CN101816631A - 用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种抗肿瘤药物技术领域的制剂及其制备方法，包括重量百分比为0.3～3％的碳酸氢盐或碳酸盐、0.0001～5％肿瘤蛋白质抗原、0.1～10％脂质，余量为水。本发明能够促进对其所装载的蛋白或多肽抗原的交叉提呈，从而引起特异性的细胞免疫，达到治疗肿瘤或病毒感染的目的。

Description

用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物技术领域的制剂及其制备方法，具体涉及一种用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

人类在自身发展过程中，与疾病不断进行斗争。随着现代医学的发展，很多威胁人类生命的重大疾病得到了控制，尤其是青霉素的发现带来了一些抗生素的研究突破，使得过去很多致命的感染性疾病得到了控制，人类的平均寿命得到了极大的延长。但是仍有很多危重疾病未能得到有效治疗，肿瘤是其中最典型的药类。根据2000年数据，全球每年有一千万新发肿瘤病例，而且还有上升趋势，WTO预测到2020年每年将有1千五百万新发肿瘤病例。

目前，常用的肿瘤治疗手段包括放疗、化疗和手术治疗三大手段。虽然已经取得了很大的进步，但距离战胜肿瘤仍有很大差距。例如肺癌的治愈率仅为10～15％。面对困境，科学家们寻找更有力的武器。十九世纪末，美国医生Coley发现有感染丹毒的肉瘤患者会发生肿瘤的消退，于是推测感染和肿瘤消退之间有一定联系。他尝试给一些肿瘤患者注射链球菌热源质后，发现患者的肿瘤发展被抑制甚至肿瘤缩小。Coley认为细菌毒素引起的免疫反应对肿瘤发展有抑制作用。这一研究结果说明刺激人体免疫系统能够产生对肿瘤的免疫反应，抑制肿瘤发展，证明人体自身的免疫系统就是战胜肿瘤非常强大的武器，从而拉开了肿瘤免疫治疗的序幕。近年来，随着对人体免疫机制认识的深入，人们越来越认识到肿瘤的免疫治疗可以激发人体的免疫系统，产生特异性很强的抗肿瘤作用，对正常细胞毒性小，同时作用范围广泛，适合多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤，肿瘤特异性的记忆T细胞还能够控制肿瘤复发。由于肿瘤免疫治疗具有这些突出的优点，已经成为一个非常活跃的研究领域，被视为战胜肿瘤的新希望。

肿瘤细胞是由正常细胞突变或转化病毒基因或是自身组织正常基因的异常表达所引起的，所以肿瘤细胞表达一些正常细胞完全不表达或表达量很少的某些蛋白质，即肿瘤抗原。肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(Tumour-specific antigen，TSA)和肿瘤相关抗原(Tumour-associated antigen，TAA)等。肿瘤分子生物学的研究使得越来越多的肿瘤抗原被发现。

肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原主要都是蛋白形式，体外生产重组抗原蛋白将其注入机体可以作为疫苗。进一步的，还可以选择抗原蛋白上的抗原表位肽，制备多肽疫苗。蛋白和多肽疫苗的优点是非常安全，便于生产和质量控制，能够提供大规模应用的可能性。蛋白和多肽疫苗的缺点是免疫原性弱，单独使用时常常引起免疫耐受而非免疫激活，需要佐剂的帮助才能激活特异性T细胞。

佐剂指能够增强抗原免疫原性或控制免疫反应方向的物质。佐剂研究有着悠久的历史，但目前在批准用于人体的只有铝佐剂和MF59乳剂佐剂，而这两种佐剂只能引起体液免疫，而不能引起治疗肿瘤所需要的细胞免疫。近年来发现各种微纳米载体因为可以作为抗原贮库，起到改变抗原释放过程、延长抗原作用时间，促进抗原摄取的作用，还可以实现对抗原提呈细胞的靶向，因而在肿瘤疫苗研究方面有着重要的应用。

经过对现有技术的检索发现，PCT专利申请WO00/62800记载了一种疫苗，PCT专利申请WO2005/065712记载了一种佐剂复合物。但现有技术中往往使用皂角苷、高分子聚合物等，这些物质对人体健康的影响目前尚不完全明确，因此使用受到限制。

