CN101804193B

CN101804193B - CTLA4Ig及其衍生物用于抗病毒

Info

Publication number: CN101804193B
Application number: CN200910004904A
Authority: CN
Inventors: 吴军; 王晓娟; 胡婕; 罗高兴; 贺伟峰
Original assignee: CHONGQING XI'NAN HOSPITAL
Current assignee: CHONGQING XI'NAN HOSPITAL
Priority date: 2009-02-16
Filing date: 2009-02-16
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2029-02-16
Also published as: CN101804193A

Abstract

本发明公开了CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备抗病毒药物中的新应用。本发明首次发现CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物对NK细胞(自然杀伤细胞)的细胞毒性具有显著的激活作用，并且证实CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物提高NK细胞毒性的分子机制是显著提高了NK细胞膜表面的激活受体如NKG2D，NKp44等的表达。实验证明，通过提高机体NK细胞的细胞毒性，CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物可以用于抗病毒治疗。

Description

CTLA4Ig及其衍生物用于抗病毒

技术领域

本发明涉及已知物质的新药用。具体地，本发明涉及CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在治疗病毒中的应用和在制备抗病毒药物中的新应用。

背景技术

CTLA4Ig

活化的T细胞在许多疾病及病理过程中起着十分重要的作用。研究表明，T细胞必须在第一信号(TCR/MHC-Ag)及辅助刺激信号共同作用下才能完全活化(^{1，2，3，4}，见后附参考文献列表。以下同)。前者是T淋巴细胞活化的基础，并决定了T细胞反应的特异性；后者是T细胞活化的必要条件，两者缺一不可。缺乏或阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应性(anergy)或细胞凋亡(apoptosis)及克隆丢失(deletion)^{(2，3，4，5)}。到现在为止已发现多种辅助刺激信号系统，如B7/CD28-CTLA4系统、CD40/CD40L系统、CD95(Fas)/Fas L、CD2/LFA3、ICAM1/LFA1、VCAM1/VLA4系统等^{(6，7，8，9)}。后者为T细胞膜上表面分子，前者为表达于APC膜上的相应配体，二者相互作用发挥辅助刺激作用。研究发现，在所有的辅助刺激信号途径中，B7/CD28-CTLA4系统被认为是最重要的辅助刺激信号系统(6)。

CTLA4(Cytotoxic Lymphocyte Antigen 4，CTLA4)是细胞毒性T淋巴细胞中发现的第四种特异性抗原基因编码的糖蛋白。最早由Brunt等在筛选小鼠CTL细胞cDNA扣除文库时发现其编码基因⁽¹⁰⁾。在人类，其基因位于2号染色体长臂33带(2q33)(CD28基因也同在此位点)，单拷贝，长约4Kb，含有4个外显子和3个内含子。外显子1含108bp，编码一段含疏水氨基酸的前导链，外显子2含348bp，编码CTLA4V区116个氨基酸，外显子3含111bp，编码37个氨基酸，包括胞外一部分氨基酸、跨膜区疏水氨基酸和胞浆内功能区开始几个氨基酸，外显子4有102bp，编码CTLA4胞浆段大部分氨基酸，其后是3’非编码区的1150bp，含有约60个AT重复序列辊，可能与控制mRNA的稳定性有关⁽¹¹⁾。CTLA4是一种跨膜糖蛋白，除信号肽及终止信号外，人CTLA4由187个氨基酸组成，第109至111位为糖基化位点。由膜外区166个氨基酸、跨膜区37氨基酸和胞浆区34个氨基酸组成。主要表达在活化T细胞膜上，并发现，其表达在刺激后48小时左右达高峰⁽¹²⁾。CTLA4可和CD28分子竞争性抑制与APC膜上的B7分子结合，从而阻断T淋巴细胞活化中的B7-CD28辅助信号途径，进而阻断T细胞的活化。另一方面，当T细胞CTLA4分子与B7分子结合后，致CTLA4胞内段磷酸化，产生负调信号，从而阻断T淋巴细胞活化及功能，因而认为CTLA4是一种T细胞活化的负性调节因子⁽¹³⁾。

CTLA4胞外段的主要功能是与其相关配体B7分子结合，现在已发现三种以上的B7分子，分别命名为B71(CD80)、B72(CD86)、B73等^(14，15)。但CTLA4胞外区与B7分子的结合力比CD28大20至100倍⁽¹⁶⁾。跨膜区是将胞外区被B7分子结合的信号传向细胞内。CTLA4胞内区是将外来信号转变成细胞负调信号，而降低T细胞的功能。所以，CTLA4至少通过两条途径发挥着下调T细胞功能的作用^(17，18)。一是通过CTLA4胞外区和CD28竞争性结合，而抑制抗原提呈细胞上的B7分子与T细胞膜上的CD28分子结合，从而使阻断T细胞活化所必须的B7-CD28辅助信号途径，致使T细胞功能下调。另一方面，当CTLA4与B7分子结合后，直接产生负调信号，同样下调T细胞功能。

