粒共转化，并分析表达。结果显示在图13中。在图13中，菱形表示就CBH1信号序列(与漆酶有效的连接)加Bip1获得的数据，而方块表示就单独CBH1信号序列(与漆酶有效的连接)获得的数据。图13示例了CBH1信号序列加BIP1分子伴侣表达所提供的漆酶产量的增加，其在发酵罐中显著增加了表达，增加了超过15％。
实施例12.分析在摇瓶中的利用CBH1信号序列和bip1共表达的漆酶 产量
将CBH1信号序列质粒(与漆酶有效的连接)与里氏木霉bip1质粒共转化，生长并使用ABTS测定分析漆酶表达。结果显示在图14中。就3天(第1条)、4天(第2条)和5天(第3条)分析5个不同的克隆。KB410-13是只含有CBH1信号序列质粒的对照。其它4个克隆是KB410-13与一个bip1的共转化体：E32、E9、E16和E10。图14示例了在摇瓶中通过共表达分子伴侣和单色下皮黑孔菌对漆酶产量的增加。与bip1的共表达显著增加了摇瓶中的表达(14-41％)。
实施例13.分析利用CBH1-漆酶D融合体和共表达多种分子伴侣的 漆酶产量
将表达质粒与多种里氏木霉分子伴侣质粒(BIP1、PDI1和ERO1)共转化，所述表达质粒具有与漆酶有效连接的CBH1信号序列、催化结构域和接头。培养物种生长所获得的转化细胞，并分析漆酶表达。图15示例了通过将融合且bip1、pdi1和ero1分子伴侣共表达，对漆酶产量的改善，其中所述融合是编码单色下皮黑孔菌漆酶的基因与CBH1信号序列、催化结构域和接头的融合。
所有菌株都具有与漆酶D连接的CBH1信号序列、催化结构域和接头，菌株1B1、1B12和1B19具有bip1表达盒；它们是3个独立的转化体，具有bip1质粒拷贝数和整合位置的差异。菌株3B2和3B8具有pdi1表达盒；它们是2个独立的转化体，具有pdi1质粒拷贝数和整合位置的差异。菌株9B6和9B7具有ero1表达盒；它们是2个独立的转化体，具有ero1质粒拷贝数和整合位置的差异。#8-2是对照菌株，没有分子伴侣表达盒。
图15的结果表示，与bip1分子伴侣共表达获得了最多的表达增加。
实施例14.分析利用CBH1信号序列和共表达多种分子伴侣的漆酶产 量
将CBH1信号序列质粒(即，与漆酶有效的连接)与多种里氏木霉分子伴侣质粒(bip1、lhs1、pdi1、ppi1、ppi2、tig1、prp1和ero1)(单独或组合的)共转化。如本领域已知的，在摇瓶中生长培养物，并使用ABTS测定分析漆酶表达。一式三份的分析克隆。表4中提供的数据显示，添加一种以上的分子伴侣所增加的漆酶表达没有超过单独使用bip1。表4中的数据显示了来自同一菌株的三次独立的孢子纯化样品(或克隆)。
Figure GPA00001126067600411
Figure GPA00001126067600421
目前，以已经全面、清楚、简洁和准确术语的描述了本发明，以及产生和利用本发明的方式和过程，使任何所属领域技术人员都可以制备和使用其。应该理解，前文描述了本发明优选的实施方案，在不脱离权利要求提出的本发明范围的条件下，可以进行修饰。为了特别指出并明确声明视为发明的主题，下列权利要求总结本说明书。
序列表
<110>丹尼斯科美国公司(DANISCO US，INC.)
     鲍锴(BAO，Kai)
     王华明(WANG，Huaming)
 
<120>用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣
 
<130>02718.0027.00PC00
 
<150>US 60/984,430
<151>2007-11-01
 
<160>45
 
<170>PatentIn版本3.5
 
<210>1
<211>11689
<212>DNA
<213>木霉属(Trichoderma)
 
<400>1
aagcgcctgc agccacttgc agtcccgtgg aattctcacg gtgaatgtag gccttttgta     60
gggtaggaat tgtcactcaa gcacccccaa cctccattac gcctccccca tagagttccc    120
aatcagtgag tcatggcact gttctcaaat agattgggga gaagttgact tccgcccaga    180
gctgaaggtc gcacaaccgc atgatatagg gtcggcaacg gcaaaaaagc acgtggctca    240
ccgaaaagca agatgtttgc gatctaacat ccaggaacct ggatacatcc atcatcacgc    300
acgaccactt tgatctgctg gtaaactcgt attcgcccta aaccgaagtg acgtggtaaa    360
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ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca cctgcatcat gtatataata gtgatcctga    540
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tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac    1800
ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt    1860
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tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg aacacactgc tgcctttacc aagcagctga    1980
gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc actgcatggt ttcgaataga aagagaagct    2040
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gtcagcgaat gtgtatatat aaaggttcga ggtccgtgcc tccctcatgc tctccccatc    2160
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ggccacagct cgtgctcagt cggcctgcac tctccaatcg gagactcacc cgcctctgac    2340
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agccgtcatc caacaacgca aacacgggca ttggaggaca cggaagctgc tgctctgaga    3000
tggatatctg ggaggccaac tccatctccg aggctcttac cccccaccct tgcacgactg    3060
tcggccagga gatctgcgag ggtgatgggt gcggcggaac ttactccgat aacagatatg    3120
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ccgtgcgcgg aagctgctcc accagctccg gtgtccctgc tcaggtcgaa tctcagtctc    3660
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aactctgccc caagtataac ggactctccg cttcccagaa agtgaagccc aagaagggaa    5340
cagccatcta aggcgcgccg cgcgccagct ccgtgcgaaa gcctgacgca ccggtagatt    5400
cttggtgagc ccgtatcatg acggcggcgg gagctacatg gccccgggtg atttattttt    5460
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ggcctgcttg gtattgcgat gttgtcagct tggcaaattg tggctttcga aaacacaaaa    5580
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ccctcgctgc ttgtgcaata atcgcagtgg ggaagccaca ccgtgactcc catctttcag    5940
taaagctctg ttggtgttta tcagcaatac acgtaattta aactcgttag catggggctg    6000
atagcttaat taccgtttac cagtgccgcg gttctgcagc tttccttggc ccgtaaaatt    6060
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aacaccatcc gctcccccgg gatcaatgag gagaatgagg gggatgcggg gctaaagaag    6180
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gcattctgta aacgggcagc aatcgcccag cagttagtag ggtcccctct acctctcagg    6540
gagatgtaac aacgccacct tatgggacta tcaagctgac gctggcttct gtgcagacaa    6600
actgcgccca cgagttcttc cctgacgccg ctctcgcgca ggcaagggaa ctcgatgaat    6660
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accagcttcg agtcaaggta caccgttgcc cctaagtcgt tagatgtccc tttttgtcag    6780
ctaacatatg ccaccagggc tacgaaacat caatgggcta catctcatgg ctaaacaagt    6840
acgacgaagg ggactcggtt ctgacaacca tgctccgcaa agccggtgcc gtcttctacg    6900
tcaagacctc tgtcccgcag accctgatgg tctgcgagac agtcaacaac atcatcgggc    6960
gcaccgtcaa cccacgcaac aagaactggt cgtgcggcgg cagttctggt ggtgagggtg    7020
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ttacgcactc tgttgagggt gagtccttcg cctcttcctt cttttcctgc tctataccag    7260
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tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac     9780
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tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc    11220
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aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcc                11689
 
<210>2
<211>9375
<212>DNA
<213>木霉属
 
<400>2
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ctcaactcaa tgcccctcac tggcgaggcg agggcaagga tggaggggca gcatcgcctg    120
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<210>3
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<213>木霉属
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ccccttcttc gagtggcaca aagctcttca ttgagatgga ctaacacaat tctagttggc    1800
aaattgtctc ggaagagacg tcgagattgt atcgcgcttg ggtcggtctg cctgcgcgac    1860
ccagacggta cgcgttcaga ctgcccaact tgaatagaga cgagttgtga               1910
 
<210>5
<211>12297
<212>DNA
<213>木霉属
 
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gcgccagctg caggcggccg cctgcagcca cttgcagtcc cgtggaattc tcacggtgaa    120
tgtaggcctt ttgtagggta ggaattgtca ctcaagcacc cccaacctcc attacgcctc    180
ccccatagag ttcccaatca gtgagtcatg gcactgttct caaatagatt ggggagaagt    240
tgacttccgc ccagagctga aggtcgcaca accgcatgat atagggtcgg caacggcaaa    300
aaagcacgtg gctcaccgaa aagcaagatg tttgcgatct aacatccagg aacctggata    360
catccatcat cacgcacgac cactttgatc tgctggtaaa ctcgtattcg ccctaaaccg    420
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aatagtgatc ctgagaaggg gggtttggag caatgtggga ctttgatggt catcaaacaa    660
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gagaatcgag atgtgctgga aagcttctag cgagcggcta aattagcatg aaaggctatg     960
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ccgtcgcagt agcaggcact cattcccgaa aaaactcgga gattcctaag tagcgatgga    1080
accggaataa tataataggc aatacattga gttgcctcga cggttgcaat gcaggggtac    1140
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gggtcgcttg tttgttccgg tgaagtgaaa gaagacagag gtaagaatgt ctgactcgga    1740
gcgttttgca tacaaccaag ggcagtgatg gaagacagtg aaatgttgac attcaaggag    1800
tatttagcca gggatgcttg agtgtatcgt gtaaggaggt ttgtctgccg atacgacgaa    1860
tactgtatag tcacttctga tgaagtggtc catattgaaa tgtaaagtcg gcactgaaca    1920
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<210>8
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<212>DNA
<213>里氏木霉
 
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gcggttgata tatatgtatg tttgactgca ggctgctcag cgacgacagt caagttcgcc    4140
ctcgctgctt gtgcaataat cgcagtgggg aagccacacc gtgactccca tctttcagta    4200
aagctctgtt ggtgtttatc agcaatacac gtaatttaaa ctcgttagca tggggctgat    4260
agcttaatta ccgtttacca gtgccatggt tctgcagctt tccttggccc gtaaaattcg    4320
gcgaagccag ccaatcacca gctaggcacc agctaaaccc tataattagt ctcttatcaa    4380
caccatccgc tcccccggga tcaatgagga gaatgagggg gatgcggggc taaagaagcc    4440
tacataaccc tcatgccaac tcccagttta cactcgtcga gccaacatcc tgactataag    4500
ctaacacaga atgcctcaat cctgggaaga actggccgct gataagcgcg cccgcctcgc    4560
aaaaaccatc cctgatgaat ggaaagtcca gacgctgcct gcggaagaca gcgttattga    4620
tttcccaaag aaatcgggga tcctttcaga ggccgaactg aagatcacag aggcctccgc    4680
tgcagatctt gtgtccaagc tggcggccgg agagttgacc tcggtggaag ttacgctagc    4740
attctgtaaa cgggcagcaa tcgcccagca gttagtaggg tcccctctac ctctcaggga    4800
gatgtaacaa cgccacctta tgggactatc aagctgacgc tggcttctgt gcagacaaac    4860
tgcgcccacg agttcttccc tgacgccgct ctcgcgcagg caagggaact cgatgaatac    4920
tacgcaaagc acaagagacc cgttggtcca ctccatggcc tccccatctc tctcaaagac    4980
cagcttcgag tcaaggtaca ccgttgcccc taagtcgtta gatgtccctt tttgtcagct    5040
aacatatgcc accagggcta cgaaacatca atgggctaca tctcatggct aaacaagtac    5100
gacgaagggg actcggttct gacaaccatg ctccgcaaag ccggtgccgt cttctacgtc    5160
aagacctctg tcccgcagac cctgatggtc tgcgagacag tcaacaacat catcgggcgc    5220
accgtcaacc cacgcaacaa gaactggtcg tgcggcggca gttctggtgg tgagggtgcg    5280
atcgttggga ttcgtggtgg cgtcatcggt gtaggaacgg atatcggtgg ctcgattcga    5340
gtgccggccg cgttcaactt cctgtacggt ctaaggccga gtcatgggcg gctgccgtat    5400
gcaaagatgg cgaacagcat ggagggtcag gagacggtgc acagcgttgt cgggccgatt    5460
acgcactctg ttgagggtga gtccttcgcc tcttccttct tttcctgctc tataccaggc    5520
ctccactgtc ctcctttctt gctttttata ctatatacga gaccggcagt cactgatgaa    5580
gtatgttaga cctccgcctc ttcaccaaat ccgtcctcgg tcaggagcca tggaaatacg    5640
actccaaggt catccccatg ccctggcgcc agtccgagtc ggacattatt gcctccaaga    5700
tcaagaacgg cgggctcaat atcggctact acaacttcga cggcaatgtc cttccacacc    5760
ctcctatcct gcgcggcgtg gaaaccaccg tcgccgcact cgccaaagcc ggtcacaccg    5820
tgaccccgtg gacgccatac aagcacgatt tcggccacga tctcatctcc catatctacg    5880
cggctgacgg cagcgccgac gtaatgcgcg atatcagtgc atccggcgag ccggcgattc    5940
caaatatcaa agacctactg aacccgaaca tcaaagctgt taacatgaac gagctctggg    6000
acacgcatct ccagaagtgg aattaccaga tggagtacct tgagaaatgg cgggaggctg    6060
aagaaaaggc cgggaaggaa ctggacgcca tcatcgcgcc gattacgcct accgctgcgg    6120
tacggcatga ccagttccgg tactatgggt atgcctctgt gatcaacctg ctggatttca    6180
cgagcgtggt tgttccggtt acctttgcgg ataagaacat cgataagaag aatgagagtt    6240
tcaaggcggt tagtgagctt gatgccctcg tgcaggaaga gtatgatccg gaggcgtacc    6300
atggggcacc ggttgcagtg caggttatcg gacggagact cagtgaagag aggacgttgg    6360
cgattgcaga ggaagtgggg aagttgctgg gaaatgtggt gactccatag ctaataagtg    6420
tcagatagca atttgcacaa gaaatcaata ccagcaactg taaataagcg ctgaagtgac    6480
catgccatgc tacgaaagag cagaaaaaaa cctgccgtag aaccgaagag atatgacacg    6540
cttccatctc tcaaaggaag aatcccttca gggttgcgtt tccagtctag acacgtataa    6600
cggcacaagt gtctctcacc aaatgggtta tatctcaaat gtgatctaag gatggaaagc    6660
ccagaatatc gatcgcgcgc agatccatat atagggcccg ggttataatt acctcaggtc    6720
gacgtcccat ggccattcga attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg    6780
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg    6840
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc    6900
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt    6960
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct    7020
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga    7080
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc    7140
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg    7200
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg    7260
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt    7320
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt    7380
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg    7440
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact    7500
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt    7560
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct    7620
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac    7680
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc    7740
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg    7800
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta    7860
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca    7920
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc    7980
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc    8040
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc    8100
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat    8160
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt    8220
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc    8280
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag    8340
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt    8400
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac    8460
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg    8520
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat    8580
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc    8640
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc    8700
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa    8760
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg    8820
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg    8880
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac    8940
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga    9000
aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg    9060
gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa    9120
ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat aaaattgtaa acgttaatat    9180
tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga    9240
aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagcccgag atagggttga gtgttgttcc    9300
agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac    9360
cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc aaatcaagtt ttttggggtc    9420
gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg    9480
gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag    9540
ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc    9600
gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgtatgc ggtgtgaaat accgcacaga    9660
tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg    9720
gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct    9780
gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg    9840
gccagtgccc aagcttacta gtacttctcg agctctgtac atgtccggtc gcgacgtacg    9900
cgtatcgatg gcgccagctg caggcggccg c                                   9931
 
