CN101772577A

CN101772577A - 半胱天冬蛋白酶成像探针

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Publication number: CN101772577A
Application number: CN200880101733A
Authority: CN
Inventors: M·凯恩德曼; C·米尼尤; K-U·文特
Original assignee: Sanofi Aventis SpA
Current assignee: Sanofi Aventis France; Sanofi Aventis SpA
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2010-07-07
Also published as: AU2008285761A1; WO2009019115A1; CA2695244A1; MY148484A; EP2185721A1; EP2185721B1; US20100303728A1; JP2010535167A; BRPI0814771A2; KR20100072167A

Abstract

本发明涉及本文定义的式(I){L1-R1-L}_n-A-CO-NH-R2-L2(I)的分子探针，其可用于在体外分析、在细胞或多细胞有机体中观察所选半胱天冬蛋白酶的催化活性，本发明还涉及这种探针的制备方法和用途。{L1-R1-L}_n-A-CO-NH-R2-L2 (I)。

Description

半胱天冬蛋白酶成像探针

本发明涉及用于在体外分析、在细胞或多细胞有机体中观察单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组的催化活性的分子探针(底物)。本发明还涉及合成和设计这种探针(底物)的方法。

发明背景

蛋白水解酶(蛋白酶)在活细胞内部或外部使其它酶或多肽裂解或降解。蛋白酶参与很多关键的过程，其中很多过程是细胞信号转导和组织稳态中的关键过程。蛋白酶活性异常或活性增强与多种疾病有关，包括癌症、骨关节炎、动脉粥样硬化、炎症等等。由于在活系统中，必须对蛋白水解活性保持严格控制，因此很多蛋白酶被表达为非活性的前体蛋白(酶原)，然后在控制下被蛋白水解裂解之后被激活。对于蛋白水解活性的其它控制来自于内源性抑制剂，所述内源性抑制剂与蛋白水解酶的催化活性形式结合并使之灭活。由于存在这种严格的控制，因此在细胞或生理学事件中研究蛋白酶功能时需要监测蛋白酶活性而不只是监测蛋白酶的表达。因此，文献中也出现了关于各种基于活性的化学探针的报道。一般的蛋白酶探针通过以下两种途径之一产生可检测信号：(i)通过酶切肽键使报告系统光谱性质发生改变，或(ii)通过使机理性抑制剂与研究的蛋白酶对象共价连接。对于特定蛋白酶或一组蛋白酶的活性和抑制进行定位研究和定量研究(例如在细胞分析或全动物成像实验中)要求研制成像探针，所述探针能够(i)到达蛋白酶作用的生理学相关位点(例如细胞溶胶或全动物成像中的特定器官)且(ii)对于期望的蛋白酶或一组蛋白酶具有选择性。制备蛋白酶选择性探针对该领域提出了很大挑战。本发明涉及(i)针对半胱氨酸蛋白酶、优选针对半胱天冬蛋白酶亚家族的新型选择性探针，(ii)这些探针在体外分析、在细胞或多细胞有机体中的应用(例如通过分子成像)和(iii)合成和设计这种探针的方法。

近年来，几种分子成像技术(光学和非光学的)对于体内特定分子靶点和路径的非侵袭性可视化观察已变得越来越重要。由于任何影像信号的信息内容最初都是内部对比度的函数，开发内部淬灭的、在酶促反应(例如肽键的裂解)中可被激活的成像探针已经普遍应用于催化活性的蛋白酶的成像和定位中。通过常规方法很少能够获得对于个别蛋白酶具有选择性且能够到达蛋白酶体内作用位点的探针。制药工业中的药物化学家们在研制具有适当药代动力学特征和对于给定靶点具有适当选择性的药物时也面临相关的挑战。在本发明中，我们发明了制备针对半胱氨酸蛋白酶具有选择性活性的探针的新路线，我们已将该方法应用于半胱天冬蛋白酶亚家族的蛋白酶。

半胱氨酸蛋白酶的特征是在活性位点上具有半胱氨酸残基，其在催化过程中作为亲核基团。催化性半胱氨酸通常与适当的相邻基团通过氢键结合，以便能够形成硫醇根离子。当该蛋白酶识别底物时，易裂解的肽键被置于催化性半胱氨酸附近，所述催化性半胱氨酸攻击羰基碳原子形成含氧阴离子中间体。然后酰胺键断裂，释放胺形式的C末端肽。易裂解的肽的N末端部分保留在共价的酰基酶中间体中，该中间体随后被水裂解，使酶再生。底物的N末端裂解产物以羧酸的形式被释放出来。

半胱天冬蛋白酶是一族天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。人类基因组编码11种半胱天冬蛋白酶。其中8种(半胱天冬蛋白酶-2、3、6、7、8、9、10和14)在细胞凋亡或程序性细胞死亡中发挥作用。它们通过高度调节的信号转导级联发挥作用。按照等级次序，一些半胱天冬蛋白酶启动酶(半胱天冬蛋白酶-2、8、9和10)裂解并激活半胱天冬蛋白酶效应酶(半胱天冬蛋白酶-3、6和7)。这些半胱天冬蛋白酶与癌症、自身免疫病、退行性病症和中风有关。其它三种半胱天冬蛋白酶(半胱天冬蛋白酶-1、4和5)的功能完全不同：通过激活一个亚组的炎性细胞因子介导炎症。

半胱天冬蛋白酶-1也叫白细胞介素-1β-转化酶(ICE)，主要存在于单核细胞中。该蛋白酶主要负责促炎性细胞因子白细胞介素-1β和白细胞介素-18的生成。已证实，在人类炎性疾病模型(包括类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性肠病和哮喘)中抑制半胱天冬蛋白酶-1可产生有益作用。

半胱天冬蛋白酶-3负责对各种基本蛋白质包括细胞骨架蛋白、激酶和DNA修复酶进行蛋白水解性裂解。在神经元中，半胱天冬蛋白酶-3是细胞凋亡的关键介导因子。已证实，在例如中风、创伤性脑脊髓损伤、缺氧性脑损伤、心肌缺血和再灌注损伤等模型中抑制半胱天冬蛋白酶-3具有有益效果。

