CN101768214B - 一种人肿瘤标志物-Tim17多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术和医学领域，涉及新的人肿瘤标志物-Tim17多肽，编码Tim17的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本发明还涉及Tim17蛋白及其编码序列的用途，以及含Tim17蛋白拮抗剂的药物组合物。经实验显示，所述的Tim17多肽及其编码序列及该基因的表达产物，在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达，并且表达量与肿瘤的级别，分化程度以及预后均呈明显正相关。结果表明Tim17为一特异的肿瘤标志物。能作为乳腺癌、肺癌、肝癌、肠癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌的预防和早期检测的标志物或肿瘤治疗的靶标。

Description

一种人肿瘤标志物-Tim17多肽及其用途

技术领域

本发明属生物技术和医学领域。具体涉及一种新的人肿瘤标志物-Tim17多肽(translocase of inner mitochondrial membrane 17)，编码Tim17的多核苷酸序列和经重组技术产生该蛋白的方法。本发明还涉及Tim17蛋白及其编码序列的用途，如用于肿瘤的预防，早期检测，预后的判断，以及含Tim17蛋白拮抗剂(如抗体和反义核酸，RNAi等)的药物组合物。

背景技术

生物标志物(biomarker)是指能被客观测量的，指示正常生理或病理过程，或是机体对于药物反应的物理、化学、生物指标。肿瘤研究的最关键的问题之一，就是寻找早期检测，诊断分型，治疗监测和预后，以及作为药物靶标的标志物。细胞从正常状态转变为肿瘤的过程中，细胞内蛋白表达谱会发生一系列变化。肿瘤标志物就是在肿瘤发生和发展过程中，由肿瘤细胞合成释放或宿主对肿瘤反应性释放的一类物质。它们具有一定的特异性与灵敏度，可以用作诊断与治疗中的监测指标。

目前，已被用于临床的肿瘤标志物还相当缺乏。各国的标志物审核标准略有不同。我国在肿瘤标志物应用方面主要还是参照美国等西方发达国家的标准。以美国为例，每年ASCO(American Society of Clinical Oncology)都会对肿瘤临床所用的生物标志物提出指导性建议。如2007年能用于乳腺癌的标志物包括ER/PR，HER2，uPA/PAIl，和多参数基因表达分析方法(Oncotype DM，MammaPrint等)，并提供了详细的建议使用条件和范围。其余的如Ki67，Cyclin D，Cyclin E，p27，p21，蛋白质组分析等因证据不充分，不被建议使用(参见ASCO网页)。可以看到，在承认这些标志物在改善病人诊断，治疗中的作用同时，目前肿瘤病人的发病率和致死率仍总体上呈上升趋势。这一现象要求更多更好的肿瘤标志物的发现和临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人肿瘤标志物Tim17的多肽SEQ ID NO：1，核酸(RNA)SEQ ID NO：5，及其片断，类似物，衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码上述RNA，多肽的脱氧核酸序列(DNA)SEQ ID NO：6。

本发明的另一个目的是提供上述RNA和多肽的制备方法，以及该RNA，多肽和其编码序列的用途。

所述的RNA可以通过PCR的方式产生。具体的说，可以用SEQ ID NO：3中的引物对，通过聚合酶链反映，获得序列为SEQ ID NO：5的RNA产物。所述多肽可以通过化学合成的方式生产。该RNA和多肽均可帮助检测肿瘤的存在。

本发明经过广泛而深入的研究，发现了新的可作为肿瘤标志物的基因。该基因的表达产物，包括RNA SEQ ID NO：4和蛋白SEQ ID NO：2，在正常细胞和组织中几乎检测不到，在肿瘤细胞和组织中却有很高的表达。并且表达量与肿瘤的级别，分化程度，以及病人的预后都呈明显正相关。研究结果表明Tim17是一特异的肿瘤标志物。在此基础上完成了本发明。

