CN101828937A

CN101828937A - 一种利用组织工程脂肪再生技术进行整形美容的方法

Info

Publication number: CN101828937A
Application number: CN200910025898A
Authority: CN
Inventors: 王影; 唐玉良; 董运海; 魏翠; 文献; 黄金龙
Original assignee: 王影
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2010-09-15

Abstract

本发明提供一种利用组织工程脂肪再生技术进行整形美容的方法，适用于整形外科及整形美容，属于组织工程领域。本发明技术路线采用直接从病人脂肪组织内提取具有多种分化能力的间充质基质细胞，体外培养增殖，将特定数量的细胞和其他必需成分包覆在水凝胶支架材料内移植入病人体内相应部位。随着支架材料的降解吸收细胞生长成脂肪组织，从而对病人软组织缺损进行再生性修复。本发明的优点是：病人自身的细胞不会给病人带来免疫排斥反应；所使用的水凝胶支架材料最终会在病人体内降解吸收，再生修复效果安全、自然、持久。

Description

一种利用组织工程脂肪再生技术进行整形美容的方法

技术领域

本发明提供一种利用人体自身干细胞进行人体缺损组织的修复方法，适用于整形外科及整形美容，属于组织工程领域。

背景技术

组织、器官的丧失是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。目前临床上常用的组织或器官的修复大致有以下三种途径：自体组织移植、异体组织移植或使用组织代用品。自体组织移植虽然不存在免疫排斥反应，但来源有限并且造成供区损伤。异体组织移植可引起急性排斥反应及疾病的传染，同样存在供应有限等缺陷；人工组织代用品近年来虽然应用较为广泛，但它不具备生理活性，不属于一种生理性的修复，并且容易感染，故其应用仍受到很大限制。

组织工程学的兴起，为上述病患的治疗提供了一条崭新的途径。组织工程是20世纪80年代随着现代医学技术的发展，尤其是细胞生物学、分子生物学和生物材料科学的发展而提出来的医学新概念，其正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。其基本原理和方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程有三个基本的要素：一是种子细胞；二是为细胞提供类似于细胞外基质生长环境的三维支架材料；三是其他成分如生长因子、细胞黏附因子、细胞养分等，为细胞的生长分化提供所需要的微观生理环境。

因先天缺陷、衰老、创伤、感染、肿瘤手术而导致的软组织缺损，是临床上常见而又亟待解决的难题。目前临床上一种常用的方法是自体脂肪移植。自体脂肪移植是将脂肪组织作为软组织填充材料，用于修复体表软组织凹陷畸形及进行体型塑造的一种整形技术，具有外形自然，无免疫排斥等优点，但也存在供体有限、可吸收率高、需反复注射方可维持其外形等不足，因此，如何提高自体脂肪的移植成活率，是目前有待于解决的问题。

本发明中利用组织工程脂肪再生技术进行人体软组织缺陷的修复，有效解决了上述存在的问题，其应用范围有：皮下填充面部除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤、颜面萎缩，隆胸，乳房切除手术后的修复，肿瘤术后修复、阴道松弛后填充，男性生殖器扩充整形等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种利用人体自身脂肪干细胞进行脂肪再生的方法，具体方法如下：

从人体脂肪组织内提取脂肪干细胞作为种子细胞，将种子细胞经体外培养增殖后混合入支架材料中移植入病人体内，脂肪干细胞在体内增殖、分化成为脂肪细胞，进一步形成具有生命活性的脂肪组织，从而对人体内软组织的缺损进行再生性的修复。

本发明中使用的种子细胞是从病人自身脂肪组织内分离纯化制得，因而避免了伦理争议和免疫排斥反应。可以采用注射器抽吸法进行脂肪组织的取材，操作简单，给病人带来的创伤和痛苦小。