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>里氏木霉
<400>9
ctgcagccac ttgcagtccc                                                 20
 
<210>10
<211>2221
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(166)..(166)
<223>n是a、c、g或t
 
<400>10
aagcttagcc aagaacaata gccgataaag atagcctcat taaacggaat gagctagtag     60
gcaaagtcag cgaatgtgta tatataaagg ttcgaggtcc gtgcctccct catgctctcc    120
ccatctactc atcaactcag atcctccagg agacttgtac accatntttt gaggcacaga    180
aacccaatag tcaaccgcgg actggcatca tgtatcggaa gttggccgtc atctcggcct    240
tcttggccac agctcgtgct cagtcggcct gcactctcca atcggagact cacccgcctc    300
tgacatggca gaaatgctcg tctggtggca cttgcactca acagacaggc tccgtggtca    360
tcgacgccaa ctggcgctgg actcacgcta cgaacagcag cacgaactgc tacgatggca    420
acacttggag ctcgacccta tgtcctgaca acgagacctg cgcgaagaac tgctgtctgg    480
acggtgccgc ctacgcgtcc acgtacggag ttaccacgag cggtaacagc ctctccattg    540
gctttgtcac ccagtctgcg cagaagaacg ttggcgctcg cctttacctt atggcgagcg    600
acacgaccta ccaggaattc accctgcttg gcaacgagtt ctctttcgat gttgatgttt    660
cgcagctgcc gtaagtgact taccatgaac ccctgacgta tcttcttgtg ggctcccagc    720
tgactggcca atttaaggtg cggcttgaac ggagctctct acttcgtgtc catggacgcg    780
gatggtggcg tgagcaagta tcccaccaac accgctggcg ccaagtacgg cacggggtac    840
tgtgacagcc agtgtccccg cgatctgaag ttcatcaatg gccaggccaa cgttgagggc    900
tgggagccgt catccaacaa cgcaaacacg ggcattggag gacacggaag ctgctgctct    960
gagatggata tctgggaggc caactccatc tccgaggctc ttacccccca cccttgcacg   1020
actgtcggcc aggagatctg cgagggtgat gggtgcggcg gaacttactc cgataacaga   1080
tatggcggca cttgcgatcc cgatggctgc gactggaacc cataccgcct gggcaacacc   1140
agcttctacg gccctggctc aagctttacc ctcgatacca ccaagaaatt gaccgttgtc   1200
acccagttcg agacgtcggg tgccatcaac cgatactatg tccagaatgg cgtcactttc    1260
cagcagccca acgccgagct tggtagttac tctggcaacg agctcaacga tgattactgc    1320
acagctgagg aggcagaatt cggcggatcc tctttctcag acaagggcgg cctgactcag    1380
ttcaagaagg ctacctctgg cggcatggtt ctggtcatga gtctgtggga tgatgtgagt    1440
ttgatggaca aacatgcgcg ttgacaaaga gtcaagcagc tgactgagat gttacagtac    1500
tacgccaaca tgctgtggct ggactccacc tacccgacaa acgagacctc ctccacaccc    1560
ggtgccgtgc gcggaagctg ctccaccagc tccggtgtcc ctgctcaggt cgaatctcag    1620
tctcccaacg ccaaggtcac cttctccaac atcaagttcg gacccattgg cagcaccggc    1680
aaccctagcg gcggcaaccc tcccggcgga aaccgtggca ccaccaccac ccgccgccca    1740
gccactacca ctggaagctc tcccggacct acccagtctc actacggcca gtgcggcggt    1800
attggctaca gcggccccac ggtctgcgcc agcggcacaa cttgccaggt cctgaaccct    1860
tactactctc agtgcctgta aagctccgtg cgaaagcctg acgcaccggt agattcttgg    1920
tgagcccgta tcatgacggc ggcgggagct acatggcccc gggtgattta ttttttttgt    1980
atctacttct gacccttttc aaatatacgg tcaactcatc tttcactgga gatgcggcct    2040
gcttggtatt gcgatgttgt cagcttggca aattgtggct ttcgaaaaca caaaacgatt    2100
ccttagtagc catgcatttt aagataacgg aatagaagaa agaggaaatt aaaaaaaaaa    2160
aaaaaacaaa catcccgttc ataacccgta gaatcgccgc tcttcgtgta tcccagtacc    2220
a                                                                    2221
 
<210>11
<211>51
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>11
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc t              51
 
<210>12
<211>1438
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>12
cagtcggcct gcactctcca atcggagact cacccgcctc tgacatggca gaaatgctcg     60
tctggtggca cttgcactca acagacaggc tccgtggtca tcgacgccaa ctggcgctgg    120
actcacgcta cgaacagcag cacgaactgc tacgatggca acacttggag ctcgacccta    180
tgtcctgaca acgagacctg cgcgaagaac tgctgtctgg acggtgccgc ctacgcgtcc    240
acgtacggag ttaccacgag cggtaacagc ctctccattg gctttgtcac ccagtctgcg    300
cagaagaacg ttggcgctcg cctttacctt atggcgagcg acacgaccta ccaggaattc    360
accctgcttg gcaacgagtt ctctttcgat gttgatgttt cgcagctgcc gtaagtgact    420
taccatgaac ccctgacgta tcttcttgtg ggctcccagc tgactggcca atttaaggtg    480
cggcttgaac ggagctctct acttcgtgtc catggacgcg gatggtggcg tgagcaagta    540
tcccaccaac accgctggcg ccaagtacgg cacggggtac tgtgacagcc agtgtccccg    600
cgatctgaag ttcatcaatg gccaggccaa cgttgagggc tgggagccgt catccaacaa    660
cgcaaacacg ggcattggag gacacggaag ctgctgctct gagatggata tctgggaggc    720
caactccatc tccgaggctc ttacccccca cccttgcacg actgtcggcc aggagatctg    780
cgagggtgat gggtgcggcg gaacttactc cgataacaga tatggcggca cttgcgatcc    840
cgatggctgc gactggaacc cataccgcct gggcaacacc agcttctacg gccctggctc    900
aagctttacc ctcgatacca ccaagaaatt gaccgttgtc acccagttcg agacgtcggg    960
tgccatcaac cgatactatg tccagaatgg cgtcactttc cagcagccca acgccgagct   1020
tggtagttac tctggcaacg agctcaacga tgattactgc acagctgagg aggcagaatt   1080
cggcggatcc tctttctcag acaagggcgg cctgactcag ttcaagaagg ctacctctgg   1140
cggcatggtt ctggtcatga gtctgtggga tgatgtgagt ttgatggaca aacatgcgcg   1200
ttgacaaaga gtcaagcagc tgactgagat gttacagtac tacgccaaca tgctgtggct   1260
ggactccacc tacccgacaa acgagacctc ctccacaccc ggtgccgtgc gcggaagctg   1320
ctccaccagc tccggtgtcc ctgctcaggt cgaatctcag tctcccaacg ccaaggtcac   1380
cttctccaac atcaagttcg gacccattgg cagcaccggc aaccctagcg gcggcaac     1438
 
<210>13
<211>72
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>13
cctcccggcg gaaaccgtgg caccaccacc acccgccgcc cagccactac cactggaagc    60
tctcccggac ct                                                        72
 
<210>14
<211>513
<212>PRT
<213>木霉属
 
<400>14
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
            20                  25                  30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
        35                  40                  45
Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
    50                  55                  60
Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp
65                  70                  75                  80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
                85                  90                  95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
            100                 105                 110
Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
        115                 120                 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
    130                 135                 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
                165                 170                 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
            180                 185                 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
        195                 200                 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
    210                 215                 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225                 230                 235                 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
                245                 250                 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
            260                 265                 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
        275                 280                 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
    290                 295                 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
                325                 330                 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
            340                 345                 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
        355                 360                 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
    370                 375                 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385                 390                 395                 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
                405                 410                 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
            420                 425                 430
Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asn
        435                 440                 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr
    450                 455                 460
Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser
465                 470                 475                 480
His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys
                485                 490                 495
Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys
            500                 505                 510
Leu
 
