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CN101835488B - 轮状病毒的热灭活 - Google Patents

轮状病毒的热灭活 Download PDF

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CN101835488B
CN101835488B CN200880110436.9A CN200880110436A CN101835488B CN 101835488 B CN101835488 B CN 101835488B CN 200880110436 A CN200880110436 A CN 200880110436A CN 101835488 B CN101835488 B CN 101835488B
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Abstract

本发明提供热灭活轮状病毒的方法，包括将轮状病毒置于约50℃‑80℃、包括50℃和80℃的温度下孵育足够长的时间以使所述轮状病毒不能复制或感染。所述热灭活的轮状病毒具有抗原性并保持基本完整的轮状病毒粒子结构。本发明还提供疫苗组合物和针对轮状病毒对受试者进行接种的方法，包括热灭活轮状病毒的产生和应用。

Description

轮状病毒的热灭活
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2007年9月4日提交的美国临时专利申请No.60/969,826的优先权，所述临时申请的全部内容以引用的方式纳入本文中。
技术领域
本发明主要涉及轮状病毒组合物和方法。更具体地，本发明涉及热灭活轮状病毒的方法和灭活轮状病毒疫苗组合物。
背景技术
在多种引起儿童严重腹泻的肠道病原性病毒中，轮状病毒是最常见的，它导致每年平均611,000例死亡。几乎所有儿童在5岁前都会被轮状病毒感染。所述病毒被认为是高度传染性的，并被描述为“平等”病毒，因为其感染的影响没有特别的社会经济或地理群的差异。尽管大部分儿童能够获得足够的支持性和缓解性医疗护理，挺过感染而不出现严重的长期后果，然而与严重腹泻、呕吐、脱水和休克有关的死亡数目是不可接受的并在可能的情况下需要预防性治疗。
针对轮状病毒介导的疾病所进行的接种是一种解决这种重大健康问题的方案。目前，尽管已经开发和授权了活的口服疫苗，然而对安全性和效力的持续关注支持用灭活轮状病毒疫苗进行肠胃外接种的替代方法。缺少灭活轮状病毒的有效方法和包含灭活轮状病毒的疫苗组合物。具体的困难为处理活的轮状病毒以在将其灭活的同时保持抗原性，所述抗原性与基本完整的双层和三层轮状病毒粒子相关。
对于灭活轮状病毒的有效方法和包含灭活轮状病毒的组合物有着持续的需要。
发明内容
本发明的实施方案提供包含抗原性热灭活轮状病毒的疫苗组合物，所述灭活轮状病毒的特征在于具有基本完整的三层轮状病毒粒子结构。疫苗组合物任选地包含一种佐剂如AlOH。此外，任选地，本发明的疫苗组合物被制成用于肠胃外给予受试者的剂型。本发明的疫苗组合物中所包含的热灭活轮状病毒是任何人或动物轮状病毒，包括A、B、C、D、E、F和G型轮状病毒的任一种。
根据本发明的实施方案，针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括给予所述受试者治疗有效量的包含抗原性热灭活轮状病毒的疫苗组合物。热灭活轮状病毒的特征在于具有基本完整的轮状病毒粒子结构。
本发明的针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括对哺乳动物或鸟类受试者给药。在具体实施方案中，所述受试者为人。本发明的针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括给予热灭活的人或动物轮状病毒，包括A、B、C、D、E、F和G型轮状病毒中的任一种。
给予包含热灭轮状病毒的疫苗组合物从而针对轮状病毒对受试者进行接种，可通过任何合适的途径完成。在具体实施方案中，通过肠胃外途径将所述疫苗组合物给予所述受试者。
根据本发明的实施方案，针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括给予所述受试者至少两剂所述疫苗组合物。
本发明的实施方案提供灭活轮状病毒的方法，尤其是用于对受试者进行接种的灭活轮状病毒的方法。具体方法包括将分离的轮状病毒粒子悬浮在水性缓冲液中，所述水性缓冲液的摩尔渗透压浓度为约200-500mOsm，包含至少一种浓度为约1mM-15mM的二价阳离子的盐以及量为约1-20％w/v的糖和/或糖醇，以得到具有完整轮状病毒粒子结构的轮状病毒制剂粒子的起始制剂。将所述轮状病毒粒子的起始制剂置于约50℃-80℃、包括50℃和80℃的温度下孵育足够长的时间以使轮状病毒不能复制或感染，从而得到热灭活轮状病毒制剂，所述制剂具有抗原性并基本保持起始制剂的完整轮状病毒粒子结构。
所述轮状病毒粒子的起始制剂可为双层轮状病毒粒子、三层轮状病毒粒子，或双层轮状病毒粒子和三层轮状病毒粒子的混合物。
所述孵育时间为约10分钟-24小时，包括10分钟和24小时。任选地，所述孵育时间为约30分钟-10小时，包括30分钟和10小时；在具体实施方案中，所述孵育时间为约1-3小时，包括1小时和3小时。
在另一个备选方案中，将所述分离的轮状病毒粒子过滤，然后将轮状病毒粒子的起始制剂置于约50℃-80℃、包括50℃和80℃的温度下。
在本发明方法的具体实施方案中，将轮状病毒粒子的所述起始制剂置于约55℃-70℃的温度下孵育所述时间。在优选实施方案中，将所述轮状病毒粒子的起始制剂置于约58℃-67℃、包括58℃和67℃的温度下孵育所述时间。
任选地，轮状病毒的热灭活包括第一孵育期和第二孵育期，其中将轮状病毒粒子的起始制剂置于约50℃-80℃、包括50℃和80℃的温度下。在这一实施方案中，所述第一孵育期和第二孵育期总共为约10分钟-24小时，包括10分钟和24小时。
热灭活轮状病毒制剂基本保持所述起始制剂的完整轮状病毒粒子结构，并且所述热灭活轮状病毒制剂的特征在于，基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量与存在与于所述起始制剂中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量基本相似。在所述起始制剂包括三层轮状病毒粒子的情况下，所述热灭活轮状病毒制剂的特征在于，基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于所述起始制剂中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。