半胱天冬蛋白酶-8是一种细胞凋亡半胱天冬蛋白酶启动酶，位于TNF超家族死亡受体下游。其底物包括与细胞凋亡有关的半胱天冬蛋白酶效应酶和促凋亡因子Bcl-2的家族成员。已知癌症对细胞凋亡的耐受与半胱天冬蛋白酶-8表达水平低有关，而且抑制半胱天冬蛋白酶-8可加强对细胞凋亡诱导性应激因素例如化疗和放疗的耐受性。因此对于治疗肿瘤和转移性损伤而言半胱天冬蛋白酶-8是具有吸引力的靶点。基因敲除研究还发现半胱天冬蛋白酶-8具有许多与细胞凋亡无关的其它潜在作用。例如敲除半胱天冬蛋白酶-8之后在白细胞分化、增殖和免疫应答方面表现为缺陷。

对于蛋白水解酶而言，决定其在细胞生理学和病理学中功能作用的是其活性而不只是表达水平。因此，抑制半胱天冬蛋白酶活性的分子可作为治疗剂用于治疗疾病和研制特异性成像生物标志，所述成像生物标志可使蛋白水解活性以及候选药物对其的抑制情况可视化，这可加速靶点的确认、药物开发甚至临床试验(H.Pien等，Drug Discovery Today，2005，10，259-266)。使用基于活性的成像试剂可以在复杂蛋白质混合物、完整细胞中甚至体内容易地检测特定蛋白质或蛋白质家族。此外，酶类别特异性探针可用于开发用于功能实验的小分子抑制剂的筛选方法(D.A.Jeffery，M.Bogyo Curr.Opp.Biotech.2003，14，87-95)。

迄今为止，已经开发引入了肽底物的基于活性的成像探针，其用于在细胞分析中监测和标记半胱天冬蛋白酶-1(W.Nishii等，FEBS Letters 2002，518，149-153)或半胱天冬蛋白酶-3(S.Mizukami等，FEBS Letters 1999，453，356-360)。此外，还报道了一种近红外荧光探针，其可用于在活动物中检测半胱天冬蛋白酶-1活性(S.Messerli等，Neoplasia 2004，6，95-105)。

对半胱天冬蛋白酶的酶促机理进行了比较透彻的研究，发现其具有高度保守性。根据可裂解肽的研究和筛选数据，开发了只与该保守性活性位点反应的亲电性底物类似物。这种探针中的亲电中心通常是所谓的“弹头”的一部分，所述“弹头”是一种分子实体，其亲电性能和几何布置得到最优化，使其能够很好的与半胱天冬蛋白酶的活性位点契合，并在该位点与催化性半胱氨酸残基反应。已有很多种这样的亲电性底物作为机理性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的描述，其包括但不限于：重氮甲基酮、氟甲基酮、酰氧基甲基酮、O-酰基羟基胺、乙烯基砜和环氧琥珀酸衍生物(S.Verhelst，M.Bogyo QSAR Comb.Sci.2005，24，261-269)。

另一种监测蛋白酶活性的工具存在于生物发光分析中。该方法利用与蛋白酶底物连接的氨基修饰的虫荧光素前体(beetles pro-luciferine)(Caged荧光素)或其羧基末端衍生物。第一次蛋白水解裂解释放出荧光素，荧光素随后被荧光素酶转化，可检测到发光信号。该二级分析法的应用范围与荧光探针相似，其额外优点是信噪比高。

蛋白酶抑制剂若要成为有效的生物学工具，则不仅要具有高效价，还必须对特定蛋白酶具有高度选择性的结合力。开发针对特定蛋白酶的小分子抑制剂通常从肽底物开始。虽然肽具有多种生物学性质，但其作为药物的使用却因为不稳定性和口服生物利用度过低而受到限制。为使其成为有效的药物，期望获得的蛋白酶抑制剂的肽样特征应该弱化、对非选择性蛋白水解降解作用应具有高度稳定性、对于给定的蛋白酶应具有高度选择性、在蛋白酶作用位点具有良好的生物利用度。根据这些要求，开发了半胱天冬蛋白酶抑制剂A-B，其中A是与亲电性弹头B共价连接的化学骨架。在半胱天冬蛋白酶存在下，B与催化性半胱氨酸(机理性抑制剂)发生共价反应。在很多情况下，这种抑制剂的选择性和药代动力学性质都在生物医学研究中得以成功地最优化。为了能够针对催化性半胱氨酸发起有效的亲电攻击，这种抑制剂的亲电中心必需在酶的活性位点内部进行精确的定位。催化性半胱氨酸对弹头中亲电碳原子的特殊安排对应于催化性半胱氨酸和易裂解肽底物中肽羰基的空间安排。在这种比较的指引下，我们想到将优化的共价抑制剂(带有化学骨架A和亲电性弹头B)“重新设计”为可裂解的底物应该是可能的。由于化学骨架A可被认为是抑制剂选择性的决定因素，因此我们的方法可使优化抑制剂的选择性或部分选择性转化到基于活性的化学探针内。我们将这一过程称为从选择性半胱天冬蛋白酶抑制剂进行的基于活性的选择性探针的“反向设计”。

本发明涉及式(I)的针对半胱氨酸蛋白酶的分子探针

{L1-R1-L}_n-A-CO-NH-R2-L2 (I)

其中

A是可被半胱天冬蛋白酶识别的基团；

R1是连接基团；

R2是键或连接基团；

L是键或能够使L1基团容易地结合的基团；

L1与L2彼此独立地是任选与固体支持物结合的至少一个标记基团；且

n是1；

或者

R2是键；

L2是适合于偶联生物发光分析的底物；且

n是0。

式(I)的化合物是针对半胱氨酸蛋白酶、优选半胱天冬蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶的基于活性的探针(底物)。

在其最基本的形式中，该化学探针由四个功能元素组成，即，a)作为反应性基团的酰胺基团-CO-NH-，其可被蛋白酶的作用裂解，b)骨架A，其定义针对给定蛋白酶靶的选择性，c)将各亚基连接起来的连接基团R1和R2，和d)用于检测的一套标记基团L1和L2。

优选A基团是针对给定半胱天冬蛋白酶或一组半胱天冬蛋白酶、优选半胱天冬蛋白酶-1、3和8的特异性的决定基团，例如表1、2、3中化合物1-43所示。本发明的基于活性的探针对于给定半胱天冬蛋白酶的选择性因子为1000∶1、优选10∶1，其中选择性由优选底物浓度下的相对转换数(酶的转换数1:酶2的转换数)定义。每一对酶的相对转换数是通过用研究对象酶(酶1)的转换数除以期望对其有选择性的另一个酶(酶2)的转换数来确定的。对于体内应用，期望在底物浓度较低(例如微摩尔或亚微摩尔)时具有高选择性。

方案1显示了蛋白酶P与底物的反应，其中A是特异性决定基团，P是蛋白酶，其反应性半胱氨酸含有巯基S^-：

(方案1)