具体的说，本发明通过系统地比较来自同一个病人的，不同恶性程度的乳腺癌细胞系，获得了一系列的差异表达蛋白质。Timm17A是其中的一个新的肿瘤特异表达的蛋白。其一个多肽，SEQ ID NO：1，被稳定同位素标记的质谱法特异检出在肿瘤中具有高于正常细胞4.8倍的表达水平。通过定量RT-PCR的方法，结果显示肿瘤中Timm17A的RNA表达也明显高于正常对照的水平。同时，通过抗体验证发现，Tim17(包括A，B两个亚型，抗体不区分这两个亚型)的蛋白也在肿瘤中呈上升趋势(图1A，B)。更进一步，通过免疫组化的方法，本发明对43例正常和乳腺癌肿瘤病人的组织进行试验(图1C，表1)，结果显示，正常乳腺组织中未见有Tim17蛋白的表达，而早期乳腺疾病(Hyperplasia，乳腺增生)中则显示有Tim17的表达；在早期乳腺癌病人中(DCIS，原位导管瘤)达到表达高峰。上述实验证据表明Tim17具有作为早期检测乳腺癌标志物的潜在作用。

为了验证上述实验结果，本发明进行了数据库数据发掘的工作。在Oncomine(www.oncomine.org)数据库中，存放着大量肿瘤病例的RNA微阵列芯片数据。本发明对Timm17A基因进行搜索和数据整理，其中，乳腺癌和正常组织的比较结果显示，乳腺癌中Timm17A的表达水平明显高于正常对照(图2)；在乳腺癌的级别，分化程度和Timm17A的表达相关分析中，显示了明显正相关(图3)。更有意义的是，在病人预后和Timm17A的表达相关分析中，也显示了明显正相关(图4)；同时Tim17的另一个亚型，Timm17B基因，也显示了上述这些结果。上述结果表明，Tim17的两个亚型均能成为潜在的肿瘤发现(早期检测)，诊断(分级别)，预后的标志物。

为了观察Tim17的肿瘤高表达现象是否仅仅局限于乳腺癌，本发明对Oncomine数据库里的其他肿瘤也进行了类似的数据挖掘分析。结果显示，在肺癌，肝癌，肠癌，膀胱癌，前列腺癌，淋巴癌中，均存在该种肿瘤中高表达的现象(图5)。分析结果证实，Tim17是一个广谱的肿瘤标志物。

本发明根据Tim17在肿瘤中的过表达，进行抑制它的表达是否能抑制肿瘤的生长检验：设计合成了针对Tim17的shRNA，并将它克隆到可诱导表达的慢病毒(lenti-viral)载体中。结果显示，抑制Tim17的表达可显著抑制肿瘤的生长。所述结果进一步证实Tim17能作为肿瘤治疗的靶标。

附图说明

图1Tim17在乳腺癌细胞系和组织中的表达，

其中，A：用Tim17A的特异引物进行的定量反转录-PCR，结果以对照基因GAPDH进行标准化表示，图中16N，HME为正常乳腺上皮细胞，其余为乳腺癌细胞；B：乳腺细胞中用免疫印记法检测Tim17蛋白，细胞标识如A；C：组织中用免疫组化检测Tim17蛋白，图为正常，原位癌，和侵袭性癌的示例；上：正常；中：原位导管癌；下：侵袭性癌。

图2TIMM17A RNA在正常对照和乳腺癌肿瘤病人组织中的表达差异(数据挖掘结果)，其中，Class 1：Normal(7例)；Class 2：Breast Carcinoma(45例)。

图3TIMM17A表达水平与乳腺癌病人预后呈显著正相关(数据挖掘结果)，

其中，A：数据集1，Class 1：生存(121例)，Class 2：死亡(38例)；B：数据集2，Class 1：无疾病(180例)，Class 2：复发(93例)。

图4TIMM17A表达水平与乳腺癌级别和分化程度呈显著正相关(数据挖掘结果)，

其中，A：数据集1，Class 1：grade 1(68例)，Class 2：grade 2(126例)，Class 3：grade 3(55例)；B：数据集2，Class 1：grade 1(67例)，Class 2：grade 2(128例)，Class 3：grade 3(54例)；C：数据集3，Class 1：高分化(30例)，Class 2：中分化(83例)，Class 3：低分化(83例)。

图5TIMM17A许多肿瘤中都有过表达，是一个广谱的标志物(Oncomine数据分析结果)。其中，A：膀胱癌；B：肠癌；C：肝癌；D：肺癌；E：前列腺癌。

具体实施方式

在本发明的第一方面，提供了新颖的分离出的差异表达的Tim17多肽，它包含：具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物。