本发明灭活轮状病毒的方法适用于轮状病毒，包括例如人轮状病毒、猴轮状病毒、牛轮状病毒、兔轮状病毒、猪轮状病毒、马轮状病毒、狗轮状病毒、山羊轮状病毒、鸟类轮状病毒和鼠科轮状病毒。此外，本发明灭活轮状病毒的方法适用于轮状病毒，包括例如A、B、C、D、E、F和G型轮状病毒。
附图说明
图1A是用磷钨酸染色的活的经纯化猴轮状病毒的电子显微照片的复本，所述病毒的特征在于具有三层结构；
图1B是用磷钨酸染色的根据一个本发明方法的实施方案热灭活的猴轮状病毒的电子显微照片的复本，所述病毒的特征在于具有三层结构；
图2A是考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的数字图像的复本，其示出了泳道1中的分子量标记(千道尔顿)、泳道2中的从活的轮状病毒分离的蛋白和泳道3中的从热灭活轮状病毒分离的蛋白；
图2B是免疫印迹的数字图像的复本，其示出了泳道1中的从活的轮状病毒分离的兔抗轮状病毒免疫反应性蛋白和泳道2中的从热灭活轮状病毒分离的兔抗轮状病毒免疫反应性蛋白；
图3A示出了对热灭活轮状病毒的总血清抗体反应；
图3B示出了对热灭活轮状病毒的中和抗体反应；
图4A示出了对包含AlOH和热灭活轮状病毒的组合物的总血清抗体反应；
图4B示出了对包含AlOH和热灭活轮状病毒的组合物的中和抗体反应；
图5A是纯化的活的人轮状病毒的电子显微照片的复本；
图5B是纯化的热杀死的人轮状病毒的电子显微照片的复本，所述病毒具有与所述起始制剂基本相同的形态，所述起始制剂的样品示于图5A；
图6A是考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的数字图像的复本，其示出了泳道1中的分子量标记(千道尔顿)、泳道2和4中的从活的轮状病毒分离的蛋白以及泳道3和5中的从热灭活轮状病毒分离的蛋白；
图6B是免疫印迹的数字图像的复本，其示出了泳道1中的分子量标记(千道尔顿)、泳道2中的从活的轮状病毒分离的小鼠抗轮状病毒免疫反应性蛋白VP5和泳道3中的从热灭活轮状病毒分离的小鼠抗轮状病毒免疫反应性蛋白VP5或其聚集体；
图7示出了对活的轮状病毒(TLPorg)和热杀死的轮状病毒(60C2h)的VP5的酶免疫测定(EIA)结果，表明这两种制剂含有相似水平的VP5蛋白；
图8A示出了用无抗原的750μg AlPO4接种的4只小猪的粪便样品的病毒脱落(virus shedding)；
图8B示出了用无佐剂的热灭活轮状病毒免疫的小猪的粪便样品的病毒脱落；
图8C示出了用热灭活轮状病毒和佐剂免疫的小猪的粪便样品的病毒脱落；
图8D示出了在只用缓冲液免疫的小猪的粪便样品中测量的病毒脱落；
图9示出了与以安慰剂对照组(GG)接种的受试者相比，用热灭活轮状病毒(HH)接种的受试者中轮状病毒脱落的天数减少。
具体实施方式
本发明提供热灭活轮状病毒的方法和包含热灭活轮状病毒的疫苗组合物。
概略地说，根据本发明的方法，选择加热轮状病毒粒子的温度和在该温度下孵育轮状病毒的时间的组合，从而有效地使轮状病毒灭活，同时保持轮状病毒抗原性并保持基本完整的轮状病毒粒子结构。
术语“被杀死的轮状病毒”、“失活的轮状病毒”和“被灭活的轮状病毒”是指经热处理并且在活的轮状病毒能够复制和/或感染细胞的条件下不能复制或感染的轮状病毒。
轮状病毒粒子结构是本领域熟知的。术语“三层”是指轮状病毒粒子具有三个同心的衣壳层。术语“双层”是指轮状病毒粒子失去最外面的衣壳层而保留中间和最内部的衣壳层。
术语“抗原”是指能在受试者中引发免疫反应尤其是保护性免疫反应的物质。
灭活轮状病毒的方法包括将轮状病毒置于约50℃-80℃、包括50℃和80℃的温度下孵育足够长的时间以使所述轮状病毒灭活，但保持轮状病毒抗原性并保持基本完整的轮状病毒粒子结构。
在其他实施方案中，灭活轮状病毒的方法包括将轮状病毒置于约55℃-70℃、包括55℃和70℃的温度下孵育足够长的时间以使所述轮状病毒灭活，但保持轮状病毒抗原性并保持基本完整的轮状病毒粒子结构。
在一个具体实施方案中，灭活轮状病毒的方法包括将轮状病毒置于约58℃-67℃、包括58℃和67℃的温度下孵育足够长的时间以使所述轮状病毒灭活。所灭活的轮状病毒具有抗原性并保持基本完整的轮状病毒粒子结构。
将轮状病毒置于选定温度下的孵育时间为约10分钟-24小时，包括10分钟和24小时。
在本发明方法的其他实施方案中，将轮状病毒置于选定温度下的孵育时间为约30分钟-10小时，包括30分钟和10小时。
在本发明方法的另一些实施方案中，将轮状病毒置于选定温度下的孵育时间为约1-3小时，包括1小时和3小时。
本发明灭活轮状病毒的方法适用于轮状病毒，包括例如人轮状病毒、猿轮状病毒、牛轮状病毒、兔轮状病毒、猪轮状病毒、马轮状病毒、狗轮状病毒、山羊轮状病毒、鸟类轮状病毒和鼠科轮状病毒。此外，本发明灭活轮状病毒的方法适用于轮状病毒，包括例如A、B、C、D、E、F和G型轮状病毒。
通过本发明的方法灭活的轮状病毒保持活的轮状病毒的特性。具体地，在通过在选定温度下孵育选定时间将三层轮状病毒灭活的情况下，所述灭活的轮状病毒粒子保持基本完整的三层轮状病毒粒子结构。当通过在选定温度下孵育选定时间将双层轮状病毒灭活时，所述灭活的轮状病毒粒子保持基本完整的双层轮状病毒粒子结构。
待热灭活的轮状病毒粒子的起始制剂任选地包括双层和三层轮状病毒粒子。热灭活之后，所得到的热灭活轮状病毒粒子的制剂包含与所述起始制剂基本相似的双层和三层轮状病毒粒子的比例。
此外，通过本发明方法灭活的轮状病毒在病毒蛋白的量和完整性方面与活的轮状病毒基本相似。具体地，根据本发明方法的实施方案热灭活的轮状病毒保持一种或多种基本完整的存在于活的轮状病毒中的病毒蛋白的量基本不变。
例如，根据本发明方法得到的热灭活轮状病毒制剂的特征在于基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于所述起始制剂中基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。因此，在通过本发明方法将包括三层轮状病毒，也可包括双层轮状病毒的轮状病毒起始制剂热灭活的情况下，所得到的热灭活轮状病毒粒子制剂所保持的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于活的轮状病毒中的基本完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量基本相似。