本发明中使用的种子细胞包括脂肪组织内经分离纯化得到的间充质基质细胞、脂肪前体细胞等。这些细胞在一定的诱导条件或生理环境下能分化成为脂肪细胞。

本发明中使用的支架材料是具有生物相容性和生物降解性能的高分子水凝胶。水凝胶内混合入脂肪干细胞和其他成分之后，可以通过注射器注入病人体内，手术过程非常简单，不留疤痕，避免了使用固体支架材料时所必须的手术，从而避免了给病人带来的机体损伤和痛苦。患者容易接受。

本发明中使用的水凝胶支架材料可以方便地填充入形状不规则的缺陷内，因此本发明在整形外科中的应用范围非常广泛。

本发明中注射性材料具备流动性，形成的组织柔软，最适合用于脂肪组织的工程化构建。

本发明中使用的水凝胶支架材料非常易于干细胞种植。通过简单的旋涡混合或移液器吹打混匀就可将细胞均匀地混合入水凝胶支架材料，避免了使用固体支架时漫长且不均匀的细胞种植过程。

本发明中使用的水凝胶支架材料非常易于各种成分的加入及其在内部的移动。这些成分包括生长因子以及细胞增殖、分化、生长所必须的营养成分。

本发明的目的之二是提供了一种种子细胞-支架材料复合体的制备方法。

本发明的目的之三是提供了一种构造支架材料和种子细胞复合体中适当的微观生理环境的方法。

本发明的目的之四是运用脂肪再生技术进行人体软组织缺陷的修复，其应用范围为：皮下填充面部除皱，皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤、颜面萎缩，隆胸，乳房切除手术后的修复，肿瘤术后修复、阴道松弛后填充，男性生殖器扩充整形等。

下面从种子细胞、支架材料、微观生理环境三个方面阐述本发明的先进性及可行性。

本发明中采用自脂肪来源的间充质干细胞来源非常丰富，平均每300毫升脂肪组织可以获得2-6亿个这样的细胞。另外由于是采用病人自身的成体干细胞，避免了伦理争议和免疫排斥反应。脂肪组织取材采用的注射器吸脂法，由于操作简单，创伤小，可作为临床获取脂肪组织工程种子细胞的首选方法。

由于人体待修复的组织在形态、功能、结构等方面区别很大，对支架材料也有不同的要求。但是以下几点基本要求必须满足：生物相容性，无免疫原性；适当的降解速率，降解产物无毒无副作用；适当的机械强度等。水凝胶对于脂肪组织工程的构建无疑比固体支架具有巨大的优势。水凝胶是一种在水中溶胀并保持大量水分而又可降解或不降解的聚合物。某些水凝胶由于聚合物网络中的大量水分而赋予了整个材料流体的性质；充盈有大量水分的特性又与机体组织极其相似，使其成为一种理想的作为类似于细胞外基质的支架材料；并且细胞非常容易种植其中；且能为细胞提供真正的三维空间的生存环境；其水凝胶的特性易于营养成分的渗透移动，因此能有效地为细胞提供养分；柔软、湿润的表面以及组织的亲和力大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得水凝胶聚合物具有良好的生物相容性。水凝胶特性又能使其利用简单的注射方法很容易地填充入不规则形状的损坏组织内，从而避免使用固体支架时必须动手术而给病人带来的机体损伤和痛苦。

在支架材料和种子细胞的复合体中，适当的微观生理环境是构建具有生命活性的各种组织和器官至关重要的因素。组织内环境包括了不同的细胞因子、组织特异性细胞外基质以及细胞间相互作用等。其中各种营养成分(如氧)的供应是保证组织工程所构建的各种组织具有生命活性的必要条件。本发明中使用水凝胶支架材料通过简单的旋涡混合或移液器吹打混匀就可将细胞及养分均匀地混合入支架内。在脂肪组织的构建过程中，血管的生成是保证养分供应的必要条件之一，可以通过加入生长因子来刺激脂肪组织工程构建中血管的生成，这些生长因子包括：成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、肝细胞生长因子(hepatocytic growth factor，HGF)、血小板来源的生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor，IGF)等。