正如前面所述，国内外学者应用CTLA4与B7分子高亲合力特性，正致力研制阻断B7-CD28途径的CTLA4胞外段制剂，以阻断T细胞活化中的B7/CD28途径，进而阻断T细胞的完全活化，最终达到治疗T细胞过度活化相关性疾病的目的。出于纯化方法等方面的考虑，linesly等首先将CTLA4胞外段与部分IgG Fc段融合，并将其命名为CTLA4Ig⁽¹⁹⁾。他们将人CTLA4胞外区第1至125氨基酸与人IgG Fc段的CH2，CH3及γ区的相应基因组融合而成。由于其中含有IgG Fc段，能较方便地应用蛋白A层析纯化⁽¹⁹⁾。另外，因CTLA4为免疫球蛋白超家族成员，当其胞外段与IgG Fc段融合后，还能较好地维持分子的完整性及空间构象，从而保证与B7分子结合等功能良好。

现在研究发现，CTLA4Ig不仅对与T细胞过度活化有关的多种自身免疫性疾病及移植后免疫排斥反应有一定的治疗及预防作用，它还在减轻休克损伤、延长基因治疗中转基因表达等方面发挥着重要作用。例如，CTLA4Ig对缺血再灌注损伤具有治疗作用，可应用于自身免疫性疾病的治疗中，可延长异基因移植物存活期，可促进转基因表达等。

CTLA4Ig的衍生物

CTLA4Ig已被广泛证明能结合其配体CD80和CD86分子，并由此阻断CD80/CD86-CD28共刺激通路导致T细胞的凋亡(apoptosis)或无应答(anergy)。但CTLA4Ig结合CD80及CD86分子的能力有差别，即：CTLA4Ig与CD80的亲和力更强，其阻断CD80-CD28共刺激通路的效能是阻断CD86-CD28通路的100倍[Linsley PS，Greene JL，Brady W，BajorathJ，Ledbetter JA and Peach R.Human B7-1(CD80)bind with similar aviditiesbut distinct kinetics to CD28 and CTLA4 receptors.Immunity 1994，1：793-801]。也正是因为由于CTLA4Ig不能有效阻断CD86-CD28共刺激通路，故动物模型显示CTLA4Ig不能完全阻断T细胞激活[Ronchese F，Hausmann B，Hubele S，Lane P.Mice transgenic for a soluble form of murineCTLA4 show enhanced expansion of antigen-specific CD4+T cells anddefective antibody production in vivo.J.Exp.Med.1994，179：809-817.Sayegh MH，Akalin E，Hancock WW，et al.CD28-B7 blockag\de afteralloantigenic challenge in vivo inhit\bits Th1 cytokines but spares Th2.J.Exp.Med.1995，181：1869-1874.Khoury SJ，Akalin E，Chandraker A，et al.CD28-B7 costimulatory blockade by CTLA4Ig prevents active\ely inducedexperimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits Th1 but spares Th2cytokines in the central nervous system.J.Immunol.1995，155：4521-4524.Griggs ND，Agersborg SS，Noelle RJ，Ledbetter JA，Linsley PS and Tung KS.The relative contribution of the CD28 and gp39 costimulatory pathways in theclonal expansion and pathogenic acquisition of self-reactive T cells.J.Exp.Med.1997，185：393-403.]。

为了能同时有效阻断CD80-CD28和CD86-CD28通路以增强CTLA4Ig的生物功能，Bristol-Myers Squibb公司以CTLA4Ig为母分子，选择20个氨基酸进行点突变(site-directed mutagenesis)，筛选了2300个子代CTLA4Ig融合蛋白，发现在104位用亮氨酸替代谷氨酸可显著降低(2倍)CTLA4Ig突变体与CD86的解离速率(与野生型CTLA4Ig比较)，生物学功效更优，该蛋白取名L104E[Larsen CP，Pearson TC，Adams AB，Tso P，Shirasugi N，Strobert E，Anderson D，Cowan S，Price K，Naemura J，EmswilerJ，Greene J，Turk LA，Bajorath J，Townsend R，Hagerty D，Linsley PS andPeach RJ.Rational development of LEA29Y(balatacept)，a high-affinityvariant of CTLA4-Ig with potent immunosuppressive properties.American JTransplant.2005，5：443-453]。再以L104E-Ig为PCR模版，发现A29突变的蛋白与CD86的离解速率比母代分子CTLA4Ig下降4倍，并取名LEA29Y，但单独突变A29则对离解速率无影响。实验证明，LEA29Y比CTLA4Ig有更强的与CD80和CD86的亲和力，而且，其抑制CD86调控的T细胞增殖的能力是CTLA4Ig的10倍。LEA29Y在活体实验表明，它能有效抑制体液免疫，单独或联合常规免疫抑制剂能显著延长动物的异体肾脏移植物的存活时间。该研究还证明CTLA4Ig氨基酸序列的第24和104位对与配体的结合至关重要[Larsen CP，Pearson TC，Adams AB，Tso P，Shirasugi N，Strobert E，Anderson D，Cowan S，Price K，Naemura J，EmswilerJ，Greene J，Turk LA，Bajorath J，Townsend R，Hagerty D，Linsley PS andPeach RJ.Rational development of LEA29Y(balatacept)，a high-affinityvariant of CTLA4-Ig with potent immunosuppressive properties.American JTransplant.2005，5：443-453；Bristol-Myers Squibb Co.：WO0202638.Engineering high avidity CTLA4Ig for therapy of rheumatic diseases.ExpertOpin.Ther.Patents 2002，12：1455-1457]。