脂质体作为一种载体，在药物制剂领域有广泛的应用，如阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体等均已上市销售多年，安全性已经得到证明。在作为疫苗载体方面，也有一些研究报道，但目前的研究主要集中在脂质膜的处方，而对脂质体内水相溶液的处方研究未见报道。现有的方法不能够有效保护抗原免遭内吞体或溶酶体中酶的降解，无法产生治疗性疫苗所必需的蛋白抗原交叉提呈(cross presentation)。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂及其制备方法，促进对其所装载的蛋白或多肽抗原的交叉提呈，从而引起特异性的细胞免疫，达到治疗肿瘤或病毒感染的目的。

本发明通过以下技术方案得以实现：

本发明涉及一种用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，包括重量百分比为0.3～3％的碳酸氢盐或碳酸盐、重量百分比为0.0001～5％肿瘤蛋白质抗原、重量百分比为0.1～10％脂质，余量为水。

所述的肿瘤为宫颈癌、肺癌、肝癌、肾癌、黑色素瘤、食管癌、肠癌等；

所述的碳酸氢盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢钙中的一种或其组合；

所述的肿瘤蛋白质抗原为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原；

所述的脂质是指阳离子磷脂、阴离子磷脂或中性磷脂的聚乙二醇修饰产物或胆固醇中的一种或其混合，其粒径在20nm到50μm之间；

所述的阳离子磷脂、阴离子磷脂或中性磷脂为两亲性双分子层囊泡结构或脂质颗粒结构。

所述的碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾或碳酸钙中的一种或其组合。

本发明涉及上述用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂的制备方法，在搅拌条件下将溶解有脂质的有机溶剂与肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液进行混合形成脂质体的混悬液，再分离其中的有机溶剂并进行超声，得到脂质体制剂。

本发明涉及上述用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂的另一种制备方法，通过将脂质溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发除去有机溶剂使其形脂质体膜，然后将肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液进行以下两种任一一种方法：

a)将水溶液加入脂质体膜中进行水合，冷冻干燥过夜并重新水合，形成脂质体的混悬液，反复冻融并超声处理；

b)将肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液加入超声振荡，形成脂质体的混悬液，高压乳均处理；

从而得到脂质体制剂。

根据本发明的技术方案所制备的脂质体包裹于抗原外部，同时内水相中含有碳酸氢盐或碳酸盐。通过内水相中的碳酸氢盐或碳酸盐中和内吞体或溶酶体的酸性环境，破坏内吞体或溶酶体内酶发生作用所需的酸碱环境，从而保护抗原免遭过度降解，保留了抗原表位，提高交叉提呈效率。

本发明能够根据不同的肿瘤，选择其肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，用本发明所描述的制剂进行装载，然后给药，促进抗原提呈细胞对肿瘤抗原的交叉提呈，诱导机体产生针对肿瘤抗原的细胞免疫，从而达到抑制肿瘤生长，延长患者生存期的目的，既可以单独用于治疗肿瘤，也可以与其他治疗手段，如放疗、化疗和手术治疗等结合，也可以用于治疗肿瘤，也可以用于病毒感染疾病。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

以0.3％碳酸钠溶液溶解20mg/mL的鸡卵白蛋白(ovalbumin)溶液，以氯化钠调节等渗，采用卵磷脂(EPC)/胆固醇(cholesterol)摩尔比1/1的脂质处方，通过乙醇注入法制备脂质体，将20mg EPC和10mg cholesterol溶于1mL乙醇中，用微孔滤膜过滤乙醇溶液，待用。将14mL20mg/mL的ovalbumin的0.3％碳酸钠溶液加入到50mL含有搅拌子的烧瓶中，然后在高速搅拌下将1mL脂质的乙醇溶液迅速注入形成脂质体的混悬液。透析除去乙醇，再对制得的脂质体进行超声，使其平均粒径为500纳米。

通过利用分子筛凝胶柱分离脂质体与游离蛋白，10％ Triton溶液将脂质体破膜，HPLC对其中ovalbumin浓度进行定量，以测定所制备的脂质体的组分。最终的脂质体中碳酸钠浓度为0.3％，ovalbumin蛋白抗原浓度为0.4％，脂质浓度为0.2％。同样方法制备普通脂质体(以pH7.4的HEPES溶液作为ovalbumin的溶剂)，作为参比脂质体。

向小鼠来源的骨髓来源树突状细胞(BMDC)中分别加入等浓度的ovalbumin溶液、ovalbumin参比脂质体、以及本实施例描述的ovalbumin新型脂质体，37℃，5％CO2环境中培养12小时后，收集各孔细胞，离心洗去抗原，将各孔细胞分别与RF33.70细胞共培养，24小时后测定细胞培养上清液中的白介素-2含量。