<210>15
<211>2267
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>15
atggctcgtt cacggagctc cctggccctc gggctgggcc tgctctgctg gatcacgctg     60
ctcttcgctc ctctggcgtt tgtcggaaag gccaatgccg cgagcgacga cgcggacaac    120
tacggcactg ttatcggaat tgtaagtcga ctgacggcag caaccccgcc attttcttgg    180
tgttgatgct caggcagccc tgctaacacg cttctcctcc gcccaggatc tcggaactac    240
ctacagctgc gtcggtgtga tgcagaaggg caaggttgag attctcgtca acgaccaggg    300
taaccgaatc actccctcct acgtggcctt taccgacgag gagcgtctgg ttggcgattc    360
cgccaagaac caggccgccg ccaaccccac caacaccgtc tacgatgtca agtcagttct    420
accgccctgt tggcttctat tgtataagtg gacaattagc taactgttgt cacaggcgat    480
tgattggccg caaattcgac gagaaggaga tccaggccga catcaagcac ttcccctaca    540
aggtcattga gaagaacggc aagcccgtcg tccaggtcca ggtcaacggc cagaagaagc    600
agttcactcc cgaggagatt tctgccatga ttcttggcaa gatgaaggag gttgccgagt    660
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gaccagcgca ttatcaacta cctggccaag gcctacaaca agaagaacaa cgtcgacatc    1080
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gacgtcgagg agtccaaggc agtcccggag cttcccacct ttactgtgag tttgccctct     120
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accctcattg tccaccccaa caacaccttc tccatcaagc agaacggtgt cgagaccaag     900
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<210>17
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<212>DNA
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atgaagtcgg cgagcaaatt gttctttctc tccgtgtttt ccctatgggc gacgccgggc      60
gcatgctcaa gctcgtcaag tacatgcact gtacgtcaac ccaaccttgg cctcgtttcc     120
cctttggaag aatgctttgc gctgacagat tttgttgatc tagttctccc caaacgccat     180
cattgacgat ggatgcgttt cgtatgcgac tctcgataga ctcaatgtca aggtgaagcc     240
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caacaaaaaa tgccccttct ggaacgacga agatggcatg tgcggtaaca ttgcctgcgc     360
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tttccgcaat cgcttccgca acatcagccg ggtcatggac tgcgtcggct gcgacaagtg    1320
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<210>18
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aggccgatcc ttggtctatt acttctccaa caatgaagca gaccgcgaag catacgtcaa    1140
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<400>20
atgcggctaa catccttctt ctctggcctg gccgcctttg gccttctgtc atctccagca     60
ctggcagatg atgaagctga caacgtcccc gcgcccacat acttcgattc cgtcatggtg    120
cctcccttga cagaactaac gccagacaac ttcgaaaagg aggcaagcaa aaccaagtgg    180
cttcttgtga agcactacag gtactaagcc cttcagccat atcacaccac tccccgtctg    240
attcaagctg acgcgtagcc gctgtctagt ccatactgcc accattgtat cagctacgcc    300
ccgaccttcc agacaaccta cgaattctac tacacatcca agccagaagg agctggcgac    360
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ggcgacaaag agcgccccaa atctgagccc gagacagcat cgaggagcgc aaccgaggag    660
aagaagccca agaagccggt tgccacgccg aacgaagacg gagtgtcagt ttccttgacg    720
gccgaaaact tccagcgcct ggtgactatg actcaggatc cctggttcat caagttttac    780
gcgccgtggt gcccccattg ccaagacatg gcgcctacct gggagcagct ggcgaagaac    840
atgaagggca agctcaacat tggagaggtc aactgtgaca aggagtcgcg attgtgcaaa    900
gacgttggtg cgcgggcgtt tcccactatc ctgttcttca agggtggaga gcgctcagag    960
tacgaggggc tccgaggcct gggcgacttt atcaaatatg ccgaaaacgc cgtcgacctc   1020
gctagcggag tgcctgacgt ggacttggca gcattcaagg ctctcgagca gaaggaagac   1080
gtcatctttg tctactttta cgaccacgcc accacatcgg aggacttcaa tgccctcgag    1140
aggctgcccc tgagtctcat cggacatgcc aaactggtta agactaagga tccggccatg    1200
tacgagcgct tcaagatcac gacatggccc agattcatgg tttcgaggga gggtcgccct    1260
acgtactacc ctcccctcac ccctaacgcg atgagagata cccaccaagt tctggactgg    1320
atgaggtcgg tttggcttcc ccttgtcccc gaactgttgg ttaccaacgc ccgccagatc    1380
atggacaaca aaattgttgt gctcggcgtc ctgaatcgag aagaccagga atccttccag    1440
agtgctcttc gggagatgaa gagcgcagcc aacgagtgga tggacaggca aatccaagag    1500
ttccagttgg agcggaagaa gctgcgagac gcgaagcaaa tgaggatcga ggaagctgag    1560
gaccgagacg atgagcgcgc cctgcgggcc gccaaggcga tccatattga catgaacaat    1620
tccggacgga gagaagtggc ctttgcgtgg gttgatggcg tagcgtggca gcgctggatt    1680
cgaaccacgt atggcattga tgttaaggac ggagaaagag tcattatcaa cgaccaagat    1740
gtaagcctca agctcacccc catttgtcct ccctctacaa tattgctttg cgtttcgaac    1800
atgaacgact aacaaaaaca tttgaacaga gccgcaagta ctgggacagc accgtgacgg    1860
gcaactacat cctcgtcagc cgcacgtcca tcctggagac gctcgacaag gtcgtctaca    1920
ccccgcaggc cctcaagccc aagctcacca tttcctcttt cgagaagatc tttttcgaca    1980
tccgcgtctc cttcaccgag cacccctacc tgaccctggg ctgcatcgtt ggcatcgcct    2040
ttggagcctt ctcctggctg cgtggccgct ctcgccgtgg acgcggccac ttccggctcg    2100
aggattccat cagcattaga gatttcaagg acgggttcct tggtggatct aacggcaaca    2160
ccaaggccga ctga                                                      2174
 
<210>21
<211>1578
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>21
atgcatcagc aaaccctcct cgccaccctc gcggcgagtc tcgctgctct tccttttgct     60
caggcgggct tctattcgaa gagctctccc gtgctgcaag tagacgccaa gtcgtacgac    120
cgcctcatca caaagtcgaa tcatacctct gtaagtatcc gtcctcacac actcacctca    180
ctcacaacgc gacatcatat ctcatacaca tccaccccaa accaccacaa acacaagaca    240
tatatcaagc tcaaacacat acacatacat acaaacacat acacacacag atacatacac    300
aactctcata tatatgaacc attcattgac atttccccca agattgtcga attctacgcc    360
ccctggtgcg gccactgcca aaacctcaag cccgcctacg aaaaggccgc ccgcaccctc    420
gacggcctgg ccaaggtcgc cgccgtcgac tgcgacgacg acgccaacaa ggccctctgc    480
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ggccgccccg tcgtcgagga ctaccagggc cagcgcaccg cgggcgccat tgccgacgcc    600
gtcgtcgcca agatcaacaa ccacgtcgtc aagctgacgg acaaggacat tgatgccttt    660
ctggaaaagg acggcgacaa gccaaaggcc atcttgttca cggaaaaggg aactacgagt    720
gcgctgctga ggagccttgc tattgatttt ctcgacgccg tgaccattgg ccaggtccgc    780
aacaaggaaa aggctgccgt cgacaggttc ggcatctctt cgttcccttc cttcgtcctc    840
atccccggag gcggcaagga gcccgtcgtc tacagcggcg agctcaacaa gaaggacatg    900
gtcgagttcc tcaagcaggt cgccgagccc aaccccgacc cggccccctc aaacggcaag    960
tccggcaaga aggcctccac caaggacaag gccagcagca aggaggcccc ccaaaaggcc   1020
gccgccgccg acgagtcttc gtccgccgca tcctccgaga cctcaacggc cgccgcgccg   1080
gagtcgaccc tcatcgacat ccccgccctg acttccaagg cagagctcga ggagcactgt   1140
ctccaaccaa agtcccaaac ctgcgtcctc gcctttgtgc ccgcgtccgc ctcggagatg   1200
cgcaacaaga tcctttctgc cgtctcccag ctgcacacca agtacgtcca cggaaagcgc   1260
cacttcccct tcttctctgt cgacagcgac gtcgaaggct ctgccgccct caaggaagcc   1320
ctcggcctct cgggcaagat tgagctcgtt gccctcaacg cccgccgggg gtggtggagg   1380
cgatacgagg acggtgagtt cagcgttcac agcgtcgagt cctggattga cgccgttcgc   1440
atgggcgagg gcgagaagaa gaagcttccc gagggagtcg tcgtcgagaa ggcggagccg   1500
gcggaggaag caaagtctga gactgaagct gccgcagctg atgaggccac tgagaagcct   1560
gagcacgatg agctctaa                                                 1578
 
<210>22
<211>1167
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>22
atggtcttga tcaagagcct cgtgctcgcc gtcctggcca gctcggtggc tgccaagtcg     60
gccgtcatcg acctgattcc gtccaacttt gacaagcttg tcttctccgg aaagcccacg    120
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agcgtggtga tgctgaacac taggaccttc cacgacactg ttggaggcga caagaatgtc    480
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cttgattctc gcatatttac ctcttgacca gactgcaaga acctcgcccc cacttgggaa    600
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ttcttccccg ctggcaccaa gaagcaggtt gactaccaag gcggccgatc ggagggtgac    780
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<210>23
<211>1705
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>23
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gagtcggatg tcaagtcctt gaccaaggac accttcaacg acttcatcaa ctccaatgac    120
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cccgctaaca gctgcaatct tccagtcttc gctccctggt gcggccactg caaggctctc    300
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gggtaagctt tgaattgcac tgttctttgc atcaatccat tcattcgcta acgttggttg    540
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<210>24
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<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>24
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<210>25
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<212>DNA
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<400>25
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<210>26
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atgatactgc gcgcggcaat cttcgtcttg ctggcgctgg tatcgctggc ggtttgcgcc     60
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<400>27
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<210>28
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<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>28
atggtgatgc tggtggcgat cgcgctcgca tggctgggat gctcgctgct gcggccggta     60
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ccaagaagag ccgagacgtc gcagtctaca cctactacga tgaaagcttc acaaactctt    1980
gtccggcccc tcggccgcct tcagagcatc acctgatagg ctcggccacg gcggccaggc    2040
cagacttgtt ctccgtctct cgcttcacag acctgtacag aacgcccaac gtacacgggc    2100
ccctggagaa ggtggagatg cgagacaaga agaagggccg ggtggttcga tacagggcca    2160
cctcaaacca caccatcttc ccctggactc ttcccccagc catgctgccg gagaatggca    2220
cctgcgctgc tcccccggaa cgcatcatat ccttgattga gttcccggcc aacgacatca    2280
ccagtggaat cacgtcgcgg ttcggcaacc atctatcgtg gcagacgcat ctggggccaa    2340
cggtcaacat tctagaggga ctgaggctcc agctcgagca ggtgtcggac cctgccacgg    2400
gagaagacaa gtggaggatc acacacattg gcaacacgca gctggggcgc cacgagacag    2460
tcttcttcca cgcggaacac gtaaggcatc tcaaggacga ggtgttttcc tgccgcagaa    2520
ggagggacgc cgtggaaatc gagctcctgg tcgacaagcc gagcgatacc aacaacaaca    2580
acacgcttgc ctcgtccgat gacgatgtag tggtagatgc aaaagcagaa gagcaagacg    2640
gcatgctagc cgacgacgac ggcgacacac tcaacgcaga aacactctcc tccaactccc    2700
tcttccagtc cctcctccgc gccgtctcct ccgtcttcga gcccgtctac accgccatcc    2760
ccgagtccga ccccagcgcc ggcaccgcca aggtctacag tttcgacgcc tacacgtcca    2820
ccggccccgg cgcgtacccc atgccgtcca tctcggacac gcccatcccc ggcaacccct    2880
tttacaactt ccgcaacccg gcctccaact tcccctggtc gaccgtcttc ctcgccggcc    2940
aggcctgcga gggcccgctc cccgcgtccg cgccgcgcga gcaccaggtc attgtcatgc    3000
tccgcggcgg ctgctccttc agccgcaagc tggacaacat ccccagcttc tcgccccacg    3060
acagggcgct gcagctcgtc gttgtcctcg acgaaccgcc gccgccgccg ccgccgccgc    3120
cagccagtca gaacagcggc ggcgatgacg acgatgaaga tgacgaagac gaccacgacg    3180
ccgtcaacga caacgaagac gacaggcgcg acgtgacgcg gccactgctc gacacggagc    3240
agaccacgcc caagggcatg aagcgcctgc acggcatccc aatggtcctc gtccgagccg    3300
cgcggggcga ctacgagctt ttcgggcatg ccattggcgt gggcatgagg cgcaagtatc    3360
gggttgaaag ccaggggctt gtcgtggaga atgcggttgt gctgtga                  3407
 
<210>29
<211>1221
<212>DNA
<213>里氏木霉
 
<400>29
atgaggcctc tggcactcat atttgccctc atcttgggcc tattgctctg cttagcagcc     60
ccagcaacgg catcgtcatc atcatcacaa cactctcccc aagcggcatc agacgagtca    120
gatttaatat gtcacacatc aaacccagac gaatgctatc cccgggtctt cgtaccaacg    180
catgagttcc agccagtcca cgacgaccag caactcccaa acggcctcca tgtccgtctc    240
aacatctgga ccggccaaaa ggaagccaag atcaacgtcc ccgatgaggc caaccctgat    300
ctcgatggcc tgcccgtcga ccaagccgtg gttctcgtcg accaggagca gccagaaatt    360
atccagatcc ccaagggcgc accaaaatac gacaatgtcg gcaagatcaa ggaacccgcg    420
caagaaggag acgcccaaac ggaagccatt gcttttgcag agacgttcaa catgctcaag    480
accggcaagt cgccaagcgc cgaggagttc gacaacggac tggaaggcct ggaggagctc    540
tcccacgaca tctactacgg gctcaaaatc acagaggacg cggacgtggt caaggcgcta    600
ttctgcttga tgggggctcg cgacggcgac gcctcggagg gagccacgcc gcgcgaccag    660
caagcggccg cgatcctcgc cggcgccctg tccaacaatc cgtcggcact cgccgagata    720
gccaagatct ggcctgagct tctggactcg tcgtgtcctc gcgacggcgc caccatctct    780
gaccgtttct accaagacac cgtctccgtt gccgactctc cggcaaaggt caaggccgcc    840
gtctcggcca tcaacggcct gatcaaggac ggcgccatcc gaaagcagtt tctcgaaaac    900
agcggcatga agcagctcct ctcggtcctg tgccaagaga agccggagtg ggcgggagcg    960
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gcgctcgatg acggatgctg ggactatcat gcggacagga tggtgaagct gcatgggacg   1140
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ccggatcatg gcgagctgta g                                             1221
 
