CN101802173A

CN101802173A - 调节禽类的生产性状

Info

Publication number: CN101802173A
Application number: CN200880102770A
Authority: CN
Inventors: T·J·多兰; R·J·莫尔; J·W·洛温塔尔
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Australian Poultry CRC Pty Ltd
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Australian Poultry CRC Pty Ltd
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2010-08-11
Anticipated expiration: 2028-06-12
Also published as: AU2008261604B2; EP2167645A1; RU2010100886A; BRPI0812500A2; AU2008261604A1; JP2010528667A; WO2008151364A1; EP2167645A4; CN101802173B; US20130067606A1; US20100306869A1; MX2009013532A; RU2518681C2; JP5554231B2

Abstract

本发明涉及调节禽类如鸡的性状尤其是生产性状的方法。特别地，本发明涉及dsRNA分子尤其是siRNA的卵内输送以改变商业上重要的鸟类的生产性状。

Description

调节禽类的生产性状

发明领域

本发明涉及调节禽类如鸡的性状尤其是生产性状的方法。特别地，本发明涉及dsRNA分子尤其是siRNA的卵内(in ovo)输送以改变商业上重要的鸟类的生产性状。

发明背景

从动物被驯养开始人们已经通过种畜的多代筛选来改变家畜的表型特征。这导致数量生产参数如身体大小和肌肉总量的提高。新近的改变家禽生产性状和/或提高对病原体抗性的创新集中于转基因方法，但是许多消费者担心遗传改变的生物体。

鸡农已经开始寻找一种有效、经济的方法来确定满日龄(day old)雏鸡的性别。不同生产者已经使用肛门鉴定性别法和羽毛鉴定性别法，但发现这些方法实质上是不经济的，因为分离雄性和雌性雏鸡需要大量时间和劳力成本。探针的使用(US 5,508,165)也是昂贵的方法，在经济上是不实用的。雏鸡肛区的光感应(US 4,417,663)是确定雏鸡性别的另一方法，但它还也昂贵和耗时的，因为必须处理和操作每只雏鸡。已经使用了可以根据羽毛区分雏鸡的专家，但这类专家代价较高并且根据羽毛区分耗时。

现在需要改变家禽生产性状的方法，这种方法不导致鸟类基因组的转化，但适应高通量处理。

发明概述

本发明人意外的发现给禽类的卵施用包括双链区的合适核酸分子可以改变发育胚胎的表型。

因此，在第一个方面，本发明提供了改变禽类性状的方法，所述方法包括给禽类卵施用至少一种包括双链区的核酸分子，其中所述核酸分子导致卵中至少一种RNA分子和/或蛋白水平的降低。

在优选的实施方案中，所述核酸分子是dsRNA。更优选dsRNA是siRNA或shRNA。

在更优选的实施方案中，所述性状是生产性状。生产性状的实例包括但不限于肌肉质量或性别。

在一个实施方案中，生产性状是性别且核酸分子降低DMRT1基因编码的蛋白的水平。

在一个实施方案中，生产性状是性别且核酸分子降低WPKCI(ASW)基因编码的蛋白的水平。

在另一实施方案中，生产性状是肌肉质量且核酸分子降低筒箭毒碱基因编码的蛋白的水平。

优选核酸分子通过注射施用。

禽类可以是鸟纲(Aves)的任意种。实例包括但不限于鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡和鹌鹑。在特别优选的实施方案中，禽类是鸡。

在另一个方面，本发明提供了使用本发明方法产生的禽类。

在另一个方面，本发明提供了使用本发明方法产生的鸡。

在另一个方面，本发明提供了包括双链区的分离和/或外源核酸分子，当给禽类卵施用时其降低至少一种RNA分子和/或蛋白的水平。

优选核酸分子是dsRNA分子。更优选dsRNA是siRNA或shRNA。

在一个实施方案中，核酸分子降低DMRT1基因或筒箭毒碱基因编码的蛋白的水平。

本发明还提供了编码核酸分子或其单链的载体。可以在宿主细胞或无细胞表达系统中使用这类载体来产生可用于本发明方法的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了包括本发明的外源核酸分子或其单链和/或本发明的载体的宿主细胞。

在另一个方面，本发明提供了包括本发明的核酸分子或其单链、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞的组合物。

在另一个方面，本发明提供了包括本发明的核酸分子或其单链、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞的禽类卵。

在另一个方面，本发明提供了包括本发明的核酸分子或其单链、本发明的载体、本发明的宿主细胞和/或本发明的组合物的试剂盒。

显而易见的是，本发明一个方面的优选特点和特征适用于本发明的其他许多方面。

在本说明书自始至终，单词“包括”或“包含”应被理解为表示包含一个指定元件、整数或步骤或一组元件、整数或步骤，但不排除任意其他元件、整数或步骤或一组元件、整数或步骤。

在下文中通过下列非限制性实施例并参照附图来描述本发明。

附图简述

图1-用于shRNA表达盒的PCR。用于产生shRNA表达载体的PCR策略的图示。PCR使用与包括所有shRNA组成的反向引物配对的正向引物。所有PCR终产物由鸡U6启动子，shRNA有义，环，shRNA反义，终止序列和XhoI位点组成。

图2-检测挑选的shRNA用于EGFP-Dmrt1基因融合表达的降低(knockdown)。每种转染条件下相对于pEGFP-Dmrt1表达的平均荧光强度。误差线表示对每个单独实验重复3次计算出的标准误差。

图3-检测挑选的shRNA用于EGFP-Gdf8基因融合表达的降低。DF1细胞用下列转染：组1，单独的pEGFP-C；组2，单独的pEGFP-Gdf8转录融合体；组3-6，pEGFP-Gdf8与pshEGFP或特异性Gdf8shRNA表达质粒pshGdf8-258，pshGdf8-913和pshGdf8-1002。利用Leica DM LB荧光显微镜(Leica Microsystems，Germany)进行镜检，使用Leica DC300F彩色数码相机(Leica Microsystems，Germany)和Photoshop 7.0成像软件

在50×放大率捕捉图像。

序列表说明

SEQ ID NO：1-鸡筒箭毒碱(Genbank NM_001001461)。

SEQ ID NO：2-编码鸡筒箭毒碱的核苷酸序列(Genbank

NM_001001461)。

SEQ ID NO：3-部分鸡DMRT1蛋白序列(Genbank AF123456)。

SEQ ID NO：4-编码鸡DMRT1的部分核苷酸序列(Genbank

AF123456)。

SEQ ID NO：5-鸡WPKCI(ASW)(Genbank AF148455)。

SEQ ID NO：6-编码鸡WPKCI(ASW)的核苷酸序列(Genbank

AF148455)。

SEQ ID NO：7-鸡U6-1启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8-鸡U6-3启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9-鸡U6-4启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10-鸡7SK启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11到98和113到122-用于本发明的RNA序列。

SEQ ID NO：99到112-寡核苷酸引物。

发明详述

一般技术和定义

除非另外特别定义，本文使用的所有技术和科学术语都应与本领域(例如细胞培养，分子遗传学，禽类生物学，RNA干扰和生物化学)普通技术人员通常理解的具有相同的含义。

除非另外指出，本发明使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域技术人员公知的标准方法。这类技术在以下文献中被描述和解释，如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，Volumes 1and 2，IRL Press(1991)，D.M.Gloverand B .D.Hames(editors)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and 1996)，和F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，including all updates until present)，Ed Harlow and David Lane(editors)。

本文使用的术语“禽类”是指分类学上鸟纲生物体的任意种、亚种或品种(race)，如但不限于以下生物体如鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，稚，鹦鹉，雀，鹰、乌鸦和平胸类鸟包括鸵鸟，鸸鹋和鹤鸵。该术语包括原鸡(Gallusgallus)(鸡)的各种已知品系，例如白色来亨鸡(White Leghorn)，棕色来亨鸡(Brown Leghorn)，Barred-Rock，Sussex，New Hampshire，Rhode Island，澳洲黑鸡(Australorp)，Cornish，Minorca，Amrox，California Gray，ItalianPartidge-coloured，以及火鸡，稚，鹌鹑，鸭，鸵鸟和其他通常按商品化量繁育的家禽。

本文使用的术语“卵”是指由鸟类产出的受精卵。典型地，禽类卵由硬的卵圆形外卵壳、“卵清”或白蛋白、卵黄和各种薄膜组成。此外，“卵内(in ovo)”是指在卵中。

本文使用的术语“降低”或其变化是指与还没有施用本文所述的核酸的同种禽类(更优选是禽类的相同品系或品种，甚至更优选相同的鸟)的卵相比，卵中靶RNA和/或靶蛋白的量可测量的降低。该术语还表示靶蛋白活性的可测量的降低。优选靶RNA和/或靶蛋白水平降低至少约10％。更优选降低至少约20％，30％，40％，50％，60％，80％，90％和甚至更优选约100％。

本文使用的短语“核酸分子导致降低”或其变化是指卵中核酸分子的存在通过本领域称为“RNA干扰”或“基因沉默”的过程诱导卵中同源RNA的降解。此外，核酸分子直接导致降低，而不是在卵内转录产生所需效果。

“至少一种RNA分子”可以是存在于禽类卵内和/或由禽类卵产生的任意类型的RNA。实例包括但不限于mRNA，snRNA，微小RNA和tRNA。

本文使用的术语“生产性状”是指具有商业价值如肌肉质量、性别和营养含量的禽类的任意表型。

本文使用的术语“肌肉质量”是指肌肉组织的重量。肌肉质量的增加可以通过以下方式确定：称取(从按照本文所述处理的卵孵出)的鸟的全部肌肉组织的重量，然后与没有施用本文所述的核酸的同种禽类的鸟(更优选是禽类的相同品系或品种，和甚至更优选是相同的鸟)进行比较。或者，具体的肌肉如胸部和/或腿部肌肉可用于鉴定肌肉质量的增加。优选本发明的方法使肌肉质量增加大约至少1％，2.5％，5％，7.5％和甚至更优选约10％。

本发明核酸分子的“变体”包括具有不同大小和/或一或多个不同核苷酸的分子，但其仍然能够用于沉默靶基因。例如，变体可以包括额外的核苷酸(如1，2，3，4，或更多个)或更少的核苷酸。此外，一些核苷酸可以被取代但不影响核酸沉默靶基因的能力。在一个实施方案中，变体包括额外的5′和/或3′核苷酸，其与相应的靶RNA分子同源和/或增强核酸分子的稳定性。在另一个实施方案中，当与本文提供的序列比较时，核酸分子的核苷酸差异不超过4个、更优选不超过3个、更优选不超过2个和甚至更优选不超过1个。在另一个实施方案中，当与本文提供的序列比较时，核酸分子具有不超过2个、更优选不超过1个的内部添加和/或缺失的核苷酸。

“分离的核酸分子”表示至少与其天然状态结合或连接的核酸分子至少部分分离的核酸分子。优选分离的核酸分子是至少60％、优选至少75％和最优选至少90％不含与其天然结合的其他组分。此外，术语“多核苷酸”在本文中可以与术语“核酸”互换使用。

在核酸分子的上下文中的术语“外源”是指以改变的量存在于细胞或无细胞表达系统中的核酸分子。优选细胞是天然不包括核酸分子的细胞。但是细胞可以是包括外源核酸分子的细胞，所述外源核酸分子导致核酸分子的量增加。本发明的外源核酸分子包括还没有与重组细胞或无细胞表达系统(其中存在核酸分子)的其他组分分离的核酸分子和在这类细胞或无细胞系统中产生的核酸分子，其随后被从至少一些其他组分中纯化出来。

基因沉默

术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”通常表示其中双链RNA(dsRNA)分子降低核酸序列(所述双链RNA分子与其具基本上或完全的同源性)的表达的过程。但是，近年来已经证明可以使用非RNA双链分子实现基因沉默(参见例如US 20070004667)。

RNA干扰(RNAi)尤其可用于特异性抑制特定RNA和/或蛋白的产生。尽管不希望受到理论的约束，Waterhouse等(1998)提供了一种dsRNA(双链RNA)可用于降低蛋白产生的机制的模型。该技术依赖于dsRNA分子的存在，所述dsRNA分子包含与目标基因的mRNA或其一部分基本上相同序列，在这种情况下mRNA编码本发明的多肽。方便地是dsRNA可以从重组载体或宿主细胞中的单个启动子产生，其中有义和反义序列的侧面是无关序列，该无关序列使得有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，再与所述无关序列形成环结构。适于本发明的dsRNA分子的设计和产生在本领域技术人员的能力范围内，尤其参考Waterhouse等(1998)，Smith等(2000)，WO 99/32619，WO 99/53050，WO 99/49029和WO 01/34815。