实施例1：获得差异表达的Tim17多肽

从一个病人分离得到的乳腺癌细胞系，包括正常(16N)，肿瘤(NT)，和转移瘤(MT2)，用D3-Leu(Cambridge Isotope公司)稳定同位素培养标记肿瘤细胞。正常和转移瘤细胞用含D0-Leu的培养液培养。将三个细胞系的蛋白质用裂解液(8M urea，2.5Mthiourea，65mMDTT，4％(w/v)CHAPS，0.5％(v/v)Biolytes pH 3-10，proteaseinhibitor cocktail)抽提，定量(RC DC Protein Assay Kit，Biorad公司)。等量的蛋白质混合成正常：肿瘤组和肿瘤：转移瘤组，然后以一维SDS凝胶电泳分离。凝胶经染色后，每一凝胶条切割成大小相似的8个条带。每一条带经脱色，干胶，胶内酶切，提肽等步骤，再用液相色谱分离多肽。分离的多肽由LTQ-Orbitrap(ThermoElectron公司)质谱仪进行鉴定。鉴定获得1200多个蛋白的定量信息。其中70多个被确定为显著差异表达的蛋白。除去已知的肿瘤标志物，在余下的新标志物中，确定差异表达显著的TIMM17A(Tim17蛋白两个亚型中的一个)，其为具有重要线粒体功能的蛋白。所获得的定量信息的多肽为GKEDPWNSITSGALTGAILAAR。在肿瘤中，它的表达比正常细胞高4.8倍。经多次的质谱鉴定均得到相同的结果。

在本发明的第二方面，提供了编码分离的所述多肽的多核苷酸。SEQ ID NO：4。

实施例2：从乳腺癌细胞系中获得编码TIMM17A的全长基因

用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取21T乳腺癌细胞系(来源于NT或MT2两种细胞)中的总RNA，用PrimeScript lst strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)将总RNA反转录成cDNA。以合成的cDNA为模板，设计含酶切位点的TIMM17A克隆基因正向引物(已经除去原TIMM17A的起始密码子ATG)5’-CA GAA TTC TGG AGG AGT ACGCGC GAG-3’和反向引物5’-GACCTCGAGCTACTGATATTGTCGATA-3’，用热启动Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)进行PCR反应，反应条件为98度预变性2分钟，然后95度10秒，55度退火15秒，72度40秒进行延伸反应，反映30个循环。将PCR产物和pcDNA3.O-HA-FLAG空载体分别进行EcoRI和XhoI双酶切、连接以及DH5α细菌的转化实验，得到TIMM17A基因转化的阳性克隆，待DNA测序确定基因序列无误后得到pcDNA3.O-HA-FLAG-TIMM-17A载体。

在本发明的第三方面，提供了模拟、促进、拮抗人Tim17活性的化合物，以及抑制人Tim17的表达的化合物。较佳地，该化合物是人Tim17编码序列或其片断的小分子干扰RNA。将所述的小分子shRNA克隆到pLVTHM载体中成pLVTHM-sTimm17A.将该载体同包装质粒共转入包装细胞293T以产生病毒。用病毒感染待测肿瘤细胞，发现待测肿瘤细胞的生长明显减慢。

实施例3：TIMM17A小分子干扰RNA抑制肿瘤的生长

按照shRNA的设计规则，设计三个序列的23碱基shRNA。将其中具有较好的抑制基因表达效果的序列克隆到pLVTHM(Trono实验室，Switzerland)载体的MluI和ClaI位点。产生的载体命名为pLVTHM-sTimm17A。为了产生可诱导的shRNA表达细胞系，pLVPT-tTR/KRAB-Red载体(Trono实验室，Switzerland)转入293T细胞。同时，两个包装载体PMD.G(VSV.G)，CMV-DR891被共转入293T细胞。转染的293T细胞继续生长48小时后，收集细胞的上清。过滤去除细胞，将上清感染MDA-231乳腺癌细胞。被感染的MDA-231细胞经48小时培养后，用流式细胞仪分选获得带红色荧光的表达KRAB抑制因子的细胞。获得稳定表达KRAB的MDA-231-KRAB细胞株。将构建的pLVTHM-sTimm17A载体与PMD.G(VSV.G)，CMV-DR891包装载体共转入293T细胞以产生shRNA的表达载体病毒颗粒。用上述产生稳定细胞株同样的方法，以病毒感染MDA-231-KRAB细胞株，从而产生可被DOX(Sigma公司)诱导表达shRNA的MDA-231-KRAB-sTimm17A细胞株。所述细胞在1μg/ml的DOX下，表达shRNA，抑制TIMM17A基因的表达。