<210>30
<211>648
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>30
Met Ala Arg Ser Arg Ser Ser Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Leu Cys
1               5                   10                  15
Trp Ile Thr Leu Leu Phe Ala Pro Leu Ala Phe Val Gly Lys Ala Asn
            20                  25                  30
Ala Ala Ser Asp Asp Ala Asp Asn Tyr Gly Thr Val Ile Gly Ile Asp
        35                  40                  45
Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Met Gln Lys Gly Lys Val
    50                  55                  60
Glu Ile Leu Val Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val
65                  70                  75                  80
Ala Phe Thr Asp Glu Glu Arg Leu Val Gly Asp Ser Ala Lys Asn Gln
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Asn Pro Thr Asn Thr Val Tyr Asp Val Lys Arg Leu Ile
            100                 105                 110
Gly Arg Lys Phe Asp Glu Lys Glu Ile Gln Ala Asp Ile Lys His Phe
        115                 120                 125
Pro Tyr Lys Val Ile Glu Lys Asn Gly Lys Pro Val Val Gln Val Gln
    130                 135                 140
Val Asn Gly Gln Lys Lys Gln Phe Thr Pro Glu Glu Ile Ser Ala Met
145                 150                 155                 160
Ile Leu Gly Lys Met Lys Glu Val Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Lys Lys
                165                 170                 175
Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Asn Gln
            180                 185                 190
Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu
        195                 200                 205
Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp
    210                 215                 220
Lys Thr Asp Gly Glu Arg Gln Ile Ile Val Tyr Asp Leu Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Gly Val Phe Glu Val
                245                 250                 255
Leu Ala Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Gln
            260                 265                 270
Arg Ile Ile Asn Tyr Leu Ala Lys Ala Tyr Asn Lys Lys Asn Asn Val
        275                 280                 285
Asp Ile Ser Lys Asp Leu Lys Ala Met Gly Lys Leu Lys Arg Glu Ala
    290                 295                 300
Glu Lys Ala Lys Arg Thr Leu Ser Ser Gln Met Ser Thr Arg Ile Glu
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ala Phe Phe Glu Gly Asn Asp Phe Ser Glu Thr Leu Thr Arg
                325                 330                 335
Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Lys Lys Thr Leu Lys
            340                 345                 350
Pro Val Glu Gln Val Leu Lys Asp Ala Asn Val Lys Lys Ser Glu Val
        355                 360                 365
Asp Asp Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln
    370                 375                 380
Ser Leu Ile Glu Glu Tyr Phe Asn Gly Lys Lys Ala Ser Lys Gly Ile
385                 390                 395                 400
Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Phe Gly Ala Ala Val Gln Ala Gly Val
                405                 410                 415
Leu Ser Gly Glu Glu Gly Thr Asp Asp Ile Val Leu Met Asp Val Asn
            420                 425                 430
Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Thr Gly Gly Val Met Thr Lys Leu
        435                 440                 445
Ile Pro Arg Asn Thr Pro Ile Pro Thr Arg Lys Ser Gln Ile Phe Ser
    450                 455                 460
Thr Ala Ala Asp Asn Gln Pro Val Val Leu Ile Gln Val Phe Glu Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Ser Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu
                485                 490                 495
Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Ser
            500                 505                 510
Gly Thr Gly Lys Gln Glu Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg
        515                 520                 525
Leu Thr Gln Glu Glu Ile Asp Arg Met Val Ala Glu Ala Glu Lys Phe
    530                 535                 540
Ala Glu Glu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Arg Ile Glu Ala Arg Asn Gly
545                 550                 555                 560
Leu Glu Asn Tyr Ala Phe Ser Leu Lys Asn Gln Val Asn Asp Glu Glu
                565                 570                 575
Gly Leu Gly Gly Lys Ile Asp Glu Glu Asp Lys Glu Thr Ile Leu Asp
            580                 585                 590
Ala Val Lys Glu Ala Thr Glu Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ala Asp Ala
        595                 600                 605
Thr Thr Glu Asp Phe Glu Glu Gln Lys Glu Lys Leu Ser Asn Val Ala
    610                 615                 620
Tyr Pro Ile Thr Ser Lys Met Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Ser Glu Asp
625                 630                 635                 640
Asp Gly Asp Phe His Asp Glu Leu
                645
 
<210>31
<211>558
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>31
Met Lys Phe Asn Thr Val Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Gly Val
1               5                   10                  15
Ala Tyr Ala Glu Asp Val Glu Glu Ser Lys Ala Val Pro Glu Leu Pro
            20                  25                  30
Thr Phe Thr Pro Thr Ser Ile Lys Ala Asp Phe Leu Glu Gln Phe Thr
        35                  40                  45
Asp Asp Trp Glu Ser Arg Trp Lys Pro Ser His Ala Lys Lys Asp Thr
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Asp Lys Asp Ala Glu Glu Glu Trp Ala Tyr Val Gly Glu
65                  70                  75                  80
Trp Ala Val Glu Glu Pro Tyr Gln Tyr Lys Gly Ile Asn Gly Asp Lys
                85                  90                  95
Gly Leu Val Val Lys Asn Pro Ala Ala His His Ala Ile Ser Ala Lys
            100                 105                 110
Phe Pro Lys Lys Ile Asp Asn Lys Gly Lys Thr Leu Val Val Gln Tyr
        115                 120                 125
Glu Val Lys Leu Gln Lys Gly Leu Asp Cys Gly Gly Ala Tyr Met Lys
    130                 135                 140
Leu Leu Arg Asp Asn Lys Ala Leu His Gln Asp Glu Phe Ser Asn Thr
145                 150                 155                 160
Thr Pro Tyr Val Ile Met Phe Gly Pro Asp Lys Cys Gly His Asn Asn
                165                 170                 175
Arg Val His Phe Ile Val Asn His Lys Asn Pro Lys Thr Gly Glu Tyr
            180                 185                 190
Glu Glu Lys His Leu Asn Ser Ala Pro Ala Val Asn Ile Val Lys Thr
        195                 200                 205
Thr Glu Leu Tyr Thr Leu Ile Val His Pro Asn Asn Thr Phe Ser Ile
    210                 215                 220
Lys Gln Asn Gly Val Glu Thr Lys Ala Gly Ser Leu Leu Glu Asp Leu
225                 230                 235                 240
Ser Pro Pro Ile Asn Pro Pro Lys Glu Ile Asp Asp Pro Lys Asp Ser
                245                 250                 255
Lys Pro Asp Asp Trp Val Asp Glu Ala Arg Ile Pro Asp Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Val Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Asp Ala Pro Phe Glu Ile Val Asp
        275                 280                 285
Glu Glu Ala Val Lys Pro Glu Asp Trp Leu Glu Asp Glu Pro Thr Thr
    290                 295                 300
Ile Pro Asp Pro Glu Ala Gln Lys Pro Glu Asp Trp Asp Asp Glu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Gly Asp Trp Ile Pro Pro Thr Val Pro Asn Pro Lys Cys Glu Asp
                325                 330                 335
Val Ser Gly Cys Gly Pro Trp Thr Lys Pro Met Val Arg Asn Pro Asn
            340                 345                 350
Tyr Lys Gly Lys Trp Thr Ala Pro Tyr Ile Asp Asn Pro Ala Tyr Lys
        355                 360                 365
Gly Val Trp Ala Pro Arg Lys Ile Lys Asn Pro Asp Tyr Phe Glu Asp
    370                 375                 380
Lys Thr Pro Ala Asn Phe Glu Pro Met Gly Ala Ile Gly Phe Glu Ile
385                 390                 395                 400
Trp Thr Met Thr Asn Asp Ile Leu Phe Asp Asn Ile Tyr Ile Gly His
                405                 410                 415
Ser Ile Glu Asp Ala Glu Lys Leu Ala Asn Glu Thr Phe Phe Val Lys
            420                 425                 430
His Pro Ile Glu Lys Ala Leu Ala Glu Ala Asp Glu Pro Lys Phe Asp
        435                 440                 445
Asp Thr Pro Lys Ser Pro Ser Asp Leu Lys Phe Leu Asp Asp Pro Val
    450                 455                 460
Thr Phe Val Lys Glu Lys Leu Asp Leu Phe Leu Thr Ile Ala Gln Arg
465                 470                 475                 480
Asp Pro Val Glu Ala Ile Lys Phe Val Pro Glu Val Ala Gly Gly Ile
                485                 490                 495
Ala Ala Val Phe Val Thr Leu Ile Ala Ile Ile Val Gly Leu Val Gly
            500                 505                 510
Leu Gly Ser Ser Ser Ala Ala Pro Lys Lys Ala Ala Ala Thr Ala Lys
        515                 520                 525
Glu Lys Ala Lys Asp Val Ser Glu Ala Val Ala Ser Gly Ala Asp Lys
    530                 535                 540
Val Lys Gly Glu Val Thr Lys Arg Thr Thr Arg Ser Gln Ser
545                 550                 555
 
<210>32
<211>585
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>32
Met Lys Ser Ala Ser Lys Leu Phe Phe Leu Ser Val Phe Ser Leu Trp
1               5                    10                  15
Ala Thr Pro Gly Ala Cys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Cys Thr Phe Ser
            20                  25                  30
Pro Asn Ala Ile Ile Asp Asp Gly Cys Val Ser Tyr Ala Thr Leu Asp
        35                  40                  45
Arg Leu Asn Val Lys Val Lys Pro Ala Ile Asp Glu Leu Val Gln Thr
    50                  55                  60
Thr Asp Phe Phe Ser His Tyr Arg Leu Asn Leu Phe Asn Lys Lys Cys
65                  70                  75                  80
Pro Phe Trp Asn Asp Glu Asp Gly Met Cys Gly Asn Ile Ala Cys Ala
                85                  90                  95
Val Glu Thr Leu Asp Asn Glu Glu Asp Ile Pro Glu Ile Trp Arg Ala
            100                 105                 110
His Glu Leu Ser Lys Leu Glu Gly Pro Arg Ala Lys His Pro Gly Lys
        115                 120                 125
Gln Glu Gln Arg Gln Asn Pro Glu Arg Pro Leu Gln Gly Glu Leu Gly
    130                 135                 140
Glu Asp Val Gly Glu Ser Cys Val Val Glu Tyr Asp Asp Glu Cys Asp
145                 150                 155                 160
Asp Arg Asp Tyr Cys Val Trp Asp Asp Glu Gly Ala Thr Ser Lys Gly
                165                 170                 175
Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Arg Asn Pro Glu Arg Phe Thr Gly Tyr Gly
            180                 185                 190
Gly Gln Ser Ala Lys Gln Val Trp Asp Ala Ile Tyr Ser Glu Asn Cys
        195                 200                 205
Phe Lys Lys Ser Ser Phe Pro Lys Ser Ala Asp Leu Gly Val Ser His
    210                 215                 220
Arg Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Asp Phe Lys Gln Val Leu Asp Thr
225                 230                 235                 240
Ala Gly Arg Gln Ala Gln Leu Glu Gln Gln Arg Gln Ser Asn Pro Asn
                245                 250                 255
Ile Pro Phe Val Ala Asn Thr Gly Tyr Glu Val Asp Asp Glu Cys Leu
            260                 265                 270
Glu Lys Arg Val Phe Tyr Arg Val Val Ser Gly Met His Ala Ser Ile
        275                 280                 285
Ser Val His Leu Cys Trp Asp Phe Leu Asn Gln Ser Thr Gly Gln Trp
    290                 295                 300
Gln Pro Asn Leu Asp Cys Tyr Glu Ser Arg Leu His Lys Phe Pro Asp
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Arg Ile Ser Asn Leu Tyr Phe Asn Tyr Ala Leu Val Thr Arg Ala Ile
                325                 330                 335
Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Val Leu Ser Pro Gln Tyr Thr Phe Cys Thr
            340                 345                 350
Gly Asp Pro Leu Gln Asp Gln Glu Thr Arg Asp Lys Ile Ala Ala Val
        355                 360                 365
Thr Lys His Ala Ala Ser Val Pro Gln Ile Phe Asp Glu Gly Val Met
    370                 375                 380
Phe Val Asn Gly Glu Gly Pro Ser Leu Lys Glu Asp Phe Arg Asn Arg
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Phe Arg Asn Ile Ser Arg Val Met Asp Cys Val Gly Cys Asp Lys Cys
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Arg Leu Trp Gly Lys Ile Gln Thr Ser Gly Tyr Gly Thr Ala Leu Lys
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Thr Glu Leu Val Ala Leu Phe Asn Thr Tyr Ala Arg Leu Ser Ser Ser
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Val Ala Ala Val Gly Arg Phe Arg Ala Met Ile Asp Met Arg Asp Lys
465                 470                 475                 480
Met Ala Ser Lys Pro Asp Phe Lys Pro Glu Asp Leu Tyr Thr Leu Ile
                485                 490                 495
Asp Glu Ala Asp Glu Asp Met Asp Glu Phe Ile Arg Met Gln Asn Arg
            500                 505                 510
Gly Ser His Gly Asp Thr Leu Gly Glu Gln Val Gly Asn Glu Phe Ala
        515                 520                 525
Arg Val Met Met Ala Val Lys Ile Val Leu Lys Ser Trp Ile Arg Thr
    530                 535                 540
Pro Lys Met Ile Trp Gln Ile Val Ser Glu Glu Thr Ser Arg Leu Tyr
545                 550                 555                 560
Arg Ala Trp Val Gly Leu Pro Ala Arg Pro Arg Arg Tyr Ala Phe Arg
                565                 570                 575
Leu Pro Asn Leu Asn Arg Asp Glu Leu
            580                 585
 
