CN101837148B - 一种多孔性可生物降解支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多孔性可生物降解支架及其制备方法，它主要由生物降解性聚合物组成。其制备方法为：将生物降解性聚合物溶解在有机溶剂里，然后与可溶性盐在常温下搅拌成膏状物，并在模具中加压成半成品，再将半成品干燥，去除有机溶剂及在纯水中脱盐，最后经过冷冻干燥预处理和冷冻干燥而制得成品。本发明的有益效果是：本发明提供的多孔性可生物降解支架具有良好的生物可降解性、高孔隙率、特定的孔径大小、高度的连续性、极高的表面积/体积比、组织相容性和血液相容性等特点，使人体无异物感，无免疫排斥反应。本发明适用于人体隆鼻、隆胸、除皱等和组织器官缺损、人体软骨、骨骼、肝脏、心脏瓣膜、胆囊管、消化道等的组织再生。

Description

一种多孔性可生物降解支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔性可生物降解支架及其制备方法。

背景技术

随着生物材料和组织工程学的发展，组织工程学产品逐渐应用于临床疾病的诊断及治疗，特别是应用于人体部分脏器的修复和再生。20世纪采用有机物、无机物医疗用材料的第一代生物材料和组织工程学产品已延长或改善了全球2000万人以上人的生命。据统计美国65岁以上老人当中1/5的人有必要接受临时或永久性的脏器移植手术。全世界的人脏器移植手术费用占医疗费用的8％，其支出额是3500亿美金。可以预见，随着科学技术的发展，特别是生物技术、临床医学和相关组织工程学材料的进步，将会研制出更多的组织工程学生物产品，不仅满足患者的临床需求，服务于人类的健康事业，而且将作为一项新兴的产业成为国民经济新的增长点。

组织修复用生物降解支架是结合组织工程三大要素研制而成，其表面性质、孔径、孔隙率、孔结构、材料理化性能和生物学指标直接影响产品的最终功能。目前使用的材料主要有天然聚合物和人工合成聚合物，具有良好的生物相容性。生物支架根据其体内的存在形式分为两类：生物降解和生物惰性。生物陶瓷、医用金属以及一些医用高分子聚合物(如聚乙烯、聚四氟乙烯等)作为第一代组织工程材料应用于人体硬组织修复和替代。

近代生物技术和医用生物材料的发展，使我们获得了许多可生物降解的人工合成高分子材料，主要有：脂肪族聚酯，聚亚胺酯，聚原酸酯，聚碳酸酯，聚酰胺酯等；同时这些材料在人体内的降解与新生组织的生长匹配机理的研究和控制技术方面也取得了许多成果，这些成果为开发第二代生物降解生物支架提供了有利的条件。

目前，中国和世界各国在组织工程方面的产品和方法主要有：

a、惰性材料细胞支架：如生物陶瓷、医用金属以及一些医用高分子聚合物。缺陷是不可降解性、有异物感。

b、真皮、脂肪移植。缺陷是术后有疤痕、吸收不均、外观效果不明显、自体排斥，手术成功率低。

c、单纯性细胞培养：但因其市场价格昂贵，且培养时间漫长，而不易被消费群体接受。

d、胶原海绵体：胶原海绵体因本体强度小，培养所需细胞后植入人体时海绵体被撕裂，不易移植，并常出现免疫排斥反应。

e、异体器官移植：其缺陷是器官资源有限、有排斥反应、价格昂贵。

总之，上述产品和方法存在不同程度的毒性、排斥反应、异物感、操作程序繁琐，技术难度大，不可降解，价格昂贵、资源限制等缺陷。

为了使生物体组织再生，支架除了具有可降解性特性和相容性特性外，还应具有让高密度的细胞附着成为可能的大的表面积，以及在有细胞附着的支架植入生物体后，空隙大小和空隙之间高度的连续性，使得血管形成、生长因子、激素(荷尔蒙等)、营养成分的传递成为可能。

现在最常用的并且商品化的主要有实现PLGA缝合线的支架，通过热处理随机解开，形成立体形状，尽管有很高的空隙率、一定的孔径和连续性，但是机械强度弱，应用受限(引用A.G.Mikos，Y.Bao，L.G.Cima.D.E.Ingber，J.P.Vacan ti，and R.langer，J.Biomed.Mater.Res.(1993)27，183-189)。