反应速率取决于底物结构。

连接基团R1或R2优选是分别与标记基团L1或L2连接或者与多个相同或不同的标记基团L2或L1连接的灵活性连接基团。根据设想的应用进行连接基团的选择，即根据针对特定蛋白酶的基于活性的成像探针进行选择。连接基团也可能增加底物在适当溶剂中的溶解度。使用的连接基团在实际应用的条件下具有化学稳定性。连接基团不干扰选定蛋白酶靶的反应，也不干扰标记基团L1和/或L2的检测，但构建时可考虑在某一时间点连接基团可被裂解。具体而言，连接基团R1或R2是含有1至300个碳原子的直链或支链亚烷基，其中任选地，

(a)一个或多个碳原子被氧替代，特别是其中每逢第三个碳原子被氧替代，例如含有1至100个氧乙烯单元的聚氧乙烯基团；和/或

(b)一个或多个碳原子被带有氢原子的氮替代，且相邻的碳原子被氧代基团替代，形成酰胺官能团-NH-CO-；和/或

(c)一个或多个碳原子被酯官能团-O-CO-替代；

(d)两个相邻碳原子间的键是双键或叁键；和/或

(e)两个相邻的碳原子被二硫键替代。

本领域技术人员可根据探针的应用意图选择底物的标记基团L1和L2。

标记基团L1和L2彼此独立的是光谱探针例如荧光团；淬灭基团(quencher)或生色团；磁性探针；造影剂；能与配体特异性结合的作为特异性结合对的一部分的分子；作为酶底物的分子；与聚合物支持物、树状聚合物、载玻片、本领域技术人员已知的微量滴定板共价连接的分子；或具有上述任何性质的组合的分子。

本发明的一个优选实施方案是将修饰的氨基荧光素或其羧基末端保护的衍生物用作报告基团，当其从中心骨架A上被裂解下来时可被荧光素酶转化产生发光信号。因此，标记基团L2也可以是适合于偶联生物发光分析的底物，其特征是具有修饰的氨基荧光素或其羧基末端保护的衍生物作为报告基团。

US7148030公开了生物发光蛋白酶分析的实例，其包含肽作为半胱天冬蛋白酶底物，所述底物与修饰的氨基荧光素连接。

优选含有分子内淬灭荧光探针的探针，其包含聚合物骨干(backbone)和多个荧光团，这些荧光团通过骨架A以足以导致荧光淬灭的密度与所述骨干共价连接。

本发明的另一优选实施方案是使用树状大分子，有两种或多种荧光团通过骨架A以足以导致荧光淬灭的密度与所述树状大分子共价连接。使用聚合物探针的优点在于可局部递送探针(靶向)、其在动物或人类的血液中循环时间延长。聚合物轭合使低分子量物质的生物分布发生改变，使肿瘤特异性靶向作用成为可能(通过增强的渗透和潴留效应(EPR效应)，使到达毒性位点的量减少，共轭聚合物与低分子量成像探针的结合是本发明进行多细胞有机体(包括哺乳动物例如小鼠、大鼠等)成像的最优选实施方案。聚合物骨干可由任何生物相容性聚合物组成，可含有多肽、多糖、核酸或合成聚合物。关于本发明可用的聚合物的全面概述参见M.J.Vincent等，Trends Biotech.2006，24，39-47和R.Duncan，Nature Reviews Cancer，2006，688-701。WO99/58161中公开了关于本发明可用的聚合物的进一步描述。所述的聚合物或树状聚合物探针可包含与骨干或树状分子共价连接的保护链。保护链包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇和乙二醇的其它共聚物。

本发明的探针还可以含有靶向基团例如抗体、抗体片段、受体结合配体、肽片段或合成蛋白质抑制剂。

标记基团L1和L2还可以是荷正电的直链或支链聚合物。本领域技术人员已知所述聚合物可促进其中连接的分子跨活细胞膜的转运。对于活细胞膜渗透力较差或者实际上无法透过活细胞膜的物质而言更优选所述聚合物。无法透过细胞的化学探针在与这样的L1或L2基团轭合后将能够透过细胞膜。这种细胞膜转运促进基团L1和L2包括例如含有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的线性聚(精氨酸)、含有6-15个亚单位的线性聚合物(其中每个亚单位都携带胍基)、寡聚物或含有6至最多50个亚单位的短链聚合物(其中一部分携带胍基和/或HIV-tat蛋白序列的一部分，例如Tat49-Tat57亚单位(单字母氨基酸编码为RKKRRQRRR)。如果L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2的一个成员且L2是其中的另一成员，例如在FRET对中的情况，那么优选使用含有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的线性聚(精氨酸)作为聚合物标记。

最优选的L1和/或L2标记基团是光谱探针。最优选的L2标记基团是作为与L1形成相互作用的光谱对的一部分的分子，以及能够特异性结合与固体支持物共价连接的配体和分子的标记基团。

特别优选的标记基团中，L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2中的一个成员且L2是其中的另一成员，其中能量可以以非辐射方式通过动态或静态淬灭而在供体和受体(淬灭基团)之间转移。所述的这种标记对L1/L2在经过相应的半胱天冬蛋白酶蛋白酶反应/裂解之后光谱性质会发生改变。这种标记对L1/L2的一个实例是FRET(

共振能量转移)对，例如荧光探针前体(pro-fluorescent probe)，其在一端(例如L1)用供体(报告基团)共价标记并且在另一端(L2)用受体(淬灭基团)共价标记，或反之亦然。

具体而言，L1是供体(报告基团)且L2是受体(淬灭基团)，或者L1是淬灭基团且L2是报告基团。使用该探针时，半胱氨酸蛋白酶与探针的反应导致荧光的变化。与蛋白酶反应时，双标记底物内部报告基团与淬灭基团之间的距离发生变化，导致报告基团与淬灭基团发生空间分离，从而发出荧光或使发射波长改变。多种报告基团都可以分别作为L1或L2标记基团，包括例如发射近红外光的荧光团。在与蛋白酶反应之前，含有报告基团和淬灭基团的底物一直保持暗色，当反应开始时，由于报告标记基团和淬灭标记基团发生空间分离，反应混合物被“点亮”，荧光团发射被启动。可通过淬灭基团或能量供应标记基团这两者之一的发射情况测量荧光淬灭和能量转移。发生能量转移时，接受能量的标记基团也发出荧光，也可以测量这一受体标记基团的荧光。这两个相互作用的标记基团中，供体标记基团可以选自于化学发光供体探针，这样便不需要激发灯，并降低了受体背景荧光水平。所述的使用这种双标记底物的具体方法可用于根据荧光时间测量来测定反应动力学，可在体内或体外应用。