具体实施方式

本发明可以通过一下步骤予以完成：

实施例一：人脂肪干细胞提取、纯化、培养

实施例二：标记实验

实施例三：体外成脂肪细胞诱导分化

实施例四：胶原蛋白水凝胶支架的制备

实施例五：脂肪干细胞与胶原蛋白水凝胶的复合物制备

实施例六：脂肪干细胞皮下注射入大鼠形成脂肪组织

实施例一、人脂肪干细胞提取、纯化、培养

(1)将获得的脂肪组织(30毫升)内血管等多余组织剔除后用含有抗生素的D-PBS(美国Sigma公司)冲洗2-3遍；

(2)冲洗干净的脂肪加入2mg/ml的I型胶原酶(美国Worthington公司)于37℃消化60-90min，完全培养基(DMEM+10％FBS，均为美国Gibco公司)终止消化；

(3)200目筛网过滤人脂肪组织消化后的产物；

(4)过滤后以1500转/分的转速离心10min，完全培养基重悬，苔盼蓝(中国国药集团)染色后计数；

(5)在完全培养基中以1×10⁵/cm²的密度将人脂肪干细胞接种在T25的塑料培养瓶(美国Corning公司)中，并置于37℃、5％的二氧化碳培养箱内培养；

(6)待人脂肪干细胞长至85％左右时进行细胞传代。传代时先移去血清培养基，然后每瓶加入2ml 0.25％胰酶(Sigma，美国)室温消化5分钟，显微镜下观察，待细胞变圆后加入血清培养基终止消化，收集消化得到的细胞悬液以1500转/分的转速离心10min，完全培养基重悬后以1∶3的比例重新接种细胞，待细胞长满后得到第一代人脂肪干细胞。

(7)人脂肪干细胞培养扩增按照步骤(6)的方法进行。

实施例二、标记实验

(1)将实施例一获得第二代脂肪干细胞接种到盖玻片上，低糖DMEM和10％FBS完全培养基培养，待第三代细胞长至80％左右，弃培养基并用4％的多聚甲醛(美国Sigma)固定过夜；

(2)固定结束后用PBS洗3次，共5min；

(3)分别用免疫荧光染色抗体鼠抗人PE标记的CD90、PE标记的CD71、RBITC标记的CD106、RBITC标记的CD44、FITC标记的CD45、FITC标记的CD29、FITC标记的CD34(以上均为美国Chemicon产品，稀释比例均为1∶100)孵育，室温条件下放置90min，然后用PBS洗3次，共5min；

(4)Hoechst 33258(美国Sigma)复染核5min，PBS洗1次。最后用50％甘油封片，荧光显微镜(日本，Olympus)拍照，阴性对照都采用PBS代替荧光抗体。

(5)结果显示第三代人脂肪干细胞抗原CD29、CD44、CD71、CD106呈阳性表达，抗原CD45、CD34呈阴性表达。

实施例三、体外成脂肪细胞诱导分化

取第三代人脂肪干细胞，按5×10⁴个/孔接种在6孔板中，低糖DMEM、10％FBS条件下37℃、5％CO2培养箱中静置培养，待细胞至70％汇合后更换成脂诱导培养基：L-DMEM基础培养液含10％FBS、地塞米松(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、吲哚美辛(200μM)、IBMX(500μM)、1％青霉素链霉素混合液。每4天更换一次成脂诱导培养基，成脂诱导两到三周后进行油红O(美国，Sigma)染色，显微镜下观察结果并拍照。

实施例四、胶原蛋白水凝胶支架的制备

取SD大鼠鼠尾，用碘酒擦拭消毒，再用75％乙醇浸泡消毒30min，无菌条件下抽取大鼠尾腱，剪碎，加入灭过菌的0.1％乙酸溶液中，每毫升乙酸溶液中加尾腱25mg。置于4℃冰箱中溶解2～3天，期间反复振摇。4℃ 4000r/min离心30min，上清液即为鼠尾胶原液。-20℃保存备用。

实施例五、脂肪干细胞与胶原蛋白水凝胶的复合物制备

将实施例一中获得的脂肪干细胞混入实施例四所制备的胶原蛋白水凝胶中配制成细胞浓度为3×10⁷/ml的悬浮液，内含浓度为20ng/ml的成纤维生长因子(bFGF，美国Chemicon)。此悬浮液可用来进行皮下注射进行组织工程脂肪再生。