优选地在过滤轮状病毒粒子之后，加热所述轮状病毒粒子以灭活所述粒子。在一个优选的备选方式中，使用孔径为约0.2-0.8微米的过滤器过滤轮状病毒粒子。并非希望囿于理论思考，过滤被认为减少或消除了轮状病毒粒子的聚集物，从而使得热灭活更加有效。
在本发明的灭活轮状病毒方法的具体实施方案中，在孵育过程中例如通过搅拌摇动粒子对使热量均匀分配到轮状病毒粒子上是有利的。
在本发明的具体实施方案中，将轮状病毒粒子置于第一个容器中孵育第一段时间，然后将轮状病毒粒子转移到第二个容器中孵育第二段时间。
用于根据本发明方法热灭活的轮状病毒的起始制剂是根据标准方法制备的。例如，通常用轮状病毒对相容的细胞类型进行接种并将所述细胞保持在允许病毒复制和产生感染粒子的条件下。
允许轮状病毒感染、复制和产生粒子的细胞类型的一个具体实例为哺乳动物细胞系如非洲绿猴肾细胞系。
术语“分离的轮状病毒粒子”是指从轮状病毒粒子通常所在的环境中分离出的轮状病毒粒子，所述环境为例如生物体、细胞、培养细胞上清液和诸如粪便或下水道污物的废弃物。通常从细胞培养上清液中收集轮状病毒粒子用于进行热灭活。所述轮状病毒粒子可从细胞培养上清液中通过例如过滤和/或离心而分离。
在一个具体的实例中，将分离的轮状病毒重悬浮于稀释缓冲液中并置于约50℃-80℃、包括50℃和80℃的温度下孵育足够长的时间以使所述轮状病毒灭活。
用于悬浮分离的轮状病毒粒子的稀释缓冲液是水性缓冲液，尤其是pH保持在5-9的水性缓冲液，例如但不限于，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、马来酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液或组氨酸缓冲液。
在优选的实施方案中，用于本发明方法的稀释缓冲液的摩尔渗透压浓度为约200-500mOsm，优选为约225-450mOsm，更优选为约250-350mOsm。
稀释缓冲液中包含至少一种二价阳离子的盐，包括但不限于CaCl2、MgCl2和MgSO4。所述稀释缓冲液中包含至少一种浓度为约1mM-15mM的二价阳离子的盐。
所述稀释缓冲液中优选地包含病毒粒子稳定剂。在具体实施方案中，病毒粒子稳定剂是糖如单糖和/或二糖，或糖醇。所述稀释缓冲液中包含一种或多种糖和/或糖醇以使所述糖和/或糖醇的总浓度达到约1-20％w/v。糖或糖醇的实例包括但不限于，山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。
在某些实施方案中，用于轮状病毒热灭活方法中的稀释缓冲液基本不含氨基酸。在其他实施方案中，用于轮状病毒热灭活方法中的稀释缓冲液基本不含维生素。任选地，用于轮状病毒热灭活方法中的稀释缓冲液基本不含氨基酸和维生素。
在本发明的实施方案中，用于轮状病毒热灭活方法中的稀释缓冲液含有浓度为约200-2000mg/L的NaHCO3。在其他实施方案中，用于轮状病毒热灭活方法中的稀释缓冲液含有浓度为约300-500mg/L的NaHCO3。
在一个具体的实例中，稀释缓冲液为含有1.3mM CaCl2、0.5mMMgCl2和0.4mM MgSO4的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)，并添加有10％的山梨糖醇。
灭活后，任选地将分离的轮状病毒粒子冻干，例如用于以后重悬浮于药学可接受的载体中。
本发明的实施方案提供包含抗原性热灭活轮状病毒的疫苗组合物，所述灭活轮状病毒的特征在于具体基本完整的三层轮状病毒粒子结构。在其他实施方案中，本发明的实施方案提供包含具有基本完整的三层轮状病毒粒子结构和基本完整的双层轮状病毒粒子结构的疫苗组合物。
本文所用的术语“疫苗组合物”是指包含热灭活轮状病毒的组合物，所述热灭活轮状病毒能够在用所述疫苗组合物接种的受试者中诱导免疫反应。在一个具体的实施方案中，包含热灭活轮状病毒的疫苗组合物刺激产生抗所述热灭活轮状病毒的中和抗体。疫苗组合物优选地包括药学可接受的载体。
术语“药学可接受的载体”是指对受试者基本无毒并且基本不与疫苗组合物中所包含的热灭活轮状病毒反应的载体。药学可接受的载体为固体、液体或凝胶形式并通常为无菌和无热原的。
本发明的疫苗组合物可以适于给予受试者的任何形式存在。
疫苗组合物通过任何合适的给药途径给药，所述途径包括口服和肠胃外途径如皮内、肌内、粘膜、经鼻或皮下给药途径。
在优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物通过肠胃外途径给药。用于肠胃外给药的疫苗组合物可被配制为包含热灭活轮状病毒和药学可接受载体的可注射液体。合适的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等，以及它们合适的混合物；植物油如橄榄油；以及可注射有机酯如油酸乙酯。例如可通过使用包衣如卵磷脂，通过保持分散相所需的粒径，和/或通过使用表面活性剂如十二烷基硫酸钠来保持合适的流动性。任选地包含稳定剂如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化剂。
用于给药或者用于在给药前悬浮于液体中的固体剂型包括例如胶囊剂、片剂、粉剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，将轮状病毒与以下成分混合：至少一种载体，所述载体包括缓冲剂如柠檬酸钠或碱金属磷酸盐，所述碱金属磷酸盐包括例如磷酸钠、磷酸钾和磷酸钙；填充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；保湿剂如甘油；崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、植物淀粉如马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；溶液缓聚剂如石蜡；吸收加速剂如季铵化合物；润湿剂如十六烷醇、单硬脂酸甘油酯和乙二醇；吸附剂如高岭土和膨润土；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇或月桂基磺酸钠；防腐剂如抗细菌剂和抗真菌剂，包括例如山梨酸、庆大霉素和苯酚；以及稳定剂如蔗糖EDTA、EGTA和抗氧化剂。