<210>33
<211>1008
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>33
Met Lys Ser Pro Arg Lys  Ser Pro Leu Leu Lys Leu Leu Gly Ala Ala
1               5                    10                  15
Phe Leu Phe Ser Thr Asn Val Leu Ala Ile Ser Ala Val Leu Gly Val
            20                  25                  30
Asp Leu Gly Thr Glu Tyr Ile Lys Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ile
        35                  40                  45
Pro Leu Glu Ile Val Leu Thr Lys Asp Ser Arg Arg Lys Glu Thr Ser
    50                  55                  60
Ala Val Ala Phe Lys Pro Ala Lys Gly Ala Leu Pro Glu Gly Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Pro Glu Arg Ser Tyr Gly Ala Asp Ala Met Ala Leu Ala Ala Arg Phe
                85                  90                  95
Pro Gly Glu Val Tyr Pro Asn Leu Lys Pro Leu Leu Gly Leu Pro Val
            100                 105                 110
Gly Asp Ala Ile Val Gln Glu Tyr Ala Ala Arg His Pro Ala Leu Lys
        115                 120                 125
Leu Gln Ala His Pro Thr Arg Gly Thr Ala Ala Phe Lys Thr Glu Thr
    130                 135                 140
Leu Ser Pro Glu Glu Glu Ala Trp Met Val Glu Glu Leu Leu Ala Met
145                 150                 155                 160
Glu Leu Gln Ser Ile Gln Lys Asn Ala Glu Val Thr Ala Gly Gly Asp
                165                 170                 175
Ser Ser Ile Arg Ser Ile Val Leu Thr Val Pro Pro Phe Tyr Thr Ile
            180                 185                 190
Glu Glu Lys Arg Ala Leu Gln Met Ala Ala Glu Leu Ala Gly Phe Lys
        195                 200                 205
Val Leu Ser Leu Val Ser Asp Gly Leu Ala Val Gly Leu Asn Tyr Ala
    210                 215                 220
Thr Ser Arg Gln Phe Pro Asn Ile Asn Glu Gly Ala Lys Pro Glu Tyr
225                 230                 235                 240
His Leu Val Phe Asp Met Gly Ala Gly Ser Thr Thr Ala Thr Val Met
                245                 250                 255
Arg Phe Gln Ser Arg Thr Val Lys Asp Val Gly Lys Phe Asn Lys Thr
            260                 265                 270
Val Gln Glu Ile Gln Val Leu Gly Ser Gly Trp Asp Arg Thr Leu Gly
        275                 280                 285
Gly Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Asp Asp Met Ile Ala Gln Phe
    290                 295                 300
Val Glu Ser Lys Gly Ala Gln Lys Ile Ser Ala Thr Ala Glu Gln Val
305                 310                 315                 320
Gln Ser His Gly Arg Ala Val Ala Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Arg
                325                 330                 335
Leu Arg His Val Leu Ser Ala Asn Gln Asn Thr Gln Ala Ser Phe Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Tyr Glu Asp Val Asp Phe Lys Tyr Lys Ile Ser Arg Ala Asp
        355                 360                 365
Phe Glu Thr Met Ala Lys Ala His Val Glu Arg Val Asn Ala Ala Ile
    370                 375                 380
Lys Asp Ala Leu Lys Ala Ala Asn Leu Glu Ile Gly Asp Leu Thr Ser
385                 390                 395                 400
Val Ile Leu His Gly Gly Ala Thr Arg Thr Pro Phe Val Arg Glu Ala
                405                 410                 415
Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ser Gly Asp Lys Ile Arg Thr Asn Val Asn
            420                 425                 430
Ser Asp Glu Ala Ala Val Phe Gly Ala Ala Phe Arg Ala Ala Glu Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Ser Phe Arg Val Lys Glu Ile Arg Ile Ser Glu Gly Ala Asn
    450                 455                 460
Tyr Ala Ala Gly Ile Thr Trp Lys Ala Ala Asn Gly Lys Val His Arg
465                 470                 475                 480
Gln Arg Leu Trp Thr Ala Pro Ser Pro Leu Gly Gly Pro Ala Lys Glu
                485                 490                 495
Ile Thr Phe Thr Glu Gln Glu Asp Phe Thr Gly Leu Phe Tyr Gln Gln
            500                 505                 510
Val Asp Thr Glu Asp Lys Pro Val Lys Ser Phe Ser Thr Lys Asn Leu
        515                 520                 525
Thr Ala Ser Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Pro Thr Cys Ala Asp
    530                 535                 540
Thr Gly Val Gln Phe Lys Ala Ala Ala Lys Leu Arg Thr Glu Asn Gly
545                 550                 555                 560
Glu Val Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Glu Cys Glu Ala Glu Val Val
                565                 570                 575
Glu Lys Glu Gly Phe Val Asp Gly Val Lys Asn Leu Phe Gly Phe Gly
            580                 585                 590
Lys Lys Asp Gln Lys Pro Leu Ala Glu Gly Gly Asp Lys Asp Ser Ala
        595                 600                 605
Asp Ala Ser Ala Asp Ser Glu Ala Glu Thr Glu Glu Ala Ser Ser Ala
    610                 615                 620
Thr Lys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Thr Lys Ser Gly Asp Ala Ala
625                 630                 635                 640
Glu Ser Thr Glu Ala Ala Lys Glu Val Lys Lys Lys Gln Leu Val Ser
                645                 650                 655
Ile Pro Val Glu Val Thr Leu Glu Lys Ala Gly Ile Pro Gln Leu Thr
            660                 665                 670
Lys Ala Glu Trp Thr Lys Ala Lys Asp Arg Leu Lys Ala Phe Ala Ala
        675                 680                 685
Ser Asp Lys Ala Arg Leu Gln Arg Glu Glu Ala Leu Asn Gln Leu Glu
    690                 695                 700
Ala Phe Thr Tyr Lys Val Arg Asp Leu Val Asp Asn Glu Ala Phe Ile
705                 710                 715                 720
Ser Ala Ser Thr Glu Ala Glu Arg Gln Thr Leu Ser Glu Lys Ala Ser
                725                 730                 735
Glu Ala Ser Asp Trp Leu Tyr Glu Glu Gly Asp Ser Ala Thr Lys Asp
            740                 745                 750
Asp Phe Val Ala Lys Leu Lys Ala Leu Gln Asp Leu Val Ala Pro Ile
        755                 760                 765
Gln Asn Arg Leu Asp Glu Ala Glu Lys Arg Pro Gly Leu Ile Ser Asp
    770                 775                 780
Leu Arg Asn Ile Leu Asn Thr Thr Asn Val Phe Ile Asp Thr Val Arg
785                 790                 795                 800
Gly Gln Ile Ala Ala Tyr Asp Glu Trp Lys Ser Thr Ala Ser Ala Lys
                805                 810                 815
Ser Ala Glu Ser Ala Thr Ser Ser Ala Ala Ala Glu Ala Thr Thr Asn
            820                 825                 830
Asp Phe Glu Gly Leu Glu Asp Glu Asp Asp Ser Pro Lys Glu Ala Glu
        835                 840                 845
Glu Lys Pro Val Pro Glu Lys Val Val Pro Pro Leu His Asn Ser Glu
    850                 855                 860
Glu Ile Asp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Lys Glu Thr Leu Glu Trp Leu
865                 870                 875                 880
Asn Lys Leu Glu Arg Gln Gln Ala Asp Val Pro Leu Thr Glu Glu Pro
                885                 890                 895
Val Leu Val Val Ser Glu Leu Val Ala Arg Arg Asp Ala Leu Asp Lys
            900                 905                 910
Ala Ser Leu Asp Leu Ala Leu Lys Ser Tyr Thr Gln Tyr Gln Lys Asn
        915                 920                 925
Lys Pro Lys Lys Pro Thr Lys Ser Lys Lys Ala Lys Lys Gln Asp Lys
    930                 935                 940
Thr Lys Ser Ala Asp Lys Ala Gly Pro Thr Phe Glu Phe Pro Glu Gly
945                 950                 955                 960
Ser Val Pro Leu Ser Gly Glu Glu Leu Glu Glu Leu Val Lys Lys Tyr
                965                 970                 975
Met Lys Glu Glu Glu Glu Thr Arg Arg Gln Ala Glu Gly Gly Gln Ala
            980                 985                 990
Glu Glu Lys  Pro Ala Glu Asp Thr  Glu Lys Ser Ser His  Asp Glu Leu
        995                  1000                 1005
 
<210>34
<211>363
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>34
Met Val Ala Arg Leu Ser Ser Ile Tyr Ala Cys Gly Leu Leu Ala Trp
1               5                   10                  15
Thr His Ile Val Cys Ala Ser Gln Phe Ser Asp Pro Met Gln Leu Gln
            20                  25                  30
Lys His Leu Ala Gln Asn Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Phe Val Ala Ser
        35                  40                  45
Arg Leu Glu Ala Asp Leu Lys Val Ser Leu Pro Leu Thr Ala Ser Thr
    50                  55                  60
Ser Asn Gly Arg Glu Ala Ser Lys Leu Leu Leu Glu Glu Trp Gln Thr
65                  70                  75                  80
Val Gln Gln His Val Ala Ser Thr Ala Thr Ile Asp Cys Pro Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Lys Leu Cys Gln Glu Met Asp Val Ala Ser Phe Pro Ala Ile Arg
            100                 105                 110
Leu Tyr Arg Gln Asp Gly Ser Val Thr Arg Tyr Arg Gly Pro Arg Arg
        115                 120                 125
Thr Ala Pro Ile Asp Ala Phe Val Lys Arg Ala Leu Lys Pro Ser Val
    130                 135                 140
Gln Asn Val Pro Gly Gln Gln Leu Ala Asn Phe Ile Thr Asn Asp Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Phe Ile Ala Lys Leu Gln Gly Glu Ser Glu Ser Ile Asn Ser
                165                 170                 175
His Tyr Arg Asp Phe Ala Gln Glu Tyr Ser Asp Arg Tyr Ser Phe Gly
            180                 185                 190
Ile Ile Thr Ser Gly Ser Val Pro Ser Asn Gly Val Trp Cys Tyr Asn
        195                 200                 205
Asn Val Asp Gly Asn Gln His Ala Ala Thr Asp Leu Asn Asp Pro Asn
    210                 215                 220
Ala Leu Lys Lys Leu Leu Asn Leu Cys Thr Ala Glu Val Ile Pro Gln
225                 230                 235                 240
Leu Thr Arg Arg Asn Glu Met Thr Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Ser Leu
                245                 250                 255
Val Tyr Tyr Phe Ser Asn Asn Glu Ala Asp Arg Glu Ala Tyr Val Lys
            260                 265                 270
Ala Leu Lys Pro Ile Ala Gln Arg Tyr Ala Glu Phe Leu Gln Phe Val
        275                 280                 285
Thr Val Asp Ser Gly Glu Tyr Pro Asp Met Leu Arg Asn Leu Gly Val
    290                 295                 300
Arg Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gln Asn Val His Asn Gly His Ile
305                 310                 315                 320
Phe Pro Phe Arg Gly Asp Ala Ala Ala Ser Pro Gly Gln Val Asp Gln
                325                 330                 335
Phe Ile Val Ala Ile Ser Glu Gly Arg Ala Gln Pro Trp Asp Gly Arg
            340                 345                 350
Phe Asp Glu Gly Gln Glu Ala His Asp Glu Leu
        355                 360
 