本发明包括核酸分子，所述核酸分子包含和/或编码用于基因沉默的双链区。核酸分子通常是RNA，但也可以包括DNA、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

双链区应当是至少19个连续核苷酸，例如约19到23个核苷酸，或可以是更长的，例如30或50个核苷酸，或100个核苷酸或更多。可以使用对应于完整基因转录物的全长序列。优选它们长约19到约23个核苷酸。

核酸分子的双链区与靶转录物的相同性程度应当是至少90％，更优选95-100％。通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定核酸分子的百分比相同性，其中缺口产生罚分＝5，和缺口延伸罚分＝0.3。优选在两条序列的完整长度上对它们进行比对。

核酸分子当然还可以包括能够具有稳定分子的功能的无关序列。

本文使用的术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指包括能够抑制或下调基因表达的核糖核苷酸的核酸分子，例如以序列特异性方式介导RNAi，其中双链部分的长度少于50个核苷酸，优选长度为约19到约23个核苷酸。例如siRNA可以是包括自互补的有义和反义区的核酸分子，其中反义区包括与靶核酸分子或其一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义区具有对应于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列。siRNA可以从两个分离的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链，另一条链是反义链，其中反义和有义链是自互补的。

本文使用的术语siRNA表示等同于用于描述核酸分子的其他术语，所述核酸分子能够介导序列特异性RNAi，例如微小RNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，短干扰寡核苷酸，短干扰核酸(siNA)，短干扰修饰的寡核苷酸，化学修饰的siRNA，转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等等。此外，本文使用的术语RNAi表示等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，如转录后基因沉默，翻译抑制，或外因遗传学。例如，本发明的siRNA分子可用于在转录后水平或转录前水平外遗传沉默基因。在非限制性的实例中，通过本发明siRNA分子的基因表达的外遗传调节可以源于siRNA介导的染色质结构的变化以改变基因表达。

优选的小干扰RNA(“siRNA”)分子包括与靶mRNA的约19到23个连续核苷酸相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，靶mRNA序列从二核苷酸AA开始，包括约30-70％(优选30-60％，更优选40-60％，和更优选约45％-55％)的GC含量，并且与任意核苷酸序列(除了被导入禽类(优选鸡)基因组中的靶之外)不具有高百分比相同性，例如通过标准BLAST检索确定。

“shRNA”或“短发夹RNA”表示一种siRNA分子，其中少于约50个核苷酸(优选约19到约23个核苷酸)与位于相同RNA分子上的互补序列碱基配对，所述序列与互补序列被至少约4到15个核苷酸的不配对区域(在碱基互补的两个区域产生的茎结构上形成单链环)分开。单链环序列的实例是5′UUCAAGAGA 3′和5′UUUGUGUAG 3′。

包括的shRNA是双或二指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包括被单链间隔区分离的两个或更多个这类茎-环结构。

存在公认的设计siRNA的标准(参见例如Elbashire et al.，2001；Amarzguioui et al.，2004；Reynolds et al.，2004)。详细内容可以参见数个商品供应商的站点，如Ambion，Dharmacon，GenScript和OligoEngine。典型地，必须产生大量siRNA并进行筛选以便比较它们的功效。

一旦设计好，用于本发明方法的dsRNA可以通过本领域已知的任意方法产生，例如通过体外转录，重组，或通过合成方式。siRNA可以在体外产生，通过使用重组酶(如T7RNA聚合酶)和DNA寡核苷酸模板，或可以在体内制备，例如在培养的细胞中。在优选的实施方案中，核酸分子是合成产生的。

此外，已经描述了从包含例如RNA聚合酶III启动子的载体产生发夹siRNA的策略。已经构建了各种载体用于在宿主细胞中产生发夹siRNA，使用H1-RNA或snU6RNA启动子(参见SEQ ID NO：7到9)。如上所述的RNA分子(例如，第一个部分，连接序列和第二个部分)可以与这类启动子可操纵地连接。当通过RNA聚合酶III转录时，第一和第二个部分形成发夹的双链茎，连接序列形成环。pSuper载体(OligoEngines Ltd.，Seattle，Wash.)也可用于产生siRNA。

还可以导入核苷酸的修饰物或类似物以改善本发明核酸分子的性质。改善的性质包括增加的核酸酶抗性和/或增加的穿透细胞膜的能力。因此，术语“核酸分子”和“双链RNA分子”包括合成修饰的碱基如但不限于肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基-，2-丙基-和其他烷基-腺嘌呤，5-卤尿嘧啶，5-卤胞嘧啶，6-氮胞嘧啶和6-氮胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫脲嘧啶，8-卤腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-巯基腺嘌呤，8-硫代烷基腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤，8-卤鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，8-巯基鸟嘌呤，8-硫代烷基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤，其他氮杂和去氮腺嘌呤，其他氮杂和去氮鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

性状，尤其是生产性状和负责其的基因

本发明的方法可用于改变禽类物种的任意性状，尤其是胚胎在卵中发育是决定或影响的性状。优选可以改变的性状包括性别和肌肉质量。

在一个实施方案中，生产性状是性别，核酸分子降低DMRT1基因编码的蛋白的水平。DMRT1是涉及性别决定的第一个分子，在门(phyla)之间显示序列保守性。DMRT1的禽类同系物发现于鸡的Z(性别)染色体，在公鸡和母鸡胚胎的生殖脊中差异表达(Raymond et al.，1999；Smith et al.，1999)。DMRT1是迄今为止涉及哺乳动物性别决定的少数基因之一，看起来具有严格的生殖腺表达模式(Raymond et al.，1999)。

可用于降低鸡DMRT1蛋白水平的核酸分子的实例包括但不限于包括下列核苷酸序列中至少一种的那些核酸分子：

CCAGUUGUCAAGAAGAGCA(SEQ ID NO：11)

GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO：12)

CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO：13)

GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)

CCAGCAACAUACAUGUCAA(SEQ ID NO：15)

CCUGCGUCACACAGAUACU(SEQ ID NO：16)

GGAGUAGUUGUACAGGUUG(SEQ ID NO：17)

GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO：18)

AUGGCGGUUCUCCAUCCCU(SEQ ID NO：19)，或其任意一种的变体。

在特别优选的实施方案中，可用于降低鸡DMRT1蛋白水平的核酸分子包括序列GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)或其变体。

可以被靶向以改变性别(作为生产性状)的基因的另一个实例是WPKCI基因。禽类基因WPKCI已经被证明在禽类W染色体上普遍是保守的，并且在生殖腺分化发生前在母鸡胚胎中表达活跃。通过干扰PKCI的功能或在细胞核中展示其独特的功能表明WPKCI可能在雌性生殖腺的分化中起作用(Hori et al.，2000)。该基因也被确定为ASW(禽类性别特异性W-连锁的)(O′Neill et al.，2000)。

在另一实施方案中，生产性状是肌肉质量，核酸分子降低筒箭毒碱基因编码的蛋白的水平。筒箭毒碱，也称为“生长和分化因子-8”(GDF8)，是最近发现的TGFβ超家族的成员。筒箭毒碱mRNA和蛋白已经被证明在骨骼肌，心脏和乳腺中表达。小鼠中筒箭毒碱基因的靶向破坏和双倍肌肉(double muscled)Belgian Blue牛中筒箭毒碱基因第三外显子的突变(其中表达无功能的筒箭毒碱蛋白)导致肌肉质量增加。因此，筒箭毒碱是骨骼肌生长的负调节物。

可用于降低鸡筒箭毒碱蛋白水平的核酸分子的实例包括但不限于包括下列核苷酸序列中至少一种的那些核酸分子：

AAGCUAGCAGUCUAUGUUU(SEQ ID NO：20)

GCUAGCAGUCUAUGUUUAU(SEQ ID NO：21)

CGCUGAAAAAGACGGACUG(SEQ ID NO：22)

AAAGACGGACUGUGCAAUG(SEQ ID NO：23)

AGACGGACUGUGCAAUGCU(SEQ ID NO：24)

UGCUUGUACGUGGAGACAG(SEQ ID NO：25)

UACAAAAUCCUCCAGAAUA(SEQ ID NO：26)

AAUCCUCCAGAAUAGAAGC(SEQ ID NO：27)

UCCUCCAGAAUAGAAGCCA(SEQ ID NO：28)

UAGAAGCCAUAAAAAUUCA(SEQ ID NO：29)

GCCAUAAAAAUUCAAAUCC(SEQ ID NO：30)

AAAUUCAAAUCCUCAGCAA(SEQ ID NO：31)

AUUCAAAUCCUCAGCAAAC(SEQ ID NO：32)

AUCCUCAGCAAACUGCGCC(SEQ ID NO：33)

ACUGCGCCUGGAACAAGCA(SEQ ID NO：34)

CAAGCACCUAACAUUAGCA(SEQ ID NO：35)

GCACCUAACAUUAGCAGGG(SEQ ID NO：36)

CAUUAGCAGGGACGUUAUU(SEQ ID NO：37)

GCAGCUUUUACCCAAAGCU(SEQ ID NO：38)

UUCCUGCAGUGGAGGAGCU(SEQ ID NO：39)

CUGAUUGAUCAGUAUGAUG(SEQ ID NO：40)

GACGAUGACUAUCAUGCCA(SEQ ID NO：41)

CCGAGACGAUUAUCACAAU(SEQ ID NO：42)

UGCCUACGGAGUCUGAUUU(SEQ ID NO：43)

AUGGAGGGAAAACCAAAAU(SEQ ID NO：44)

AACCAAAAUGUUGCUUCUU(SEQ ID NO：45)

CCAAAAUGUUGCUUCUUUA(SEQ ID NO：46)

AAUGUUGCUUCUUUAAGUU(SEQ ID NO：47)

UGUUGCUUCUUUAAGUUUA(SEQ ID NO：48)

GUUUAGCUCUAAAAUACAA(SEQ ID NO：49)

AAUACAAUAUAACAAAGUA(SEQ ID NO：50)

UACAAUAUAACAAAGUAGU(SEQ ID NO：51)

UAUAACAAAGUAGUAAAGG(SEQ ID NO：52)

CAAAGUAGUAAAGGCACAA(SEQ ID NO：53)

AGUAGUAAAGGCACAAUUA(SEQ ID NO：54)

AGGCACAAUUAUGGAUAUA(SEQ ID NO：55)

UUAUGGAUAUACUUGAGGC(SEQ ID NO：56)

GUCCAAAAACCUACAACGG(SEQ ID NO：57)

AAACCUACAACGGUGUUUG(SEQ ID NO：58)

ACCUACAACGGUGUUUGUG(SEQ ID NO：59)

CGGUGUUUGUGCAGAUCCU(SEQ ID NO：60)

GCCCAUGAAAGACGGUACA(SEQ ID NO：61)

AGACGGUACAAGAUAUACU(SEQ ID NO：62)

GAUAUACUGGAAUUCGAUC(SEQ ID NO：63)

UUCGAUCUUUGAAACUUGA(SEQ ID NO：64)

ACUUGACAUGAACCCAGGC(SEQ ID NO：65)

CCCAGGCACUGGUAUCUGG(SEQ ID NO：66)

GACAGUGCUGCAAAAUUGG(SEQ ID NO：67)

AAUUGGCUCAAACAGCCUG(SEQ ID NO：68)

UUGGCUCAAACAGCCUGAA(SEQ ID NO：69)

ACAGCCUGAAUCCAAUUUA(SEQ ID NO：70)

UCCAAUUUAGGCAUCGAAA(SEQ ID NO：71)

UUUAGGCAUCGAAAUAAAA(SEQ ID NO：72)

AUAAAAGCUUUUGAUGAGA(SEQ ID NO：73)

AAGCUUUUGAUGAGACUGG(SEQ ID NO：74)

GCUUUUGAUGAGACUGGAC(SEQ ID NO：75)

GAUGGAUUGAACCCAUUUU(SEQ ID NO：76)

CCCAUUUUUAGAGGUCAGA(SEQ ID NO：77)

ACGGUCCCGCAGAGAUUUU(SEQ ID NO：78)

CGGAAUCCCGAUGUUGUCG(SEQ ID NO：79)