A.G.Mikos粒子浸出方法也被广泛应用，通过使用的Nacl的大小，调节空隙大小，虽然很容易，但是残存的NaCl或粗糙的形状导致的细胞损伤也成问题。(引用A.G.Mikos，G.Sarakinos，S.M.Leite，J.P.Vacanti，and R.Langer，Biomaterials(1993)14，5，323-330；A.G.Mikos，A.J.Thorsen，L.A.Czerwonka，Y.bao，R，Langer，D.N.Winslow，andJ.P.Vacanti，Polymer(1994)35，5，1068-1077)。

除此之外，乳化-冷冻干燥法和高压气体膨胀法各有优点，但是制造有敞开构造的空隙有一定的难度。(引用K.Whang，C.H.Thomas，K.E.Healy，G.Nuber，Polymer(1995)36，4，837-842；D.J.Mooney，D.F.Baldwin，N.P.Suh，J.P.Vacanti，R.Langer，Biomaterials(1996)17，1417-1422)。

利用高分子溶液相分离现象的方法被尝试过，但是空隙大小和细胞培养有困难。(引用

H.Lo，M.S.Ponticiello，K.W.Leong，Tissue Eng.(1995)1，15-28；H.Lo，S.Kadiyala，S.E.Guggino，K.W.Leong，J.Biomed.Mater.Res.(1996)30，475-484；Ch.Sc hugens，V.Maguet，Ch.Grandfils，R.Jerome，Ph.Teyssie，J.Biomed.Mater.Res.(1996)30，449-461)。

以上所述方法是为了制造可以诱导细胞附着与分化的立体高分子支架，但是在用可降解性高分子制造具有三维空间的组织再生用支架的方法上，仍有很多问题。在组织工程领域，除了小规模的PGA缝合线制造方法外，还没能实现商品化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多孔性可生物降解支架及其制备方法。这种多孔性可生物降解支架不仅具有良好的生物可降解性、高孔隙率、特定的孔径大小和高度的连续性，还具有极高的表面积/体积比，提供了宽大的表面积和适宜的空间，有利于细胞附着生长，细胞外基质沉积，营养和氧气的进入和代谢产物排出。

本发明的发明目的是通过以下技术方案实现的：一种多孔性可生物降解支架，它主要由生物降解性聚合物组成，其中所述的生物降解性聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、白蛋白、胶原蛋白、聚羟基丁酸酯、聚己丙酯和丙烯酸羟丁酯的一种或两种混合物，所述的多孔性可生物降解支架呈多孔结构。

其中所述的生物降解性聚合物的分子量为5000～500000。

一种多孔性可生物降解支架的制备方法，它包括以下步骤：

(1)、在常温下，将生物降解性聚合物按重量百分比20～35∶65～80在有机溶剂中自然溶解2～4小时，形成高粘性溶液；

(2)、按盐与生物降解性聚合物的重量比为1∶5～1∶100加入可溶性盐，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间不超过3分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和可溶性盐的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在345～483千帕下加压8～10分钟形成半成品；

(3)、将半成品在25℃～29℃下干燥24～48小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱可溶性盐24～48小时，致盐浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱去可溶性盐后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-100℃至-75℃下进行2～6小时的冷冻干燥前的预处理，然后在-70℃至-50℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥24～48小时，并在-20℃～8℃以下低温保存。

所述的有机溶剂由丙酮、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、丁酮(甲基乙基酮)、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二噁英(又称二氧杂己烷)和四氢呋喃中的一种或两种混合物。

所述的可溶性盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸钾、硫酸氢钾、硫酸铵、硫酸氢铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵和碳酸氢铵中的一种或两种混合物。

其中，所述的可溶性盐的颗粒大小为100～1000微米。

本发明的有益效果是：由于本发明所述的多孔性可生物降解支架具有良好的生物可降解性、高孔隙率、特定的孔径大小、高度的连续性以及极高的表面积/体积比等特点，使得对血液、皮肤间液、氧气、二氧化碳等的物质传输有良好效果，且这种结构具有组织相容性和血液相容性，无异物感，无免疫排斥反应；在支架上培养细胞后移植入组织缺损部位，随着多孔性支架逐渐降解，原来的孔隙由新生的细胞取代，组织缺损部位逐渐修复。