实施例六、脂肪干细胞皮下注射入大鼠形成脂肪组织

裸鼠腹腔注射无菌戊巴比妥钠溶液(按照80～100mg/kg的剂量)，待裸鼠处于昏迷无意识后在其背部皮下通过1ml针头注射器缓慢注入1ml实施例五中获得的脂肪干细胞-胶原蛋白混合物，注射速度是1ml/min。实验对照组设置为注射1ml胶原蛋白水凝胶、1ml生理盐水，以上实验每组分别取用三只裸鼠，注射结束后，相同条件下饲养观察。以上三组试样注射后背部注射部位出现明显的凸起。6周后观察，注射细胞-水凝胶混合物的裸鼠注射部位凸起没有萎缩，与之相比注射生理盐水或胶原蛋白水凝胶的大鼠凸起消失。经解剖切片染色发现注射细胞-水凝胶复合物的裸鼠在部位出现一块新生脂肪组织，染色结果同时显示在新生的脂肪组织内出现了新生的毛细血管，为脂肪组织的存活提供了营养成分的保障。

Claims

1.一种利用干细胞进行人体缺损软组织的修复方法，其特征在于：种子细胞取自病人自身的脂肪组织，经提取、纯化、体外培养扩增后，均匀植入水凝胶支架材料内形成复合物，再注射入病人体内。

2.如权利要求书1所述的人体缺损软组织修复方法，其应用范围有：面部皮下填充除皱，面部皮下填充美容，皮下填充修复凹陷性缺失或损伤、颜面萎缩，隆胸，乳房切除手术后的修复，肿瘤术后修复，阴道松弛后填充，男性生殖器扩充整形等。

3.如权利要求书1所述的病人是指有整形美容需求的所有自然人。

4.如权利要求书1所述的种子细胞取自于病人自身脂肪组织。

5.如权利要求书1所述的种子细胞经从脂肪组织中提取、纯化、体外培养扩增等一系列过程。

6.如权利要求书1所述的复合物，其特征在于：将一定数量的种子细胞(细胞浓度为10⁵～10⁸/ml)植入水凝胶支架材料内形成细胞均匀分散的细胞-水凝胶支架材料复合物。

7.如权利要求书4所述的种子细胞，其特征在于：种子细胞是从脂肪组织内分离出来的间充质干细胞和前脂肪细胞。

8.如权利要求书6使用的水凝胶支架材料，其特征在于：水凝胶支架材料是具有生物相容性和生物降解性能的天然高分子或合成高分子材料。水凝胶支架材料是可以通过针头注射入病人体内的可流动的水凝胶。水凝胶成分为胶原蛋白、透明质酸或透明质酸盐、泊洛沙姆(poloxamer)、纤维素衍生物、海藻酸或海藻酸盐、壳聚糖及其衍生物、纤维蛋白原中的一种或几种的混合物。

9.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为胶原蛋白水凝胶，其重量百分比浓度为0.1-10％。

10.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为透明质酸或透明质酸盐，其浓度为0.1-5％。

11.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为泊洛沙姆(poloxamer)，其浓度为15-30％。

12.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为纤维素衍生物，其浓度为0.1-10％。

13.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为海藻酸或海藻酸盐，其浓度为0.1-10％。

14.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为壳聚糖及其衍生物以及以壳聚糖及其衍生物为基础的混合物，其中壳聚糖及其衍生物浓度为0.1-10％。

15.如权利要求书8所述的一种可供使用的可注射水凝胶支架材料为纤维蛋白原以及以纤维蛋白原为基础的混合物，其中纤维蛋白原浓度为0.1-5％。

16.如权利要求书6，细胞-水凝胶支架材料内可以含有血管生长因子以及细胞必需的营养成分。

17.如权利要求书1，细胞-水凝胶支架材料复合物使用医用注射针头注射入病人体内。