CN101812171B - 一种用于生物传感器的导电聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为了解决困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到金属上而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题，提供了一种用于生物传感器的导电聚合物及其制备方法，通过先将生物活性单元引入导电聚合物单体中，然后采用原位电化学组合合成方法及独立寻址的微电极阵列技术，一步直接在电极表面原位形成具有生物活性的导电聚合物，得到功能化微电极阵列以应用于生物传感器。本发明使生物传感器向集约化、微型化和微功耗方向发展成为可能，可以推动疾病诊断、药物筛选、医疗保健、司法鉴定、食品检测、环境监测、个性化药物等以及以上产业链的发展，具有深远的社会意义和广阔的市场价值。

Description

一种用于生物传感器的导电聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于生物传感器的导电聚合物及其制备方法，具体说，是涉及一种采用原位电化学组合合成(combinatorial synthesis)方法，使带有生物活性单元(如DNA，RNA，肽，蛋白质，酶，适配物(aptamer)，组织，细胞等)的导电聚合物一步直接固定于电极之上，得到功能化微电极阵列以应用于生物传感器。

背景技术

生物传感器是一门由生物信息学、生物控制论、仿生学、生物计算机、生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，是一种对物质进行分子水平的快速、平行、微量化的分析方法。待测物质流经生物传感器，经分子识别，将生物活性单元之间交互反应表达的信号经物理或化学换能器转换成为可定量和可处理的电信号，并用电脑进行信息化和数字化。生物传感器技术是介于信息和生物技术之间的新增长点，随着物联网的发展和生物科学、信息科学和材料科学发展的推动，以及光导、光纤、超导、纳米技术、智能材料等新技术的应用，进一步实现信息的采集与传输、处理集成化、智能化，特别是分子生物学与微电子学、光电子学、微细加工技术及纳米技术等新学科、新技术结合，正改变着传统医学、医疗保健、疾病诊断、食品检测、环境监测的面貌。生物传感器是生物技术与信息技术的完美融合，是生物信息的物化，是物联网的战略前沿，掌握了生物传感器技术并将之数字化、自动化、微型化、集约化、智能化，就等于占领了物联网的一个战略制高点。生物传感器的研究开发，已成为世界科技发展的新热点，形成21世纪新兴的高技术产业的重要组成部分，具有重要的战略意义。

导电聚合物因其特殊的结构和优异的物理化学性能，在光学、电磁学和化学等领域具有广阔的应用前景。近年来，导电聚合物在生物材料领域的应用，取得了一定的研究成果。导电聚合物在生物材料领域中的应用，以作为生物传感器最为多见。通常情况下，将不同的酶、辅酶、抗体、DNA、甚至细胞和组织等生物活性物质固定于导电聚合物中，形成各种新型的生物传感器。这种传感器具有响应性能强，制作过程简单、可控等特点。在构建导电聚合物生物传感器过程中，聚合物的合成通常采用操作简单、易于控制的电化学方法。在聚合过程中，生物活性物质既可与聚合物单体同时聚合到电极表面，也可先与其单体吸附在电极表面，再氧化聚合形成生物识别固态元件。其间，通过有效地控制聚合物电聚合过程，生物活性物质可固定到各种类型的电极或者电极的特定部位，也可将两种或多种酶等生物活性物质同时固定于同一层聚合膜或分别固定于多层聚合膜上。导电聚合物作为分子导线，其三维立体结构可使电子在生物分子(活性中心)与电极表面直接传递，显著提高生物传感器的响应特性。通过控制聚合膜的厚度、生物分子在膜中的空间分布、聚合膜的空隙度等指标可以调整生物传感器的响应特性和选择性。

构建导电聚合物生物传感器的关键是如何将生物活性物质有效地固定在导电聚合膜上，且最大限度地保持其生物活性，形成可长期反复作用的生物识别固态元件。生物活性物质常用的固定方法主要有包埋法、共价法、吸附法和交联法。其中以包埋法最为多见，该法依赖于电化学聚合而实现，即，在电化学聚合的同时，生物活性物质以包埋的形式固定到导电聚合膜中。目前，导电聚合物生物传感器的研究虽然取得了一定的成果，但同时也面临了一些问题。如无常规设备可制造稳定的可重复生产的导电聚合物生物传感器，这在很大程度上限制了此类传感器在分析领域的广泛应用。