或者，标记基团L2可以是固体支持物、或另外连接在固体支持物上、或者连接或可连接在聚合物/固体支持物上。对于L1/L2 FRET对，优选使用含有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的线性聚(精氨酸)作为聚合物标记。

特别优选的组合是两个不同的亲和标记基团，特别是一对互相作用的光谱标记基团L1/L2，例如FRET对。亲和标记基团的定义是指作为能够与配体特异性结合的特异结合对的一部分的分子。特异结合对是指例如生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，此外还有甲氨蝶呤，其是二氢叶酸还原酶(DHFR)的紧密结合抑制剂。

本领域技术人员可选择适当的报告基团和淬灭基团配对。通常，报告基团和淬灭基团是光谱重叠度很高的荧光染料，例如荧光素作为报告基团，罗丹明作为淬灭基团。其它淬灭基团有金团簇和金属穴合物。

本发明使用的第二类淬灭基团是“暗淬灭基团”，即本身没有荧光的染料，其吸收光谱与普通报告染料的发射光谱重叠从而引发最大程度的FRET淬灭。此外，可选择染料对以使得吸收带重叠，以便于促进基态复合体中的共振偶极-偶极相互作用机制(静态淬灭)。

具体的荧光团和淬灭基团有：Alexa染料，包括Alexa 350、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 635和Alexa 647(US5696157、US6130101、US6716979)；二甲基氨基香豆素(例如7-二甲基氨基香豆素-4-乙酸琥珀酰亚胺酯，Invitrogen，CA 92008，USA提供的产品D374)；淬灭基团QSY 35、QSY 9和QSY 21(Invitrogen，CA 92008，USA)；花青-3(Cy 3)、花青5(Cy 5)和花青5.5(Cy 5.5)(Amersham-GE Healthcare，Solingen，Germany)；BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，CA 94949，USA公司的Black Hole Quencher^TM)；荧光团ATTO 488、ATTO532、ATTO 600和ATTO 655和淬灭基团ATTO 540Q和ATTO 612Q(Atto-Tec，D57076 Siegen，Germany)；荧光团DY-505、DY-547、DY-632和DY-647(Dyomics，Jena，Germany)；5/6-羧基荧光素、四甲基罗丹明、4-二甲基氨基偶氮苯-4’-磺酰基衍生物(Dabsyl)和4-二甲基氨基偶氮苯-4’-羰基衍生物(Dabcyl)。这些物质可以有利地进行以下组合：

荧光团淬灭基团

●Alexa 350、二甲基氨基香豆素、5/6- ●Dabsyl、Dabcyl、

羧基荧光素、Alexa 488、ATTO 488、 BHQ 1、QSY 35

DY-505

●5/6-羧基荧光素、Alexa 488、Alexa ●BHQ 2、QSY 9、

532、Alexa 546、Alexa 555、ATTO ATTO 540Q

488、ATTO 532、四甲基罗丹明、Cy3、

DY-505、DY-547

●Alexa 635、Alexa 647、ATTO 600、 ●BHQ 3、ATTO

ATTO 655、 612Q、QSY 21

DY-632、Cy 5、DY-647 Cy 5.5

与酶促反应有关的生物发光分析产生的光与催化反应的即时速率有关。该方法包含氨基修饰的氨基虫荧光素或其羧基末端保护的衍生物，氨基荧光素中的氨基通过酰胺键与中心的骨架A连接，得到的底物被半胱天冬蛋白酶识别和裂解。半胱天冬蛋白酶的酶促活性使氨基荧光素与骨架A连接的肽键断裂释放荧光素酶的底物氨基荧光素。随后荧光素酶与其底物的反应产生可检测的信号(发光)。这样，该方法将半胱天冬蛋白酶活性与第二个酶促反应关联起来，产生可读取的光信号。这类分析要求研制“荧光素前体”(“Caged荧光素”)，它只有被之前的酶促反应例如蛋白水解裂解作用转化为荧光素之后才被荧光素酶识别为底物。这样，光信号直接取决于之前的酶促反应。因此，本发明的另一实施方案旨在提供通过发光手段检测半胱天冬蛋白酶的蛋白水解活性的探针。

在一个具体实施方案中，该方法涉及一种底物，其中L2是固体支持物或者与携带报告基团/淬灭基团对成员之一的固体支持物连接，或者其中L2是固体支持物与报告基团/淬灭基团对成员之一的组合，且L1是该对的另一成员。这样，当与适当的蛋白酶反应时暗的固体支持物会发出荧光。

固体支持物可以是载玻片、微量滴定板或本领域技术人员已知的任何聚合物，例如功能化聚合物(优选珠状形式)、化学修饰的氧化表面例如二氧化硅、五氧化钽或二氧化钛，或者化学修饰的金属表面例如贵金属表面例如金或银表面。固体支持物也可以是合适的传感元件。

优选式(I)化合物含有作为半胱天冬蛋白酶-1抑制剂的A基团。具有半胱天冬蛋白酶-1抑制活性的骨架A的制备方法描述于例如US5670494；WO9526958；WO9722619；WO9816504；WO0190063；WO03106460；WO03104231；WO03103677；W.G.Harter，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，809-812；Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，2779-2782；Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.2002，10，31-40；M.C.Laufersweiler等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，4322-4326；K.T.Chapman，Bioorg.Med.Chem.Lett.1992，2，613-618；Dolle等，J.Med.Chem.1997，40，1941-1946；D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4233-4236；D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.2006，14，7880-7892；D.J.Lauffer等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12，1225-1227；和C.D.Ellis等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4728-4732中。更优选式(I)化合物是针对半胱天冬蛋白酶-1的探针，其特征是含有以下的优选骨架A的化合物(表1)：

表1-针对半胱天冬蛋白酶-1的选择性探针(I)的实例

其中1至28组中变量的定义如相应化合物近旁的定义所述；X是-CONH-R2-L2；Y是-L-R1-L1；且R1、R2、L、L1和L2如上所述。

进一步优选式(I)化合物含有作为半胱天冬蛋白酶-3抑制剂的A基团。具有半胱天冬蛋白酶-3抑制活性的骨架A的制备方法描述于例如WO0032620；WO0055127；WO0105772；WO03024955；WO 2008/008264；P.Tawa等，Cell Death and Differentiation 2004，11，439-447；Micale等，J.Med.Chem.2004，47，6455-6458；和Berger等，Molecular Cell，2006，23，509-521中。更优选式(I)化合物是针对半胱天冬蛋白酶-3的探针，其特征是含有以下的优选骨架A的化合物(表2)：