此外，研究者还对CTLA4Ig的Fc部分进行了突变，即：把IgG恒定区的第130，136和139位的半光氨酸(cysteine)用丝氨酸(serine)替代，148位的脯氨酸(proline)用丝氨酸替代，并取名Abatacept。实验表明，Abatacept不再具有结合CD16和CD32的能力，并只具有较弱的结合CD69的能力。这些特点使得Abatacept不再有ADCC和CDC作用[PM.Davis，R.Abraham，L.Xu，ST Nadler and SJ Suchard.Abatacept binds to the Fc receptorCD64 but does not mediate complement-dependent cytotoxicity orantibody-dependent cellular cytotoxicity.J Rheumatology 2007，34：2204-10]。

综上所述，迄今为止，CTLA4Ig及其所有功能衍生物，包括但不限于Abatacept，Belatacept，LEA29Y等，都是通过与CD80和CD86分子结合，从而阻断CD80-CD28和CD86-CD28共刺激通路，达到控制免疫应答的作用。因此，有理由认为，凡是能结合CD80和CD86分子的CTLA4Ig及其功能衍生物，包括但不限于Abatacept，Belatacept，LEA29Y等，都具有相同或相似的生物学功能，能用于相关的疾病的治疗，并能达到相同或相似的疗效。

Abatacept

Abatacept是临床用于治疗类风湿性关节炎的CTLA4Ig，是由CTLA4胞外区和人IgG1的CH2、CH3区组成的融合蛋白，对CD80/CD86分子亲和力高于CTLA4本身。而对Fc段的修饰使其与细胞表面CD16/CD32不接合，从而避免ADCC作用的发生。在动物实验中，CTLA4Ig的用量较大。因此Abatacept无论从经济角度考虑还是其作用的特点考虑，无疑是最好的CTLA4Ig的替代品。

NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)

NK细胞是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15％，在脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。

NK细胞较大，含有胞浆颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。

NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如细菌，真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等，但不伤及正常细胞。

NK细胞表面受体(NKR)可以识别被病毒感染的细胞表面表达的多糖分子。NK细胞的杀伤效应是由其活化后释放出的毒性分子介导，如穿孔素、颗粒酶和TNFα(肿瘤坏死因子)等。

NK细胞作用机理

NK细胞抗肿瘤的机理可能经过三个步骤：(1)NK细胞与靶细胞结合，NK细胞表面有识别靶细胞的受体，而靶细胞表面有被受体识别的决定簇；(2)靶细胞刺激NK细胞释放NK细胞毒性因子；(3)NK细胞毒性因子与靶细胞结合，促使某些酶发生变化，导致靶细胞溶解。

此外，NK细胞通过自然杀伤和ADCC发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。(1)抗病毒感染：NK可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。由辅佐细胞或NK细胞所产生的IFN可协同NK的抗病毒作用，而对正常细胞有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对NK的杀伤细胞作用变得更加敏感。在体外，NK可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。体内试验表明，NK低活性小鼠品系对某些病毒感染更加敏感；注射抑制NK细胞的抗Asialo GM1抗体可加重小鼠流感病毒性肺炎。此外，NK细胞在体外还可杀伤细菌、真菌、原虫等，可能与NK细胞释放某些杀伤介质有关。(2)NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。某些疾病如Chediak-Higashi或X性联淋巴增殖综合征患者，由于NK功能缺陷对恶性淋巴细胞增殖疾病特别易感。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemia effect，GVL)：在体外NK细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。骨髓移植后数周内，来自供体的NK细胞在PBL中占相当高的比例。此外，在体内NK细胞还可杀伤某些不成熟细胞如骨髓干细胞、胸腺细胞亚群等。

NK细胞表面受体

NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NKG2D为NK细胞的激活性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解病毒细胞的主要激活性受体。NKG2D的配体为MHCI类链相关基因产物(MICA，MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1，ULBP2，ULBP3)，NKG2D的配体在多种病毒感染细胞表达。NKG2D影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D的表达有可能提高NK细胞的抗病毒活性。

NK细胞受体还包括NKp46、NKp44和NKp30等，其中NKp46和NKp30表达于所有静止和活化的NK细胞，而NKp44则选择性的表达于活化的NK细胞。靶细胞上的配体分子与NK细胞受体的结合(交联)引发NK细胞的激活导致靶细胞的裂解和大量细胞因子的产生。目前已经确认NKp46和NKp44可以识别病毒上的配体分子红血球凝聚素，而NKp46则能识别细胞上的乙酰硫酸多聚糖。