UCCAGUCCCAUCCAAAAGC(SEQ ID NO：80)

GCUUUUGGAUGGGACUGGA(SEQ ID NO：81)

AAGAUACAAAGCCAAUUAC(SEQ ID NO：82)

GAUACAAAGCCAAUUACUG(SEQ ID NO：83)

AGCCAAUUACUGCUCCGGA(SEQ ID NO：84)

UUACUGCUCCGGAGAAUGC(SEQ ID NO：85)

UGCGAAUUUGUGUUUCUAC(SEQ ID NO：86)

CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)

AUACCCGCACACUCACCUG(SEQ ID NO：88)

GCAAAUCCCAGAGGUCCAG(SEQ ID NO：89)

AUCCCAGAGGUCCAGCAGG(SEQ ID NO：90)

GAUGUCCCCUAUAAACAUG(SEQ ID NO：91)

ACAUGCUGUAUUUCAAUGG(SEQ ID NO：92)

UGGAAAAGAACAAAUAAUA(SEQ ID NO：93)

AAGAACAAAUAAUAUAUGG(SEQ ID NO：94)

GAACAAAUAAUAUAUGGAA(SEQ ID NO：95)

CAAAUAAUAUAUGGAAAGA(SEQ ID NO：96)

AUAAUAUAUGGAAAGAUAC(SEQ ID NO：97)

UAUAUGGAAAGAUACCAGC(SEQ ID NO：98)

CCAGAAUAGAAGCCAUAAA(SEQ ID NO：113)

GCACAAUUAUGGAUAUACU(SEQ ID NO：114)

GUACAAGAUAUACUGGAAU(SEQ ID NO：115)

CCUAUAAACAUGCUGUAUU(SEQ ID NO：116)

GCGAAUUUGUGUUUCUACA(SEQ ID NO：117)

GAGUAUUGAUGUGAAGACA(SEQ ID NO：118)

CCUCCAGAAUAGAAGCCAU(SEQ ID NO：119)

GGUCAGAGUUACAGACACA(SEQ ID NO：120)

CAGUGGAUUUCGAAGCUUU(SEQ ID NO：121)

CAACGGUGUUUGUGCAGAU(SEQ ID NO：122)，或其任意一种的变体。

在特别优选的实施方案中，可用于降低鸡筒箭毒碱蛋白水平的核酸分子包括序列CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)，或其变体。

载体和宿主细胞

本发明还提供了编码核酸分子的载体，所述核酸分子包括本发明的双链区或其单链。优选载体是能够在宿主细胞和/或无细胞系统中表达编码dsRNA的开放读框的表达载体。宿主细胞可以是任意的细胞类型如但不限于细菌，真菌，植物或动物细胞。

通常，本发明的载体将包括与编码本发明的核酸分子或其链的开放读框可操纵连接的启动子。

本文使用的术语“启动子”是指能够指导可操纵连接的核酸分子转录的核酸序列，包括例如RNA聚合酶II和RNA聚合酶III启动子。该定义还包括那些转录调控元件(例如增强子)，其足以使启动子依赖性基因表达成为以细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性方式可控的，或通过外部试剂或信号诱导的。

本文使用的“可操纵地连接”是指两个或更多个核酸(例如DNA)节段之间的功能关系。通常，它表示转录调控元件与转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列在合适细胞中的转录，则该启动子与编码序列(如编码本文所述双链RNA分子的开放读框)可操纵地连接。通常，与转录的序列可操纵连接的启动子转录调控元件与所述被转录的序列是物理上相邻的，即它们是顺式作用的。但是，一些转录调控元件如增强子不需要与编码序列(其转录被增强)物理上相邻或位于其附近。

“RNA聚合酶III启动子”或“RNApoi III启动子”或“聚合酶III启动子”或“pol III启动子”表示任何无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物启动子，例如鸡，人，鼠，猪，牛，灵长类动物，猿等等，在细胞的自然情况下其与RNA聚合酶III结合或相互作用来转录其可操纵连接的基因或其任意变体(天然或工程化的)，在挑选的宿主细胞中与RNA聚合酶III相互作用来转录可操纵连接的核酸序列。U6启动子(例如鸡U6，人U6，鼠U6)，H1启动子或7SK启动子表示任何无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物启动子或多态性变体或突变体，在自然界发现它们与RNA聚合酶III相互作用来分别转录其同源RNA产物，即U6RNA，H1RNA或7SK RNA。合适启动子的实例包括cU6-1(SEQ ID NO：7)，cU6-3(SEQ ID NO：8)，cU6-4(SEQ IDNO：9)和c7SK(SEQ ID NO：10)。

当使用大肠杆菌(E.coli)作为宿主细胞时，除了载体应具有为了在大肠杆菌(例如JM109.DH5α，HB101或XL1Blue)中扩增和大量产生载体的“ori”以及用于选择转化大肠杆菌的标记基因(例如通过药物如氨苄青霉素，四环素，卡那霉素或氯霉素选择的药物抗药性基因)以外，没有任何限制。例如，可以使用M13-系列载体，pUC-系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。pGEM-T，pDIRECT，pT7等等也可用于编码dsRNA的基因以及上述载体的亚克隆和切割。

就用于大肠杆菌的表达载体而言，这类载体包括JM109，DH5α，HB101或XL1Blue，载体应具有启动子如lacZ启动子，araB启动子或T7启动子，它们可以有效促进所需基因在大肠杆菌中的表达。载体的其他实例是“QIAexpress系统”(Qiagen)，pEGFP和pET(对于该载体优选使用BL21(表达T7RNA聚合酶的菌株)作为宿主)。

除了用于大肠杆菌的载体外，例如，载体可以是哺乳动物来源的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)，pEGF-BOS，pEF和pCDM8)，昆虫细胞来源的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GibcoBRL)和pBacPAK8)，植物来源的表达载体(例如pMH1和pMH2)，动物病毒来源的表达载体(例如pHSV，pMV和pAdexLcw)，逆转录病毒来源的表达载体(例如pZIPneo)，酵母来源的表达载体(例如，“Pichia Expression Kit”(Invitrogen)，pNV11和SP-Q01)，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的表达载体(例如pPL608和pKTH50)。

为了在动物细胞(如CHO，COS，Vero和NIH3T3细胞)中表达核酸分子，载体应具有在这类细胞中表达必需的启动子，例如SV40启动子，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子，CMV启动子等等，更优选其具有用于选择转化体的标记基因(例如通过药物(例如新霉素G418，等等)选择的药物抗性基因)。具有这些特征的载体实例包括pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。

通过例如将编码核酸的开放读框插入合适的载体并通过逆转录病毒法、脂质体法、阳离子脂质体法、腺病毒法等等导入载体可以在动物中表达包括本发明双链区的核酸分子。使用的载体包括但不限于腺病毒载体(例如pAdexlcw)和逆转录病毒载体(例如pZIPneo)。可以按照常规方法实施基因操作的一般技术，如将本发明的核酸插入载体。

本发明还提供了宿主细胞，在所述宿主细胞中已经导入外源核酸分子(典型地位于本发明的载体中)。本发明的宿主细胞可以用做例如用于产生或表达核酸分子的生产系统。对于体外生产来说，可以使用真核细胞或原核细胞。

有用的真核宿主细胞可以是动物、植物或真菌细胞。作为动物细胞，可以使用哺乳动物细胞如CHO，COS，3T3，骨髓瘤，幼仓鼠肾(BHK)，HeLa或Vero细胞，MDCK细胞，DF1细胞，两栖动物细胞如非洲爪蟾卵细胞或昆虫细胞如Sf9，Sf21或Tn5细胞。还可以使用不含DHFR基因的CHO细胞(dhfr-CHO)或CHO K-1。载体可以通过以下方法导入宿主细胞，例如磷酸钙法，DEAE-葡聚糖法，阳离子脂质体DOTAP(BoehringerMannheim)法，电穿孔，脂质体转染等等。

有用的原核细胞包括细菌细胞，如大肠杆菌，例如JM109，DH5a和HB101，或枯草芽胞杆菌。

培养基如DMEM，MEM，RPMI-1640或IMDM可用于动物细胞。可以使用含有或不含血清补充剂如胎牛血清(FCS)的培养基。培养基的pH优选在约6到8之间。细胞典型地在约30到40℃培养约15到200小时，培养基可以被更换，通气或必要时搅拌。

组合物

本发明还提供了可以给禽类卵施用的包含核酸分子的组合物，所述核酸分子包括双链区。包含包括双链区的核酸分子的组合物可以包含药物可接受的载体以便使所述组合物适于施用。

合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂包括但不限于乳糖，蔗糖，淀粉，滑石粉，烷酸(alkonoic acid)的纤维素酯，硬脂酸镁，氧化镁，结晶纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素，明胶，甘油，海藻酸钠，抗细菌剂，抗真菌剂，阿拉伯树胶，阿拉伯胶，磷酸和硫酸的钠和钙盐，聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇，盐水，和水。在一个实施方案中，载体、赋形剂和/或稀释剂是磷酸缓冲盐溶液或水。

组合物还可以包含转染促进剂。用于促进核酸被摄取入活细胞的转染促进剂是本领域公知的。增强转染的试剂包括以下类型的化学品家族；多聚阳离子，树枝状物，DEAE葡聚糖，嵌段共聚物和阳离子脂类。优选转染促进剂是含脂化合物(或制剂)，提供带正电荷的亲水区和脂肪酰基疏水区，使得在水溶液中自装配成囊泡(通常被称为微团或脂质体以及脂多氨)。

应理解可以使用任意常规培养基或试剂，只要其不是与本发明的组合物或方法不相容的。

施用

包括双链区的核酸分子(包括包含核酸分子的组合物，所述核酸分子包括双链区)的施用方便地通过注射入卵来完成，通常是注射入气囊。尽管气囊是优选的卵内施用途径，其他区域如卵黄囊或绒膜尿囊液也可以通过注射接种。当气囊不是施用靶时，孵化率可能稍微降低，但这不一定是商业上无法接受的水平。注射的器械不是实施本发明关键，尽管优选针头不会对卵或发育胚胎的组织和器官或胚胎周围的外胚胎膜造成过度损伤。

当生产性状是性别时，优选在产卵4天内施用核酸分子。

通常，配备大约22号针头的皮下注射器是合适的。本发明的方法尤其适用于自动化注射系统，如描述于US 4,903,635，US 5,056,464，US 5,136,979和US 20060075973中的那些。

以足以至少在一定程度上改变靶性状的有效量施用核酸分子。就性别而言，通过比较接受本发明方法的合适样本数与未接受本发明方法的类似数量的样本数来检测所述改变。两组间鸟类性别统计学上显著的变化说明已经施用了有效量。确定用于性别或其他性状的有效量的其他方法在本领域技术人员的能力范围内。

优选将约1ng到100μg，更优选约100ng到1μg的核酸给卵施用。此外，优选以约1μl到1ml，更优选约10μl到500μl的体积施用核酸。

实施例

实施例1-鉴定下调鸡中DMRT1蛋白产生的shRNA分子

靶向Dmrt1的shRNA序列的选择

本发明人利用Ambion设计的siRNA靶发现物(target finder)(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)选择了针对Dmrt1的30种预测的siRNA序列。然后筛选这30种siRNA序列以选择shRNA(表1)。现在有数种算法用于选择针对特定靶基因的潜在siRNA序列。但是已经证明当使用表达的shRNA时，这些预测siRNA中的许多不能有效的起作用。Taxman等(2006)特别设计了一种预测有效shRNA分子的算法，本发明人对该算法做出自己的改进以提高shRNA预测。本发明人对30种选择的siRNA使用改进的Taxman算法以便选择序列用于检测shRNA对Dmrt1基因表达的特异性敲低。

使用Taxman算法用于shRNA选择有4条标准。这些标准中的3条评分为最大值4分。这些标准是：1)序列5′端的C或G＝1分，5端的A或T＝-1分；2)3′端的A或T＝1分，3′端的C或G＝-1分；3)7个3′碱基中5个或更多个A或T＝2分，7个3′碱基中4个A或T＝1分。具有最高分数的shRNA序列是优选的。第4条标准基于shRNA序列6个中心碱基自由能的计算(与反义链碱基9-14杂交的有义链碱基6-1)。中心双链AG＞-12.9kcal/mol的shRNA是优选的。Taxman算法的改进使用Freier等(1986)公开的用于预测RNA双链稳定性的不同自由能参数。基于该算法，本发明人选择了siRNA靶发现物siRNA序列中的6种作为可能有效的shRNA来检测它们敲低Dmrt1基因表达的能力。选择的序列在表1中粗体突出显示，它们的5′-3′序列显示于表2。这6种序列用于构建表达6种shRNA的ddRNAi质粒。