表2-针对半胱天冬蛋白酶-3的选择性探针(I)

其中29至42组中变量的定义如相应化合物近旁的定义所述；X是-CONH-R2-L2；Y是-L-R1-L1；且R1、R2、L、L1和L2如上所述。

此外还优选式(I)化合物含有作为半胱天冬蛋白酶-8抑制剂的A基团。具有半胱天冬蛋白酶-8抑制活性的骨架A的制备方法描述于例如Berger等，Molecular Cell，2006，23，509-521；和Garcia-Calvo，J.Biol.Chem.1998，273(49)，32608-32613。更优选式(I)化合物是针对半胱天冬蛋白酶-8的探针，其特征是含有以下优选的骨架A的化合物(表3)：

表3-针对半胱天冬蛋白酶-8的选择性探针(I)实例

其中X是-CONH-R2-L2；Y是-L-R1-L1；且R1、R2、L、L1和L2如上所述。

若非另外说明，则以下定义适用。

烷基是指具有1至6个碳原子的直链或支链烃基。(C₁-C₆)烷基的实例有甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、丁基、叔丁基、仲丁基、戊基和己基。

酰基的定义是-C(＝O)烷基。

芳基的定义是具有6至10个碳原子的芳烃。芳基的实例包括苯基和萘基。

杂芳基的定义是其中一个或多个芳烃碳原子被杂原子替代的芳基，其中“杂原子”包括氧、氮、硫和磷。杂芳基包括呋喃、噻吩、苯并噻吩、吡咯、噻唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、苯并呋喃、吲哚、香豆素、喹啉、异喹啉和萘啶。

环烷基是指具有3至10个碳原子的环状烷基。环烷基的实例包括环丙烷、环丁烷、环戊烷和环己烷。

杂环或杂环基是指其中一个或多个碳原子被杂原子替代的环烷基。杂环基的实例包括哌嗪、吗啉和哌啶。

所述芳基、杂芳基或环烷基可以被一个或多个相同或不同的取代基取代。合适取代基的实例包括烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、卤素、三氟甲基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、NO₂、CN、CO₂H、CO₂烷基、SO₃H、CHO、C(＝O)烷基、CONH₂、CONH-烷基、CONHR_q、C(＝O)N(烷基)₂、(CH₂)_nNH₂、OH、CF₃、O(C₁-C₆)烷基、(CH₂)_nNH-烷基、NHR_q、NHCOR_q、苯基，其中n是1至5且R_q是氢或(C₁-C₆)烷基。

关于本发明的基于活性的探针的合成，可以采用本领域技术人员已知的适当的保护基化学构建中心骨架A，并通过L基团和-C(O)-NH-基团使该骨架A与两个连接基团之一和标记基团L1或L2连接。适宜的构建基本元件以及FRET对例如花青染料(例如Cy3 B、Cy 5.5、Cy 7)可商购获得(例如Sigma-Aldrich、GE-Healthcare)。对于本发明描述的探针亚组，固相合成方法特别有用(B.J.Merrifield，Methods in Enzymology 1997，289，3-13)。根据合成要求，连接基团、淬灭基团或荧光团的连接可以在固体支持物上完成或者通过溶液相化学完成。

一般而言，中心骨架A上的反应性侧链基团和任选的L基团将被保护，然后依次被释放，以分别进一步用L1R1和L2R2亚单位进行修饰。可根据化学合成领域的已知方法完成这些亚单位的结合。特别有用的是染料活性酯与骨架A的伯胺基团之间进行反应使两个单位通过酰胺键连接。中间体和终产物探针分子在用于标记和成像实验之前可以经高效液相色谱法(HPLC)纯化，并通过质谱和分析HPLC进行鉴定。

以下段落通过一些非限制性实例举例说明本发明。

在优选的实施方案中，式(I)的探针含有衍生于四肽半胱天冬蛋白酶-1抑制剂的骨架A(表1，化合物2)，其在C末端和N末端携带发色团。对发色团进行适当的选择，从而使其光谱性质适合于荧光共振能量转移(FRET)。发色团可以发射荧光也可以不发射荧光。原则上，本发明可以使用多种发色团，只要符合蛋白水解裂解肽键之后光谱会发生变化这一基本要求即可。这种互相作用的发色团与中心骨架的连接可任选通过连接单位进行。

优选荧光团选自于呫吨染料或花青染料。更优选选自于碳花青类、硫杂花青类、氧杂花青类和氮杂花青类的花青染料。适用于本发明的花青染料公开于US5268468和US5627027中。包括商标名(Amersham，GEHealthcare)为Cy 3、Cy 3B、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7和Cy 7.5的染料。

优选淬灭单元是非荧光发色团，其包括2，4-二硝基苯基、4-(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)、7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基和WO9964519中公开的非荧光花青染料。

在优选的实施方案中，淬灭基团没有显著的发射，更优选淬灭基团是非荧光发色团。在该实施方案中，成像试剂含有荧光团和非荧光(暗)受体发色团。

更优选的是基于四肽骨架的式(I)的探针(表1、化合物2)，其N末端携带QSY 21-淬灭基团，C末端携带CY 5.5荧光团(方案2)：

(方案2)。

另一优选实施方案包括相同骨架，其N末端携带暗淬灭基团BHQ 3，C末端携带Cy 7荧光团(方案3)：

(方案3)。

在一个优选实施方案中，选择荧光素和四甲基罗丹明作为互相作用的FRET对，且四甲基罗丹明是位于骨架的N末端侧，而荧光素与C末端连接，如(方案4)所示：

(方案4)。

在另一优选实施方案中，相互作用的FRET对的一个成员含有纳米粒子。本发明更优选的是CdSe纳米粒子(例如量子点(Quantum-dots))、镧系元素离子掺杂的氧化物纳米粒子(例如Y_0.6Eu_0.4VO₄)和氧化铁纳米粒子(例如VisEn Medical，Inc.，MA 01801，USA提供的AminoSPARK 680和AminoSPARK 750)。如果这种纳米粒子在FRET对中作为供体，其激发波长远远短于受体吸收波长，因此直接受体激发可被降至最低。而且，供体发射波长范围窄，不会与受体发射波段重叠。此外，已证明这种纳米粒子比可发生快速光致褪色的有机染料的光学稳定性好。用于化学共轭作用的活化量子点可商购获得(Invitrogen，CA 92008，USA)，其发射波长可以从多种产品中选择。