发明内容

本发明人经过深入研究，意外地发现CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物(包括但不限于Abatacept，Belatacept，LEA29Y等，优选Abatacept和Balatacept)对NK细胞(自然杀伤细胞)的细胞毒性具有显著的激活作用，并且证实CTLA4Ig提高NK细胞毒性的分子机制是显著提高了NK细胞膜表面的激活受体如NKG2D，NKp44等的表达。实验证明，通过提高机体NK细胞的细胞毒性，CTLA4Ig可以用于抗病毒治疗。

具体地，本发明提供以下各项：

1.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备抗病毒药物中的应用。

2.根据以上1的应用，其中所述CTLA4Ig衍生物具有激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的活性。

3.根据以上2的应用，其中优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合CD80及CD86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合CD80及CD86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatacept。

4.根据以上3的应用，其中所述CTLA4Ig衍生物是Abatacept和Balatacept。

5.根据以上1至4中任何一项的应用，其中所述病毒选自由下列组成的组：疱疹病毒，牛痘病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，巨细胞病毒和流感病毒。

6.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有激活NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合CD80及CD86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合CD80及CD86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatacept。

7.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于提高生物体(人体或动物体)的NK细胞的激活性受体的表达的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有提高NK细胞的激活性受体的表达的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合CD80及CD86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合CD80及CD86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatacept。

8.根据以上7的应用，其中所述NK细胞的激活性受体是NKG2D和/或NKp44。

9.一种抗病毒药物组合物，其包含CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物和药用辅剂，所述CTLA4Ig衍生物具有激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合CD80及CD86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合CD80及CD86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatacept。

药物组合物的配制是本领域技术人员所公知的，例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro版本1985)。

10.根据以上9的药物组合物，其还含有另外的抗病毒活性成分。

11.一种治疗受试者的病毒感染的方法，该方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述受试者是人或动物。

本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定CTLA4Ig和药物组合物的剂量水平。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。

12.根据以上11的方法，其中所述受试者还同时接受另一种抗病毒疗法。

13.一种激活受试者中NK细胞的细胞毒性功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述受试者是人或动物。

14.一种提高受试者中NK细胞的激活性受体的表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述激活性受体是NKG2D或NKp44。优选所述受试者是人或动物。

应当理解，本发明意欲包括上述各项的任意组合。

附图说明

图1.CTLA4Ig对人外周血单个核细胞(PBMC)毒性调节作用。A：加入的CTLA4Ig浓度对PBMC细胞毒性的影响；B：CTLA4Ig(在本文和附图中有时也表示为CTLA-4Ig或CTLA4-Ig)的调节作用的激活率；

图2.CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(≥1μg/ml)；

图3.CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(＜1μg/ml)；

图4A：CTLA4Ig对NK细胞表面NKG2D受体表达的影响；

图4B：CTLA4Ig对NK细胞表面NKP44受体表达的影响；

图5.抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)在CTLA4Ig激活NK细胞功能中可能的作用。A：CTLA4Ig可增强NK92的细胞毒性；B：CTLA4Ig增强人NK细胞毒性部分是ADCC非依赖的；

图6.CTLA4Ig与IL-2对于NK细胞杀伤毒性的影响；

图7.CTLA-4Ig体内促进NK细胞杀伤毒性；

图8.CTLA-4Ig的衍生物Abatacept体内促进NK细胞杀伤毒性；

图9.CTLA4Ig在病毒感染模型中的作用；

图10.Abatacept的CTLA4区域和Fc区域的氨基酸序列；

图11.CTLA4Ig的CTLA4区域和Fc区域的氨基酸序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1 CTLA4Ig对人外周血单个核细胞(PBMC)毒性调节作用研究

1.试剂和材料：

人PBMC：来源于重庆西南医院输血科，手工分浓缩白细胞；

CTLA4Ig，Recombinant Human CTLA-4/Fc Chimera，Catalog Number：325-CT，商购自美国R&D system公司；

人淋巴细胞分离液200ml，Catalog Number：LTS1077，商购自天津市灏洋生物制品有限责任公司(TBD)；

CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，Catalog Number：ALX-610-030，商购自Alexis biochemicals；

Propidium Iodide/碘化丙啶，Catalog Number：537059，商购自Calbiochem，San Diego，CA；

K562(人慢性粒细胞白血病细胞系)：购自中科院上海细胞库；

流式细胞仪，美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckman coμltercell)型号：商购自Cell Lab Quanta SC。

2.实验方法

人PBMC分离：将手工分浓缩白细胞缓慢加至等体积淋巴细胞分离液面上，室温离心，3000rpm/min，20min，取中间白膜层，大量PBS洗涤细胞，计数备用(参考文献：Ulmer，A.J.，W.Scholz，M.Ernst，E.Brandt，andH.D.Flad.1984.Isolation and subfractionation of human peripheral bloodmononuclear cells(PBMC)by density gradient centrifugation on Percoll.Immunobiology 166：238-250)；

细胞毒性检测方法(参考文献：Marcusson-Stahl，M.，and K.Cederbrant.2003.A flow-cytometric NK-cytotoxicity assay adapted for use in rat repeateddose toxicity studies.Toxicology 193：269-279)：

用CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562：用DMSO溶解活细胞绿色荧光染料(CFSE)成5mmol/L的储存液，于-20℃避光保存。使用时，用无血清RPMI 1640培养基(含L-谷氨酰胺，#C11875500BT，Invitrogen)稀释成5μmol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5×10⁶个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10min，用1640+10％体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的RPMI1640(+10％胎牛血清)重悬细胞。

效应细胞、靶细胞共培养：10⁶个人PBMC+2×10⁴个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞的自然死亡对照。

PI(碘化丙啶)标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg/ml，工作液50μg/ml。取出培养板中的细胞，离心后用100μlPI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中带CFSE/PI双标记的细胞即为死亡的K562细胞。PBMC的杀伤效率可用下列公式计算：

细胞毒性(cytotoxicity)％＝100×(加入PBMC的K562死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)

在共培养体系中加入不同浓度CTLA4Ig(终浓度分别为0.1，0.5，2，5，10和20μg/ml)，检测其对PBMC毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，P＜0.05确定为有显著性差异。所用软件为spss 13.0。

3.实验结果(见图1和表1)：

表1

	0	0.1	0.5	2	5	10	20
								0		0.119	0.03	0.019	0.003	0.004	0.005
0.1	0.119		0.957	0.855	0.196	0.276	0.408
								0.5	0.030	0.957		1	0.588	0.729	0.880
2	0.019	0.855	1		0.763	0.880	0.969
								5	0.003	0.196	0.588	0.763		1	0.996
10	0.004	0.276	0.729	0.880	1		1
								20	0.005	0.408	0.880	0.969	0.996	1

注：各表中数值为P值(以下同)。

结论：

从图1和表1可以看出，CTLA4Ig促进人PBMC杀伤NK细胞敏感靶细胞，其最低有效浓度为0.5μg/ml，超过该浓度后，激活能力与剂量无关。

实施例2 CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(≥1μg/ml)

1.试剂和材料：

人NK细胞分离试剂盒(NK Cell Isolation Kit human)，Catalog Number：130-092-657，商购自miltenyi biotec公司(德国)。

LD columns，Catalog Number：130-042-901，miltenyi biotec

其余材料同实施例1。

2.实验方法：

人PBMC分离同实施例1；

人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；

细胞毒性检测方法：

CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。

效应细胞、靶细胞共培养：10⁵个人NK细胞+2×10³个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。

PI标记死亡细胞、流式细胞仪检测和NK细胞的杀伤效率的计算方法同实施例1。

在共培养体系中加入不同浓度的CTLA4Ig(分别为1，5，10和20μg/ml)，检测其对NK细胞毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

3.实验结果(参见表2和图2)：

表2

	0	1	5	10	20
						0		0.002	0.001	0.002	0.002
1	0.002		0.474	0.965	1.000
						5	0.001	0.474		0.777	0.436
10	0.002	0.965	0.777		0.946
						20	0.002	1.000	0.436	0.946

结论：

从表2和图2可以明显看出，CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力。在浓度大于1μg/ml时，CTLA4Ig促进NK细胞杀伤靶细胞的能力为非剂量依赖性。

实施例3 CTLA4Ig有效的促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(＜1μg/ml)

1.试剂和材料：

同实施例2。

2.实验方法：

人PBMC分离同实施例1；

人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；

细胞毒性检测方法：

CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。

效应细胞、靶细胞共培养：10⁵个人NK细胞+2×10³个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。加入IL-2的K562作为阳性对照。

在共培养体系中加入不同浓度的CTLA4Ig(分别为0.01，0.1，0.5和1μg/ml)，检测其对NK细胞毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

3.实验结果(参见表3和图3)：

表3

	0	0.01	0.1	0.5	1	IL-2
							0		0.839	0.090	0.000	0.000	0.000
0.01	0.839		0.652	0.001	0.002	0.000
							0.1	0.090	0.652		0.005	0.007	0.000
0.5	0.000	0.001	0.005		1.000	0.121
							1	0.000	0.002	0.007	1.000		0.091
IL-2	0.000	0.000	0.000	0.121	0.091

结论：

从表3和图3可以明显看出，CTLA4Ig促进人NK细胞杀伤NK细胞敏感靶细胞的最低有效浓度为0.1μg/ml，且激活能力随浓度增加而增强，超过0.5μg/ml后，激活能力与剂量无关。

IL-2是公认的NK细胞强有力的激活剂，在文献中经常用于做NK细胞激活的阳性对照，此处主要用于明确CTLA4Ig对NK细胞激活作用与IL-2相比较的程度，最终得出CTLA4Ig对NK细胞激活能力与IL-2相当的结论，在后面的研究中专门提到。

实施例4 CTLA4Ig对NK细胞表面激活受体表达的影响

1.试剂和材料：

赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hIgG1)；(上海罗氏生产用于预防肾移植后急性排斥反应的药品，赛尼哌为商品名，Daclizumab为药品名，其中含hIgG1片段可作为本试验的对照)

Fluorescein isothiocyanate(FITC)anti-human CD56(N-CAM，NCAM)，Catalog Number：11-0569-71/25tests，商购自eBioscience(美国)；

PE anti-human CD56(NCAM)，Catalog Number：318305/25 tests，Biolegend(美国)