发明内容

本发明为了解决困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到金属上而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题，提供了一种用于生物传感器的导电聚合物及其制备方法，使生物传感器的集约化、微型化和微功耗成为了现实。

为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下：

本发明的用于生物传感器的导电聚合物，具有如下通式：

通式中的R＝S或NH；

通式中的R1为其中的n可为1、2或3；

X代表生物活性单元，可以是DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞，优选辅酶R-生物素(Biotin)；

通式中的R2是氢。

本发明的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，包括如下具体步骤：

a)制备带有生物活性单元的导电聚合物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入导电聚合物单体的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与导电聚合物单体的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂(activator)，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸馏至粉末状；加入过量氧化溶液(oxidation solution)，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺的质量比为8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入质量百分比浓度为10％的氢氧化铵水溶液脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

b)将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为步骤a)制备得到的带有生物活性单元的导电聚合物单体与其摩尔量的1～10倍的未经修饰的导电聚合物单体及适量作为电解质的氯化钾混合而成；以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间的逻辑电路控制下，具有生物活性的导电聚合物立即在电极表面原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得用于生物传感器的功能化微电极阵列。

所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺；所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺优选带有辅酶R-生物素的甘醇亚磷酰胺。

所述的导电聚合物单体可以是通式为：

的吡咯衍生物，其中的n可为1、2或3。

所述的导电聚合物单体还可以是通式为：

的噻吩衍生物，其中的n可为1、2或3。

所述电极可以是金属、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料，优选金属。

所述金属可选自铂、铱、钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨或铝，优选铂。

正因为每个电极都与其下的独立寻址逻辑及放大电路连接，所以都具有智能传感和讯号放大功能，当以一定的脉冲波扫描每个电极时，会产生一个微小的偶极化电子信号，此信号因电极所处的生物环境(有无分子识别反应)的变化而略有差异，因此，CMOS的运用提供了前所未有的可重复性，高度灵活的微米和亚微米范围内合成聚合物微阵列的能力，使生物传感得以成为现实。

本发明人还研究发现：随着反应的进行，具有生物活性并导电的聚合物分子在形成电流通路的同时不断延伸，依次从纳米颗粒到纳米纤维，最后纤维与纤维连接成片状网络结构。通过调控单体浓度、电流密度和反应时间等活性自由基聚合条件，可以控制具有生物活性并导电的聚合物生长成纳米纤维。因为纳米纤维状的导电聚合物具有纳米的三维微观结构，具有独特的化学、物理性质，因此，可大幅提高对生物分子或者细胞的检测灵敏度，大大缩短检测的反应时间，使生物传感器向集约化、微型化和微功耗方向发展成为可能。

与现有技术相比，本发明的突破点主要有以下几点：

1、通过先将生物活性单元引入导电聚合物单体中，然后采用原位电化学组合合成方法，可以一步直接在原位形成具有生物活性的导电聚合物，解决了困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到电极上、而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题。

2、通过调控单体浓度、电流密度和反应时间等活性自由基聚合条件，可以控制导电聚合物生长成纳米纤维状，从而大幅提高对生物分子或者细胞的检测灵敏度，大大缩短检测的反应时间，使生物传感器向集约化、微型化和微功耗方向发展成为可能。

3、由于本发明的生物传感器是用导电纳米纤维作为探头，具有灵敏度高、采样量小、重现性好、速度快、高通量、微型化、微功耗、数位化、便于携带和现场操作等优点，在与物联网的互动下，能够实现公共场所流行性传染病的监测，达到防患于未然的目的。因此，本发明可以推动疾病诊断、药物筛选、医疗保健、司法鉴定、食品检测、环境监测、个性化药物等以及以上产业链的发展，具有深远的社会意义和广阔的市场价值。

附图说明

图1是本发明中的独立寻址逻辑电路芯片的结构示意图；图中：1是指聚合反应驱动电路；2是指通过内部寻址连接导通的电极；3是指通过内部寻址连接的电极但在实验中有意不通电而保持惰性；

图2是实施例3所制备的功能化微电极阵列在室光下的照片(16微米直径的电极经100倍光学放大得到)；

图3是实施例4所制备的功能化微电极阵列在室光下的照片(16微米直径的电极经50倍光学放大得到)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明；实施例中所用化学试剂均向美国Sigma-Aldrich公司采购，生物素甘醇亚磷酰胺及供DNA合成之用的活化剂(activator)和氧化溶液(oxidation solution)是从美国Glen Research公司采购。