固体剂型任选地包含包衣如肠溶衣。所述肠溶衣通常为聚合材料。优选的肠溶衣材料的特征在于为可生物蚀解的、可逐渐水解的和/或可逐渐溶于水的聚合物。用于固体剂型的包衣材料的量通常决定服药和药物释放之间的时间间隔。使用的包衣具有一个厚度，使得整个包衣不溶解在与胃酸有关的pH小于3的胃肠液中，而溶解在pH大于3的小肠环境中。可以预期，在实施本发明的过程中，任何具有pH依赖性的溶解性特征的阴离子聚合物都可容易地作为肠溶衣，以实现将所述活性物质递送到下胃肠道中。具体肠溶衣材料的选择倚赖于以下性质，例如，对胃中分解的抗性；在胃中对胃液和活性物质扩散的不渗透性；在目标肠位置消散的能力；储存过程中的物理和化学稳定性；无毒性；以及易用性。
合适的肠溶衣材料包括，例如，纤维素聚合物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、琥珀酸羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选地由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸铵、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙酯形成；乙烯基聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；虫胶；以及它们的组合。一种具体的肠溶衣材料包括例如美国专利No.6,136,345所述的丙烯酸聚合物和共聚物。
所述肠溶衣任选地包含增塑剂以防止形成可使胃液渗入所述固体剂型的孔和裂缝。合适的增塑剂包括，例如，柠檬酸三乙酯(Citroflex 2)、三醋精(三醋酸甘油酯)、乙酰柠檬酸三乙酯(Citroflec A2)、Carbowax400(聚乙二醇400)、邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰化甘油一酸酯、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和邻苯二甲酸二丁酯。具体地，由阴离子羧基丙烯酸聚合物构成的包衣通常含有大约10-25wt％增塑剂，尤其是邻苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯和三醋精。所述包衣也可含有其他包衣赋形剂如防粘剂、消泡剂、润滑剂(如硬脂酸镁)和稳定剂(如羟丙基纤维素，酸或碱)以溶解或分散所述包衣材料并且改善包衣性能和所包覆的产品。
用于口服给药的液体剂型包含热灭活轮状病毒和被制成乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酏剂的药学可接受的载体。本发明的疫苗组合物的液体剂型可包括润湿剂、乳化剂、助悬剂、增甜剂、调味剂或芳香剂。
关于用于制备剂型的常规组分、设备和方法的详细信息参见PharmaceuticalDosage Forms：Tablets，eds.H.A.Lieberman et al.，NewYork：Marcel Dekker，Inc.，1989；L.V.Allen，Jr.et al.，Ansel’sPharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，8th Ed.，Philadelphia，PA：Lippincott，Williams & Wilkins，2004；A.R.Gennaro，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，LippincottWilliams& Wilkins，20th ed.，2003；和J.G.Hardman et al.，Goodman & Gilman′sThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill Professional，10th ed.，2001。
本发明实施方案的疫苗组合物中任选地包含佐剂。本文所用的术语“佐剂”是指增强受试者对抗原的免疫反应而基本无不良反应的物质。佐剂为本领域所知晓，并且包括例如Freund佐剂、氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、氧化铁、皂角甙、葡聚糖如DEAE-葡聚糖，植物油(如花生油、橄榄油和/或维生素E醋酸酯)、矿物油、细菌脂多糖、肽聚糖和蛋白聚糖。
本发明的实施方案提供针对轮状病毒对受试者进行接种的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的包含抗原性热灭活轮状病毒的疫苗组合物，所述热灭活轮状病毒的特征在于具有基本完整的三层和/或双层轮状病毒粒子结构。
本文所用的术语“治疗有效量”是指一个可有效地诱导免疫反应并赋予保护性免疫力以预防或改善轮状病毒介导的疾病的体征或症状的量。在受试者中诱导保护性免疫反应可通过多种本领域所知技术中的任何技术确定，所述技术包括例如抗轮状病毒抗体的检测、抗轮状病毒抗体滴度的测量和/或淋巴细胞增殖测定。可监测轮状病毒介导的疾病的体征和症状以检测受试者中本发明疫苗组合物给药所诱导的免疫反应。例如，免疫反应的诱导可通过轮状病毒介导的疾病的临床体征和症状的减轻来检测，例如粪便中病毒脱落量的下降、病毒脱落在粪便中的天数的减少、受试者腹泻的天数的减少、死亡率的下降、发病率的下降、体重减少的下降或体重增加。
在具体实施方案中，给予本发明方法的疫苗组合物包括一次性给予受试者一剂或多剂疫苗组合物。或者，间隔地给予两剂或多剂疫苗组合物。给予疫苗组合物药剂的合适方案倚赖若干因素，包括例如受试者的年龄和健康程度，所用的疫苗组合物的类型和给药途径。本领域技术人员能够容易地确定用于给予具体受试者的给药剂量和方案。
根据本发明的实施方案的针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括给予所述受试者至少两剂所述疫苗组合物。
尽管所用术语“受试者”在本申请中主要指人，然而应理解，根据本发明的具体实施方案也可给非人动物接种，所述非人动物包括例如牛、马、绵羊、山羊、猪、狗、猫、鸟类、家禽和啮齿动物。因此，根据本发明的针对轮状病毒对受试者进行接种的方法包括对哺乳动物或鸟类受试者给药。在具体实施方式中，所述受试者为人。
以下实施例举例说明了本发明组合物和方法的实施方案。提供这些实施例是出于说明的目的，而不应被认作对本发明组合物和方法的范围的限制。
实施例
实施例1