<210>35
<211>688
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>35
Met Arg Leu Thr Ser Phe Phe Ser Gly Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Ser Pro Ala Leu Ala Asp Asp Glu Ala Asp Asn Val Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Thr Tyr Phe Asp Ser Val Met Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu Thr Pro
        35                  40                  45
Asp Asn Phe Glu Lys Glu Ala Ser Lys Thr Lys Trp Leu Leu Val Lys
    50                  55                  60
His Tyr Ser Pro Tyr Cys His His Cys Ile Ser Tyr Ala Pro Thr Phe
65                  70                  75                  80
Gln Thr Thr Tyr Glu Phe Tyr Tyr Thr Ser Lys Pro Glu Gly Ala Gly
                85                  90                  95
Asp Thr Ser Phe Thr Asp Phe Tyr Asp Phe Lys Phe Ala Ala Val Asn
            100                 105                 110
Cys Ile Ala Tyr Ser Asp Leu Cys Val Glu Asn Gly Val Lys Leu Tyr
        115                 120                 125
Pro Thr Thr Val Leu Tyr Glu Asn Gly Lys Glu Val Lys Ala Val Thr
    130                 135                 140
Gly Gly Gln Asn Ile Thr Phe Leu Ser Asp Leu Ile Glu Glu Ala Leu
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ser Lys Pro Gly Ser Arg Pro Lys Ser Leu Ala Leu Pro Gln
                165                 170                 175
Pro Gly Asp Lys Glu Arg Pro Lys Ser Glu Pro Glu Thr Ala Ser Arg
            180                 185                 190
Ser Ala Thr Glu Glu Lys Lys Pro Lys Lys Pro Val Ala Thr Pro Asn
        195                 200                 205
Glu Asp Gly Val Ser Val Ser Leu Thr Ala Glu Asn Phe Gln Arg Leu
    210                 215                 220
Val Thr Met Thr Gln Asp Pro Trp Phe Ile Lys Phe Tyr Ala Pro Trp
225                 230                 235                 240
Cys Pro His Cys Gln Asp Met Ala Pro Thr Trp Glu Gln Leu Ala Lys
                245                 250                 255
Asn Met Lys Gly Lys Leu Asn Ile Gly Glu Val Asn Cys Asp Lys Glu
            260                 265                 270
Ser Arg Leu Cys Lys Asp Val Gly Ala Arg Ala Phe Pro Thr Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Phe Lys Gly Gly Glu Arg Ser Glu Tyr Glu Gly Leu Arg Gly Leu
    290                 295                 300
Gly Asp Phe Ile Lys Tyr Ala Glu Asn Ala Val Asp Leu Ala Ser Gly
305                 310                 315                 320
Val Pro Asp Val Asp Leu Ala Ala Phe Lys Ala Leu Glu Gln Lys Glu
                325                 330                 335
Asp Val Ile Phe Val Tyr Phe Tyr Asp His Ala Thr Thr Ser Glu Asp
            340                 345                 350
Phe Asn Ala Leu Glu Arg Leu Pro Leu Ser Leu Ile Gly His Ala Lys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Thr Lys Asp Pro Ala Met Tyr Glu Arg Phe Lys Ile Thr
    370                 375                 380
Thr Trp Pro Arg Phe Met Val Ser Arg Glu Gly Arg Pro Thr Tyr Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Leu Thr Pro Asn Ala Met Arg Asp Thr His Gln Val Leu Asp
                405                 410                 415
Trp Met Arg Ser Val Trp Leu Pro Leu Val Pro Glu Leu Leu Val Thr
            420                 425                 430
Asn Ala Arg Gln Ile Met Asp Asn Lys Ile Val Val Leu Gly Val Leu
        435                 440                 445
Asn Arg Glu Asp Gln Glu Ser Phe Gln Ser Ala Leu Arg Glu Met Lys
    450                 455                 460
Ser Ala Ala Asn Glu Trp Met Asp Arg Gln Ile Gln Glu Phe Gln Leu
465                 470                 475                 480
Glu Arg Lys Lys Leu Arg Asp Ala Lys Gln Met Arg Ile Glu Glu Ala
                485                 490                 495
Glu Asp Arg Asp Asp Glu Arg Ala Leu Arg Ala Ala Lys Ala Ile His
            500                 505                 510
Ile Asp Met Asn Asn Ser Gly Arg Arg Glu Val Ala Phe Ala Trp Val
        515                 520                 525
Asp Gly Val Ala Trp Gln Arg Trp Ile Arg Thr Thr Tyr Gly Ile Asp
    530                 535                 540
Val Lys Asp Gly Glu Arg Val Ile Ile Asn Asp Gln Asp Val Ser Leu
545                 550                 555                 560
Lys Leu Thr Pro Ile Cys Pro Pro Ser Thr Ile Leu Leu Cys Ser Arg
                565                 570                 575
Lys Tyr Trp Asp Ser Thr Val Thr Gly Asn TyrIle Leu Val  Ser Arg
            580                 585                 590
Thr Ser Ile Leu Glu Thr Leu Asp Lys Val Val Tyr Thr Pro Gln Ala
        595                 600                 605
Leu Lys Pro Lys Leu Thr Ile Ser Ser Phe Glu Lys Ile Phe Phe Asp
    610                 615                 620
Ile Arg Val Ser Phe Thr Glu His Pro Tyr Leu Thr Leu Gly Cys Ile
625                 630                 635                 640
Val Gly Ile Ala Phe Gly Ala Phe Ser Trp Leu Arg Gly Arg Ser Arg
                645                 650                 655
Arg Gly Arg Gly His Phe Arg Leu Glu Asp Ser Ile Ser Ile Arg Asp
            660                 665                 670
Phe Lys Asp Gly Phe Leu Gly Gly Ser Asn Gly Asn Thr Lys Ala Asp
        675                 680                 685
 
<210>36
<211>461
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>36
Met His Gln Gln Thr Leu Leu Ala Thr Leu Ala Ala Ser Leu Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Pro Phe Ala Gln Ala Gly Phe Tyr Ser Lys Ser Ser Pro Val Leu
            20                  25                  30
Gln Val Asp Ala Lys Ser Tyr Asp Arg Leu Ile Thr Lys Ser Asn His
        35                  40                  45
Thr Ser Ile Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Asn
    50                  55                  60
Leu Lys Pro Ala Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Thr Leu Asp Gly Leu Ala
65                  70                  75                  80
Lys Val Ala Ala Val Asp Cys Asp Asp Asp Ala Asn Lys Ala Leu Cys
                85                  90                  95
Gly Ser Leu Gly Val Lys Gly Phe Pro Thr Leu Lys Ile Val Arg Pro
            100                 105                 110
Gly Lys Lys Pro Gly Arg Pro Val Val Glu Asp Tyr Gln Gly Gln Arg
        115                 120                 125
Thr Ala Gly Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Ala Lys Ile Asn Asn His
    130                 135                 140
Val Val Lys Leu Thr Asp Lys Asp Ile Asp Ala Phe Leu Glu Lys Asp
145                 150                 155                 160
Gly Asp Lys Pro Lys Ala Ile Leu Phe Thr Glu Lys Gly Thr Thr Ser
                165                 170                 175
Ala Leu Leu Arg Ser Leu Ala Ile Asp Phe Leu Asp Ala Val Thr Ile
            180                 185                 190
Gly Gln Val Arg Asn Lys Glu Lys Ala Ala Val Asp Arg Phe Gly Ile
        195                 200                 205
Ser Ser Phe Pro Ser Phe Val Leu Ile Pro Gly Gly Gly Lys Glu Pro
    210                 215                 220
Val Val Tyr Ser Gly Glu Leu Asn Lys Lys Asp Met Val Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Lys Gln Val Ala Glu Pro Asn Pro Asp Pro Ala Pro Ser Asn Gly Lys
                245                 250                 255
Ser Gly Lys Lys Ala Ser Thr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Lys Glu Ala
            260                 265                 270
Pro Gln Lys Ala Ala Ala Ala Asp Glu Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser
        275                 280                 285
Glu Thr Ser Thr Ala Ala Ala Pro Glu Ser Thr Leu Ile Asp Ile Pro
    290                 295                 300
Ala Leu Thr Ser Lys Ala Glu Leu Glu Glu His Cys Leu Gln Pro Lys
305                 310                 315                 320
Ser Gln Thr Cys Val Leu Ala Phe Val Pro Ala Ser Ala Ser Glu Met
                325                 330                 335
Arg Asn Lys Ile Leu Ser Ala Val Ser Gln Leu His Thr Lys Tyr Val
            340                 345                 350
His Gly Lys Arg His Phe Pro Phe Phe Ser Val Asp Ser Asp Val Glu
        355                 360                 365
Gly Ser Ala Ala Leu Lys Glu Ala Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ile Glu
    370                 375                 380
Leu Val Ala Leu Asn Ala Arg Arg Gly Trp Trp Arg Arg Tyr Glu Asp
385                 390                 395                 400
Gly Glu Phe Ser Val His Ser Val Glu Ser Trp Ile Asp Ala Val Arg
                405                 410                 415
Met Gly Glu Gly Glu Lys Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Val Val Glu
            420                 425                 430
Lys Ala Glu Pro Ala Glu Glu Ala Lys Ser Glu Thr Glu Ala Ala Ala
        435                 440                 445
Ala Asp Glu Ala Thr Glu Lys Pro Glu His Asp Glu Leu
    450                 455                 460
 
<210>37
<211>368
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>37
Met Val Leu Ile Lys Ser Leu Val Leu Ala Val Leu Ala Ser Ser Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Lys Ser Ala Val Ile Asp Leu Ile Pro Ser Asn Phe Asp Lys
            20                  25                  30
Leu Val Phe Ser Gly Lys Pro Thr Leu Val Glu Phe Phe Ala Pro Trp
        35                  40                  45
Cys Gly His Cys Lys Asn Leu Ala Pro Val Tyr Glu Glu Leu Ala Gln
    50                  55                  60
Val Phe Glu His Ala Lys Asp Lys Val Gln Ile Ala Lys Val Asp Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Glu Arg Asp Leu Gly Lys Arg Phe Gly Ile Gln Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Phe Phe Asp Gly Lys Ser Lys Glu Pro Gln Glu Tyr Lys
            100                 105                 110
Ser Gly Arg Asp Leu Asp Ser Leu Thr Lys Phe Ile Thr Glu Lys Thr
        115                 120                 125
Gly Val Lys Pro Lys Lys Lys Gly Glu Leu Pro Ser Ser Val Val Met
    130                 135                 140
Leu Asn Thr Arg Thr Phe His Asp Thr Val Gly Gly Asp Lys Asn Val
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Phe Thr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Asn Leu Ala
                165                 170                 175
Pro Thr Trp Glu Lys Val Ala Asn Asp Phe Ala Gly Asp Glu Asn Val
            180                 185                 190
Val Ile Ala Lys Val Asp Ala Glu Gly Ala Asp Ser Lys Ala Val Ala
        195                 200                 205
Glu Glu Tyr Gly Val Thr Gly Tyr Pro Thr Ile Leu Phe Phe Pro Ala
    210                 215                 220
Gly Thr Lys Lys Gln Val Asp Tyr Gln Gly Gly Arg Ser Glu Gly Asp
225                 230                 235                 240
Phe Val Asn Phe Ile Asn Glu Lys Ala Gly Thr Phe Arg Thr Glu Gly
                245                 250                 255
Gly Glu Leu Asn Asp Ile Ala Gly Thr Val Ala Pro Leu Asp Thr Ile
            260                 265                 270
Val Ala Asn Phe Leu Ser Gly Thr Gly Leu Ala Glu Ala Ala Ala Glu
        275                 280                 285
Ile Lys Glu Ala Val Asp Leu Leu Thr Asp Ala Ala Glu Thr Lys Phe
    290                 295                 300
Ala Glu Tyr Tyr Val Arg Val Phe Asp Lys Leu Ser Lys Asn Glu Lys
305                 310                 315                 320
Phe Val Asn Lys Glu Leu Ala Arg Leu Gln Gly Ile Leu Ala Lys Gly
                325                 330                 335
Gly Leu Ala Pro Ser Lys Arg Asp Glu Ile Gln Ile Lys Ile Asn Val
            340                 345                 350
Leu Arg Lys Phe Thr Pro Lys Glu Asn Glu Asp Gln Lys Asp Glu Leu
        355                 360                 365
 
<210>38
<211>502
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>38
Met Gln Gln Lys Arg Leu Thr Ala Ala Leu Val Ala Ala Leu Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Val Ser Ala Glu Ser Asp Val Lys Ser Leu Thr Lys Asp Thr Phe
            20                  25                  30
Asn Asp Phe Ile Asn Ser Asn Asp Leu Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala
        35                  40                  45
Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Thr Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ile Lys Leu Ala Lys Val Asp Cys
65                  70                  75                  80
Val Glu Glu Ala Asp Leu Cys Lys Glu His Gly Val Glu Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Lys Val Ala Pro Tyr Thr Gly
            100                 105                 110
Pro Arg Lys Ala Asp Gly Ile Thr Ser Tyr Met Val Lys Gln Ser Leu
        115                 120                 125
Pro Ala Val Ser Ala Leu Thr Lys Asp Thr Leu Glu Asp Phe Lys Thr
    130                 135                 140
Ala Asp Lys Val Val Leu Val Ala Tyr Ile Ala Ala Asp Asp Lys Ala
145                 150                 155                 160
Ser Asn Glu Thr Phe Thr Ala Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Thr Tyr
                165                 170                 175
Leu Phe Gly Gly Val Asn Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Glu Gly Val
            180                 185                 190
Lys Phe Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys Ser Phe Asp Glu Gly Lys Asn
        195                 200                 205
Val Phe Ser Glu Lys Phe Asp Ala Glu Ala Ile Arg Asn Phe Ala Gln
    210                 215                 220
Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Gly Glu Val Gly Pro Glu Thr Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe Ala Glu Thr
                245                 250                 255
Ala Glu Glu Arg Glu Asn Leu Ala Lys Thr Leu Lys Pro Val Ala Glu
            260                 265                 270
Lys Tyr Lys Gly Lys Ile Asn Phe Ala Thr Ile Asp Ala Lys Asn Phe
        275                 280                 285
Gly Ser His Ala Gly Asn Ile Asn Leu Lys Thr Asp Lys Phe Pro Ala
    290                 295                 300
Phe Ala Ile His Asp Ile Glu Lys Asn Leu Lys Phe Pro Phe Asp Gln
305                 310                 315                 320
Ser Lys Glu Ile Thr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Phe Val Asp Gly Phe
                325                 330                 335
Ser Ser Gly Lys Ile Glu Ala Ser Ile Lys Ser Glu Pro Ile Pro Glu
            340                 345                 350
Thr Gln Glu Gly Pro Val Thr Val Val Val Ala His Ser Tyr Lys Asp
        355                 360                 365
Ile Val Leu Asp Asp Lys Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe Tyr Ala Pro
    370                 375                 380
Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr Asp Glu Leu Ala
385                 390                 395                 400
Ser Leu Tyr Ala Lys Ser Asp Phe Lys Asp Lys Val Val Ile Ala Lys
                405                 410                 415
Val Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp Glu Ile Gln Gly Phe Pro
            420                 425                 430
Thr Ile Lys Leu Tyr Pro Ala Gly Asp Lys Lys Asn Pro Val Thr Tyr
        435                 440                 445
Ser Gly Ala Arg Thr Val Glu Asp Phe Ile Glu Phe Ile Lys Glu Asn
    450                 455                 460
Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Val Glu Ile Pro Ala Glu Pro Thr Glu Glu
465                 470                 475                 480
Ala Glu Ala Ser Glu Ser Lys Ala Ser Glu Glu Ala Lys Ala Ser Glu
                485                 490                 495
Glu Thr His Asp Glu Leu
            500
 