表1RF33.70细胞分泌的白介素-2浓度

组别	白介素-2含量(pg/mL)
		ovalbumin溶液	8.0
ovalbumin参比脂质体	104.5
		ovalbumin新型脂质体	697.2

由表1可见，加入ovalbumin新型脂质体的树突状细胞能够更好实现交叉提呈，使特异性的RF33.70细胞分泌更高浓度的白介素-2。

实施例2

通过冷冻干燥法制备脂质体，以0.9％碳酸氢钠溶解ovalbumin形成2mg/mL的蛋白溶液，以氯化钠调节等渗，将含有40mg DPPC和10mg cholesterol溶于氯仿溶液，置于茄形瓶中，旋转蒸发仪上低压除去氯仿，加入1mL ovalbumin溶液水合，液氮冷冻，冷冻干燥过夜，重新水合，得到脂质体混悬液。对制得的脂质体进行反复冻融并超声，然后先后通过1000nm、400nm、200nm、100nm的膜，使其平均粒径为100nm左右。

利用分子筛凝胶柱分离脂质体与游离蛋白，10％Triton溶液将脂质体破膜，HPLC对其中ovalbumin浓度进行定量，以测定所制备的脂质体的组分。最终的脂质体中碳酸氢钠浓度为0.9％，ovalbumin蛋白抗原浓度为0.04％，脂质浓度为5％。同样方法制备普通脂质体(以pH7.4的PBS溶液作为ovalbumin的溶剂)，作为参比脂质体。

在0、7、14天向6周龄的雄性C57/BL6小鼠左腹部皮下分别注射等浓度的ovalbumin溶液、ovalbumin参比脂质体、以及本实施例描述的ovalbumin新型脂质体，第21天取小鼠T细胞，调整其浓度至3×106/mL，然后3×10⁵T细胞和6×10⁴事先用丝裂霉素C(50μg/mL，45分钟)处理过的E.G7-OVA细胞共培养，在24小时测IL-2含量，48小时测IFN-γ含量。

表2免疫小鼠T细胞分泌的白介素-2和干扰素-γ浓度

组别	白介素-2含量(pg/mL)	干扰素-γ含量(pg/mL)
			ovalbumin溶液	2.1	0.4
ovalbumin参比脂质体	8.3	11.9
			ovalbumin新型脂质体	103.0	163.1

由表2可见，以ovalbumin新型脂质体免疫可以使小鼠产生细胞免疫，分泌更高浓度的IL-2和IFN-γ。

实施例3

通过薄膜分散法制备脂质体，将5mg DPPC、0.6mg cholesterol和0.4mg DOTAP溶于氯仿溶液中，加入茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，以3％碳酸氢钠溶解ovalbumin蛋白为10mg/mL的溶液，向茄形瓶中加入1mL ovalbumin溶液，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。对制得的脂质体进行高压乳匀，使其平均粒径为200nm左右。

利用超速离心分离脂质体与游离蛋白，10％Triton溶液将脂质体破膜，HPLC对其中ovalbumin浓度进行定量，以测定所制备的脂质体的组分。最终的脂质体中碳酸氢钠浓度为3％，ovalbumin蛋白抗原浓度为0.005％，脂质浓度为0.6％。同样方法制备普通脂质体(以pH7.4的PBS溶液作为ovalbumin的溶剂)，作为参比脂质体。

在0、7、14天向6周龄的雄性C57/BL6小鼠左腹部皮下分别注射等浓度的ovalbumin溶液、ovalbumin参比脂质体以及本实施例描述的ovalbumin新型脂质体，第21天取小鼠T细胞，用5×10⁵/mL用丝裂霉素处理后的E.G7-OVA细胞刺激5天，培养液中同时加入IL-2，然后收集CTL效应细胞。E.G7-OVA作为靶细胞，以Na₂CrO₄标记测定细胞毒性。

表3免疫小鼠抗原特异性CTL活力(specific lysis％)

由表3可见，本实施例描述的ovalbumin新型脂质体诱导产生了较强的CTL活力。

实施例4

通过薄膜分散法制备脂质体，将10mg DMPC溶于氯仿溶液中，然后加入茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，以0.9％碳酸钠溶解ovalbumin蛋白为30mg/mL，向茄形瓶中加入1mL ovalbumin溶液，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。对制得的脂质体进行高压乳匀，使其平均粒径为200nm左右。