PE anti-human CD336(NKp44)，Catalog Number：325107/25 tests，Biolegend

Fluorescein isothiocyanate(FITC)antihuman NKG2D/CD314(activating)，Catalog Number：11-5878/25 tests，eBioscience

其余试剂和材料同实施例2。

2.实验方法：

人PBMC分离同实施例1；

人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；

分离NK细胞后，立即加入96孔板，10⁵个/孔，并分别加入CTLA4Ig2.5μg/ml，hIgG1(体外试验中使用的纯化的CTLA4Ig中Fc段可能与NK细胞表面CD16等分子结合，介导ADCC作用从而增加NK细胞活性，加入hIgG1的目的是为了排除ADCC作用的影响)2.5μg/ml，IL-2(注射用重组人白介素-2，商购自北京双鹭药业，文献报道认为IL-2能作用于NK细胞)1000U/ml(参考文献：Lin，S.J.，R.L.Roberts，B.J.Ank，Q.H.Nguyen，E.K.Thomas，and E.R.Stiehm.1997.Human immunodeficiency virus(HIV)type-1 GP120-specificcell-mediated cytotoxicity(CMC)and natural killer(NK)activity in HIV-infected(HIV+)subjects：enhancement with interleukin-2(IL-2)，IL-12，and IL-15.Clinical immunology andimmunopathology 82：163-173)，相互作用16小时后，取出细胞按文献(Dasgupta，S.，M.Bhattacharya-Chatterjee，B.W.O′Malley，Jr.，and S.K.Chatterjee.2005.Inhibition ofNK cell activity through TGF-beta 1 by down-regulation of NKG2D in a murine model ofhead and neck cancer.J Immunol 175：5541-5550；和Mavoungou，E.，M.K.Bouyou-Akotet，and P.G.Kremsner.2005.Effects of prolactin and cortisol on natural killer(NK)cell surfaceexpression and function of human natural cytotoxicity receptors(NKp46，NKp44 andNKp30).Clinical and experimental immunology 139：287-296)方法标记细胞表面受体，PBS洗去抗体后用流式细胞仪检测。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

3.实验结果：

A：CTLA4Ig对NK细胞表面的激活性受体NKG2D的表达的影响(参见图4A和表4)

表4

	NK	NK+CTLA4-Ig	NK+IL-2	NK+hIgG1
					NK		0.000	0.000	0.784
NK+CTLA4-Ig	0.000		0.667	0.000
					NK+IL-2	0.000	0.667		0.000
NK+hIgG1	0.784	0.000	0.000

结论：

CTLA4可上调NK细胞表面NKG2D的表达。

应当指出，体外试验中使用的纯化的CTLA4Ig中Fc段可能与NK细胞表面CD16等分子结合，从而活化NK细胞的细胞毒性功能。因为CTLA4Ig的Fc段与hIgG1的Fc段是一样的，故加入hIgG1目的是为了证明CTLA4Ig对NK的作用不是Fc段的作用，而是CTLA4的作用。

B：CTLA4Ig对NK细胞表面的激活性受体NKP44的表达的影响(参见图4B和表5)

表5

	NK	NK+CTLA4-Ig	NK+IL-2	NK+hIgG1
					NK		0.000	0.000	0.223
NK+CTLA4-Ig	0.000		0.046	0.000
					NK+IL-2	0.000	0.046		0.000
NK+hIgG1	0.223	0.000	0.000

结论：

CTLA4可上调NK细胞表面NKp44的表达。

实施例5 抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)在CTLA4Ig激活NK细胞功能中可能的作用

A.CTLA4Ig可增强NK92细胞毒性

1.试剂和材料：

CTLA4Ig，Recombinant Human CTLA-4/Fc Chimera，Catalog Number：325-CT，R&D system；

赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hIgG1)；

NK92细胞株：购自中科院上海细胞库；

CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，Catalog Number：ALX-610-030，Alexis biochemicals；

Propidium Iodide/碘化丙啶，Catalog Number：537059，Calbiochem，SanDiego，CA；

K562(人慢性粒细胞白血病细胞系)：购自中科院上海细胞库；

流式细胞仪美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckman coμltercell)型号：Cell Lab Quanta SC；

2.实验方法：

细胞毒性检测方法：

CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562：用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于-20℃避光保存。使用时，用无血清1640培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5×10⁶个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10min，用1640+10％体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。

效应细胞、靶细胞共培养：10⁶个NK92细胞+2×10⁴个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养4h。未加NK92的K562作为靶细胞自然死亡对照。

PI标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50μg/ml。取出培养板中的细胞，离心后用100μl PI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的K562细胞。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算：

细胞毒性％＝100×(加入NK92的K562死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)

在共培养体系中分别加入CTLA4Ig，hIgG1 2.5μg/ml，检测其对NK92细胞毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

实验结果(参见图5A和表6)：

表6

	Nk92	Nk92+hIgG1	Nk92+CTLA4Ig
				Nk92		0.720	0.032
Nk92+hIgG1	0.720		0.046
				Nk92+CTLA4Ig	0.032	0.046

