CN101791438B - 骨修复用生物活性聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨修复用生物活性聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法，步骤包括：将聚(乳酸-羟基乙酸)电纺纳米纤维膜经等离子体处理后涂层胶原，然后将其浸入模拟人体生理体液中矿化，获得聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜。本发明制备方法简单快捷、材料来源广泛。采用等离子体处理及涂层的方法在聚(乳酸-羟基乙酸)电纺纤维中引入骨细胞外基质成分的胶原，并将活性羟基磷灰石沉积到纤维膜上，得到了高度仿生化的纳米纤维复合膜。所得的复合纤维膜综合性能优良、使用方便，可以有效地促进成骨细胞和干细胞的粘附、生长和钙化成骨的能力，有望成为骨修复用的理想的活性支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨修复用复合纤维膜的制备方法，具体说是生物活性聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法。
背景技术
骨损伤是目前常见的疾病。由于风湿、类风湿等各种骨关节疾病或运动创伤所造成的关节骨损伤给许多病人带来了痛苦。我国每年的骨损伤患者高达约千余万，需做关节置换术者约500万(每位患者的目前费用是3-5万元)，需做面部软骨缺损修复患者近30万。
自19世纪以来，为修复由于创伤、肿瘤或感染所造成的大范围骨缺损，恢复肢体功能，临床上一直主要采用骨移植术。但无论是常用的自体骨移植还是异体骨移植，均存在着供体有限或免疫排斥反应等问题。目前临床上也在广泛使用各种以金属或陶瓷制备的人工骨替代材料，但这些材料在生物相容性、生物活性、生物可降解性及力学性能、使用寿命等方面都有各自的缺点。迄今为止，大范围骨缺损的医治仍未有效解决。自从Langer和Vacanti提出组织工程的概念之后，组织工程和再生医学的方法和原理也为修复骨组织的缺损和病变提供了希望。对于骨组织工程而言，可以通过成骨细胞的生长、增殖或干细胞的诱导分化生长成活体骨组织，从而有望促进大范围骨缺损的修复。其中，支架材料在骨组织工程和再生医学中起着十分重要的作用。
理想的支架材料要求其既具有促进细胞粘附、增殖和维持表型等功能，又能提供一定的力学强度。对于骨组织工程支架，还应具有一定的骨传导性和骨诱导性，这就要求其能有效地模拟骨细胞外基质的成分和结构。从材料角度，骨是由羟基磷灰石纳米晶体和胶原纤维构成的纳米生物复合材料；从其形成角度，骨是通过羟基磷灰石晶体在胶原纤维上自组装矿化沉积而形成的复杂的层状结构。天然胶原大分子和羟基磷灰石陶瓷是骨细胞外基质的组成成分，具有良好的生物相容性和生物活性，无疑是骨组织工程支架材料的理想组分，但力学性能较差；合成高分子材料如聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)虽表面疏水、缺乏细胞识别位点，但具有良好的机械强度、可降解性和加工性，可以弥补它们的缺点。在组织工程支架的制备技术中，静电纺丝法因其得到的纳米纤维形态结构类似骨细胞外基质、有利于细胞的粘附和生长，且工艺设备简单、适用性广，从而具有独特的优势；同时，还可结合生理体液矿化的方法在电纺纤维表面沉积羟基磷灰石，高度模拟骨组织的自组装沉积过程，得到的生物活性复合支架有望对骨细胞的生长产生刺激，从而诱导骨的形成。
因此，针对骨组织的特点，通过各材料的优势互补，采用静电纺丝和矿化的方法制备出复合羟基磷灰石的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纳米纤维。该类高度仿生化的复合材料可为细胞提供与天然骨相似的微环境，符合骨组织工程的生物学要求，有望成为骨修复用的一种理想的活性支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度模拟人体天然骨的组成、结构和自组装矿化形成过程，并为受损的骨组织提供仿生的微环境且能有效地促进骨细胞的粘附、生长、功能表达与成骨分化的骨修复用生物活性聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法。
本发明的骨修复用生物活性聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
1)将胶原溶解于体积浓度为3％的乙酸溶液中，配制质量浓度为0.5～5mg/mL胶原的乙酸溶液；
2)将聚(乳酸-羟基乙酸)电纺纳米纤维膜置于等离子体放电仪中，设置功率为10～400W，处理5～30分钟后，浸入步骤1)配制的溶液中，4℃过夜，冻干，得到表面涂层胶原的聚(乳酸-羟基乙酸)复合纤维膜；
3)将步骤2)制得的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜置于1～5倍浓度的模拟人体生理体液中，37℃水浴中矿化处理，每2天更换模拟体液，矿化处理1～28天后，取出样品，用三蒸水洗涤多次，冻干，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜。
上述的1倍浓度的模拟体液是指每升三蒸水含有145.2mM氯化钠、5mM氯化钾、1.5mM氯化镁、2.5mM氯化钙、4.2mM碳酸氢钠、1mM磷酸氢二铵、0.5mM硫酸钠和50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液，其pH值为7.4。
本发明中，所说的聚(乳酸-羟基乙酸)电纺纳米纤维膜可以按以下方法制备：
将聚(乳酸-羟基乙酸)溶解于体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制其质量浓度为15％；将该溶液加入到注射器中进行静电纺丝，设置流速0.5～2.0mL/h，电压12～15kV，室温下铝膜收集，收集距离10～20cm，得到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜。