利用分子筛凝胶柱分离脂质体与游离蛋白，10％Triton溶液将脂质体破膜，HPLC对其中ovalbumin浓度进行定量，，以测定所制备的脂质体的组分。最终的脂质体中碳酸钠浓度为0.9％，ovalbumin蛋白抗原浓度为0.15％，脂质浓度为3％。同样方法制备普通脂质体(以0.9％NaCl溶液作为ovalbumin的溶剂)，作为参比脂质体。

在第0、7、14天向6周龄的雄性C57/BL6小鼠左腹部皮下分别注射等浓度的ovalbumin溶液、ovalbumin参比脂质体以及本实施例描述的ovalbumin新型脂质体，在第21天，在小鼠皮下种E.G7肿瘤细胞，每只3×10⁵ E.G7肿瘤细胞，然后每隔一天检测肿瘤直径。

表4免疫小鼠的肿瘤生长速度

由表4可见，本实施例描述的ovalbumin新型脂质体能够使免疫小鼠肿瘤生长速度明显减缓。

实施例5

通过薄膜分散法制备脂质体，将40mg DMPC和10mg cholesterol溶于氯仿溶液中，然后加入茄形瓶中，30℃水浴，旋转蒸发除去氯仿使其成膜后，保持真空1小时以除尽溶剂，以0.9％碳酸氢钠溶解人乳头瘤病毒(HPV)的E7蛋白为2mg/mL，向茄形瓶中加入1mLE7溶液，超声振荡，室温放置2h，形成半透明的脂质复合物的混悬液。对制得的脂质体进行高压乳匀，使其平均粒径为200nm左右。

利用分子筛凝胶柱分离脂质体与游离蛋白，10％Triton溶液将脂质体破膜，HPLC对其中E7浓度进行定量，以测定所制备的脂质体的组分。最终的脂质体中碳酸氢钠浓度为0.9％，E7蛋白抗原浓度为0.05％，脂质浓度为5％。同样方法制备普通脂质体(以0.9％NaCl溶液作为E7蛋白的溶剂)，作为参比脂质体。

给6周龄的雌性C57/BL6小鼠注射TC-1细胞建立肿瘤，在第6天左腹部皮下分别注射等浓度的E7溶液、E7参比脂质体以及本实施例描述的E7新型脂质体，统计肿瘤生长小鼠的比例

表5免疫小鼠的肿瘤生长比例

由表5可见，本实施例描述的含有E7蛋白的新型脂质体能够使免疫小鼠肿瘤得到治愈。

Claims (8)

1.一种用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征在于，包括重量百分比为0.3～3％的碳酸氢盐或碳酸盐、重量百分比为0.0001～5％肿瘤蛋白质抗原、重量百分比为0.1～10％脂质，余量为水。

2.根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征是，所述的碳酸氢盐为碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢钙中的一种或其组合。

3.根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征是，所述的肿瘤蛋白质抗原为肿瘤特异性抗原和肿瘤的抗原。

4.根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征是，所述的脂质是指阳离子磷脂、阴离子磷脂或中性磷脂的聚乙二醇修饰产物或胆固醇中的一种或其混合，其粒径在20nm到50μm之间。

5.根据权利要求4所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征是，所述的阳离子磷脂、阴离子磷脂或中性磷脂为两亲性双分子层囊泡结构或脂质颗粒结构。

6.根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂，其特征是，所述的碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾或碳酸钙中的一种或其组合。

7.一种根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂的制备方法，其特征在于，在搅拌条件下将溶解有脂质的有机溶剂与肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液进行混合形成脂质体的混悬液，再分离其中的有机溶剂并进行超声，得到脂质体制剂。

8.一种根据权利要求1所述的用于肿瘤治疗性疫苗的脂质体制剂的制备方法，其特征在于，通过将脂质溶解于有机溶剂中，通过旋转蒸发除去有机溶剂使其形成脂质体膜，然后将肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液进行以下两种任一一种方法：

a)将水溶液加入脂质体膜中进行水合，冷冻干燥过夜并重新水合，形成脂质体的混悬液，反复冻融并超声处理；

b)将肿瘤蛋白抗原的碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液作超声振荡处理，形成脂质体的混悬液，高压乳均处理；

从而得到脂质体制剂。