方案5和6显示了基于量子点的对半胱天冬蛋白酶-1特异性的式(I)的探针。因此，在进一步优选的式(I)的探针中，量子点(例如Invitrogen，CA92008，USA提供的QD605)可以通过适当的连接基团与半胱天冬蛋白酶-1探针的N末端连接(方案5)或与半胱天冬蛋白酶-1的C末端连接(方案6)。

(方案5)；

(方案6)。

量子点由黑色圆圈代表，合适的受体分子由花青染料CY 7代表。

在另一优选实施方案中，式(I)的探针中的量子点通过蛋白水解可裂解的亚单位与金纳米粒子连接(方案7)：

(方案7)。

量子点和金纳米粒子由黑色圆圈代表。

已显示金纳米粒子(AuNP)对于有机荧光染料和量子点而言是有效的淬灭基团。量子点与AuNP的组合应用公开于例如WO2006126570中。

在另一优选实施方案中，式(I)的探针由多FRET系统组成，其中两个特异性蛋白酶探针共价连接在一起(方案8)：

(方案8)。

在这一构型中，可以在单一波长下激发并使用不同的发射比作为独特的FRET信号(K.E Sapsford等，Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，4562-4588)。该探针在一个分子中合并了两个独特特殊结构，即半胱天冬蛋白酶-1的骨架和半胱天冬蛋白酶-3的骨架。

在另一优选实施方案中，对式(I)的探针进行设计以使其循环时间长、肿瘤累积量高，并且含有在酶激活后可在近红外光谱内发出荧光的淬灭的荧光标记物。这些探针基于合成的接枝共聚物[部分用甲氧基聚(乙二醇)修饰的聚-L-赖氨酸]，其中有多个NIR荧光团连接在游离的聚赖氨酸残基上。由于NIR发色团的密度高和距离近所导致的内部淬灭，这些大分子的荧光被大大减弱。

例如，方案9显示了基于聚合物的半胱天冬蛋白酶-1探针，其中A与D-和/或L-赖氨酸的聚赖氨酸骨干的连接通过C末端的连接基团完成，而NIR发色团Cy 5.5通过N末端的连接基团连接：

(方案9)。

方案10给出了相反的情况，其中A与D-和/或L-赖氨酸的聚氨酸骨干的连接通过N末端的连接基团完成，而NIR发色团Cy 5.5通过C末端的连接基团连接：

(方案10)。

在另一优选实施方案中，在设计式(I)的探针时，目标是将其用于同相酶联发光分析。以下方案给出了上述作用机理的一般情况。荧光素是荧光素酶的底物，第二个酶促反应会产生光信号：

以下方案显示了上述作用机理，其中荧光素被哒嗪并二氮杂

衍生物掩蔽，其通过所述半胱天冬蛋白酶-1的蛋白水解活性释放：

本发明还涉及设计用于在体外分析、在细胞或多细胞有机体中观察单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组的催化活性的分子探针的方法，其特征是将单个蛋白水解酶或一组蛋白水解酶的抑制剂转化为针对所述的单个蛋白水解酶或一组蛋白水解酶、优选半胱天冬蛋白酶的选择性成像探针。为此，我们用易裂解的酰胺键替代某些已知半胱天冬蛋白酶抑制剂中的亲电基团。优选化合物的合成方式是使特定靶点的酶促活性(例如蛋白水解活性)产生可检测的信号。具体而言，优选的探针含有内部淬灭的荧光团(例如适当的FRET对)，所述荧光团与(i)易裂解键N末端的特异性决定基团A和(ii)易裂解键的C末端连接。本发明可将已知抑制剂的期望性质和先前最优化的性质转化为新的基于活性的探针。

现有技术描述的半胱天冬蛋白酶抑制剂在P1位置使用亲电性弹头。本发明的基于活性的探针利用所述已知的骨架并进行两处修饰，首先是亲电弹头转化为易裂解的酰胺基团，其次是在易裂解的酰胺基团的两侧安置相互作用的标记对或性能调节剂。

在体外，蛋白酶与本发明底物的反应通常可在细胞提取物中进行或者用蛋白酶的纯化形式或富集形式进行。对于体内应用，报告基团的发射波长优选在近红外(NIR)波段，因为该波段没有生物荧光的干扰。符合这些要求的已知的花青NIR染料优选被引入本发明的底物中。

式(I)化合物的分子架构由携带酰胺官能团的中心骨架A和两个亚单位L1R1和L2R2组成。如式(I)所示，L2R2总是通过酰胺键与骨架A连接，因为酰胺键可被半胱天冬蛋白酶酶裂解。本领域技术人员可选择用于将亚单位L1R1与骨架A连接的合适的官能团，以下给出一些实例。前体化合物中的特异性官能团L’可以位于骨架A上以便连接适宜的L1R1亚单位而在式(I)化合物内形成L基团，只有合成策略的要求和这种底物作为基于活性的成像试剂的最终用途对其构成限制。这些基团的选择将取决于所选择的用来构建期望底物的具体试剂。在骨架A上将A与亚单位L1R1连接起来的官能团L’的实例包括氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、叠氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、醛基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳双键、碳碳叁键等。最优选的实例包括氨基、叠氮、羟基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛基、碳碳双键或碳碳叁键。因此，L优选是键或选自于

-(NRx)-、-O-、-C＝N-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)H、-CRx＝CRy-、-C≡C-和苯基的基团，其中Rx和Ry独立的是H或(C₁-C₆)烷基。

具体而言，式(I)化合物的优选合成方法利用正交保护的官能团。这种保护基的选择使得能够独立地脱保护，从而每个被释放的官能团随后能进一步被化学处理以将相应的亚单元连接于骨架A。本领域技术人员可为设想的官能团选择合适的保护基团，有关保护基团的概述参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley&Sons，New York 1991。

式L’-A-CO-OH的化合物(骨架)可根据本领域的标准方法制备，例如国际专利申请US5670494；WO9526958；WO9722619；WO9816504；WO0032620；WO0055127；WO0105772；WO0190063；WO03024955；WO03106460；WO03104231；WO03103677；W.G.Harter，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，809-812；Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，2779-2782；Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.2002，10，31-40；M.C.Laufersweiler等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，4322-4326；K.T.Chapman，Bioorg.Med.Chem.Lett.1992，2，613-618；Dolle等，J.Med.Chem.1997，40，1941-1946；D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4233-4236；D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.2006，14，7880-7892；D.J.Lauffer等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12，1225-1227；C.D.Ellis等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4728-4732；P.Tawa等，Cell Death和Differentiation 2004，11，439-447；Micale等，J.Med.Chem.2004，47，6455-6458；Berger等，Molecular Cell，2006，23，509-521；和Garcia-Calvo，J.Biol.Chem.1998，273(49)，32608-32613中所述的方法。