用于表达选择的shRNA的ddRNAi质粒的构建

鸡聚合酶III启动子cU6-1(GenBank登录号DQ531567)和cU6-4(DQ531570)被用作模板来构建选择的dmrt1和对照(EGFP和无关)shRNA的ddRNAi表达质粒，通过一步法PCR(图1)进行。用于构建shRNA质粒的PCR使用引物TD175，其与以下配对：TH346(用于shDmrt1-346)，TH461(shDmrt1-461)，TH566(shDmrt1-566)，TH622(shDmrt1-622)，TH697(shDmrt1-697)，TH839(shDmrt1-839)或TD195(shEGFP)(参见表3，扩增的特异性shRNA的引物序列和细节)。每个PCR中的反向引物被设计成包括启动子序列、shRNA有义、环和shRNA反义序列的每一个的最后20个核苷酸，并经HPLC纯化。将全长扩增的表达盒产物连接入pGEM-T Easy，然后测序。用于基因敲低分析的最终shRNA表达质粒被称为pshDmrt1-346，pshDmrt1-461，pshDmrt1-566，pshDmrt1-622，pshDmrt1-697，pshDmrt1-839和pshEGFP。还构建了cU6-1无关对照质粒，将其用于基因表达分析中的模拟比较(见下文)。对于这种模拟质粒，正向引物TD135与包括chU6-1启动子最后20个核苷酸和所有其他无关shRNA组分的反向引物TD149配对。将PCR产物连接入pGEM-T Easy，然后测序。

表1.靶向Dmrt1的shRNA序列的算法选择。

shRNA	5’末端分数	ΔG中心	3’分数	3’的A+T	分数
shRNA	5’末端分数	ΔG中心	3’分数	3’的A+T	分数	Dmrt1-346	1	-11.2	1	1	3
Dmrt1-461	1	-13.3	1	1	3	Dmrt1-346	1	-11.2	1	1	3
Dmrt1-461	1	-13.3	1	1	3	Dmrt1-566	1	-11.6	1	2	4
Dmrt1-622	1	-13.6	1	1	3	Dmrt1-566	1	-11.6	1	2	4
Dmrt1-622	1	-13.6	1	1	3	Dmrt1-697	1	-10.7	1	2	4
Dmrt1-839	1	-14.2	1	2	4	Dmrt1-697	1	-10.7	1	2	4
Dmrt1-839	1	-14.2	1	2	4	Dmrt1-581	1	-13.2	-1	2	2
Dmrt1-341	1	-15.8	1	2	4	Dmrt1-581	1	-13.2	-1	2	2
Dmrt1-341	1	-15.8	1	2	4	Dmrt1-578	-1	-10.9	1	2	2
Dmrt1-563	1	-12.8	1	2	4	Dmrt1-578	-1	-10.9	1	2	2
Dmrt1-563	1	-12.8	1	2	4	Dmrt1-779	-1	-14	1	1	1
Dmrt1-837	1	-15.5	1	2	4	Dmrt1-779	-1	-14	1	1	1
Dmrt1-837	1	-15.5	1	2	4	Dmrt1-593	1	-14.7	-1	1	1
Dmrt1-778	1	-15.2	-1	1	1	Dmrt1-593	1	-14.7	-1	1	1
Dmrt1-778	1	-15.2	-1	1	1	Dmrt1-577	-1	-9.8	1	1	1
Dmrt1-583	1	-13.8	1	0	2	Dmrt1-577	-1	-9.8	1	1	1
Dmrt1-583	1	-13.8	1	0	2	Dmrt1-839	1	-14.2	1	2	4
Dmrt1-691	1	-16.8	-1	2	2	Dmrt1-839	1	-14.2	1	2	4

shRNA	5’末端分数	ΔG中心	3’分数	3’的A+T	分数
shRNA	5’末端分数	ΔG中心	3’分数	3’的A+T	分数	Dmrt1-455	1	-15.4	-1	1	1
Dmrt1-705	-1	-11.5	-1	2	0	Dmrt1-455	1	-15.4	-1	1	1
Dmrt1-705	-1	-11.5	-1	2	0	Dmrt1-532	1	-14.6	1	1	3
Dmrt1-184	1	-15.3	1	1	3	Dmrt1-532	1	-14.6	1	1	3
Dmrt1-184	1	-15.3	1	1	3	Dmrt1-761	-1	-13.6	1	0	0
Dmrt1-505	-1	-15	1	2	2	Dmrt1-761	-1	-13.6	1	0	0
Dmrt1-505	-1	-15	1	2	2	Dmrt1-208	1	-17.1	1	2	4
Dmrt1-219	1	-13.4	-1	0	0	Dmrt1-208	1	-17.1	1	2	4
Dmrt1-219	1	-13.4	-1	0	0	Dmrt1-458	1	-14.2	1	1	3
Dmrt1-837	1	-15.2	1	2	4	Dmrt1-458	1	-14.2	1	1	3
Dmrt1-837	1	-15.2	1	2	4	Dmrt1-701	1	-10.7	1	0	2
Dmrt1-628	1	-13.6	1	1	3	Dmrt1-701	1	-10.7	1	0	2

表2.Dmrt1shRNA的序列。

shRNA	5’-3’序列
shRNA	5’-3’序列	Dmrt1-346	CCAGUUGUCAAGAAGAGCA(SEQ ID NO：11)
Dmrt1-461	GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO：12)	Dmrt1-346	CCAGUUGUCAAGAAGAGCA(SEQ ID NO：11)
Dmrt1-461	GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO：12)	Dmrt1-566	CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO：13)
Dmrt1-622	GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)	Dmrt1-566	CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO：13)
Dmrt1-622	GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)	Dmrt1-697	CCAGCAACAUACAUGUCAA(SEQ ID NO：15)
Dmrt1-839	CCUGCGUCACACAGAUACU(SEQ ID NO：16)	Dmrt1-697	CCAGCAACAUACAUGUCAA(SEQ ID NO：15)

表3.使用的引物的序列和细节。

构建各个ddRNAi质粒使得每条shRNA序列的起始位于天然U6snRNA转录物的+1位。将XhoI限制性内切酶位点工程化到终止信号的下游以便筛选插入pGEM-T Easy的全长shRNA产物。所有最终的shRNA表达载体由全长鸡U6启动子，shRNA有义序列，环序列，shRNA反义序列，终止序列和XhoI位点中的任意一种组成。所有shRNA中使用的环序列是5′UUCAAGAGA 3′。

检测选择的shRNA对Dmrt1基因表达的敲低

使用报道基因表达分析法检测shRNA对Dmrt1的沉默。报道基因是插入pEGFP-C(Clontech)的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因3’末端下游的Dmrt1的转录基因融合体。如下构建报道质粒：从4天龄胚胎分离的总RNA逆转录Dmrt1的cDNA，然后将其克隆入pCMV-Script(Stratagene)的多克隆位点。从克隆载体取出作为NotI-EcoRI片段的Dmrt1插入序列，然后将其克隆入pEGFP-C(Clontech)的EGFP基因下游。所获质粒被称为pEGFP-Dmrt1。将该质粒转染入鸡DF-1细胞，利用如下所述的流式细胞术通过检测EGFP荧光证实转录基因融合体的表达。DF-1细胞是鸡胚胎成纤维细胞的连续系，源自EV-0胚胎(ATCC，CRL-12203)，因此是研究RNAi分子卵内作用的模型系统。

通过用pEGFP-Dmrt1报道质粒和各种表达Dmrt1特异性和对照shRNA的ddRNAi质粒共转染DF-1细胞来进行Dmrt1基因沉默分析。如下进行共转染实验：在37℃包含5％CO₂的湿润环境下，DF-1细胞(ATCC CRL-12203，鸡成纤维细胞)在Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)中培养，其中DMEM包含4.5g/l葡萄糖，1.5g/l碳酸氢钠，10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷氨酰胺并添加青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。根据需要使用0.25％(w/v)胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)传代DF1细胞。

当DF-1细胞生长到80-90％汇合时，在用于流式细胞分析的24孔培养板(Nunc)中进行pEGFP-Dmrt1和ddRNAi质粒的共转染，用于EGFP-Dmrt1融合体沉默分析。利用Lipofectamine^TM2000转染剂(Invitrogen)按每孔共1μg质粒DNA转染细胞。使用转染的流式细胞分析法在转染后60小时分析转染的DF-1细胞中的EGFP表达，重复3次。细胞用100μl 0.25％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶作用，在2000rpm沉淀5分钟，然后用1ml冷的磷酸缓冲盐溶液-A(PBSA)(Oxoid)清洗一次，1ml FACS-清洗液(PBSA+1％FCS)清洗两次，重悬于250μl FACS-清洗液。使用FACScalibur(Becton Dickinson)荧光活化细胞分检器进行流式细胞术取样。利用CELLQuest软件(BectonDickinson)进行3份共转染样品的平均荧光强度(MFI)的数据获取和计算。基因沉默分析的结果显示于图2。pshEGFP被用作阳性对照。从该质粒表达的shRNA已知有效的靶向融合转录物的EGFP区并显示降低报道荧光大约50％。与从pshIrr表达的阴性对照无关shRNA相比，观察到Dmrt1特异性shRNA将报道基因的表达降低到不同水平。shDmrt1-622诱导大约60％的最大基因沉默水平。

实施例2-鉴定下调鸡中筒箭毒碱蛋白产生的shRNA分子

靶向筒箭毒碱(Gdf8)的shRNA序列的选择

利用Ambion设计的siRNA靶发现物(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)鉴定针对Gdf8的79种预测的siRNA序列(表4)。利用Taxman算法优化的其他siRNA序列在表5中提供。本发明人选择这些序列中的3种(Gdf8-258，Gdf8-913和Gdf8-1002)用于构建表达shRNA(在表4中粗体显示)的ddRNAi质粒。

用于表达选择的shRNA的ddRNAi质粒的构建

鸡聚合酶III启动子cU6-1(GenBank登录号DQ531567)被用作模板来通过一步法PCR构建用于选择的Gdf8和cEGFP shRNA的ddRNAi表达质粒(图1)。用于构建shRNA质粒的PCR使用引物TD135，其与以下配对：DS304(用于shGdf8-253)，DS305(shGdf8-913)，DS306(shGdf8-1002)或TD 148(shEGFP)(参见表6，扩增的特异性shRNA的引物序列和细节)。每个PCR中的反向引物被设计成包括启动子序列、shRNA有义、环和shRNA反义序列的每一个的最后20个核苷酸，并经HPLC纯化。将全长扩增的表达盒产物连接入pGEM-T Easy，然后测序。用于基因敲低分析的最终shRNA表达质粒被称为pshGdf8-253，pshGdf8-913，pshGdf8-1002和pshEGFP。