实施例1：制备带有生物活性单元的吡咯衍生物单体

将生物素甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入1-FMOC-3-吡咯甲醇的无水乙腈溶液，其中：生物素甘醇亚磷酰胺与1-FMOC-3-吡咯甲醇的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌30分钟后，进行减压蒸馏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺的质量比为8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌10分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入质量百分比浓度为10％的氢氧化铵水溶液脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用即可，本实施例的化学反应式如下：

类似的合成方法也适用于4位上具有饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基的1-FMOC-3-吡咯甲醇、1-FMOC-3-吡咯乙醇、1-FMOC-3-吡咯丙醇、1-BOC-3-吡咯甲醇、1-BOC-3-吡咯乙醇或1-BOC-3-吡咯丙醇。

实施例2：制备带有生物活性单元的噻吩衍生物单体

将生物素甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入3-噻吩甲醇的无水乙腈溶液，其中：生物素甘醇亚磷酰胺与3-噻吩甲醇的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌30分钟后，进行减压蒸馏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺的质量比为8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌10分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入质量百分比浓度为10％的氢氧化铵水溶液脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用即可，本实施例的化学反应式如下：

类似的合成方法也适用于4位上具有饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基的3-噻吩甲醇、3-噻吩乙醇或3-噻吩丙醇。

实施例3：制备用于生物传感器的导电聚吡咯

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片(见图1所示)上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为制备得到的带有生物素取代基的吡咯单体与其摩尔量的1～10倍的吡咯及适量作为电解质的氯化钾混合而成；以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在1.5伏，30秒总时间的逻辑电路控制下，具有生物活性的导电聚吡咯立即在电极表面原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得用于生物传感器的功能化微电极阵列，图2即为室光下电极的照片(16微米直径的电极经100倍光学放大得到，其中圆形为电极，电极周围为绝缘体)。

实施例4：制备用于生物传感器的导电聚噻吩

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片(见图1所示)上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为制备得到的带有生物素取代基的噻吩单体与其摩尔量的1～10倍的噻吩及适量作为电解质的氯化钾混合而成；以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在2.0伏，30秒总时间的逻辑电路控制下，具有生物活性的导电聚噻吩立即在电极表面原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得用于生物传感器的功能化微电极阵列，图3即为室光下电极的照片(16微米直径的电极经50倍光学放大得到，其中圆形为电极，电极周围为绝缘体)。

实施例中使用的电极为铂金属，可由铱或其他金属(例如：钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨、铝)或金属合金、碳纳米管、玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料所替代。

Claims (10)

1.一种用于生物传感器的导电聚合物，其特征在于，具有如下通式：

通式中的R＝S或NH；

通式中的R1为

其中的n为1、2或3；

X代表生物活性单元；

通式中的R2是氢。

2.根据权利要求1所述的用于生物传感器的导电聚合物，其特征在于，所述生物活性单元是DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞。

3.根据权利要求2所述的用于生物传感器的导电聚合物，其特征在于，所述生物活性单元是辅酶R-生物素。

4.一种权利要求1所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

a)制备带有生物活性单元的导电聚合物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入导电聚合物单体的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与导电聚合物单体的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸馏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％的氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

b)将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个流体反应器中，反应器中的反应液为步骤a)制备得到的带有生物活性单元的导电聚合物单体与其摩尔量的1～10倍的未经修饰的导电聚合物单体及适量作为电解质的氯化钾混合而成；在逻辑电路控制下，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间内，具有生物活性的导电聚合物即刻在电极表面原位生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得用于生物传感器的功能化微电极阵列。

5.根据权利要求4所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺。

6.根据权利要求5所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有辅酶R-生物素的甘醇亚磷酰胺。

7.根据权利要求4所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述的导电聚合物单体是通式为：的吡咯衍生物，其中的n为1、2或3。

8.根据权利要求4所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述的导电聚合物单体是通式为：

的噻吩衍生物，其中的n为1、2或3。

9.根据权利要求4所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述电极是金属、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料。

10.根据权利要求9所述的用于生物传感器的导电聚合物的制备方法，其特征在于，所述电极是铂金属。

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