结论：

由于NK92细胞表面不存在CD16/CD32/CD64(Maki，G.，H.G.Klingemann，J.A.Martinson，and Y.K.Tam.2001.Factors regulating the cytotoxic activity of the humannatural killer cell line，NK-92.Journal of hematotherapy & stem cell research 10：369-383)，可认为其不具备ADCC作用。故CTLA4Ig对NK92细胞毒性增强作用是非ADCC介导的。

B.CTLA4Ig增强人NK细胞毒性部分是ADCC非依赖的

1.试剂和材料：

同上述实施例。

2.实验方法：

人PBMC分离同实施例1；

人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；

细胞毒性检测方法：

CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。

hIgG1包被96孔板：10μg/ml hIgG1加入PBS中配成2.5μg/ml，200μl加入96孔板，3个平行孔，4℃，12小时(Dubois，S.，H.J.Patel，M.Zhang，T.A.Waldmann，and J.R.Muller.2008.Preassociation of IL-15 with IL-15Ralpha-IgG1-Fc enhances its activity on proliferation of NK andCD8+/CD44high T cells and its antitumor action.J Immunol 180：2099-2106)。

在共培养体系中分别加入CTLA4Ig，hIgG1 2.5μg/ml，同时在包被孔中加入混合细胞，检测CTLA4Ig对人NK细胞毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

实验结果(参见图5B和表7)：

表7

	NK	NK+CTLA4Ig	NK+Soluble Ig	Nk+bound-Ig
					NK		0.000	0.012	0.02
NK+CTLA4Ig	0.000		0.000	0.000
					NK+Soluble Ig	0.012	0.000		0.680
Nk+bound-Ig	0.02	0.000	0.680

(Soluble Ig是指在培养体系中加入可溶性的hIgG1，模拟细胞微环境中的游离作用状态，而bound-Ig则是在试验前12小时利用文献报道方法模拟膜表达的状态将hIgG1固定在细胞培养板上)

3.结论：

hIgG1可通过ADCC作用显著增强人NK细胞毒性，CTLA4Ig对NK细胞毒性激活作用与hIgG1所介导的ADCC作用相比有显著性差异，即其对NK细胞毒性激活作用部分是非ADCC依赖的。

由此，CTLA4Ig对NK细胞毒性激活作用的活性部分主要是在于其CTLA4部分。因此，可以对CTLA4Ig的Fc部分进行修饰，以获得避免了Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。

实施例6 CTLA4Ig与IL-2对于NK细胞杀伤毒性的影响

1.试剂和材料：

人PBMC西南医院输血科手工分浓缩白细胞

CTLA4Ig，Recombinant Human CTLA-4/Fc Chimera，Catalog Number：325-CT，R&D system

人淋巴细胞分离液200ml，Catalog Number：LTS1077，TBDNK Cell Isolation Kit human，Catalog Number：130-092-657，miltenyibiotec

LD columns，Catalog Number：130-042-901，miltenyi biotec

注射用重组人白介素-2 50万IU/瓶，北京双鹭药业

CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，Catalog Number：ALX-610-030，Alexis biochemicals

Propidium Iodide/碘化丙啶，Catalog Number：537059，Calbiochem，SanDiego，CA

K562(人慢性粒细胞白血病细胞系)购自中科院上海细胞库

流式细胞仪美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckman coμltercell)型号：Cell Lab Quanta SC

2.实验方法：

1，人PBMC分离：手工分浓缩白细胞缓慢加至等体积淋巴细胞分离液面上，3000rpm/min，室温，20min，取中间白膜层，大量PBS洗涤细胞，计数备用；

2，人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作

3，细胞毒性检测方法：

(1)CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562：用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于-20℃避光保存。使用时，用无血清1640培养液稀释成5umol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5×106个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10min，用1640+10％体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。

(2)效应细胞、靶细胞共培养：10⁵个人NK细胞+2×10³个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5h。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。

PI标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50μg/ml。取出培养板中的细胞，离心后用100μl PI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的K562细胞。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算：cytotoxicity％＝100×(加入人NK细胞的K562死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)

4，在共培养体系中分别加入CTLA4Ig 2.5μg/ml和IL-21000U/ml(3)，比较CTLA4Ig和IL-2对人NK细胞毒性的影响。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

实验结果(参见图6和表8)：

表8

	NK	NK+hIgG1	NK+CTLA4Ig	NK+IL-2
					NK		0.012	0.000	0.000
NK+hIgG1	0.012		0.000	0.000
					NK+CTLA4Ig	0.000	0.000		0.337
NK+IL-2	0.000	0.000	0.337

(hIgG1是对照，用于排除ADCC作用的影响)

结论：

CTLA4Ig对NK细胞毒性功能激活的能力与IL-2相当。

实施例7 静脉注射小剂量的CTLA-4Ig能够在体内促进NK细胞杀伤毒性

试剂和动物：

CTLA-4Ig，Recombinant Human CTLA-4/Fc Chimera，Catalog Number：325-CT，R&D system

红细胞裂解液配制：首先配制储存液，即0.16M氯化铵：8.3g/L，0.17M Tris：将20.6g Tris溶于900ml的双蒸水中，调整pH值至7.65后，补足至1000ml。工作液：将90ml 0.16M氯化铵和10ml 0.17M Tris(pH 7.65)混合，调整pH值至7.2，0.22微米过滤除菌备用。