<210>39
<211>190
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>39
Met Lys Ala Ala Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Cys Ala Ile Gly
1               5                   10                  15
Leu Val Ala Ala Ala Ala Glu Asp Phe Lys Ile Glu Val Thr His Pro
            20                  25                  30
Val Glu Cys Asp Arg Lys Thr Gln Lys Gly Asp Lys Leu Ser Met His
        35                  40                  45
Tyr Arg Gly Thr Leu Ala Lys Thr Gly Asp Lys Phe Asp Ala Ser Tyr
    50                  55                  60
Asp Arg Asn Gln Pro Phe Asn Phe Lys Leu Gly Ala Gly Gln Val Ile
65                  70                  75                  80
Lys Gly Trp Asp Gln Gly Leu Leu Asp Met Cys Ile Gly Glu Lys Arg
                85                  90                  95
Thr Leu Thr Ile Pro Pro Glu Leu Gly Tyr Gly Gln Arg Asn Met Gly
            100                 105                 110
Pro Ile Pro Ala Gly Ser Thr Leu Ile Phe Glu Thr Glu Leu Leu Ala
        115                 120                 125
Ile Glu Gly Val Lys Ala Pro Glu Lys Lys Pro Val Pro Glu Thr Pro
    130                 135                 140
Ile Val Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Glu Glu Ser Val Val Glu Lys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Glu Ala Val Asp Ala Ala
                165                 170                 175
Lys Thr Val Phe Ala Asp Thr Asp Glu Gly His Gly Glu Leu
            180                 185                 190
 
<210>40
<211>207
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>40
Met Leu Thr Phe Arg Arg Leu Phe Thr Thr Ala Ile Val Leu Val Val
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Phe Phe Val Lys Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gly Pro Lys
            20                  25                  30
Ile Thr His Lys Val Phe Phe Asp Ile Glu His Gly Asp Glu Lys Leu
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Val Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val Pro Glu Thr Ala
    50                  55                  60
Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ala Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Gly Ser Thr Phe His Arg Val Ile Lys Gln Phe Met Ile Gln Gly Gly
                85                  90                  95
Asp Phe Thr Lys Gly Asp Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Asn
            100                 105                 110
Lys Phe Lys Asp Glu Asn Phe Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Gly Leu
        115                 120                 125
Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe
    130                 135                 140
Ile Thr Thr Val Val Thr Ser Trp Leu Asp Gly Arg His Val Val Phe
145                 150                 155                 160
Gly Glu Val Leu Glu Gly Tyr Asp Ile Val Glu Lys Ile Glu Asn Val
                165                 170                 175
Gln Thr Gly Pro Gly Asp Arg Pro Val Lys Pro Val Lys Ile Ala Lys
            180                 185                 190
Ser Gly Glu Leu Glu Val Pro Pro Glu Gly Ile His Val Glu Leu
        195                 200                 205
 
<210>41
<211>413
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>41
Met Ile Leu Arg Ala Ala Ile Phe Val Leu Leu Ala Leu Val Ser Leu
1               5                   10                  15
Ala Val Cys Ala Glu Asp Phe Tyr Lys Val Leu Gly Val Asp Lys Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Asp Lys Gln Leu Lys Gln Ala Tyr Arg Gln Leu Ser Lys Lys
        35                  40                  45
Phe His Pro Asp Lys Asn Pro Gly Asp Glu Thr Ala His Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Val Leu Val Ser Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Leu Arg
65                  70                  75                  80
Lys Val Tyr Asp Arg Tyr Gly His Glu Gly Val Lys Ser His Arg Gln
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Pro Phe Asp Leu Phe Ser Arg
            100                 105                 110
Phe Phe Gly Gly His Gly His Phe Gly Arg Asn Ser Arg Glu Pro Arg
        115                 120                 125
Gly Ser Asn Ile Glu Val Arg Ile Glu Ile Ser Leu Arg Asp Phe Tyr
    130                 135                 140
Asn Gly Ala Thr Thr Glu Phe Gln Trp Glu Lys Gln His Ile Cys Glu
145                 150                 155                 160
Lys Cys Glu Gly Thr Gly Ser Ala Asp Gly Lys Val Glu Thr Cys Ser
                165                 170                 175
Val Cys Gly Gly His Gly Val Arg Ile Val Lys Gln Gln Leu Val Pro
            180                 185                 190
Gly Met Phe Gln Gln Met Gln Met Arg Cys Asp His Cys Gly Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Lys Thr Ile Lys Asn Lys Cys Ser Val Cys His Gly Ser Arg Val
    210                 215                 220
Glu Arg Lys Pro Thr Thr Val Ser Leu Thr Val Glu Arg Gly Ile Ala
225                 230                 235                 240
Arg Asp Ala Lys Val Val Phe Glu Asn Glu Ala Asp Gln Ser Pro Asp
                245                 250                 255
Trp Val Pro Gly Asp Leu Ile Val Asn Leu Gly Glu Lys Ala Pro Ser
            260                 265                 270
Tyr Glu Asp Asn Pro Asp Arg Val Asp Gly Thr Phe Phe Arg Arg Lys
        275                 280                 285
Gly His Asp Leu Tyr Trp Thr Glu Val Leu Ser Leu Arg Glu Ala Trp
    290                 295                 300
Met Gly Gly Trp Thr Arg Asn Leu Thr His Leu Asp Lys His Val Val
305                 310                 315                 320
Arg Leu Gly Arg Glu Arg Gly Gln Val Val Gln Ser Gly Leu Val Glu
                325                 330                 335
Thr Ile Pro Gly Glu Gly Met Pro Ile Trp His Glu Glu Gly Glu Ser
            340                 345                 350
Val Tyr His Thr His Glu Phe Gly Asn Leu Tyr Val Thr Tyr Glu Val
        355                 360                 365
Ile Leu Pro Asp Gln Met Asp Lys Lys Met Glu Ser Glu Phe Trp Asp
    370                 375                 380
Leu Trp Glu Lys Trp Arg Ser Lys Asn Gly Val Asp Leu Gln Lys Asp
385                 390                 395                 400
Leu Gly Arg Pro Glu Pro Gly His Asp His Asp Glu Leu
                405                 410
 
<210>42
<211>182
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>42
Met Ala Arg Arg Gln His Leu Thr Ala Thr Val Leu Leu Ala Val Val
1               5                   10                  15
Leu Phe Phe Ser Ile Thr Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Ser Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ala Asp Arg Thr Arg Glu Ala Val Val Ala Glu Pro Lys Ser Glu Phe
        35                  40                  45
Lys Val Asp Phe Asp Gly Met Pro Ala Asn Leu Leu Glu Gly Glu Ser
    50                  55                  60
Ile Ala Pro Lys Leu Glu Asn Ala Thr Leu Lys Ala Glu Leu Gly Arg
65                  70                  75                  80
Ala Thr Trp Lys Phe Met His Thr Met Val Ala Arg Phe Pro Glu Lys
                85                  90                  95
Pro Ser Pro Glu Glu Arg Lys Thr Leu Glu Thr Phe Ile Tyr Leu Phe
            100                 105                 110
Gly Arg Leu Tyr Pro Cys Gly Asp Cys Ala Arg His Phe Arg Gly Leu
        115                 120                 125
Leu Ala Lys Tyr Pro Pro Gln Thr Ser Ser Arg Asn Ala Ala Ala Gly
    130                 135                 140
Trp Leu Cys Phe Val His Asn Gln Val Asn Glu Arg Leu Lys Lys Pro
145                 150                 155                 160
Ile Phe Asp Cys Asn Asn Ile Gly Asp Phe Tyr Asp Cys Gly Cys Gly
                165                 170                 175
Asp Glu Lys Lys Asp Gly
            180
 
<210>43
<211>1070
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>43
Met Val Met Leu Val Ala Ile Ala Leu Ala Trp Leu Gly Cys Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Arg Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Asp Tyr Leu Ala Gln Leu Arg
            20                  25                  30
Gln Glu Thr Val Asp Met Phe Tyr His Gly Tyr Ser Asn Tyr Met Glu
        35                  40                  45
His Ala Phe Pro Glu Asp Glu Leu Arg Pro Ile Ser Cys Thr Pro Leu
    50                  55                  60
Thr Arg Asp Arg Asp Asn Pro Gly Arg Ile Ser Leu Asn Asp Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asn Tyr Ser Leu Thr Leu Ile Asp Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ile
                85                  90                  95
Leu Ala Gly Gly Pro Gln Asn Gly Pro Tyr Thr Gly Pro Gln Ala Leu
            100                 105                 110
Ser Asp Phe Gln Asp Gly Val Ala Glu Phe Val Arg His Tyr Gly Asp
        115                 120                 125
Gly Arg Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly Ile Arg Ala Arg Gly Phe Asp
    130                 135                 140
Leu Asp Ser Lys Val Gln Val Phe Glu Thr Val Ile Arg Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Leu Ser Ala His Leu Phe Ala Ile Gly Glu Leu Pro Ile Thr
                165                 170                 175
Gly Tyr Val Pro Arg Pro Glu Gly Val Ala Gly Asp Asp Pro Leu Glu
            180                 185                 190
Leu Ala Pro Ile Pro Trp Pro Asn Gly Phe Arg Tyr Asp Gly Gln Leu
        195                 200                 205
Leu Arg Leu Ala Leu Asp Leu Ser Glu Arg Leu Leu Pro Ala Phe Tyr
    210                 215                 220
Thr Pro Thr Gly Ile Pro Tyr Pro Arg Val Asn Leu Arg Ser Gly Ile
225                 230                 235                 240
Pro Phe Tyr Val Asn Ser Pro Leu His Gln Asn Leu Gly Glu Ala Val
                245                 250                 255
Glu Glu Gln Ser Gly Arg Pro Glu Ile Thr Glu Thr Cyg Ser Ala Gly
            260                 265                 270
Ala Gly Ser Leu Val Leu Glu Phe Thr Val Leu Ser Arg Leu Thr Gly
        275                 280                 285
Asp Ala Arg Phe Glu Gln Ala Ala Lys Arg Ala Phe Trp Glu Val Trp
    290                 295                 300
His Arg Arg Ser Glu Ile Gly Leu Ile Gly Asn Gly Ile Asp Ala Glu
305                 310                 315                 320
Arg Gly Leu Trp Ile Gly Pro His Ala Gly Ile Gly Ala Gly Met Asp
                325                 330                 335
Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Lys Ser His Ile Leu Leu Ser Gly Leu
            340                 345                 350
Gly Met Pro Asn Ala Ser Thr Ser Arg Arg Gln Ser Thr Thr Ser Trp
        355                 360                 365
Leu Asp Pro Asn Ser Leu His Pro Pro Leu Pro Pro Glu Met His Thr
    370                 375                 380
Ser Asp Ala Phe Leu Gln Ala Trp His Gln Ala His Ala Ser Val Lys
385                 390                 395                 400
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Arg Ser His Phe Pro Tyr Tyr Ser Asn Asn
                405                 410                 415
His Arg Ala Thr Gly Gln Pro Tyr Ala Met Trp Ile Asp Ser Leu Gly
            420                 425                 430
Ala Phe Tyr Pro Gly Leu Leu Ala Leu Ala Gly Glu Val Glu Glu Ala
        435                 440                 445
Ile Glu Ala Asn Leu Val Tyr Thr Ala Leu Trp Thr Arg Tyr Ser Ala
    450                 455                 460
Leu Pro Glu Arg Trp Ser Val Arg Glu Gly Asn Val Glu Ala Gly Ile
465                 470                 475                 480
Gly Trp Trp Pro Gly Arg Pro Glu Phe Ile Glu Ser Thr Tyr His Ile
                485                 490                 495
Tyr Arg Ala Thr Arg Asp Pro Trp Tyr Leu His Val Gly Glu Met Val
            500                 505                 510
Leu Arg Asp Ile Arg Arg Arg Cys Tyr Ala Glu Cys Gly Trp Ala Gly
        515                 520                 525
Leu Gln Asp Val Gln Thr Gly Glu Lys Gln Asp Arg Met Glu Ser Phe
    530                 535                 540
Phe Leu Gly Glu Thr Ala Lys Tyr Met Tyr Leu Leu Phe Asp Pro Asp
545                 550                 555                 560
His Pro Leu Asn Lys Leu Asp Ala Ala Tyr Val Phe Thr Thr Glu Gly
                565                 570                 575
His Pro Leu Ile Ile Pro Lys Ser Lys Arg Gly Ser Gly Ser His Asn
            580                 585                 590
Arg Gln Asp Arg Ala Arg Lys Ala Lys Lys Ser Arg Asp Val Ala Val
        595                 600                 605
Tyr Thr Tyr Tyr Asp Glu Ser Phe Thr Asn Ser Cys Pro Ala Pro Arg
    610                 615                 620
Pro Pro Ser Glu His His Leu Ile Gly Ser Ala Thr Ala Ala Arg Pro
625                 630                 635                 640
Asp Leu Phe Ser Val Ser Arg Phe Thr Asp Leu Tyr Arg Thr Pro Asn
                645                 650                 655
Val His Gly Pro Leu Glu Lys Val Glu Met Arg Asp Lys Lys Lys Gly
            660                 665                 670
Arg Val Val Arg Tyr Arg Ala Thr Ser Asn His ThrIle  Phe Pro Trp
        675                 680                 685
Thr Leu Pro Pro Ala Met Leu Pro Glu Asn Gly Thr Cys Ala Ala Pro
    690                 695                 700
Pro Glu Arg Ile Ile Ser Leu Ile Glu Phe Pro Ala Asn Asp Ile Thr
705                 710                 715                 720
Ser Gly Ile Thr Ser Arg Phe Gly Asn His Leu Ser Trp Gln Thr His
                725                 730                 735
Leu Gly Pro Thr Val Asn Ile Leu Glu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Glu
            740                 745                 750
Gln Val Ser Asp Pro Ala Thr Gly Glu Asp Lys Trp Arg Ile Thr His
        755                 760                 765
Ile Gly Asn Thr Gln Leu Gly Arg His Glu Thr Val Phe Phe His Ala
    770                 775                 780
Glu His Val Arg His Leu Lys Asp Glu Val Phe Ser Cys Arg Arg Arg
785                 790                 795                 800
Arg Asp Ala Val Glu Ile Glu Leu Leu Val Asp Lys Pro Ser Asp Thr
                805                 810                 815
Asn Asn Asn Asn Thr Leu Ala Ser Ser Asp Asp Asp Val Val Val Asp
            820                 825                 830
Ala Lys Ala Glu Glu Gln Asp Gly Met Leu Ala Asp Asp Asp Gly Asp
        835                 840                 845
Thr Leu Asn Ala Glu Thr Leu Ser Ser Asn Ser Leu Phe Gln Ser Leu
    850                 855                 860
Leu Arg Ala Val Ser Ser Val Phe Glu Pro Val Tyr Thr Ala Ile Pro
865                 870                 875                 880
Glu Ser Asp Pro Ser Ala Gly Thr Ala Lys Val Tyr Ser Phe Asp Ala
                885                 890                 895
Tyr Thr Ser Thr Gly Pro Gly Ala Tyr Pro Met Pro Ser Ile Ser Asp
            900                 905                 910
Thr Pro Ile Pro Gly Asn Pro Phe Tyr Asn Phe Arg Asn Pro Ala Ser
        915                 920                 925
Asn Phe Pro Trp Ser Thr Val Phe Leu Ala Gly Gln Ala Cys Glu Gly
    930                 935                 940
Pro Leu Pro Ala Ser Ala Pro Arg Glu His Gln Val Ile Val Met Leu
945                 950                 955                 960
Arg Gly Gly Cys Ser Phe Ser Arg Lys Leu Asp Asn Ile Pro Ser Phe
                965                 970                 975
Ser Pro His Asp Arg Ala Leu Gln Leu Val Val Val Leu Asp Glu Pro
            980                 985                 990
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro  Ala Asn Asp Arg Arg  Asp Val Thr
        995                 1000                 1005
Arg Pro  Leu Leu Asp Thr Glu  Gln Thr Thr Pro Lys  Gly Met Lys
    1010                 1015                 1020
Arg Leu  His Gly Ile Pro Met  Val Leu Val Arg Ala  Ala Arg Gly
    1025                 1030                 1035
Asp Tyr  Glu Leu Phe Gly His  Ala Ile Gly Val Gly  Met Arg Arg
    1040                 1045                 1050
Lys Tyr  Arg Val Glu Ser Gln  Gly Leu Val Val Glu  Asn Ala Val
    1055                 1060                 1065
Val Leu
    1070
 