将非洲绿猴肾细胞在添加有5％胎牛血清(Invitrogen Corporation，GrandIsland，NY)和50μg/ml新霉素(Sigma，St.Louis，MO)的DMEM培养基(InvitrogenCorporation，Grand Island，NY)中培养。将转瓶(rollerbottle)中单层汇合的非洲绿猴肾细胞用猴轮状病毒YK-1感染，感染复数为0.1。YK-1是一种新近分离的具有P[3]，G3特异性的轮状病毒毒株，如Virol.J.，3：40，2006所述。在感染后4天收集感染的培养物。
实施例2
通过以下方式从上清液中纯化利用溶于三层轮状病毒粒子：使用SW32Ti转头通过TNC缓冲液(10mM Tris[pH 8.0]，140mM NaCl，10mM CaCl2)中的40％蔗糖垫层以106,750g离心2小时，然后使用SW40Ti转头通过在CsCl梯度中以111,160g等密度离心17小时。将纯化的病毒粒子重悬浮于稀释缓冲液中进行热灭活，所述稀释缓冲液为含有1.3mMCaCl2、0.5mMMgCl2和0.4mM MgSO4并添加有10％的山梨糖醇的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)。
实施例3
将纯化的病毒粒子重悬浮于含有CaCl2和MgCl2(Invitrogen)并添加有10％山梨糖醇(Sigma)的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中，并储存在-70℃下直至进行热灭活和注射到受试者中。
将纯化的三层轮状病毒粒子用稀释缓冲液稀释至300μg/ml的浓度并使用Millex-HV PVDF Syringe驱动过滤装置(0.45微米；MilliporeCorporation，Bedford，MA)过滤除菌。为热灭活轮状病毒，将病毒粒子置于3.6ml的冻存管(NalgeNunc，Rochester，NY)中并在60℃的循环水水浴(型号为NesLab Ex10；Thermo Electron Corporation，Newington，NH)中孵育1小时，然后转移到另一个新管中并在60℃下再孵育1小时。立即取一小份等分试样检测任何残留的感染性，将剩余的储存在-70℃下直至用于给受试者免疫。
实施例4
将热处理的轮状病毒悬浮液接种到转管(roller tube)中的单层非洲绿猴肾细胞中并在37℃下在滚动设备中孵育7天，以检测灭活效果。然后将感染的细胞培养物在非洲绿猴肾细胞中以相同方式进行第二轮的7天扩增。如果使用市售的EIA试剂盒(Rotaclone；Meridian，Cincinnati，OH)测出接种的细胞培养物为轮状病毒阴性，那么认为YK-1轮状病毒是灭活的。在对照中，将未经热处理的YK-1以相同方式接种到非洲绿猴肾细胞中，感染的培养物经测试为轮状病毒阳性。
实施例5
由电子显微技术确定热灭活之前和之后的轮状病毒粒子的完整性。
从感染的非洲绿猴肾病毒培养物中纯化YK-1轮状病毒，只将三层粒子用于所述灭活研究。将活的和灭活的三层YK-1粒子用磷钨酸染色并用电子显微镜检查。在60℃下热处理2小时后，发现YK-1粒子保持了生物物理学完整性，表现为保持了与活的天然病毒粒子在形态学上相似的三层结构。用磷钨酸染色的经纯化的活YK-1轮状病毒的电子显微图像的复本示于图1A。用磷钨酸染色的经纯化的热灭活YK-1轮状病毒的电子显微图像的复本示于图1B。图1A和图1B中所示的比例尺都表示100nm长度。
实施例6
用本发明的热灭活方法灭活的轮状病毒粒子的纯度和蛋白组成是通过以下方式确定的：进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行考马斯亮蓝染色或使用轮状病毒特异性兔超免疫血清进行免疫印迹分析。从感染的非洲绿猴肾病毒培养物中纯化YK-1轮状病毒，并且只将三层粒子用于所述灭活研究。在60℃下热处理2小时后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配合考马斯亮蓝染色或者配合使用轮状病毒特异性兔超免疫血清的免疫印迹进行分析热灭活的粒子。热处理样品中的轮状病毒在非洲绿猴肾细胞中连续两次传代后仍不生长，这确认了所述病毒的灭活。在对照中，在被原始的、活的、未经热处理的YK-1轮状病毒感染的细胞中观察到了旺盛的病毒生长。对于此分析，使用牛IgG作为标准品(Bio-Rad，Hercules，CA)通过布拉德福特法测量纯化粒子的蛋白浓度。通过以下方式分析活的和热灭活的三层轮状病毒粒子：先在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后进行考马斯亮蓝染色。此分析显示热灭活的病毒粒子含有全部的主要结构病毒蛋白——VP1、VP2、VP4、VP6和VP7并且具有抗原性，如通过使用抗RRV轮状病毒的兔超免疫血清的蛋白质印迹分析检测所证明的那样，如图2A和2B所示。图2A示出了考马斯亮蓝染色的聚丙烯烯胺凝胶的数字图像的复本，其中泳道1含有分子量标记(千道尔顿)而泳道2和3分别含有活的和杀死的YK-1。图2B示出了使用轮状病毒特异性兔超免疫血清的免疫印迹的数字图像的复本，所述免疫印迹显示了主要轮状病毒蛋白的抗原性。泳道1含有来自活的YK-1的蛋白，泳道2含有来自杀死的YK-1的蛋白。主要结构病毒蛋白由图2A和2B右侧的标签标示。
实施例7
对雌性近交系BALB/C小鼠(Covance Research Products，Denver，PA)预抽血，用EIA测得轮状病毒特异性总抗体(IgA、IgG和IgM)为阴性。用溶于稀释缓冲液中的20μg或2μg杀死的YK-1通过两次肌内注射对小鼠(每组7只)进行免疫，在21天后进行增强免疫。对于对照，用缓冲液以相同方式对小鼠(每组6只)进行免疫。对于免疫，将100μl的疫苗或缓冲液注射到小鼠的后肢中，在第0、21和35天抽血，并在第49天大量采血。
在小鼠中测定对热灭活轮状病毒的总血清抗体和中和抗体反应。用热灭活的YK-1通过两次肌内注射(I.M.)给小鼠接种，用EIA测定轮状病毒特异性总抗体(IgA、IgG和IgM)和中和抗体。对于总抗体，以初始稀释度1∶100对每个血清样品进行检测。预抽血的血清样品在此稀释度下检测不到抗体，用数值20确定几何平均滴度和作图。以初始稀释度1∶20检测中和抗体。