表4.Gdf8 shRNA的序列。

shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列
shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列	Gdf8-5	AAGCUAGCAGUCUAUGUUU(SEQ IDNO：20)	Gdf8-555	CGGUGUUUGUGCAGAUCCU(SEQ ID NO：60)
Gdf8-7	GCUAGCAGUCUAUGUUUAU(SEQ ID NO：21)	Gdf8-567	GCCCAUGAAAGACGGUACA(SEQ ID NO：61)	Gdf8-5	AAGCUAGCAGUCUAUGUUU(SEQ IDNO：20)	Gdf8-555	CGGUGUUUGUGCAGAUCCU(SEQ ID NO：60)
Gdf8-7	GCUAGCAGUCUAUGUUUAU(SEQ ID NO：21)	Gdf8-567	GCCCAUGAAAGACGGUACA(SEQ ID NO：61)	Gdf8-96	CGCUGAAAAAGACGGACUG(SEQ IDNO：22)	Gdf8-578	AGACGGUACAAGAUAUACU(SEQ ID NO：62)
Gdf8-103	AAAGACGGACUGUGCAAUG(SEQ ID NO：23)	Gdf8-590	GAUAUACUGGAAUUCGAUC(SEQ ID NO：63)	Gdf8-96	CGCUGAAAAAGACGGACUG(SEQ IDNO：22)	Gdf8-578	AGACGGUACAAGAUAUACU(SEQ ID NO：62)
Gdf8-103	AAAGACGGACUGUGCAAUG(SEQ ID NO：23)	Gdf8-590	GAUAUACUGGAAUUCGAUC(SEQ ID NO：63)	Gdf8-105	AGACGGACUGUGCAAUGCU(SEQ IDNO：24)	Gdf8-603	UUCGAUCUUUGAAACUUGA(SEQ ID NO：64)
Gdf8-120	UGCUUGUACGUGGAGACAG(SEQ IDNO：25)	Gdf8-615	ACUUGACAUGAACCCAGGC(SEQ ID NO：65)	Gdf8-105	AGACGGACUGUGCAAUGCU(SEQ IDNO：24)	Gdf8-603	UUCGAUCUUUGAAACUUGA(SEQ ID NO：64)

shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列
shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列	Gdf8-144	UACAAAAUCCUCCAGAAUA(SEQ IDNO：26)	Gdf8-654	CCCAGGCACUGGUAUCUGG(SEQ ID NO：66)
Gdf8-149	AAUCCUCCAGAAUAGAAGC(SEQ ID NO：27)	Gdf8-667	GACAGUGCUGCAAAAUUGG(SEQ ID NO：67)	Gdf8-144	UACAAAAUCCUCCAGAAUA(SEQ IDNO：26)	Gdf8-654	CCCAGGCACUGGUAUCUGG(SEQ ID NO：66)
Gdf8-149	AAUCCUCCAGAAUAGAAGC(SEQ ID NO：27)	Gdf8-667	GACAGUGCUGCAAAAUUGG(SEQ ID NO：67)	Gdf8-151	UCCUCCAGAAUAGAAGCCA(SEQ ID NO：28)	Gdf8-669	AAUUGGCUCAAACAGCCUG(SEQ ID NO：68)
Gdf8-161	UAGAAGCCAUAAAAAUUCA(SEQ IDNO：29)	Gdf8-678	UUGGCUCAAACAGCCUGAA(SEQ ID NO：69)	Gdf8-151	UCCUCCAGAAUAGAAGCCA(SEQ ID NO：28)	Gdf8-669	AAUUGGCUCAAACAGCCUG(SEQ ID NO：68)
Gdf8-161	UAGAAGCCAUAAAAAUUCA(SEQ IDNO：29)	Gdf8-678	UUGGCUCAAACAGCCUGAA(SEQ ID NO：69)	Gdf8-166	GCCAUAAAAAUUCAAAUCC(SEQ ID NO：30)	Gdf8-688	ACAGCCUGAAUCCAAUUUA(SEQ ID NO：70)
Gdf8-173	AAAUUCAAAUCCUCAGCAA(SEQ ID NO：31)	Gdf8-696	UCCAAUUUAGGCAUCGAAA(SEQ ID NO：71)	Gdf8-166	GCCAUAAAAAUUCAAAUCC(SEQ ID NO：30)	Gdf8-688	ACAGCCUGAAUCCAAUUUA(SEQ ID NO：70)
Gdf8-173	AAAUUCAAAUCCUCAGCAA(SEQ ID NO：31)	Gdf8-696	UCCAAUUUAGGCAUCGAAA(SEQ ID NO：71)	Gdf8-175	AUUCAAAUCCUCAGCAAAC(SEQ IDNO：32)	Gdf8-709	UUUAGGCAUCGAAAUAAAA(SEQ ID NO：72)
Gdf8-181	AUCCUCAGCAAACUGCGCC(SEQ ID NO：33)	Gdf8-713	AUAAAAGCUUUUGAUGAGA(SEQ ID NO：73)	Gdf8-175	AUUCAAAUCCUCAGCAAAC(SEQ IDNO：32)	Gdf8-709	UUUAGGCAUCGAAAUAAAA(SEQ ID NO：72)
Gdf8-181	AUCCUCAGCAAACUGCGCC(SEQ ID NO：33)	Gdf8-713	AUAAAAGCUUUUGAUGAGA(SEQ ID NO：73)	Gdf8-195	ACUGCGCCUGGAACAAGCA(SEQ IDNO：34)	Gdf8-715	AAGCUUUUGAUGAGACUGG(SEQ ID NO：74)
Gdf8-208	CAAGCACCUAACAUUAGCA(SEQ IDNO：35)	Gdf8-772	GCUUUUGAUGAGACUGGAC(SEQ ID NO：75)	Gdf8-195	ACUGCGCCUGGAACAAGCA(SEQ IDNO：34)	Gdf8-715	AAGCUUUUGAUGAGACUGG(SEQ ID NO：74)
Gdf8-208	CAAGCACCUAACAUUAGCA(SEQ IDNO：35)	Gdf8-772	GCUUUUGAUGAGACUGGAC(SEQ ID NO：75)	Gdf8-211	GCACCUAACAUUAGCAGGG(SEQ IDNO：36)	Gdf8-783	GAUGGAUUGAACCCAUUUU(SEQ ID NO：76)
Gdf8-219	CAUUAGCAGGGACGUUAU	Gdf8-822	CCCAUUUUUAGAGGUCA	Gdf8-211	GCACCUAACAUUAGCAGGG(SEQ IDNO：36)	Gdf8-783	GAUGGAUUGAACCCAUUUU(SEQ ID NO：76)
Gdf8-219	CAUUAGCAGGGACGUUAU	Gdf8-822	CCCAUUUUUAGAGGUCA		U(SEQ IDNO：37)		GA(SEQ ID NO：77)

shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列
shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列	Gdf8-240	GCAGCUUUUACCCAAAGCU(SEQ ID NO：38)	Gdf8-866	ACGGUCCCGCAGAGAUUUU(SEQ ID NO：78)
Gdf8-258	UUCCUGCAGUGGAGGAGCU(SEQ ID NO：39)	Gdf8-871	CGGAAUCCCGAUGUUGUCG(SEQ IDNO：79)	Gdf8-240	GCAGCUUUUACCCAAAGCU(SEQ ID NO：38)	Gdf8-866	ACGGUCCCGCAGAGAUUUU(SEQ ID NO：78)
Gdf8-258	UUCCUGCAGUGGAGGAGCU(SEQ ID NO：39)	Gdf8-871	CGGAAUCCCGAUGUUGUCG(SEQ IDNO：79)	Gdf8-277	CUGAUUGAUCAGUAUGAUG(SEQ ID NO：40)	Gdf8-913	UCCAGUCCCAUCCAAAAGC(SEQ ID NO：80)
Gdf8-334	GACGAUGACUAUCAUGCCA(SEQ IDNO：41)	Gdf8-948	GCUUUUGGAUGGGACUGGA(SEQ ID NO：81)	Gdf8-277	CUGAUUGAUCAGUAUGAUG(SEQ ID NO：40)	Gdf8-913	UCCAGUCCCAUCCAAAAGC(SEQ ID NO：80)
Gdf8-334	GACGAUGACUAUCAUGCCA(SEQ IDNO：41)	Gdf8-948	GCUUUUGGAUGGGACUGGA(SEQ ID NO：81)	Gdf8-356	CCGAGACGAUUAUCACAAU(SEQ IDNO：42)	Gdf8-950	AAGAUACAAAGCCAAUUAC(SEQ ID NO：82)
Gdf8-406	UGCCUACGGAGUCUGAUUU(SEQ IDNO：43)	Gdf8-957	GAUACAAAGCCAAUUACUG(SEQ ID NO：83)	Gdf8-356	CCGAGACGAUUAUCACAAU(SEQ IDNO：42)	Gdf8-950	AAGAUACAAAGCCAAUUAC(SEQ ID NO：82)
Gdf8-406	UGCCUACGGAGUCUGAUUU(SEQ IDNO：43)	Gdf8-957	GAUACAAAGCCAAUUACUG(SEQ ID NO：83)	Gdf8-416	AUGGAGGGAAAACCAAAAU(SEQ ID NO：44)	Gdf8-963	AGCCAAUUACUGCUCCGGA(SEQ ID NO：84)
Gdf8-418	AACCAAAAUGUUGCUUCUU(SEQ IDNO：45)	Gdf8-979	UUACUGCUCCGGAGAAUGC(SEQ ID NO：85)	Gdf8-416	AUGGAGGGAAAACCAAAAU(SEQ ID NO：44)	Gdf8-963	AGCCAAUUACUGCUCCGGA(SEQ ID NO：84)
Gdf8-418	AACCAAAAUGUUGCUUCUU(SEQ IDNO：45)	Gdf8-979	UUACUGCUCCGGAGAAUGC(SEQ ID NO：85)	Gdf8-422	CCAAAAUGUUGCUUCUUUA(SEQ IDNO：46)	Gdf8-985	UGCGAAUUUGUGUUUCUAC(SEQ ID NO：86)
Gdf8-424	AAUGUUGCUUCUUUAAGUU(SEQ ID NO：47)	Gdf8-1002	CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)	Gdf8-422	CCAAAAUGUUGCUUCUUUA(SEQ IDNO：46)	Gdf8-985	UGCGAAUUUGUGUUUCUAC(SEQ ID NO：86)
Gdf8-424	AAUGUUGCUUCUUUAAGUU(SEQ ID NO：47)	Gdf8-1002	CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)	Gdf8-441	UGUUGCUUCUUUAAGUUUA(SEQ ID NO：48)	Gdf8-1033	AUACCCGCACACUCACCUG(SEQ ID NO：88)
Gdf8-453	GUUUAGCUCUAAAAUACAA(SEQ ID NO：49)	Gdf8-1037	GCAAAUCCCAGAGGUCCAG(SEQ ID NO：89)	Gdf8-441	UGUUGCUUCUUUAAGUUUA(SEQ ID NO：48)	Gdf8-1033	AUACCCGCACACUCACCUG(SEQ ID NO：88)
Gdf8-453	GUUUAGCUCUAAAAUACAA(SEQ ID NO：49)	Gdf8-1037	GCAAAUCCCAGAGGUCCAG(SEQ ID NO：89)	Gdf8-455	AAUACAAUAUAACAAAGUA(SEQ ID NO：50)	Gdf8-1081	AUCCCAGAGGUCCAGCAGG(SEQ ID NO：90)

shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列
shRNA	5’-3’序列	shRNA	5’-3’序列	Gdf8-460	UACAAUAUAACAAAGUAGU(SEQ ID NO：51)	Gdf8-1095	GAUGUCCCCUAUAAACAUG(SEQ ID NO：91)
Gdf8-465	UAUAACAAAGUAGUAAAGG(SEQ ID NO：52)	Gdf8-1111	ACAUGCUGUAUUUCAAUGG(SEQ ID NO：92)	Gdf8-460	UACAAUAUAACAAAGUAGU(SEQ ID NO：51)	Gdf8-1095	GAUGUCCCCUAUAAACAUG(SEQ ID NO：91)
Gdf8-465	UAUAACAAAGUAGUAAAGG(SEQ ID NO：52)	Gdf8-1111	ACAUGCUGUAUUUCAAUGG(SEQ ID NO：92)	Gdf8-468	CAAAGUAGUAAAGGCACAA(SEQ IDNO：53)	Gdf8-1116	UGGAAAAGAACAAAUAAUA(SEQ ID NO：93)
Gdf8-476	AGUAGUAAAGGCACAAUUA(SEQ ID NO：54)	Gdf8-1118	AAGAACAAAUAAUAUAUGG(SEQ ID NO：94)	Gdf8-468	CAAAGUAGUAAAGGCACAA(SEQ IDNO：53)	Gdf8-1116	UGGAAAAGAACAAAUAAUA(SEQ ID NO：93)
Gdf8-476	AGUAGUAAAGGCACAAUUA(SEQ ID NO：54)	Gdf8-1118	AAGAACAAAUAAUAUAUGG(SEQ ID NO：94)	Gdf8-484	AGGCACAAUUAUGGAUAUA(SEQ ID NO：55)	Gdf8-1121	GAACAAAUAAUAUAUGGAA(SEQ ID NO：95)
Gdf8-508	UUAUGGAUAUACUUGAGGC(SEQ ID NO：56)	Gdf8-1124	CAAAUAAUAUAUGGAAAGA(SEQ ID NO：96)	Gdf8-484	AGGCACAAUUAUGGAUAUA(SEQ ID NO：55)	Gdf8-1121	GAACAAAUAAUAUAUGGAA(SEQ ID NO：95)
Gdf8-508	UUAUGGAUAUACUUGAGGC(SEQ ID NO：56)	Gdf8-1124	CAAAUAAUAUAUGGAAAGA(SEQ ID NO：96)	Gdf8-514	GUCCAAAAACCUACAACGG(SEQ IDNO：57)	Gdf8-1128	AUAAUAUAUGGAAAGAUAC(SEQ ID NO：97)
Gdf8-516	AAACCUACAACGGUGUUUG(SEQ ID NO：58)	Gdf8-1141	UAUAUGGAAAGAUACCAGC(SEQ ID NO：98)	Gdf8-514	GUCCAAAAACCUACAACGG(SEQ IDNO：57)	Gdf8-1128	AUAAUAUAUGGAAAGAUAC(SEQ ID NO：97)
Gdf8-516	AAACCUACAACGGUGUUUG(SEQ ID NO：58)	Gdf8-1141	UAUAUGGAAAGAUACCAGC(SEQ ID NO：98)	Gdf8-524	ACCUACAACGGUGUUUGUG(SEQ IDNO：59)