<210>44
<211>406
<212>PRT
<213>里氏木霉
 
<400>44
Met Arg Pro Leu Ala Leu Ile Phe Ala Leu Ile Leu Gly Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Ala Ala Pro Ala Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gln His Ser
            20                  25                  30
Pro Gln Ala Ala Ser Asp Glu Ser Asp Leu Ile Cys His Thr Ser Asn
        35                  40                  45
Pro Asp Glu Cys Tyr Pro Arg Val Phe Val Pro Thr His Glu Phe Gln
    50                  55                  60
Pro Val His Asp Asp Gln Gln Leu Pro Asn Gly Leu His Val Arg Leu
65                  70                  75                  80
Asn Ile Trp Thr Gly Gln Lys Glu Ala Lys Ile Asn Val Pro Asp Glu
                85                  90                  95
Ala Asn Pro Asp Leu Asp Gly Leu Pro Val Asp Gln Ala Val Val Leu
            100                 105                 110
Val Asp Gln Glu Gln Pro Glu Ile Ile Gln Ile Pro Lys Gly Ala Pro
        115                 120                 125
Lys Tyr Asp Asn Val Gly Lys Ile Lys Glu Pro Ala Gln Glu Gly Asp
    130                 135                 140
Ala Gln Thr Glu Ala Ile Ala Phe Ala Glu Thr Phe Asn Met Leu Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gly Lys Ser Pro Ser Ala Glu Glu Phe Asp Asn Gly Leu Glu Gly
                165                 170                 175
Leu Glu Glu Leu Ser His Asp Ile Tyr Tyr Gly Leu Lys Ile Thr Glu
            180                 185                 190
Asp Ala Asp Val Val Lys Ala Leu Phe Cys Leu Met Gly Ala Arg Asp
        195                 200                 205
Gly Asp Ala Ser Glu Gly Ala Thr Pro Arg Asp Gln Gln Ala Ala Ala
    210                 215                 220
Ile Leu Ala Gly Ala Leu Ser Asn Asn Pro Ser Ala Leu Ala Glu Ile
225                 230                 235                 240
Ala Lys Ile Trp Pro Glu Leu Leu Asp Ser Ser Cys Pro Arg Asp Gly
                245                 250                 255
Ala Thr Ile Ser Asp Arg Phe Tyr Gln Asp Thr Val Ser Val Ala Asp
            260                 265                 270
Ser Pro Ala Lys Val Lys Ala Ala Val Ser Ala Ile Asn Gly Leu Ile
        275                 280                 285
Lys Asp Gly Ala Ile Arg Lys Gln Phe Leu Glu Asn Ser Gly Met Lys
    290                 295                 300
Gln Leu Leu Ser Val Leu Cys Gln Glu Lys Pro Glu Trp Ala Gly Ala
305                 310                 315                 320
Gln Arg Lys Val Ala Gln Leu Val Leu Asp Thr Phe Leu Asp Glu Asp
                325                 330                 335
Met Gly Ala Gln Leu Gly Gln Trp Pro Arg Gly Lys Ala Ser Asn Asn
            340                 345                 350
Gly Val Cys Ala Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asp Gly Cys Trp Asp
        355                 360                 365
Tyr His Ala Asp Arg Met Val Lys Leu His Gly Thr Pro Trp Ser Lys
    370                 375                 380
Glu Leu Lys Gln Arg Leu Gly Asp Ala Arg Lys Ala Asn Ser Lys Leu
385                 390                 395                 400
Pro Asp His Gly Glu Leu
                405
 
<210>45
<211>505
<212>PRT
<213>木霉属
 
<400>45
Ala Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu His Ile Val Asn Lys Asp Leu Ala
1               5                   10                  15
Pro Asp Gly Val Gln Arg Pro Thr Val Leu Ala Gly Gly Thr Phe Pro
            20                  25                  30
Gly Thr Leu Ile Thr Gly Gln Lys Gly Asp Asn Phe Gln Leu Asn Val
        35                  40                  45
Ile Asp Asp Leu Thr Asp Asp Arg Met Leu Thr Pro Thr Ser Ile His
    50                  55                  60
Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Ala Trp Ala Asp Gly Pro Ala
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile Ile Ala Asp Asn Ser Phe Leu Tyr Asp
                85                  90                  95
Phe Asp Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp Tyr His Ser His Leu
            100                 105                 110
Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Ala Phe Val Val Tyr Asp
        115                 120                 125
Pro Asn Asp Pro His Lys Asp Leu Tyr Asp Val Asp Asp Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Val Leu Ala Gln Thr Val Val
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ala Thr Pro Asp Ser Thr Leu Ile Asn Gly Leu Gly Arg Ser
                165                 170                 175
Gln Thr Gly Pro Ala Asp Ala Glu Leu Ala Val Ile Ser Val Glu His
            180                 185                 190
Asn Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Ile Ser Cys Asp Pro Asn
        195                 200                 205
Phe Thr Phe Ser Val Asp Gly His Asn Met Thr Val Ile Glu Val Asp
    210                 215                 220
Gly Val Asn Thr Arg Pro Leu Thr Val Asp Ser Ile Gln Ile Phe Ala
225                 230                 235                 240
Gly Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asn Gln Pro Glu Asp Asn
                245                 250                 255
Tyr Trp Ile Arg Ala Met Pro Asn Ile Gly Arg Asn Thr Thr Thr Leu
            260                 265                 270
Asp Gly Lys Asn Ala Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Asn Ala Ser Val Glu
        275                 280                 285
Glu Pro Lys Thr Val Gly Gly Pro Ala Gln Ser Pro Leu Asn Glu Ala
    290                 295                 300
Asp Leu Arg Pro Leu Val Pro Ala Pro Val Pro Gly Asn Ala Val Pro
305                 310                 315                 320
Gly Gly Ala Asp Ile Asn His Arg Leu Asn Leu Thr Phe Ser Asn Gly
                325                 330                 335
Leu Phe Ser Ile Asn Asn Ala Ser Phe Thr Asn Pro Ser Val Pro Ala
            340                 345                 350
Leu Leu Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln Asp Leu Leu Pro
        355                 360                 365
Thr Gly Ser Tyr Ile Gly Leu Glu Leu Gly Lys Val Val Glu Leu Val
    370                 375                 380
Ile Pro Pro Leu Ala Val Gly Gly Pro His Pro Phe His Leu His Gly
385                 390                 395                 400
His Asn Phe Trp Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Asp Glu Tyr Asn Phe
                405                 410                 415
Asp Asp Ala Ile Leu Arg Asp Val Val Ser Ile Gly Ala Gly Thr Asp
            420                 425                 430
Glu Val Thr Ile Arg Phe Val Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu
        435                 440                 445
His Cys His Ile Asp Trp His Leu Glu Ala Gly Leu Ala Ile Val Phe
    450                 455                 460
Ala Glu Gly Ile Asn Gln Thr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Pro Gln Ala
465                 470                 475                 480
Trp Asp Glu Leu Cys Pro Lys Tyr Asn Gly Leu Ser Ala Ser Gln Lys
                485                 490                 495
Val Lys Pro Lys Lys Gly Thr Ala Ile
            500                 505

Claims (21)

1.生产所需蛋白质的方法，其包括步骤：
(a)将第一核酸序列引入宿主细胞，所述第一核酸序列包括与所需的蛋白质序列有效连接的信号序列；
(b)表达第一核酸序列；
(c)共表达编码分子伴侣或折叠酶的第二核酸序列，所述分子伴侣或折叠酶选自bip1、ero1、pdi1、tig1、prp1、ppi1、ppi2、prp3、prp4、钙联接蛋白和lhs1；和
(d)收集从宿主细胞分泌的所需的蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中第一核酸序列还包括在信号序列和所需的蛋白质序列之间的酶序列。
3.权利要求2的方法，其中酶序列获得自葡糖淀粉酶或CBH1酶。
4.权利要求2的方法，其中酶序列包括全长的酶序列。
5.权利要求2的方法，其中酶序列包括催化核心结构域序列。
6.权利要求5的方法，其中第一核酸序列还包括在催化核心结构域序列和所需的蛋白质序列之间的接头序列。
7.权利要求1的方法，其中所需的蛋白质是漆酶。
8.权利要求7的方法，其中所述漆酶源自丝状真菌或酵母。
9.权利要求8的方法，其中所述漆酶源自曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、柄孢壳属(Podospora)、葡萄孢属(Botrytis)、金钱菌属(Collybia)、下皮黑孔属(Cerrena)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、革耳鼠(Panus)、梭孢壳属(Thieilava)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、丝核菌属(Rhizoctonia)、鬼伞属(Coprinus)、小脆柄菇属(Psatyrella)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Schytalidium、射脉菌属(Phlebia)、革盖菌属(Coriolus)、绵皮孔菌属(Spongipellis)、多孔菌属(Polyporus)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、粗皮灵芝(Ganoderma tsunodae)或木霉属(Trichoderma)。
10.权利要求9的方法，其中所述漆酶源自下皮黑孔属漆酶A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2或E。
11.权利要求9的方法，其中所述漆酶源自下皮黑孔属漆酶D的成熟蛋白质。
12.权利要求1的方法，其中信号序列编码纤维二糖水解酶I信号肽或NSP24信号肽。
13.权利要求1的方法，其中宿主是丝状真菌。
14.权利要求13的方法，其中宿主是子囊菌。
15.权利要求14的方法，其中宿主是木霉属。
16.权利要求1的方法，其中第一核酸序列还包括在信号序列上游的启动子。
17.权利要求16的方法，其中启动子对宿主细胞是天然的，且与所需的蛋白质序列不是天然相关的。
18.权利要求1的方法，其中分子伴侣是BIP1。
19.权利要求1的方法，其中第二核酸序列与启动子有效的连接。
20.权利要求19的方法，其中启动子对宿主细胞是天然的，且与第二核酸序列不是天然相关的。
21.权利要求2的方法，其中所需的蛋白质是漆酶，且漆酶作为与酶的融合蛋白被产生。
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