通过改良的免疫测定法测量血清中轮状病毒特异性抗体(IgM、IgG和IgA)，细节如Jiang B，et al.，Vaccine 1999；17：1005-13所述。简言之，用稀释的抗RRV轮状病毒的兔超免疫血清包被96孔板(NalgeNunc，Rochester，NY)，用RRV感染的MA104细胞的上清液孵育，然后加入连续稀释的小鼠血清。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgA、IgG和IgM抗体(Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD)孵育96孔板，然后再用底物四甲基联苯胺(Aldrich，Milwaukee，WI)孵育。用1 N HCl终止所述反应，用EIA读数器(MRX Revelation，Dynex Technologies，Chantilly，VA)测量450nm下的光密度(OD)。血清中的抗体滴度被定义为净OD值(RRV的OD减去5％blotto的OD)大于0.1时最高稀释度的倒数。
通过微量中和测定法测量轮状病毒中和抗体，细节如Jiang B，et al.，Vaccine1999；17：1005-13所述。将小鼠血清进行两倍系列稀释，每个稀释度设两个平行试验，用以胰蛋白酶活化的RRV轮状病毒孵育。将活化的轮状病毒或经类似处理的不含血清的MEM培养基在无血清的情况下孵育，分别用作阳性和阴性对照。将添加有终浓度为10μg/ml的胰蛋白酶和0.5％鸡血清(Invitrogen)的MEM培养基中的MA104细胞加入每孔中。在37℃下孵育18小时后，用福尔马林固定96孔板。通过用兔抗RRV超免疫血清、HRP-标记的抗兔IgG然后用四甲基联苯胺孵育96孔板来检测MA104细胞中的轮状病毒抗原。血清中的中和抗体滴度被定义为吸收值比病毒对照吸收值降低70％时的最高稀释度的倒数。
图3A和3B所示的结果表明，热灭活轮状病毒具有高免疫原性，如用热灭活的轮状病毒对小鼠的接种所证明的。
图3A示出了对包含根据本发明方法的一个实施方案热灭活的轮状病毒的组合物的总血清抗体反应。图3A中的抗体滴度被表示为每组(n＝7或6)的几何平均值。误差棒表示1标准误差。图3A示出了在小鼠血清中观察到的轮状病毒特异性总抗体反应，所述小鼠接受了用20μg或2μg热灭活的YK-1轮状病毒进行的单剂免疫。接受用20μg热灭活的轮状病毒进行两次免疫的小鼠具有很高的总抗体滴度。在用2μg热灭活的轮状病毒接种两次的小鼠中观察到尽管较低但是具有可比性(2-8倍)的抗体滴度。最后的血清样品中的抗体高水平保持2周，然后将小鼠无痛杀死。在接受稀释缓冲液的对照小鼠中未检测到抗体滴度(＜100)。
用微量中和测定法检测从各个小鼠获得的血清中的轮状病毒特异性中和抗体，并以同总抗体反应相似的方式检测中和抗体的滴度，如图3B所示。图3B中的抗体滴度被表示为每组(n＝7或6)的几何平均值。误差棒表示1标准误差。除2个以外的全部预抽血清的中和滴度都≤20，并且剩余2个的中和滴度为40。用20μg热灭活的轮状病毒或2μg热灭活的轮状病毒接种一次的小鼠(每组7只)的中和抗体滴度升高较小(2到8倍)，但中和抗体滴度在第二次接种后剧烈升高至1280。中和抗体滴度保持高水平2周，然后将小鼠无痛杀死。用稀释缓冲液免疫的小鼠的中和滴度没有升高。以与检测总抗体相同的方式检测轮状病毒特异性IgA，在接种小鼠的血清中未检测到滴度升高。
实施例8
在具体的试验中，将AlOH佐剂加入组合物以加强所述热灭活轮状病毒疫苗的免疫原性。在这些试验中，将30只BALB/C小鼠分成5组，每组6只；用含有或不含600μg AlOH的2μg或0.2μg抗原通过肌内注射对4组小鼠进行一次免疫。用600μg AlOH以相同方式对第5组中的对照小鼠进行免疫。在第0和21天对小鼠抽血，并在第35天大量采血。全部血清储存在-70℃下直至检测。
用EIA测定中和抗体。对于总抗体，以初始稀释度1∶100对每个血清样品进行检测。预抽血的血清样品在此稀释度下检测不到抗体，用数值20表示几何平均滴度和作图。以初始稀释度1∶20检测中和抗体。结果示于图4A和4B。
图4A示出了对包含AlOH和根据本发明方法的一个实施方案热灭活的轮状病毒的组合物的总血清抗体反应。将佐剂AlOH加入热灭活YK-1轮状病毒中增强了对所述热灭活YK-1轮状病毒的免疫反应，并且用极低剂量的抗原产生了高滴度的抗体，如图4A和4B所述。在图4A和4B中，抗体滴度被表示为每组(n＝6)的几何平均值。误差棒表示1标准误差。
用不含或含有600μg AlOH的2μg或0.2μg杀死的YK-1通过肌内注射对小鼠(每组6只)进行一次免疫。图4A显示，在接受2μg或0.2μg抗原的小鼠中检出了轮状病毒特异性抗体的滴度，并且加入AlOH增加了总抗体滴度。这些高水平抗体滴度又增加了2周，然后将小鼠无痛杀死。在接受600μg AlOH的对照小鼠中未检出轮状病毒特异性抗体的滴度(＜100)。
图4B示出了对包含AlOH和根据本发明方法的一个实施方案热灭活的轮状病毒的组合物的中和抗体反应。
实施例9
将纯化的具有基因型P[8]，G1的A型人轮状病毒粒子毒株重悬浮于稀释缓冲液中，所述稀释缓冲液为含有1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.4mM MgSO4的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)，并添加有10％的山梨糖醇；储存在-70℃下直至热灭活和注射到受试者中。
用稀释缓冲液将纯化的人轮状病毒粒子样品稀释至300μg/ml的浓度，所述稀释缓冲液为含有1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.4mMMgSO4并添加有10％的山梨糖醇的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)；使用Millex-HV PVDF Syringe驱动过滤装置(0.45微米；MilliporeCorporation，Bedford，MA)过滤除菌。
为热灭活人轮状病毒，将稀释缓冲液中的病毒粒子置于3.6ml的冻存管(NalgeNunc，Rochester，NY)中并在60℃的循环水水浴(型号为NesLab Ex10；ThermoElectron Corporation，Newington，NH)中孵育1小时，然后转移到另一个新管中并在60℃下再孵育1小时。立即取一小份等分试样检测任何残留的感染性，将剩余的储存在-70℃下直至用于给受试者免疫。
将经热处理的人轮状病毒悬浮液接种到转管中的单层非洲绿猴肾细胞中并在37℃下在滚动设备中孵育7天，以确认灭活效果。然后将感染的细胞培养物在非洲绿猴肾细胞中以相同方式进行第二轮的7天扩增。如果使用市售的EIA试剂盒(Rotaclone；Meridian，Cincinnati，OH)测出接种的细胞培养物为人轮状病毒阴性，那么认为人轮状病毒是灭活的。在对照中，将未经热处理的人轮状病毒以相同方式接种到非洲绿猴肾细胞中，感染的培养物经检测为人轮状病毒阳性。