本发明制备方法简单快捷、材料来源广泛。采用等离子体处理及涂层的方法在聚(乳酸-羟基乙酸)电纺纤维中引入骨细胞外基质成分的胶原大分子，并模拟骨自组装形成过程的矿化方法沉积复合羟基磷灰石，得到了类骨组成和结构的仿生化纳米纤维复合膜。所得的复合纤维膜具有生物相容性好、综合性能优良和使用方便等优点，可以有效地促进成骨细胞和干细胞的粘附、生长与分化，具有良好的表达成骨功能和诱导分化的能力。
附图说明
图1是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜随等离子体处理时间的接触角变化曲线；
图2是等离子体处理前后的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜的扫描电镜照片，其中a)是未处理的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，b)～f)是等离子体处理时间分别为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，g)～l)分别是a)～f)的放大照片；
图3是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜经等离子体处理15分钟再涂层胶原后的形态和结构，其中a)和b)是扫描电镜照片，b)是a)的放大照片，c)是X-射线能谱图；
图4是聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜在37℃的5倍浓度的模拟体液(5×SBF)中矿化后的扫描电镜照片；其中a)～f)是矿化时间分别为1天、2天、3天、6天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；g)是矿化13天的纤维膜的内层；
图5是聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜在37℃的5×SBF中矿化前后的断面的扫描电镜照片，其中a)是聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，b)～e)是矿化时间分别为2天、6天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图6是纤维膜断面的透射电镜照片，其中a)是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，b)是聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，c)～g)是矿化时间分别为1天、2天、6天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图7是从矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上分离的羟基磷灰石矿物颗粒的形态和结构，其中a)和b)是透射电镜照片，b)是a)的放大照片，c)是X-射线电子衍射环图案；
图8是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化9天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜的应力-应变曲线；
图9是MC3T3-E1成骨细胞培养24小时和7天后的MTT活性图，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)～f)矿化时间分别为1天、3天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图10是MC3T3-E1成骨细胞培养7天后的细胞骨架的激光共聚焦显微镜照片，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)～f)矿化时间分别为1天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图11是MC3T3-E1成骨细胞培养7天后的扫描电镜照片，其中细胞培养的基体分别为a)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，b)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，c)矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)～f)分别是a)～c)的放大照片；
图12是MC3T3-E1成骨细胞培养7天和14天后的碱性磷酸酶(ALP)含量图，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)～f)矿化时间分别为1天、3天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图13是兔源骨髓间充质干细胞(MSCs)在未加骨诱导液的培养基中培养1天、3天和7天后的MTT活性图，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)～f)矿化时间分别为1天、3天、9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图14是干细胞在未加骨诱导液的培养基中培养7天后的扫描电镜照片，其中细胞培养的基体分别为a)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，b)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，c)矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和d)矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图15是干细胞在未加骨诱导液的培养基中培养3周后碱性磷酸酶染色的普通光学照片，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；