表5.使用Taxman算法优化的筒箭毒碱siRNA的序列。

名称	5’-3’序列
名称	5’-3’序列	152	CCAGAAUAGAAGCCAUAAA(SEQ ID NO：113)
460	GCACAAUUAUGGAUAUACU(SEQ ID NO：114)	152	CCAGAAUAGAAGCCAUAAA(SEQ ID NO：113)
460	GCACAAUUAUGGAUAUACU(SEQ ID NO：114)	548	GUACAAGAUAUACUGGAAU(SEQ ID NO：115)

名称	5’-3’序列
名称	5’-3’序列	1039	CCUAUAAACAUGCUGUAUU(SEQ ID NO：116)
938	GCGAAUUUGUGUUUCUACA(SEQ ID NO：117)	1039	CCUAUAAACAUGCUGUAUU(SEQ ID NO：116)
938	GCGAAUUUGUGUUUCUACA(SEQ ID NO：117)	612	GAGUAUUGAUGUGAAGACA(SEQ ID NO：118)
149	CCUCCAGAAUAGAAGCCAU(SEQ ID NO：119)	612	GAGUAUUGAUGUGAAGACA(SEQ ID NO：118)
149	CCUCCAGAAUAGAAGCCAU(SEQ ID NO：119)	762	GGUCAGAGUUACAGACACA(SEQ ID NO：120)
860	CAGUGGAUUUCGAAGCUUU(SEQ ID NO：121)	762	GGUCAGAGUUACAGACACA(SEQ ID NO：120)
860	CAGUGGAUUUCGAAGCUUU(SEQ ID NO：121)	500	CAACGGUGUUUGUGCAGAU(SEQ ID NO：122)

构建各个ddRNAi质粒使得每种shRNA序列的起始位于天然U6snRNA转录物的+1位。将XhoI限制性内切酶位点添加到终止信号的下游，以便筛选插入pGEM-T Easy的全长shRNA产物。所有最终的shRNA表达载体由全长鸡U6启动子，shRNA有义序列，环序列，shRNA反义序列，终止序列和XhoI位点组成。所有shRNA中使用的环序列是5′UUCAAGAGA3′。

表6.使用的引物的序列和细节。

检测选择的shRNA对Gdf8基因表达的敲低

使用报道基因表达分析法检测3种选择的shRNA对Gdf8的沉默。报道基因是插入pEGFP-C(Clontech)的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因3’末端下游的Gdf8的转录基因融合体。如下构建报道质粒：从7天龄胚胎分离的总RNA逆转录Gdf8的cDNA，然后将其克隆入pGEM-T Easy(Promega)的多克隆位点。从克隆载体取出作为NotI片段的Gdf8插入序列，然后将其克隆入pEGFP-C(Clontech)的EGFP基因下游。所获质粒被称为pEGFP-Gdf8。将该质粒转染入鸡DF-1细胞，利用如下所述的流式细胞术通过检测EGFP荧光证实转录基因融合体的表达。

通过用pEGFP-Gdf8报道质粒和各种表达Gdf8特异性或EGFP对照shRNA的ddRNAi质粒共转染DF-1细胞来进行Gdf8基因沉默分析。如下进行共转染实验：在37℃包含5％CO₂的湿润环境下，DF-1细胞(ATCCCRL-12203，鸡成纤维细胞)在Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)中培养，其中DMEM包含4.5g/l葡萄糖，1.5g/l碳酸氢钠，10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷氨酰胺并添加青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。根据需要使用0.25％(w/v)胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)传代DF1细胞。

当DF-1细胞生长到80-90％汇合时，在用于荧光显微镜检查分析的8孔腔式玻片(chamber slides)(Nunc)中进行pEGFP-Gdf8和ddRNAi质粒的共转染，用于EGFP-Gdf8融合体沉默分析。利用Lipofectamine^TM2000转染剂(Invitrogen)，按每孔共1μg质粒DNA转染细胞。在转染后60小时如下分析转染的DF-1细胞中的EGFP表达：用PBSA清洗8孔腔式玻片中共转染的细胞，移开腔式玻片盖(chamber slide housings)，将盖玻片盖在细胞单层上。利用Leica DM LB荧光显微镜(Leica Microsystems，Germany)进行镜检，使用Leica DC300F彩色数码相机(Leica Microsystems，Germany)和Photoshop 7.0成像软件

在50×放大率捕捉图像。结果显示于图3。shGdf8-1002非常有效的沉默融合转录物的表达，因此是用于沉默天然Gdf8转录物的优秀候选物。

本领域技术人员将理解可以对具体实施方案所示的本发明做出许多变化和改变，但不脱离大致描述的本发明的精神或范围。因此，所述实施方案在各个方面都应被认为是说明性的，而非限制性的。

本申请要求2007年6月13日提交的US 60/943,708的优先权，其全部内容在此援引加入。

所有本文讨论和/或引用的出版物在此援引加入。

关于文献、法规、材料、装置、论文等等的任何讨论(已经包括在本说明书中)只是为了提供本发明的背景。它不应被视作承认任何或全部这些内容因为存在于本申请每项权利要求的优先权日之前而构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识。

参考文献

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Waterhouse et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：13959-13964

序列表

<110>澳大利亚家禽合作研究中心私人有限公司

联邦科学技术研究组织

<120>调节禽类的生产性状

<130>507049

<150>US 60/943,708

<151>2007-06-13

<160>122

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>375

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>1

Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile

1 5 10 15

Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn

20 25 30

Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr

35 40 45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

50 55 60

Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

85 90 95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu

115 120 125

Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

130 135 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

165 170 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

195 200 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg

245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys

305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375

<210>2

<211>1128

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>2

atgcaaaagc tagcagtcta tgtttatatt tacctgttca tgcagatcgc ggttgatcca 60

gtggctctgg atggcagtag tcagcccaca gagaacgctg aaaaagacgg actgtgcaat 120

gcttgtacgt ggagacagaa tacaaaatcc tccagaatag aagccataaa aattcaaatc 180

ctcagcaaac tgcgcctgga acaagcacct aacattagca gggacgttat taagcagctt 240

ttacccaaag ctcctccact gcaggaactg attgatcagt atgatgtcca gagggacgac 300

agtagcgatg gctctttgga agacgatgac tatcatgcca caaccgagac gattatcaca 360

atgcctacgg agtctgattt tcttgtacaa atggagggaa aaccaaaatg ttgcttcttt 420

aagtttagct ctaaaataca atataacaaa gtagtaaagg cacaattatg gatatacttg 480

aggcaagtcc aaaaacctac aacggtgttt gtgcagatcc tgagactcat taagcccatg 540

aaagacggta caagatatac tggaattcga tctttgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600

ggtatctggc agagtattga tgtgaagaca gtgctgcaaa attggctcaa acagcctgaa 660

tccaatttag gcatcgaaat aaaagctttt gatgagactg gacgagatct tgctgtcaca 720

ttcccaggac cgggtgaaga tggattgaac ccatttttag aggtcagagt tacagacaca 780

ccgaaacggt cccgcagaga ttttggcctt gactgtgatg agcactcaac ggaatcccga 840

tgttgtcgct acccgctgac agtggatttc gaagcttttg gatgggactg gattatagca 900

cctaaaagat acaaagccaa ttactgctcc ggagaatgtg aatttgtgtt tctacagaaa 960

tacccgcaca ctcacctggt acaccaagca aatcccagag gctcagcagg cccttgctgc 1020

acacccacca agatgtcccc tataaacatg ctgtatttca atggaaaaga acaaataata 1080

tatggaaaga taccagccat ggttgtagat cgttgcgggt gctcatga 1128

<210>3

<211>311

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>3

Pro Ala Ala Gly Lys Lys Leu Pro Arg Leu Pro Lys Cys Ala Arg Cys

1 5 10 15

Arg Asn His Gly Tyr Ser Ser Pro Leu Lys Gly His Lys Arg Phe Cys

20 25 30

Met Trp Arg Asp Cys Gln Cys Lys Lys Cys Ser Leu Ile Ala Glu Arg

35 40 45

Gln Arg Val Met Ala Val Gln Val Ala Leu Arg Arg Gln Gln Ala Gln

50 55 60

Glu Glu Glu Leu Gly Ile Ser His Pro Val Pro Leu Pro Ser Ala Pro

65 70 75 80

Glu Pro Val Val Lys Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu Leu Gln

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Asp Ser Ser Ser Pro Ala His Ser Thr Ser Thr Val Ala Ala Ala Ala

100 105 110

Ala Ser Ala Pro Pro Glu Gly Arg Met Leu Ile Gln Asp Ile Pro Ser

115 120 125

Ile Pro Ser Arg Gly His Leu Glu Ser Thr Ser Asp Leu Val Val Asp

130 135 140

Ser Thr Tyr Tyr Ser Ser Phe Tyr Gln Pro Ser Leu Tyr Pro Tyr Tyr

145 150 155 160

Asn Asn Leu Tyr Asn Tyr Ser Gln Tyr Gln Met Ala Val Ala Thr Glu

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Ser Ser Ser Ser Glu Thr Gly Gly Thr Phe Val Gly Ser Ala Met Lys

180 185 190

Asn Ser Leu Arg Ser Leu Pro Ala Thr Tyr Met Ser Ser Gln Ser Gly

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Lys Gln Trp Gln Met Lys Gly Met Glu Asn Arg His Ala Met Ser Ser

210 215 220

Gln Tyr Arg Met Cys Ser Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Tyr Leu Gly Gln

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Gly Val Gly Ser Pro Thr Cys Val Thr Gln Ile Leu Ala Ser Glu Asp

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Thr Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Ala Arg Val Phe Ser Pro Pro Ser

260 265 270

Ser Gln Asp Ser Gly Leu Gly Cys Leu Ser Ser Ser Glu Ser Thr Lys

275 280 285

Gly Asp Leu Glu Cys Glu Pro His Gln Glu Pro Gly Ala Phe Ala Val

290 295 300

Ser Pro Val Leu Glu Gly Glu

305 310

<210>4

<211>1493

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>4

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cagcaagccc aggaagagga gctggggatc agccaccctg tacccctgcc cagtgcccct 240

gagccagttg tcaagaagag cagcagcagc agctcctgtc tcctgcagga cagcagcagc 300

cctgctcact ccacgagcac ggtggcagca gcagcagcga gcgcaccacc agagggacgg 360

atgctcattc aggacatccc ttccatcccc agcagagggc acttggagag cacgtctgat 420

ttggttgtgg actccaccta ctacagcagt ttttaccagc catccctgta tccttactat 480

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gagacagggg gtacgtttgt agggtcagcc atgaaaaaca gccttcgaag cctcccagca 600

acatacatgt caagccagtc aggaaaacag tggcagatga agggaatgga gaaccgccat 660

gccatgagct cccagtaccg gatgtgctcc tactacccgc ccacctcata cctgggccag 720

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ctgtcgagca gcgagagcac caagggagac ctggagtgcg agccccacca agagcccggc 900

gccttcgcgg tgagcccggt tcttgagggc gagtaggcgc ggcgtcgggc ggctgctgcg 960

cggcgttcac tgttgccttg ttctgttggg gttgcggggg ggcgttgggt ttcttctttc 1020

cggggcgggg ggggcacggc ggggccgcgg ccgggccggc ggggcggggc ggggcgggac 1080

ggggcggggc ggagccgcgc gggggccgca gtccgggccg gggccgccgt cgggtctcgg 1140

cccgctcccg tcggggcgga gcgtccgacg atcggcctcc acgaaacgcg gtgccgtgat 1200

gtgtttgtag tggttcctcg taggctccag acgttttctc ctcgtatcgc caaattaacg 1260

cgttttgcat attacagttg agtgcctcga cttagattgc aatataagcg gccagcaaac 1320

aagtctcaaa aaaaagttac gtgcgtttct gcgagtgtta ttttgttaag aacggctcac 1380

agtgtcctct tcctgtgtta cagaagccaa cctgaaatga aactagtctg gaaaaattca 1440

ttgttctctg tagttgcagc tgtacctgaa ataaaaatgt tattgatgac tga 1493

<210>5

<211>130

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>5

Met Ala Gly Gly Ile Val Arg Ser Pro Ala Ala Trp Arg Gly Gly Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Gly Lys Val Ala Arg Gln Glu Phe Ser Ala Asn Val Ile