由电子显微技术确定热灭活之前和之后的轮状病毒粒子的完整性。将活的和灭活的人轮状病毒粒子用磷钨酸染色并用电子显微镜检查。在60℃下热处理2小时后，发现人轮状病毒粒子保持了生物物理学完整性，表现为保持了与活的天然病毒粒子在形态学上相似的三层结构。图5A和5B为显示经纯化的活的和热杀死(灭活的)的人轮状病毒A CDC-9的电子显微照片的复本。
热灭活后，通过聚丙烯烯胺凝胶电泳和染色以及通过免疫测定来检测人轮状病毒粒子以确定所述粒子的蛋白含量和完整性。
图6A是考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的数字图像的复本，其示出了泳道1中的分子量标记(千道尔顿)、泳道2和4中来自活的人轮状病毒的蛋白以及泳道3和5中来自热灭活的人轮状病毒的蛋白。将泳道2和3中的样品在分析前在37℃下孵育10分钟，而将泳道4和5中的样品在分析前在97℃下处理5分钟。
图6B是免疫印迹的数字图像的副本，其示出了泳道2中的从活的人轮状病毒分离的小鼠抗轮状病毒免疫反应性蛋白VP5和泳道3中的从热灭活的人轮状病毒分离的小鼠抗轮状病毒免疫反应性蛋白VP5或其聚集体。将泳道2和3中的样品在分析前在37℃下孵育10分钟。在泳道4和5的样品中未检出VP5人轮状病毒免疫反应性蛋白或VP5聚集体，其中将所述样品在分析前在97℃下处理5分钟。结果表明，热灭活不破坏VP5(VP4的裂解产物)但可导致VP5的聚集或重排。
图7示出了用VP5特异性单克隆抗体通过EIA对人轮状病毒CDC-9的分析。在活的和热灭活的CDC-9制剂中检出了相似VP5的水平。
实施例10
定菌小猪-I
轮状病毒疾病的定菌小猪模型被用于具体实施例中。此小猪模型使得检测可在确定环境下进行，从而避免动物所处环境问题，并使得疾病可用作结果变量。此模型还可检测具有抗同型Wa攻击的G1血清型的热灭活轮状病毒疫苗。
选择13只定菌小猪并随机分为表1所示的4组。
表1
组名 组中小猪数 CDC-9抗原(μg) AlPO4(μg)
AA 4 0 750
BB 4 75 0
CC 3 75 750
DD 2 0(缓冲液) 0(缓冲液)
表1所示的每组动物是相互隔离的。分别用不含或含有佐剂的热灭活轮状病毒疫苗通过肌内注射给组BB和CC中的动物接种三次。此实施例中的疫苗制剂在混合有750μgAlPO4的稀释液中包含75μg热灭活的经纯化CDC-9——一种具有血清型P[8]，G1的A型人轮状病毒毒株。分别用750μg AlPO4和缓冲液以相同方式给组AA和DD中的动物接种。用布拉德福特法测定抗原吸收，显示约50％的抗原与AlPO4结合。在这些免疫接种中，结合和未结合的抗原都被注射。
如表1所示，用包含750μg AlPO4但无抗原、包含75μg抗原但无AlPO4、包含75μg抗原和750μg AlPO4或者既无抗原也无AlPO4-即仅缓冲液的疫苗制剂对小猪进行免疫。每次接种都是通过将0.5ml疫苗制剂注射到所述小猪的后肢肌肉内进行。在以10-12天的间隔给予3剂疫苗制剂后，给小猪口服强毒Wa轮状病毒进行攻击。病毒攻击之前，对每只小猪给予3ml碳酸氢钠以中和胃中的酸。每天从被攻击的小猪收集粪便样品，持续10天。在整个实验过程中，以7-14天的间隔采集血样。图8A示出了用无抗原的750μg AlPO4接种的4只小猪的粪便样品中的病毒脱落。图8B示出了用无佐剂的抗原免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。图8C示出了用抗原和佐剂免疫的小猪的粪便样品中的病毒脱落。图8D示出了在只用缓冲液免疫的小猪的粪便样品中测量的病毒脱落。这些附图显示，只用AlPO4或只用稀释缓冲液假接种的小猪均脱落轮状病毒最多至5天并处于高滴度。相反，用无AlPO4的热灭活轮状病毒接种的小猪得到了部分保护，表现为缩短至1天的脱落或者延迟和降低的脱落。在用热灭活的轮状病毒和AlPO4接种的3只小猪中，2只得到了完全保护，1只只有短短1天的、降低的脱落。因此这些结果表明了本发明实施方案的热灭活疫苗制剂的效力。
实施例11
定菌小猪-II
选择11只定菌小猪并随机分为表2所示的2组。
表2
组名 组中小猪数 CDC-9抗原(μg) AlPO4(μg)
GG 5 0 600
HH 6 50 600
如表2所示，用包含600μgAlPO4但无抗原或者包含50μg抗原和600μg AlPO4的疫苗制剂对小猪进行免疫。每次接种都通过将0.5ml疫苗制剂注射到所述小猪的后肢肌肉内进行。以10-12天的间隔给予3剂疫苗制剂后，给小猪口服强毒Wa轮状病毒进行攻击。病毒攻击之前，对每只小猪给予3ml碳酸氢钠以中和胃中的酸。每天从被攻击的小猪收集粪便样品，持续10天。在整个实验过程中，以7-14天的间隔采集血样。
表3显示的数据为用热灭活的人轮状病毒或安慰剂通过肌内注射进行接种并通过口服人轮状病毒Wa进行攻击的小猪中的中和抗体滴度。所用缩写：ID，识别代号；PID，接种后天数；PCD；攻击后天数；ND，未确定。
表3
表4显示用热灭活的人轮状病毒(IRV)或安慰剂通过肌内注射进行接种并通过口服人轮状病毒Wa进行攻击的小猪中抗原脱落情况。表4示出了Wa攻击后0-10天从小猪收集的粪便样品中人轮状病毒抗原的检测。人轮状病毒抗原的检测是通过市售EIA试剂盒(Rotaclone)进行。所示为OD值。所用缩写：PID。数据显示，给予热灭活人轮状病毒降低了轮状病毒脱落的强度和持续时间。
表4
13-11 0 0 0 0 2 16 4 0 0 0 0
图9示出了用热灭活的轮状病毒接种的小猪在受到Wa轮状病毒攻击后自其收集的粪便样品中轮状病毒脱落持续时间有所下降。人轮状病毒抗原的检测是通过市售EIA试剂盒(Rotaclone)进行。数据显示用热灭活的轮状病毒接种具有抗感染的保护作用。
本说明书提到的所有专利或出版物都以引用的方式纳入本文中，程度相当于每篇单独的出版物都具体地且分别地以引用的方式纳入本文中。
本文所述的组合物和方法在目前表示优选的实施方案，它们是示范性的，而非意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员会想到其中的改变和用于其他应用。这些改变和其他应用可在不背离如权利要求所限定的本发明范围的情况下作出。

Claims (34)