图16是钙化结节茜素红S染色照片，其中a)和b)是未培养细胞的空白聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜和矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，c)和d)是种植干细胞后在加骨诱导液的培养基中培养3周后的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜和矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，a1)～d1)是普通光学照片，a)～d)是分别是a1)～d1)相应的光学显微镜照片；
图17是钙化结节yon Kossa染色的普通光学照片，其中a1)～d1)分别是未培养细胞的空白聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜；a2)～d2)和e1)分别是种植干细胞后在未加骨诱导液的培养基中培养4周后的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和培养板；a3)～d3)和e2)分别是种植干细胞后在加骨诱导液的培养基中培养4周后的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜、矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和培养板；
图18是干细胞分别在未加骨诱导液和加骨诱导液的培养基中培养4周后的钙化结节的钙含量图，其中细胞培养的基体分别为a)培养板，b)聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜，c)聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜，d)矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和e)矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1：
1)将1.5g聚(乳酸-羟基乙酸)溶解于10mL体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺的混合溶剂中，即质量浓度为15％，将该溶液加入到20mL的注射器中进行静电纺丝，设置流速1.0mL/h，电压12kV，室温下铝膜收集，收集距离15cm。2小时后停止注射，即可在铝膜上收集到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜；
2)将0.1g胶原溶解于100mL体积浓度3％的乙酸溶液中，配制质量浓度为1mg/mL胶原的乙酸溶液；
3)取步骤1)制备的电纺纤维膜5片，置于等离子体放电仪中，设置功率为400W，分别处理5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟。将处理15分钟后的纤维膜马上浸入到步骤2)制得的1mg/mL胶原的乙酸溶液中，4℃过夜，冻干24h，得到表面涂层胶原的聚(乳酸-羟基乙酸)复合纤维膜。图1和图2分别是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜随等离子体处理时间的接触角变化曲线和形貌变化图；由图可知，未经处理的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜比较疏水，随着等离子体处理时间的延长，亲水性先逐渐提高而后又有所下降；同时纤维表面逐渐变得粗糙。选取处理时间为15分钟的纤维膜用于后续的胶原涂层。图3是聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜经等离子体处理15分钟再涂层胶原后的形态和结构；涂层胶原的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜仍保持了原有的连续且相互交叉的纳米纤维结构，且纤维之间缠绕着很多更小纳米尺度的胶原纤维，能谱图中证实了N元素的存在，这表明经等离子体和涂层处理后，成功制备了聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜/胶原复合纤维膜；同时，用紫外吸收测蛋白法测得复合纤维膜上的胶原含量为323.3±67.0μg/cm2，且其亲水性大大提高，表观接触角为零，这为后续对其进行矿化处理提供了便利。
4)将步骤3)得到的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维/胶原复合纤维膜置于每升三蒸水中含有726mM氯化钠、25mM氯化钾、7.5mM氯化镁、12.5mM氯化钙、21mM碳酸氢钠、5mM磷酸氢二铵、2.5mM硫酸钠和50mM三羟甲基氨基甲烷所配制的5倍浓度的模拟人体生理体液(5×SBF)中，37℃水浴中分别矿化1天、2天、3天、6天、9天和13天，每2天换液以保证模拟体液的活性。取出样品，用三蒸水洗涤多次，冻干得到羟基磷灰石矿物沉积的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜。图4是聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜在模拟体液中矿化后的扫描电镜照片；矿化1天的纤维膜上开始出现矿物颗粒，纤维丝形成了串珠状的结构；随着矿化时间的延长，矿物颗粒不断长大和增多，并堆积成聚集体，逐渐覆盖纤维膜表面；同时在纤维膜内部也均匀生长有矿物颗粒。