20 25 30

Arg Glu Glu Glu Pro Leu Trp Thr Arg Ser Ala Leu Arg Ser Met Ile

35 40 45

Phe His Arg Lys Leu Leu Arg Phe Phe Leu Ala Ala Pro Gln Lys Ala

50 55 60

Val Val Gly Leu Ser Gly Ala Glu Asp Cys Gly Ala Pro Leu Leu Gly

65 70 75 80

Arg Leu Met Ile Val Gly Glu Lys Cys Ala Ala Ser Leu Gly Leu Thr

85 90 95

Asp Gly Phe Arg Met Ala Val Arg Tyr Pro Pro Ser Val Pro Ser Asp

100 105 110

Tyr Arg Ala Arg Leu Cys Ile Leu Gly Gly Arg Gln Leu Gly Gln Pro

115 120 125

Pro Gly

130

<210>6

<211>393

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>6

atggccggcg ggatcgttag gtcgccggcc gcctggcgcg gtggcgccgc tctcttggga 60

aaagtcgccc gccaggagtt ctccgccaac gttatccgcg aggaggagcc gttgtggacg 120

aggagtgcct tgcgttccat gatatttcac cgcaagctcc tacgcttttt cctagccgct 180

ccccagaagg ccgttgtcgg gttatctgga gcagaagatt gtggcgcacc tcttcttggg 240

cgtttgatga ttgttggcga gaagtgtgct gctagcctgg gcttgaccga tggattccgg 300

atggctgtga gatacccacc ctcagtccct tcagactacc gcgcgcggct ctgtattctg 360

ggtggccgtc agttgggcca gcctcctggc taa 393

<210>7

<211>325

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>7

cgaagaaccg agcgctgctg gccttaaagt cccaccaaaa ctctgaagaa acgaagccag 60

acccggcact cagcgggcag cccgcgcctc ccgccgcccc acagtgccgc gcgcgtgcat 120

ttgcatagcg cggtgctcgc agggggaaac tcaccccctc aagtccgccc cccgcttccc 180

gcccgctgtc ccgcacctca tcagtgctgt gcgctgtctg tgtcccccag cacgcactct 240

ttgctgttct tacccggagg cttgccctat ccttgaggtt tctatttttt aggctataaa 300

taccgcctag gaggtagaga tattc 325

<210>8

<211>394

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>8

cagacagacg tcaggctttc taagcctgga ctgagtaaga gcggaagagc tccacagcac 60

tctgagtgcg cacagaccgc gcgtacagcg cacagccgcg cggccgctcc ttcaggcact 120

gccgacgaca gcccaggcgg aggtcctgag cgccggcgct aaatttgcat aaagaactac 180

ccaggagccc tcgcgcgcgg aaacgggcaa aaaggggctt ctaatatgga aatattacgc 240

cgaatcgcgt tacaaatcgg ctaagcgggc ctaagagtta acaagatgtg ctattaagcg 300

gagccttttg gtgggaagaa atggagtagt cactgtgttc taaaagaact tgcagaatga 360

gcctttaaat accgcagtct cgatgctctt agtc 394

<210>9

<211>287

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>9

tgaattgtgg gacggcggaa gacgggctcc cgccccgccc ctatatgcaa agcagagaac 60

ttcccgccgt gcaccgcgcg caatcggaag agaatttggg cacttcagac ccaaaaaaaa 120

acccaaaact tctgcgaaaa agaaagaatc tcagcggagt aaatagggat ttttgttaaa 180

gaggtgatac cagaagaaga aatatgcaaa tacaacgcca gctcaccgct acttaaaaat 240

catgatataa tagaggctta aatactgtcc gagagacact ggggttt 287

<210>10

<211>783

<212>DNA

<213>Gallus gallus

<400>10

gtccagccat ccacctccca ccaatacttc cccactgaac catgtccctc agtagcacag 60

ggtttgtgga acgcctcctg ggacggtgcc tcccccacct gccacgcagc ccattccagc 120

acctgacact tctggagacg aaatttttcc taacgtccaa cctgagtctc ccctggtgca 180

acttgaggct gttcccctga ctcccatcgc tagttacgtg ggaagaaaag acccctaaga 240

ccaccccgtg caaccaccag cccatcccca ccacgcccac tgaccgggcc cctcagtgcc 300

acagcagcac ggttctcgag cgcttcgcag gacggtgagc actgcccgga acctctgcac 360

ggcctcagca acgcgacttt cagccggggt cgctgcccag gagccggcgg cttcggagcg 420

cagagcgagg cgggagagct ccggccgcgg gaggctcagt gtcacgcaga gcgcgggacg 480

agcgctccga gccctcccag tgccgccccc aaggcagggc ggccggcgca gctccccgca 540

gcccgccagt gggaaggctc tgctttgcat aacgcgcaag gcctgctggg aggaaagcgg 600

agcgagaaag agcgttaacg tgcgccgagt gttttagagc aaaagcattc agacctgaag 660

cagcgctgag agatgcctct gccgcccatt tactggaaac gttcagaccc accgcaagtc 720

accgtgacct tgagacactg agctgttggc cgttatatag cacttggggc agctcgtagc 780

ttt 783

<210>11

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>11

ccaguuguca agaagagca 19

<210>12

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>12

ggaugcucau ucaggacau 19

<210>13

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>13

cccuguaucc uuacuauaa 19

<210>14

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>14

gccacugagu cuuccucaa 19

<210>15

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>15

ccagcaacau acaugucaa 19

<210>16

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>16

ccugcgucac acagauacu 19

<210>17

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>17

ggaguaguug uacagguug 19

<210>18

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>18

gacuggcuug acauguaug 19

<210>19

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>19

auggcgguuc uccaucccu 19

<210>20

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>20

aagcuagcag ucuauguuu 19

<210>21

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>21

gcuagcaguc uauguuuau 19

<210>22

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>22

cgcugaaaaa gacggacug 19

<210>23

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>23

aaagacggac ugugcaaug 19

<210>24

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>24

agacggacug ugcaaugcu 19

<210>25

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>25

ugcuuguacg uggagacag 19

<210>26

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>26

uacaaaaucc uccagaaua 19

<210>27

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>27

aauccuccag aauagaagc 19

<210>28

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>28

uccuccagaa uagaagcca 19

<210>29

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>29

uagaagccau aaaaauuca 19

<210>30

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>30

gccauaaaaa uucaaaucc 19

<210>31

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>31

aaauucaaau ccucagcaa 19

<210>32

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>32

auucaaaucc ucagcaaac 19

<210>33

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>33

auccucagca aacugcgcc 19

<210>34

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>34

acugcgccug gaacaagca 19

<210>35

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>35

caagcaccua acauuagca 19

<210>36

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>36

gcaccuaaca uuagcaggg 19

<210>37

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>37

cauuagcagg gacguuauu 19

<210>38

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>38

gcagcuuuua cccaaagcu 19

<210>39

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>39

uuccugcagu ggaggagcu 19

<210>40

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>40

cugauugauc aguaugaug 19

<210>41

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>41

gacgaugacu aucaugcca 19

<210>42

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>42

ccgagacgau uaucacaau 19

<210>43

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>43

ugccuacgga gucugauuu 19

<210>44

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>44

auggagggaa aaccaaaau 19

<210>45

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>45

aaccaaaaug uugcuucuu 19

<210>46

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>46

ccaaaauguu gcuucuuua 19

<210>47

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>47

aauguugcuu cuuuaaguu 19

<210>48

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>48

uguugcuucu uuaaguuua 19

<210>49

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>49

guuuagcucu aaaauacaa 19

<210>50

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>50

aauacaauau aacaaagua 19

<210>51

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>51

uacaauauaa caaaguagu 19

<210>52

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>52

uauaacaaag uaguaaagg 19

<210>53

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>53

caaaguagua aaggcacaa 19

<210>54

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>54

aguaguaaag gcacaauua 19

<210>55

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>55

aggcacaauu auggauaua 19

<210>56

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>56

uuauggauau acuugaggc 19

<210>57

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>57

guccaaaaac cuacaacgg 19

<210>58

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>58

aaaccuacaa cgguguuug 19

<210>59

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>59

accuacaacg guguuugug 19

<210>60

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>60

cgguguuugu gcagauccu 19

<210>61

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>61

gcccaugaaa gacgguaca 19

<210>62

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>62

agacgguaca agauauacu 19

<210>63

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>63

gauauacugg aauucgauc 19

<210>64

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>64

uuc gaucuuu gaaacuuga 19

<210>65

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>65

acuugacaug aacccaggc 19

<210>66

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>66

cccaggcacu gguaucugg 19

<210>67

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>67

gacagugcug caaaauugg 19

<210>68

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>68

aauuggcuca aacagc cug 19

<210>69

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>69

uuggcucaaa cagccugaa 19

<210>70

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>70

acagccugaa uccaauuua 19

<210>71

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>71

uccaauuuag gcaucgaaa 19

<210>72

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>72

uuuaggcauc gaaauaaaa 19

<210>73

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>73

auaaaagcuu uugaugaga 19

<210>74

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>74

aagcuuuuga ugagacugg 19

<210>75

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>75

gcuuuugaug agacuggac 19

<210>76

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>76

gauggauuga acccauuuu 19

<210>77

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>77

cccauuuuua gaggucaga 19

<210>78

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>78

acggucccgc agagauuuu 19

<210>79

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>79

cggaaucccg auguugucg 19

<210>80

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>80

uccaguccca uccaaaagc 19

<210>81

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>81

gcuuuuggau gggacugga 19

<210>82