YAC-1(鼠T淋巴瘤细胞系)购自中科院上海细胞库

流式细胞仪：美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckman coμltercell)型号：Cell Lab Quanta SC

Balb/c小鼠购自第三军医大学动物所

赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含人IgG1)

实验方法：

小鼠尾静脉注射CTLA4Ig；酒精消毒小鼠尾静脉后，用1ml注射器将200μl(含10μg CTLA4Ig)沿小鼠尾静脉，小于30°进针，注射入小鼠体内。

24h后，杀死小鼠，取脾脏，加小牛血清研磨制成细胞悬液后350g，离心6min。弃上清加入10ml以上制备的红细胞裂解液，静置2-4min后离心，弃上清后计数备用。

细胞毒性检测方法：

CFSE标记小鼠NK细胞敏感靶细胞YAC-1：用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于-20℃避光保存。使用时，用无血清RPMI 1640培养基稀释成5μmol/L的工作液备用。制作YAC-1悬液2-5×10⁶个细胞/ml，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10min，用RPMI 1640+10％体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。

效应细胞、靶细胞共培养：将10⁶个小鼠脾脏淋巴细胞+2×10⁴个CFSE标记的YAC-1加入96孔板，共培养3h。未加效应细胞的YAC-1作为靶细胞自然死亡对照。

PI标记死亡细胞，上机检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50μg/ml。取出培养板中的细胞，离心后用100μl PI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的YAC-1。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算：cytotoxicity％＝100×(加入小鼠脾脏淋巴细胞的YAC-1死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)。

将未注射CTLA4Ig和注射人Ig的小鼠脾脏淋巴细胞列为对照组，检测脾脏淋巴细胞(即NK细胞)毒性有无差异。

统计方法：单因素方差分析，p＜0.05有显著性差异。

实验结果(参见图7和表9)：

表9

	正常组(normal)	hIg注射组(hIg injected)	CTLA4Ig注射组(CTLA4Ig injected)
				正常组		0.918	0.004
hIg注射组	0.918		0.007
				CTLA4Ig注射组	0.004	0.007

结论：小鼠尾静脉注射小剂量CTLA4Ig可显著提高其脾脏NK细胞对于靶细胞YAC-1的杀伤毒性。

实施例8 静脉注射CTLA4Ig的衍生物Abatacept能够在体内促进NK细胞的杀伤毒性

除了用Abatacept(商品名是Orencia，购自美国施贵宝公司(Bristol-Myers-Squibb))替换CTLA4Ig以外，本实施例中使用的其余试剂和动物、实验方法(检测注射Abatacept(300μg/只)48小时后Balb/c脾脏细胞对靶细胞的杀伤毒性)、统计方法都与实施例7相同。

实验结果见图8。

结论：小鼠尾静脉注射CTLA4Ig的衍生物Abatacept可显著提高其脾脏NK细胞对于靶细胞YAC-1的杀伤毒性。

实施例9 CTLA4Ig在病毒感染模型中的作用

动物，细胞和试剂：

SCID(重症联合免疫缺陷小鼠)小鼠：商购于第三军医大学动物所；

鼠巨细胞病毒CMV(murine cytomegalovirus(MCMV)，Smith strain鼠巨细胞病毒，Bukowski，J.F.，J.F.Warner，G.Dennert，and R.M.Welsh.1985.Adoptive transfer studies demonstrating the antiviral effect of natural killercells in vivo.The Journal of experimental medicine 161：40-52)；

CTLA4Ig：Recombinant Human CTLA-4/Fc Chimera Catalog Number：325-CT R&D system

赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hIgG1)

实验方法：

分组：CMV+CTLA4Ig注射组，CMV+hIgG1(人IgG1)注射组，CMV+PBS注射组

SCID鼠尾静脉分别注射200μl CTLA4Ig(1.5μg/μl)，hIgG1 10μg/只和200μl PBS，各10只；24h后腹腔注射8×10³PFU(0.1ml)鼠巨细胞病毒CMV(实验步骤参见：Bukowski，J.F.，J.F.Warner，G.Dennert，and R.M.Welsh.1985.Adoptive transfer studies demonstrating the antiviral effect ofnatural killer cells in vivo.The Journal of experimental medicine 161：40-52)，以后每隔一天注射一次CTLA-4Ig，hIgG1和PBS，根据小鼠生存时间，绘制生存曲线。

实验结果见图9，其中

是CMV+PBS组；

是CMV+hIgG1组；和

是CMV+CTLA4Ig组(最右边的折线)。

结论：

CTLA4Ig通过对NK细胞毒性功能的激活，能显著延长感染CMV的小鼠的生存时间。

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Claims

1.CTLA4Ig在制备抗巨细胞病毒药物中的应用。

2.一种抗巨细胞病毒药物组合物，其包含CTLA4Ig和药用辅剂。

3.根据权利要求2的药物组合物，其还含有另外的抗病毒活性成分。