附图说明

图1以PLGA(75PLA∶25PGA)为原料，氯化钠与PLGA重量比为10∶1时的多孔性可生物降解支架的表面结构照片

图2以PLGA(75PLA∶25PGA)为原料，氯化钠与PLGA重量比为10∶1时的多孔性可生物降解支架的横截面构造照片

图3注入人体成纤维细胞前的多孔性可生物降解支架表面结构照片

图4把分离的人体成纤维细胞接种到多孔性支架内培养7天后的显微注射照片

图5通过对人体成纤维细胞存活率检测的MTT assay实验的光学显微镜观察照片

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明不限于所述的实施例。

【实施例1】

(1)、在常温下，将分子量为5000的PLGA(75PLA∶25PGA)按重量百分比20∶80在由二氯甲烷制备的有机溶剂中自然溶解2小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钠与生物降解性聚合物的重量比为1∶5加入氯化钠，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为1分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和氯化钠的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在345千帕下加压10分钟形成半成品；

(3)、将半成品在29℃下干燥24小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱氯化钠30小时，致氯化钠浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱氯化钠后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-75℃下进行6小时的冷冻干燥前的预处理，然后在-50℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥36小时，并在-20℃以下低温保存。

其中氯化钠的颗粒大小为100～200微米。

【实施例2】

(1)、在常温下，将分子量为200000的PLGA(65PLA∶35PGA)按重量百分比30∶70在由二氯甲烷与丙酮按重量百分比50∶50制备的有机溶剂中自然溶解2.5小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钾与生物降解性聚合物的重量比为1∶10加入氯化钾，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为2分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和氯化钾的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在414千帕下加压9分钟形成半成品；

(3)、将半成品在28℃下干燥30小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱氯化钾24小时，致氯化钾浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱氯化钾后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-85℃下进行4小时的冷冻干燥前的预处理，然后在-55℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥24小时，并在3℃以下低温保存。

其中氯化钾的颗粒大小为200～400微米。

【实施例3】

(1)、在常温下，将分子量为350000的PLGA(50PLA∶50PGA)按重量百分比35∶65在由丙酮制备的有机溶剂中自然溶解3小时，形成高粘性溶液；

(2)、按硝酸钾与生物降解性聚合物的重量比为1∶15加入硝酸钾，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为2分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和硝酸钾的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在483千帕下加压8分钟形成半成品；

(3)、将半成品在27℃下干燥35小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱硝酸钾48小时，致硝酸钾浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱硝酸钾后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-90℃下进行3小时的冷冻干燥前的预处理，最后在-60℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥48小时，并在0℃以下低温保存。

其中硝酸钾的颗粒大小为800～1000微米。

【实施例4】

(1)、在常温下，将分子量为500000的PLGA(25PLA∶75PGA)按重量百分比20∶80在由二氯甲烷制备的有机溶剂中自然溶解4小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钠与生物降解性聚合物的重量比为1∶100加入氯化钠，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为3分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和氯化钠的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在483千帕下加压8分钟形成半成品；

(3)、接着将半成品在25℃下干燥48小时；去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱氯化钠24小时，致氯化钠浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱氯化钠后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-100℃下进行2小时的冷冻干燥前的预处理，最后在-70℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥24小时，并在8℃以下低温保存。

其中，氯化钠的颗粒大小为500～600微米。

【实施例5】

(1)、在常温下，将分子量为5000的PLA按重量百分比20∶80在由二氯甲烷制备的有机溶剂中自然溶解2小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钠和氯化钾以重量百分比50∶50组成的可溶性盐与生物降解性聚合物的重量比为1∶5加入可溶性盐，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为1分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和可溶性盐的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在345千帕下加压10分钟形成半成品；

(3)、将半成品在29℃下干燥24小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱盐24小时，致盐浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱盐后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-75℃下进行6小时的冷冻干燥前的预处理，最后在-50℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥36小时，并在-20℃以下低温保存。

其中氯化纳和氯化钾的颗粒大小为100～200微米。

【实施例6】

(1)、在常温下，将分子量为200000的PLA按重量百分比30∶70在由二氯甲烷与丙酮按重量百分比40∶60制备的有机溶剂中自然溶解2.5小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钠与生物降解性聚合物的重量比为1∶10加入氯化钠，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为2分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和氯化钠的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在414千帕下加压9分钟形成半成品；