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>82

aagauacaaa gccaauuac 19

<210>83

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>83

gauacaaagc caauuacug 19

<210>84

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>84

agccaauuac ugcuccgga 19

<210>85

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>85

uuacugcucc ggagaaugc 19

<210>86

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>86

ugcgaauuug uguuucuac 19

<210>87

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>87

caggugagug ugcggguau 19

<210>88

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>88

auacccgcac acucaccug 19

<210>89

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>89

gcaaauccca gagguccag 19

<210>90

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>90

aucccagagg uccagcagg 19

<210>91

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>91

gauguccccu auaaacaug 19

<210>92

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>92

acaugcugua uuucaaugg 19

<210>93

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>93

uggaaaagaa caaauaaua 19

<210>94

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>94

aagaacaaau aauauaugg 19

<210>95

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>95

gaacaaauaa uauauggaa 19

<210>96

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>96

caaauaauau auggaaaga 19

<210>97

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>97

auaauauaug gaaagauac 19

<210>98

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>RNA for silencing

<400>98

uauauggaaa gauaccagc 19

<210>99

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>99

cgaagaaccg agcgctgc 18

<210>100

<211>85

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>100

gggctcgagt tccaaaaaag cgcagtgtta ctccacttct cttgaaagtg gagtaacact 60

gcgctgaata ccgcttcctc ctgag 85

<210>101

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>101

gaattgtggg acggcggaag 20

<210>102

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>102

ctcgagttcc aaaaaagctg accctgaagt tcatctctct tgaagatgaa cttcagggtc 60

agcaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>103

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>103

ctcgagttcc aaaaaaccag ttgtcaagaa gagcatctct tgaatgctct tcttgacaac 60

tggaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>104

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>104

ctcgagttcc aaaaaaggat gctcattcag gacattctct tgaaatgtcc tgaatgagca 60

tccaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>105

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>105

ctcgagttcc aaaaaaccct gtatccttac tataatctct tgaattatag taaggataca 60

gggaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>106

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>106

ctcgagttcc aaaaaagcca ctgagtcttc ctcaatctct tgaattgagg aagactcagt 60

ggcaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>107

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>107

ctcgagttcc aaaaaaccag caacatacat gtcaatctct tgaattgaca tgtatgttgc 60

tggaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>108

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>108

ctcgagttcc aaaaaacctg cgtcacacag atacttctct tgaaagtatc tgtgtgacgc 60

aggaaacccc agtgtctctc gga 83

<210>109

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>109

ctcgagttcc aaaaaagctg accctgaagt tcatctctct tgaagatgaa cttcagggtc 60

agcgaatatc tctacctcct agg 83

<210>110

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>110

ctcgagttcc aaaaaattcc tgcagtggag gagcttctct tgaaagctcc tccactgcag 60

gaagaatatc tctacctcct agg 83

<210>111

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>111

ctcgagttcc aaaaaatcca gtcccatcca aaagctctct tgaagctttt ggatgggact 60

ggagaatatc tctacctcct agg 83

<210>112

<211>83

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Oligonucleotide primer

<400>112

ctcgagttcc aaaaaacagg tgagtgtgcg ggtattctct tgaaataccc gcacactcac 60

ctggaatatc tctacctcct agg 83

<210>113

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>113

ccagaauaga agccauaaa 19

<210>114

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>114

gcacaauuau ggauauacu 19

<210>115

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>115

guacaagaua uacuggaau 19

<210>116

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223RNA for silencing

<400>116

ccuauaaaca ugcuguauu 19

<210>117

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>117

gcgaauuugu guuucuaca 19

<210>118

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>118

gaguauugau gugaagaca 19

<210>119

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>119

ccuccagaau agaagccau 19

<210>120

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>120

ggucagaguu acagacaca 19

<210>121

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>121

caguggauuu cgaagcuuu 19

<210>122

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>RNA for silencing

<400>122

caacgguguu ugugcagau 19

Claims

1.一种改变禽类性状的方法，所述方法包括给禽类卵施用至少一种包括双链区的核酸分子，其中所述核酸分子导致卵中至少一种RNA分子和/或蛋白水平的降低。

2.权利要求1的方法，其中所述核酸分子是dsRNA。

3.权利要求2的方法，其中所述dsRNA是siRNA或shRNA。

4.权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述性状是生产性状。

5.权利要求4的方法，其中所述生产性状是肌肉质量或性别。

6.权利要求5的方法，其中所述生产性状是性别且所述核酸分子降低DMRT1基因编码的蛋白的水平。

7.权利要求6的方法，其中所述核酸分子包括选自以下的至少一种核苷酸序列：

CCAGUUGUCAAGAAGAGCA(SEQ ID NO：11)

GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO：12)

CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO：13)

GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)

CCAGCAACAUACAUGUCAA(SEQ ID NO：15)

CCUGCGUCACACAGAUACU(SEQ ID NO：16)

GGAGUAGUUGUACAGGUUG(SEQ ID NO：17)

GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO：18)

AUGGCGGUUCUCCAUCCCU(SEQ ID NO：19)，

或其任一的变体。

8.权利要求5的方法，其中所述生产性状是肌肉质量且所述核酸分子降低筒箭毒碱基因编码的蛋白的水平。

9.权利要求8的方法，其中所述核酸分子包括序列CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)或其变体。

10.权利要求1到9中任意一项的方法，其中所述核酸分子通过注射施用。

11.权利要求1到10中任意一项的方法，其中所述禽类选自鸡，鸭，火鸡，鹅，矮脚鸡和鹌鹑。

12.使用权利要求1到11中任意一项的方法产生的禽类。

13.使用权利要求1到11中任意一项的方法产生的鸡。

14.一种包括双链区的分离和/或外源核酸分子，当给禽类卵施用时其降低至少一种RNA分子和/或蛋白的水平。

15.权利要求14的核酸分子，其是dsRNA分子。

16.权利要求14或15的核酸分子，其降低DMRT1基因或筒箭毒碱基因编码的蛋白的水平。

17.权利要求16的核酸分子，其包括选自以下的至少一种核苷酸序列：

CCAGUUGUCAAGAAGAGCA(SEQ ID NO：11)

GGAUGCUCAUUCAGGACAU(SEQ ID NO：12)

CCCUGUAUCCUUACUAUAA(SEQ ID NO：13)

GCCACUGAGUCUUCCUCAA(SEQ ID NO：14)

CCAGCAACAUACAUGUCAA(SEQ ID NO：15)

CCUGCGUCACACAGAUACU(SEQ ID NO：16)

GGAGUAGUUGUACAGGUUG(SEQ ID NO：17)

GACUGGCUUGACAUGUAUG(SEQ ID NO：18)

AUGGCGGUUCUCCAUCCCU(SEQ ID NO：19)

AAGCUAGCAGUCUAUGUUU(SEQ ID NO：20)

GCUAGCAGUCUAUGUUUAU(SEQ ID NO：21)

CGCUGAAAAAGACGGACUG(SEQ ID NO：22)

AAAGACGGACUGUGCAAUG(SEQ ID NO：23)

AGACGGACUGUGCAAUGCU(SEQ ID NO：24)

UGCUUGUACGUGGAGACAG(SEQ ID NO：25)

UACAAAAUCCUCCAGAAUA(SEQ ID NO：26)

AAUCCUCCAGAAUAGAAGC(SEQ ID NO：27)

UCCUCCAGAAUAGAAGCCA(SEQ ID NO：28)

UAGAAGCCAUAAAAAUUCA(SEQ ID NO：29)

GCCAUAAAAAUUCAAAUCC(SEQ ID NO：30)

AAAUUCAAAUCCUCAGCAA(SEQ ID NO：31)

AUUCAAAUCCUCAGCAAAC(SEQ ID NO：32)

AUCCUCAGCAAACUGCGCC(SEQ ID NO：33)

ACUGCGCCUGGAACAAGCA(SEQ ID NO：34)

CAAGCACCUAACAUUAGCA(SEQ ID NO：35)

GCACCUAACAUUAGCAGGG(SEQ ID NO：36)

CAUUAGCAGGGACGUUAUU(SEQ ID NO：37)

GCAGCUUUUACCCAAAGCU(SEQ ID NO：38)

UUCCUGCAGUGGAGGAGCU(SEQ ID NO：39)

CUGAUUGAUCAGUAUGAUG(SEQ ID NO：40)

GACGAUGACUAUCAUGCCA(SEQ ID NO：41)

CCGAGACGAUUAUCACAAU(SEQ ID NO：42)

UGCCUACGGAGUCUGAUUU(SEQ ID NO：43)

AUGGAGGGAAAACCAAAAU(SEQ ID NO：44)

AACCAAAAUGUUGCUUCUU(SEQ ID NO：45)

CCAAAAUGUUGCUUCUUUA(SEQ ID NO：46)

AAUGUUGCUUCUUUAAGUU(SEQ ID NO：47)

UGUUGCUUCUUUAAGUUUA(SEQ ID NO：48)

GUUUAGCUCUAAAAUACAA(SEQ ID NO：49)

AAUACAAUAUAACAAAGUA(SEQ ID NO：50)

UACAAUAUAACAAAGUAGU(SEQ ID NO：51)

UAUAACAAAGUAGUAAAGG(SEQ ID NO：52)

CAAAGUAGUAAAGGCACAA(SEQ ID NO：53)

AGUAGUAAAGGCACAAUUA(SEQ ID NO：54)

AGGCACAAUUAUGGAUAUA(SEQ ID NO：55)

UUAUGGAUAUACUUGAGGC(SEQ ID NO：56)

GUCCAAAAACCUACAACGG(SEQ ID NO：57)

AAACCUACAACGGUGUUUG(SEQ ID NO：58)

ACCUACAACGGUGUUUGUG(SEQ ID NO：59)

CGGUGUUUGUGCAGAUCCU(SEQ ID NO：60)

GCCCAUGAAAGACGGUACA(SEQ ID NO：61)

AGACGGUACAAGAUAUACU(SEQ ID NO：62)

GAUAUACUGGAAUUCGAUC(SEQ ID NO：63)

UUCGAUCUUUGAAACUUGA(SEQ ID NO：64)

ACUUGACAUGAACCCAGGC(SEQ ID NO：65)

CCCAGGCACUGGUAUCUGG(SEQ ID NO：66)

GACAGUGCUGCAAAAUUGG(SEQ ID NO：67)

AAUUGGCUCAAACAGCCUG(SEQ ID NO：68)

UUGGCUCAAACAGCCUGAA(SEQ ID NO：69)

ACAGCCUGAAUCCAAUUUA(SEQ ID NO：70)

UCCAAUUUAGGCAUCGAAA(SEQ ID NO：71)

UUUAGGCAUCGAAAUAAAA(SEQ ID NO：72)

AUAAAAGCUUUUGAUGAGA(SEQ ID NO：73)

AAGCUUUUGAUGAGACUGG(SEQ ID NO：74)

GCUUUUGAUGAGACUGGAC(SEQ ID NO：75)

GAUGGAUUGAACCCAUUUU(SEQ ID NO：76)

CCCAUUUUUAGAGGUCAGA(SEQ ID NO：77)

ACGGUCCCGCAGAGAUUUU(SEQ ID NO：78)

CGGAAUCCCGAUGUUGUCG(SEQ ID NO：79)

UCCAGUCCCAUCCAAAAGC(SEQ ID NO：80)

GCUUUUGGAUGGGACUGGA(SEQ ID NO：81)

AAGAUACAAAGCCAAUUAC(SEQ ID NO：82)

GAUACAAAGCCAAUUACUG(SEQ ID NO：83)

AGCCAAUUACUGCUCCGGA(SEQ ID NO：84)

UUACUGCUCCGGAGAAUGC(SEQ ID NO：85)

UGCGAAUUUGUGUUUCUAC(SEQ ID NO：86)

CAGGUGAGUGUGCGGGUAU(SEQ ID NO：87)

AUACCCGCACACUCACCUG(SEQ ID NO：88)

GCAAAUCCCAGAGGUCCAG(SEQ ID NO：89)

AUCCCAGAGGUCCAGCAGG(SEQ ID NO：90)

GAUGUCCCCUAUAAACAUG(SEQ ID NO：91)

ACAUGCUGUAUUUCAAUGG(SEQ ID NO：92)

UGGAAAAGAACAAAUAAUA(SEQ ID NO：93)

AAGAACAAAUAAUAUAUGG(SEQ ID NO：94)

GAACAAAUAAUAUAUGGAA(SEQ ID NO：95)

CAAAUAAUAUAUGGAAAGA(SEQ ID NO：96)

AUAAUAUAUGGAAAGAUAC(SEQ ID NO：97)

UAUAUGGAAAGAUACCAGC(SEQ ID NO：98)

CCAGAAUAGAAGCCAUAAA(SEQ ID NO：113)

GCACAAUUAUGGAUAUACU(SEQ ID NO：114)

GUACAAGAUAUACUGGAAU(SEQ ID NO：115)

CCUAUAAACAUGCUGUAUU(SEQ ID NO：116)

GCGAAUUUGUGUUUCUACA(SEQ ID NO：117)

GAGUAUUGAUGUGAAGACA(SEQ ID NO：118)

CCUCCAGAAUAGAAGCCAU(SEQ ID NO：119)

GGUCAGAGUUACAGACACA(SEQ ID NO：120)

CAGUGGAUUUCGAAGCUUU(SEQ ID NO：121)

CAACGGUGUUUGUGCAGAU(SEQ ID NO：122)，

或其任一的变体。

18.一种载体，其编码权利要求14到17中任意一项的核酸分子或其单链。

19.一种宿主细胞，其包括权利要求14到17中任意一项的外源核酸分子或其单链和/或权利要求18的载体。

20.一种组合物，其包括权利要求14到17中任意一项的核酸分子或其单链、权利要求18的载体和/或权利要求19的宿主细胞。

21.一种禽类卵，其包括权利要求14到17中任意一项的核酸分子或其单链、权利要求18的载体和/或权利要求19的宿主细胞。

22.一种试剂盒，其包括权利要求14到17中任意一项的核酸分子或其单链、权利要求18的载体、权利要求19的宿主细胞和/或权利要求20的组合物。

23.在本文公开或在本申请的说明书中单独或一起指示的步骤、特征、整数、组合物和/或化合物，以及所述步骤或特征的两个或更多个的任意和所有组合。