本发明还涉及式(I)化合物的制备方法，其特征在于，如果n是1：

(a)将式(II)的化合物

L’-A-CO-OH (II)

其中A具有以上所述的一般含义和优选含义中的定义，L’是氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、叠氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、醛基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳双键、碳碳叁键，优选氨基、叠氮、羟基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛基、碳碳双键或碳碳叁键，更优选氨基，

在本领域技术人员已知的条件下，与式L1-R1-H的化合物反应，其中L1具有以上所述的一般含义和优选含义中的定义，得到式(III)化合物，

L1-R1-L-A-CO-OH (III)

(b)将式(III)化合物与化合物H₂N-R2-L2反应得到式(I)化合物。

任选地，式(I)化合物的合成方法利用正交保护的官能团。这种保护基的选择使得能够独立地脱保护，从而每个被释放的官能团随后能进一步被化学处理以与标记基团连接或在连接基团R1和/或R2上进一步引入延伸基团。本领域技术人员可为设想的官能团选择合适的保护基团，有关保护基团的概述参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts in“Protective Groups inOrganic Synthesis”，John Wiley&Sons，New York 1991。

式(I)的探针的另一种制备方法中，n是1，其包括

(a1)将式(II)的化合物与式(IV)的化合物在本领域技术人员已知的条件下反应

H₂N-L2-PG2 (IV)

生成式(V)的化合物

L’-A-CO-NH-R2-PG2 (V)

(b)然后将式(V)的化合物与式(VI)的化合物

PG1-R1-L” (VI)

在本领域技术人员已知的各基团所需的条件下反应，生成化合物

PG1-R1-L-A-CO-NH-R2-PG2 (VI)

其中PG1和PG2彼此独立的是保护基团，优选正交保护基团，L”是需要由本领域技术人员选择的针对L’的连接基团，或者是键

(c1)将化合物(VI)的PG2基团裂解并将所得化合物与标记基团L2反应，然后将保护基团PG1裂解并将所得化合物与标记基团L1反应得到式(I)化合物，或者

(c2)将化合物(VI)的PG1基团裂解并将所得化合物与标记基团L1反应，然后将保护基团PG2裂解并将所得化合物与标记基团L2反应得到式(I)化合物。

在步骤(b)中，优选的L’和L”组合和反应类型(括号中)如下：

当L’是氟、氯、溴、碘时，L”是氨基(R-NH₂)、羟基(R-OH)、叁键(Sonogashira反应)、双键(Heck反应)、烷基硼烷(Suzuki反应)；

当L’是氰基时，L”是氨基(R-NH₂)、羟基(R-OH)、巯基(R-SH)；

当L’是氨基时，L”是活化羧酸(NHS酯...)、醛、氟、氯、溴、碘；

当L’是叠氮时，L”是叁键、膦基团(Staudinger连接)；

当L’是羧基时，L”是氨基、羟基、酰肼；

当L’是烷氧基羰基时，L”是氨基、羟基、酰肼；

当L’是芳基氧基羰基时，L”是氨基、羟基、酰肼；

当L’是羟基时，L”是氟、氯、溴、碘、羟基(Mitsunobu反应)、羧基；

当L’是醛时，L”是氨基、肼；

当L’是碳碳双键时，L”是溴、氯、碘(Heck反应)、烷基硼烷(Suzuki反应)；

当L’是碳碳叁键时，L”是溴、氯、碘(Sonogashira反应)、叠氮。

其中n是0的式(I)化合物可通过使式A-CO-OH(IV)的化合物与化合物H₂N-R2-L2反应来制备得到式(I)的探针。

优选在固体支持物上合成用不同的标记基团功能化的半胱氨酸蛋白酶底物。

对于具有模拟肽结构的式(I)的半胱天冬蛋白酶探针的合成，可以在固相合成中使用非肽类构建基本元件。实施例8中进一步描述了构建基本元件的合成。

构建基本元件(VII)优选用于合成半胱天冬蛋白酶-1探针，例如实施例1和2的化合物，

本发明的探针优选是半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-8的探针。

本发明的探针用于在体外、在细胞培养实验、离体实验或活有机体(体内)环境下的分子成像，包括筛选和全动物成像。最优选的是成像应用例如光学成像和磁共振成像(MRI)。

本发明的探针旨在用于蛋白酶活性的诊断成像。最优选的是提供监测药物或类药物物质对目标蛋白酶作用的方法的应用。施用这种药物或类药物物质对于本发明探针发出的信号应该具有可测量的效果。

本发明探针的另一最优选方面是其作为成像试剂在指导手术和监测药物治疗效果方面的用途。手术指导包括检测肿瘤边缘和检测肿瘤转移进展。

因此，本发明的另一方面是活有机体成像的方法，其包括：

(a)向所述有机体施用式(I)的探针，

(b)将所述有机体暴露于可激发非淬灭荧光团的电磁辐射以产生可检测的信号，和

(c)检测所述信号，从而创建影像。

或者，活有机体成像的方法包括：

(a)向所述有机体施用式(I)的探针，

(b)将所述有机体暴露于可激发荧光团的电磁辐射以产生可检测的信号，和

(c)检测所述信号，从而创建影像。

“活有机体”可以是任何含有待检测的半胱氨酸蛋白酶的活细胞或完整有机体，优选的活有机体是哺乳动物，例如小鼠或大鼠。

本发明的探针具有高选择性，从而可避免假阳性的风险。

缩略语：

DMF＝二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲亚砜

DCM＝二氯甲烷

equiv.＝当量

sat.＝饱和的

THF＝四氢呋喃

DIPEA＝二异丙基乙基胺

HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HATU＝O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐

NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺酯

固相肽合成的一般方法：

根据标准固相肽合成法合成以下探针。用2-氯三苯甲基树脂作为固体支持物。加载树脂时，将2当量的Fmoc保护的氨基酸和3当量的DIPEA溶于DCM，将反应混合物加至树脂中(加载量1.4mmol/g)。将反应混合物在室温下振摇过夜。用DCM和DMF洗涤树脂。进行Fmoc去保护时，将树脂用30％哌啶/DMF溶液处理两次15分钟。进行固相肽合成时，使用标准实验方案：将4当量的Fmoc保护的氨基酸、4当量的HATU、4当量的HOAt和8当量的DIPEA溶于DCM/DMF(1/1)混合物中。将反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后加至树脂中。将反应混合物振摇2小时，如果Fmoc保护的氨基酸在立体化学上受到阻碍则振摇更长时间。从固相进行裂解时，用5％TFA在DCM中的溶液处理树脂两次15分钟。减压共同蒸除溶剂和甲苯，终产物经制备HPLC纯化(梯度：H₂O+0.05％TFA；5至95％CH₃CN)。