(3)、将半成品在28℃下干燥30小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱氯化钠36小时，致氯化钠浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱氯化钠后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-85℃下进行4小时的冷冻干燥前的预处理，然后在-55℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥25小时，并在3℃以下低温保存。

其中氯化钠的颗粒大小为200～400微米。

【实施例7】

(1)、在常温下，将分子量为350000的PLA按重量百分比35∶65在由丙酮制备的有机溶剂中自然溶解3小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钙和氯化铵以重量百分比30∶70组成的可溶性盐与生物降解性聚合物的重量比为1∶15加入可溶性盐，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为2分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和可溶性盐的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在483千帕下加压8分钟形成半成品；

(3)、将半成品在27℃下干燥35小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱盐48小时，致可溶性盐浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱去氯化钙和氯化铵后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-90℃下进行3小时的冷冻干燥前的预处理，最后在-60℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥48小时，并在0℃以下低温保存。

其中氯化钙和氯化铵的颗粒大小为800～1000微米。

【实施例8】

(1)、在常温下，将分子量为500000的PGA按重量百分比20∶80在由二氯甲烷制备的有机溶剂中自然溶解4小时，形成高粘性溶液；

(2)、按氯化钾与生物降解性聚合物的重量比为1∶100加入氯化钾，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间为3分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和氯化钾的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在483千帕下加压8分钟形成半成品；

(3)、接着将半成品在25℃下干燥48小时；去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱氯化钾32小时，致氯化钾浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱氯化钾后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-100℃下进行2小时的冷冻干燥前的预处理，最后在-70℃的温度和真空13帕的条件下真空冷冻干燥24小时，并在8℃以下低温保存。

其中，氯化钾的颗粒大小为500～600微米。

如图1和图2分别是以PLGA(75PLA∶25PGA)为原料，氯化钠与PLGA重量比为1∶10时制造的多孔性可生物降解支架的表面结构照片及横截面构造照片，多孔性可降解支架的表面结构、横截面构造的内部孔隙的形状用JSM-5900LV扫描电子显微镜(Scanning ElectronMicroscopy)观察，材料在用显微镜观察前，先用Sputter镀金机(Hummers，techniques，USA)镀一层金，施加55千帕氩气压力，然后通入10mA电流5min。从显微观察图片上可以看出，产品具有高孔隙率。根据生长在产品上的细胞形态分析得出，产品的孔径在100～200um范围时，最利于细胞的生长。氯化钠与PLGA高分子的重量比为1∶10时，孔隙率达到了98.74％，其中100～200um范围占92％，平均孔径为147.67um。

如图3、图4和图5分别是采用定值注入法，注入人体成纤维细胞前的多孔性可生物降解支架表面结构照片、把分离的人体成纤维细胞接种到多孔性支架内培养7天后的显微注射照片和通过对人体成纤维细胞存活率检测的MTT assay实验的光学显微镜观察照片。注入量为7×10⁴～8×10⁴的倍数个，在5％的二氧化碳存在情况下。因为多孔性可降解支架空隙之间的连续性良好，可以保证90～95％的有效注入，图中显示，注入的成纤维细胞在支架内均匀分布。

使用本发明所述的多孔性可生物降解支架进行90例植入实验，实验结果如下表1：

表1

实验项目	技术要求	检测结果	合格率
				热原	应无热原	无热原	100％
溶血性	溶血率应＜5％	溶血率＜1％	100％
				急性全身毒性	应无急性全身毒性反应	无急性全身毒性反应	100％
细胞毒性	细胞毒性反应应1-0级	细胞毒性1级	100％
				致敏	应无致敏反应	无致敏反应	98.9％
皮下植入	植入2周，4周和12周后，试样周围的组织学反应良好。	植入2周，4周和12周后，试样周围的组织学反应良好。	98.9％

表1的实验结果表明，该支架的具有良好的组织相容性和血液相容性，无致敏性，无免疫排斥反应。

用不同重量百分比的组成的生物降解聚合物制备出来的多孔性可生物降解支架，植入家兔皮下，进行体内降解实验，其实验结果如下表2：

表2

摩尔比例	降解时间(天)
		25PLA∶75PGA	160
50PLA∶50PGA	120
		65PLA∶35PGA	160
75PLA∶25PGA	180
		100PLA∶0PGA	＞200
0PLA∶100PGA	200