图5和图6分别是纤维膜断面的扫描电镜和透射电镜照片；由图可知，相对于未矿化的聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜和聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜较为“干净”的断面，矿化后的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜在矿化早期生长出“半球状”的矿物颗粒，并逐步长大成完整的球形，包裹着纤维表面成“花朵状”的结构；同时观察到一个颗粒其实是由很多细小针状的矿物构成，其形态与市售的针状羟基磷灰石晶体相似。图7是从矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上分离的羟基磷灰石矿物颗粒的透射电镜照片和X-射线电子衍射环图案；可以发现，矿物颗粒的尺寸大致在2～3μm，与图5的扫描电镜形貌相吻合；放大照片显示一个颗粒确实是有多个针状羟基磷灰石聚集而成，与图6的透射电镜形貌也相符；电子衍射图案中由很多单晶构成了(300)，(112)，(310)，(002)，(301)，(321)和(502)的晶面，与标准羟基磷灰石相似；综合以上结果，表明通过模拟人体生理体液矿化的方法成功制备了聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石仿生化复合纤维膜。图8是不同纤维膜的应力-应变曲线图；表1是由图11曲线测得的不同纤维膜的拉伸模量和拉伸强度；
表1
由图11和表1可知，聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜的应力-应变曲线中没有屈服点；胶原涂层的纤维膜的曲线中出现了明显的屈服点，且拉伸模量急剧增大，这显示了力学性能的增强；而羟基磷灰石的沉积对纤维膜的力学增强作用更为显著，这将有利于其作为骨组织工程支架的应用。
5)将聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和矿化制备的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜切成直径为7mm的圆片，用75％的酒精浸泡，紫外光照射过夜灭菌，用无菌的PBS缓冲液置换去除其中的酒精后，将纤维膜薄片放入96孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将新生小鼠颅骨源性的成骨样细胞系(MC3T3-E1细胞)从培养盘消化，离心(1200rpm)10分钟，弃去上清夜，加入含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基。调节细胞悬液浓度，控制每孔的种植密度为2.5×104/孔(即6.5×104/cm2)，在37℃、5％CO2培养箱中培养至所需时间。每隔2天更换培养基，以保持细胞的营养供应。同样方法将细胞直接种植在空白96孔培养板中用于对照。图9是MC3T3-E1成骨细胞在培养板和不同纤维膜上培养24小时和7天后的MTT活性图；各纤维膜上的细胞活性均低于培养板上的细胞活性，而聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜、聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上的细胞在培养7天后活性大大提高，其中后两者的提高幅度更大。图10和图11是MC3T3-E1成骨细胞在培养板和不同纤维膜上培养7天后的激光共聚焦显微镜和扫描电镜照片；由图观察到，培养板上的细胞密度很高，但微丝的铺展程度不大；聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜上细胞数量较少，且细胞多为球形；聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上的细胞数量相对较多，且细胞成伸展的多角形，这与MTT活性结果相吻合；特别是矿化1天的纤维膜上的细胞相互连成一片形成细胞层覆盖在纤维表面，显示了良好的粘附和生长状态，且表面有更多的细胞分泌物。图12是MC3T3-E1成骨细胞在培养板和不同纤维膜上培养7天和14天后的碱性磷酸酶含量图；培养7天后，各基体上的细胞均分泌了一定含量的碱性磷酸酶，但差别不大；相对于其他基体，培养14天后的细胞在矿化9天和13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上分泌的碱性磷酸酶含量大大提高，结合它们富含羟基磷灰石的结构，表明矿化沉积有羟基磷灰石颗粒的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜虽然保持细胞活性和增殖的能力一般，但极大地促进了成骨细胞的表型，显示了较高的成骨活性。该类仿生化的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜具有钙化成骨的潜力，在骨的再生修复中有一定的应用前景。
实例2：
步骤1)～2)同实例1中的步骤1)～2)。
步骤3)同实例1中的步骤3)，但等离子体处理的功率为50W。
步骤4)同实例1中的步骤4)，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜。
步骤5)同实例1中的步骤5)，但用兔源骨髓间充质干细胞(MSCs)来评价纤维膜诱导成骨分化的能力，控制每孔的种植密度为6.0×103/孔(即1.6×104/cm2)。细胞部分培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基至4周，部分先在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养7天再在加入骨诱导液(含100nM地塞米松、10mM β-甘油磷酸和50μg/mL维生素C抗坏血酸)的含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至4周。图13是干细胞在未加骨诱导液的培养基中培养7天内的MTT活性图；在培养板和各纤维膜上的细胞活性随着培养时间均有所提高，但样品之间的差异不大。