实施例1：半胱天冬蛋白酶-1探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)。计算值：[M+H]⁺＝1569.70，实测值：[M+H]⁺＝1569.45。收率：54％。

实施例2：半胱天冬蛋白酶-1探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)计算值：[M+H]⁺＝1583.73实测值：[M+H]⁺＝1583.2。收率：72％。

实施例3：半胱天冬蛋白酶-1探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)计算值：[M+H]⁺＝1591.19实测值：[M+H]⁺＝1591.50。收率：66％。

实施例4：半胱天冬蛋白酶-3探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)。计算值：[M+H]⁺＝1517.66实测值：[M+H]⁺＝1517.55。收率：59％。

实施例5：半胱天冬蛋白酶-3探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)计算值：[M+H]⁺＝1546.79实测值：[M+H]⁺＝1546.35。收率：61％。

实施例6：半胱天冬蛋白酶-8探针

根据一般方法在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)计算值：[M+H]⁺＝1523.45实测值：[M+H]⁺＝1523.25。收率：55％。

实施例7

根据WO9722619中所述的一般方法制备构建基本元件(VII)。

实施例8：半胱天冬蛋白酶-1生物发光探针

根据一般方法，从6-Fmoc-氨基-D-荧光素开始在固体支持物上制备化合物，经HPLC纯化(H₂O+0.05％TFA；4-95％CH₃CN)。计算值：[M+H]⁺＝772.82，实测值：[M+H]⁺＝773.15。收率：13％。

Claims

1.式(I)的针对半胱氨酸蛋白酶的分子探针

{L1-R1-L}_n-A-CO-NH-R2-L2 (I)

其中

A是可被半胱天冬蛋白酶识别的基团；

R1是连接基团；

R2是键或连接基团；

L是键或能够使L1基团容易地结合的基团；

n是1；

或者

R2是键；

L2是适合于偶联生物发光分析的底物；且

n是0。

2.权利要求1的探针，其中半胱天冬蛋白酶是半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-8。

3.权利要求1或2之任一项的探针，其中L是键或选自于-(NRx)-、-O-、-C＝N-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)H、-CRx＝CRy-、-C≡C-和苯基的基团，其中Rx和Ry独立的是H或(C₁-C₆)烷基。

4.权利要求1至3之任一项的探针，其中R1或R2是含有1至300个碳原子的直链或支链亚烷基，其中任选地，

(c)一个或多个碳原子被酯官能团-O-CO-替代；

(d)两个相邻碳原子间的键是双键或叁键；和/或

(e)两个相邻的碳原子被二硫键替代。

5.权利要求1至4之任一项的探针，其中标记基团L1和L2彼此独立的是光谱探针例如荧光团；淬灭基团或发色团；磁性探针；造影剂；能与配体特异性结合的作为特异性结合对的一部分的分子；与固体支持物共价连接的分子，其中所述支持物可以是载玻片、微量滴定板或本领域技术人员已知的任何聚合物；具有期望的酶促性质、化学或物理性质的生物分子；或具有上述任何性质的组合的分子；或荷正电的直链或支链聚合物。

6.权利要求5的探针，其中标记基团L1和L2彼此独立的与荷正电的直链或支链聚合物连接。

7.权利要求6的探针，其中标记基团L1和L2之一是含有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的线性聚(精氨酸)。

8.权利要求5至7之任一项的探针，其中L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2的一个成员且L2是其中的另一成员。

9.权利要求8的探针，其中L1/L2是FRET对。

10.权利要求9的探针，其中一个L1/L2是荧光团，其选自于Alexa350、二甲基氨基香豆素、5/6-羧基荧光素、Alexa 488、ATTO 488、DY-505、5/6-羧基荧光素、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、ATTO 488、ATTO 532、四甲基罗丹明、Cy 3、DY-505、DY-547、Alexa 635、Alexa 647、ATTO 600、ATTO 655、DY-632、Cy 5、DY-647Cy 5.5，另一个L1/L2标记基团是淬灭基团，其选自于Dabsyl、Dabcyl、BHQ 1、QSY 35、BHQ2、QSY 9、ATTO 540Q、BHQ 3、ATTO 612Q、QSY 21。

11.权利要求1至4之任一项的探针，其中n是0，R2是键且L2是适合于偶联生物发光分析的底物，其特征是将修饰的氨基荧光素或其羧基末端保护的衍生物用作报告基团，当其从中心骨架A上被裂解下来时可被荧光素酶转化产生发光信号。

12.权利要求1至11之任一项的选择性半胱天冬蛋白酶-1探针，其特征是下表的化合物1-28：

13.权利要求1至11之任一项的选择性半胱天冬蛋白酶-3探针，其特征是下表的化合物29-42：

14.权利要求1至11之任一项的选择性半胱天冬蛋白酶-8探针，其特征是下表的化合物43-44：

15.制备权利要求1至14的式(I)的探针的方法，其特征为如果n是1：

(a)将式(II)的化合物

L’-A-CO-OH (II)

与式L1-R1-H的化合物反应，得到式(III)化合物，

L1-R1-L-A-CO-OH (III)

(b)将式(III)化合物与化合物H₂N-R2-L2反应得到式(I)的探针，其中L’是氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、叠氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、醛基、羟基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳双键、碳碳叁键，优选氨基、叠氮、羟基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛基、碳碳双键或碳碳叁键，更优选氨基，且

R1和/或R2可以被合适的正交保护基团保护并在式(I)化合物的制备过程中先后被裂解；且

若n是0：

则使式A-CO-OH(IV)的化合物与化合物H₂N-R2-L2反应来制备得到式(I)的探针。

16.权利要求1至14的式(I)的探针用于在体外、在细胞培养实验、离体实验或活有机体内分子成像的用途。

17.权利要求1至14的式(I)的探针用于活有机体分子成像的用途，其包括：

(a)向所述有机体施用式(I)的探针，

(c)检测所述信号，从而创建影像。

18.权利要求1至14的式(I)的探针用于活有机体分子成像的用途，其包括：

(a)向所述有机体施用式(I)的探针，

(c)检测所述信号，从而创建影像。