根据上述实验，可以看到PLGA不同的单体比例，其体内降解时间都有差异。为了使产品上的细胞能够完全生长，并很好的和患者自体相吻合，我们选用PLGA(75PLA∶25PGA)。

导致孔隙率和支架强度变化的试验，实验结果如下表3：

表3

可溶性盐和生物降解聚合物的重量比	孔隙率(％)	支架强度(kPa)
			5∶1	82.53	45.25±8.56
10∶1	98.74	29.24±0.42
			15∶1	98.93	16.45±7.28
100∶1	99.26	8.54±2.32

表3表明，随着可溶性盐和生物降解性聚合物的重量比增加，支架的孔隙率逐渐增大，而支架强度逐渐减小。

在实施例1～8的方法中，可溶性盐颗粒大小变化，导致孔径大小、孔隙率变化的试验，实验结果如下表4：

表4

可溶性盐颗粒大小(um)	孔径(um)	空隙总体积(cc/g)	孔隙率(％)
				100～200	52.05±8.13	8.0603	98.03
200～300	103.11±9.06	8.3960	98.04
				300～400	149.24±10.85	9.2803	98.67
500～700	276.34±28.48	9.4526	98.95
				800～1000	436.78±42.56	9.6254	99.03

表4表明，随着可溶性盐颗粒的增大，支架孔径逐渐增大，空隙总体积逐渐增大，孔隙率也逐渐增大。

在实施例1～8的方法中，成型压力变化，导致孔径、孔隙率变化的试验，实验结果如下表5：

表5

成型压力(kpa)	孔径(um)	孔隙率(％)
			345	156.53±1.70	98.24
414	149.24±0.85	98.16
			483	135.22±2.85	97.86

表5表明，随着成型压力的逐渐增大，孔径逐渐变小，孔隙率逐渐变小，但是变化幅度都不大。

在实施例1～8的方法中，接种量不同人体成纤维细胞后7天存活率和蛋白分泌物变化试验，实验结果如下表6：

表6

细胞接种量(104个/支架)	存活率(％初期生存细胞数)	白蛋白分泌量(pg/cell)
			14	36.95	49.69±4.05
28	26.18	35.52±6.83
			42	25.33	37.59±2.88
56	23.47	34.26±0.21

表6表明，随着人体成纤维细胞接种量增加，细胞存活率和白蛋白分泌量逐渐减小。

Claims (1)

1.一种多孔性可生物降解支架，其特征在于：所述的多孔性可生物降解支架，它主要由生物降解性聚合物组成，其中所述的生物降解物包括聚乳酸、聚羟基乙酸、白蛋白、胶原蛋白、聚羟基丁酸酯、聚己丙酯和丙烯酸羟丁酯的一种或两种混合物，所述的多孔性可生物降解支架呈多孔结构；

所述的生物降解聚合物的分子量为5000～500000；

该一种多孔性可生物降解支架的制备方法，它包括以下步骤：

(1)、在常温下，将生物降解性聚合物按重量百分比20～35∶65～80在有机溶剂中自然溶解2～4小时，形成高粘性溶液；

(2)、按盐与生物降解性聚合物的重量比为1∶5～1∶100加入可溶性盐，在常温下均匀搅拌，混合搅拌时间不超过3分钟，形成生物降解性聚合物、有机溶剂和可溶性盐的膏状混合物，然后将膏状混合物快速地填入可塑性模具中，在345～483千帕下加压8～10分钟形成半成品；

(3)、将半成品在25℃～29℃下干燥24～48小时，去除有机溶剂，形成成型产品；

(4)、用纯化水对成型产品进行连续脱可溶性盐24～48小时，致盐浓度小于3微克/毫升；

(5)、脱去可溶性盐后，将成型产品放入超低温保存箱在温度-100℃至-75℃下进行2～6小时的冷冻干燥前的预处理，然后在-70℃至-50℃的温度和真空13帕条件下真空冷冻干燥24～48小时，并在-20℃～8℃以下低温保存；

所述的有机溶剂包括丙酮、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、二氯甲烷、丁酮、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二噁英和四氢呋喃中的一种或两种混合物；

所述的可溶性盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸钾、硫酸氢钾、硫酸铵、硫酸氢铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵和碳酸氢铵中的一种或两种混合物；

所述的可溶性盐的颗粒大小为100～1000微米。

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