1.一种包含分离的抗原性热灭活轮状病毒颗粒的疫苗组合物，所述热灭活轮状病毒颗粒的特征在于具有选自如下的完整的轮状病毒粒子结构：三层轮状病毒粒子、双层轮状病毒粒子以及三层轮状病毒粒子和双层轮状病毒粒子的组合，所述热灭活轮状病毒颗粒通过如下方式获得：将分离的轮状病毒粒子悬浮在具有1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.4mMMgSO4及10％w/v的山梨糖醇的汉克斯平衡盐溶液中，以得到具有完整轮状病毒粒子结构的轮状病毒粒子的起始制剂；将所述轮状病毒粒子的起始制剂暴露在58℃-60℃、包括58℃和60℃的温度下2小时，从而得到热灭活的轮状病毒制剂，所述制剂具有抗原性并保持起始制剂的完整轮状病毒粒子结构。
2.权利要求1的疫苗组合物，还包括一种佐剂。
3.权利要求2的疫苗组合物，其中所述佐剂为一种含铝的佐剂，其选自：AlOH、一种铝盐以及它们的组合。
4.权利要求2的疫苗组合物，其中所述佐剂为AlPO4。
5.权利要求1的疫苗组合物，其被制成用于对受试者肠胃外给药的剂型。
6.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒是一种人或动物轮状病毒。
7.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒是一种A型轮状病毒。
8.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒是一种B型轮状病毒。
9.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒是一种C型轮状病毒。
10.权利要求1的疫苗组合物，其中所述轮状病毒选自：D型轮状病毒、E型轮状病毒、F型轮状病毒和G型轮状病毒。
11.权利要求1的疫苗组合物，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量相似。
12.权利要求1的疫苗组合物，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量相似。
13.分离的抗原性热灭活轮状病毒颗粒在制备用于针对轮状病毒对受试者进行接种的药剂中的用途，其中所述分离的热灭活轮状病毒颗粒的特征在于具有选自如下的完整的轮状病毒粒子结构：三层轮状病毒粒子、双层轮状病毒粒子以及三层轮状病毒粒子和双层轮状病毒粒子的组合，所述热灭活轮状病毒颗粒通过如下方式获得：将分离的轮状病毒粒子悬浮在具有1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.4mM MgSO4及10％w/v的山梨糖醇的汉克斯平衡盐溶液中，以得到具有完整轮状病毒粒子结构的轮状病毒粒子的起始制剂；将所述轮状病毒粒子的起始制剂暴露在58℃-60℃、包括58℃和60℃的温度下2小时，从而得到热灭活的轮状病毒制剂，所述制剂具有抗原性并保持起始制剂的完整轮状病毒粒子结构。
14.权利要求13的用途，其中所述受试者为人。
15.权利要求13的用途，其中将所述疫苗组合物通过肠胃外途径给予所述受试者。
16.权利要求13的用途，其中所述疫苗组合物还包含一种佐剂。
17.权利要求13的用途，其中所述轮状病毒是一种人或动物轮状病毒。
18.权利要求13的用途，其中所述轮状病毒是一种A型轮状病毒。
19.权利要求13的用途，其中所述轮状病毒是一种B型轮状病毒。
20.权利要求13的用途，其中所述轮状病毒是一种C型轮状病毒。
21.权利要求13的用途，其中所述轮状病毒选自：D型轮状病毒、E型轮状病毒、F型轮状病毒和G型轮状病毒。
22.权利要求13的用途，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量相似。
23.权利要求13的用途，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量相似。
24.一种灭活轮状病毒的方法，包括：
将分离的轮状病毒粒子悬浮在具有1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2和0.4mM MgSO4及10％w/v的山梨糖醇的汉克斯平衡盐溶液中，以得到具有完整轮状病毒粒子结构的轮状病毒粒子的起始制剂；
将所述轮状病毒粒子的起始制剂暴露在58℃-60℃、包括58℃和60℃的温度下2小时，从而得到热灭活的轮状病毒制剂，所述制剂具有抗原性并保持起始制剂的完整轮状病毒粒子结构。
25.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒的起始制剂具有的完整轮状病毒粒子结构选自：双层轮状病毒粒子、三层轮状病毒粒子以及双层轮状病毒粒子和三层轮状病毒粒子的混合物。
26.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，还包括将所述分离的轮状病毒粒子过滤，然后将所述轮状病毒粒子的起始制剂置于58℃-60℃、包括58℃和60℃的温度下。
27.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中将所述轮状病毒的起始制剂暴露于58℃-60℃、包括58℃和60℃的温度下，所述方法包括第一孵育期和第二孵育期，其中所述第一孵育期和第二孵育期总共为2小时，并且其中所述第一孵育期为1小时并且所述第二孵育期为1小时。
28.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒是一种人或动物轮状病毒。
29.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒是一种A型轮状病毒。
30.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒是一种B型轮状病毒。
31.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒是一种C型轮状病毒。
32.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述轮状病毒选自：D型轮状病毒、E型轮状病毒、F型轮状病毒和G型轮状病毒。
33.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2、VP4、VP5、VP6和VP7的量相似。
34.权利要求24的灭活轮状病毒的方法，其中所述热灭活的轮状病毒制剂的特征在于：完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量与存在于所述起始制剂中的完整的病毒蛋白VP1、VP2和VP6的量相似。
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