图14是干细胞在未加骨诱导液的培养基中培养7天后的扫描电镜照片；相对于聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜的球形的细胞形态，在聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜/胶原纤维膜和聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜上的细胞形态更为铺展。图15是干细胞在未加骨诱导液的培养基中培养3周后碱性磷酸酶染色的照片；明显发现，相对于培养板(图15a))和未矿化的纤维膜(图15b)和15c))，聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜(图15d))的颜色更深，说明其上培养的细胞分泌了更多的碱性磷酸酶，这是干细胞向成骨细胞分化的标志之一。图16是茜素红S染色照片；观察到在加骨诱导液的培养基中培养3周后的矿化1天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜整片膜可明显观察到图16d)中被染色的细胞，这说明干细胞在此材料上已发生了钙化结节，向成骨细胞分化。图17是von Kossa染色的照片；相对于空白材料上含有羟基磷灰石中的钙分布(图17c1)和17d1))，在未加骨诱导液的培养基中培养4周后的矿化纤维膜(图17c2)和17d2))上的钙分布更多，说明了干细胞发生了钙化结节，其效果优于直接培养在培养板上的细胞(图17e1))；而在加骨诱导液的培养基中培养4周后的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜和聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜上的钙分布更明显(图17b3)～17d3))，特别是含较多羟基磷灰石的矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜整片膜(图17d3))中深黑色部分面积最大，说明其上的细胞的钙化结节的程度最大。图18是干细胞培养4周后的钙化结节的钙含量图；也同样发现干细胞在加骨诱导液的培养基中培养后的矿化13天的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原纤维膜上分泌的钙含量最大。以上结果基本与实例1中成骨细胞的培养结果相似，说明了矿化制备的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜具有较强的生物活性和诱导干细胞钙化成骨的能力，有望最终成为骨修复用的理想支架材料。
实例3：
步骤1)～2)同实例1中的步骤1)～2)。
步骤3)同实例1中的步骤3)，但聚(乳酸-羟基乙酸)纤维膜经等离子体处理10分钟后涂层胶原。
步骤4)同实例1中的步骤4)，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜。
实例4：
步骤1)同实例1中的步骤1)，得到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜。
步骤2)同实例1中的步骤2)，但配制质量浓度为5mg/mL胶原的乙酸溶液。
步骤3)～4)同实例1中的步骤3)～4)，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜。
实例5：
步骤1)～3)同实例1中的步骤1)～3)，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜。
步骤4)同实例1中的步骤4)，但将聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜置于1倍浓度的模拟人体生理体液(SBF，每升三蒸水含有145.2mM氯化钠、5mM氯化钾、1.5mM氯化镁、2.5mM氯化钙、4.2mM碳酸氢钠、1mM磷酸氢二铵、0.5mM硫酸钠和50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液)中矿化28天，得到羟基磷灰石沉积的聚(乳酸-羟基乙酸)/胶原复合纤维膜。
Claims (2)
1.骨修复用生物活性聚（乳酸－羟基乙酸）/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
1）将胶原溶解于体积浓度为3%的乙酸溶液中，配制质量浓度为0.5~5mg/mL胶原的乙酸溶液；
2）将聚（乳酸－羟基乙酸）电纺纳米纤维膜置于等离子体放电仪中，设置功率为10~400W，处理5~30分钟后，浸入步骤1）配制的溶液中，4℃过夜，冻干，得到表面涂层胶原的聚（乳酸－羟基乙酸）复合纤维膜；
3）将步骤2）制得的聚（乳酸－羟基乙酸）/胶原复合纤维膜置于1~5倍浓度的成骨模拟体液中，37℃水浴中矿化处理，每2天更换模拟体液，矿化处理1~28天后，取出样品，用三蒸水洗涤多次，冻干，得到聚（乳酸－羟基乙酸）/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜；上述的1倍浓度的成骨模拟体液是指每升三蒸水含有145.2mM氯化钠、5mM氯化钾、1.5mM氯化镁、2.5mM氯化钙、4.2mM碳酸氢钠、1mM磷酸氢二铵、0.5mM硫酸钠和50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液，其pH值为7.4。
2.按权利要求1所述的骨修复用生物活性聚（乳酸－羟基乙酸）/胶原/羟基磷灰石复合纤维膜的制备方法，其特征在于聚（乳酸－羟基乙酸）电纺纳米纤维膜按以下方法制备：
将聚（乳酸－羟基乙酸）溶解于体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制其质量浓度为15％；将该溶液加入到注射器中进行静电纺丝，设置流速0.5~2.0mL/h，电压12~15kV，室温下铝膜收集，收集距离10~20cm，得到聚（乳酸－羟基乙酸）纳米纤维膜。
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