在这一基础上，将MDA-231-KRAB-sTimm17A细胞株以50000/孔的密度，接种于96孔细胞培养皿中的10个孔。其中5个孔培养在有DOX培养液中，另5个孔培养在无DOX的培养液中。72小时后，用MTT(Sigma公司)法测量细胞生长状况。结果显示，有DOX的培养液培养的MDA-231-KRAB-sTimm17A细胞与无DOX的细胞相比有50％的生长抑制。

在本发明的第四方面，提供了含有上述小分子干扰RNA的载体和病毒。载体和病毒的产生过程已在实施例3中详述。

在本发明的第五方面，提供了检测样品中是否存在Tim17的方法。它包括：抽提组织中的RNA，反转录成cDNA。用设计合成的引物序列(SEQ ID NO：3)进行定量PCR扩增。另一检测蛋白质水平的方法是：抽提组织中的蛋白质，用特异抗体进行免疫印记反应。或，对石蜡包埋的组织，用特异抗体进行免疫组化试验。还提供了检测肿瘤的方法，包括：对样品进行上述的定量PCR试验，免疫印记试验或免疫组化试验，结果高于本底水平的个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。

实施例4：定量PCR检测TIMM17A的RNA

按照质谱鉴别出的蛋白相应序列和NCBI网站上的基因序列信息(accession number：NM_006335.1)，用primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计TIMM17A引物。获得的上游引物序列，从5′到3′为atccctggaactccatcaca，下游引物序列为tgcagaggcaaatcttgtca。引物设计时使扩增产物跨过基因组序列的2号内含子，从而降低基因组DNA影响结果的可能性。定量PCR的内参为GAPDH基因。所用的GAPDH基因的上游引物为cgagatccctccaaaatcaa，下游引物为ttcacacccatgacgaacat。用Trizol提取总RNA，经分光光度计(260nm/280nm)测RNA的浓度和纯度。用3μg总RNA和oligo dT引物经PrimeScript lst strand cDNASynthesis Kit进行反转录(TaKaRa)。在25μl定量PCR反应体系中，加入75ng cDNA模板，1×SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time；TaKaRa)和各200nM的引物。用iQ5定量PCR仪(Bio-rad公司)进行扩增反应。反应程序为：95℃初始变性10秒，两步法进行40个循环，95℃，5秒变性，60℃退火，延伸20秒。用iQ5(Bio-Rad)v2.0版本软件在相对定量模式下进行数据定量分析。图1A是定量PCR实验的一个结果。用细胞系RNA，发现正常细胞16N，HME表达很低的TIMM17A RNA，而肿瘤细胞，如NT，MT2，T47D表达量显著高于正常细胞。

实施例5：免疫印迹和免疫组化检测Tim17蛋白

应用Tim17的抗体(兔抗人TIMM17A/TIMM17B抗体，PTGLAB公司)，在细胞和组织中进行免疫印迹和免疫组化实验。在免疫印迹中，用6-15％梯度SDS-PAGE凝胶分离大约30μg总蛋白，然后转移到PVDF膜(Amersham Bioscience公司)上。用含5％BSA的TBST缓冲液(137mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7.6，0.1％Tween 20)封闭PVDF膜，与Tim17抗体室温孵育一小时或者4度孵育过夜，洗涤，HRP偶联的二抗孵育。洗好的膜加上超敏化学发光液(Amersham Bioscience)显影，经LAS-3000成像系统成像(Fuji，Japan)。经Multi Gauge V3.0(Fuji公司，Japan)软件对免疫印迹的条带定量。图1B为免疫印迹实验在细胞系中的结果。Actin B抗体(鼠抗人Actin B抗体，PTGLAB公司)作文上样的对照。实验表明，在正常乳腺上皮细胞，16N和HME中，Tim17处于很低的表达水平，而在乳腺癌细胞，NT和MT2中，Tim17的表达水平显著增高。

在免疫组化实验中，经福尔马林固定和石蜡包埋的组织芯片购自US Biomax公司(CA，U.S.A.Catalog：TMA-BR480)。切片经脱蜡和水化后，经0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)水煮复原抗原。与1∶100稀释的抗Tim17的一抗4度过夜孵育。再由抗兔的HRP聚合体检测系统检测，Olympus BX51显微镜系统成像。由两个研究员对染好的组织芯片进行评分，至少10％的乳房上皮细胞被染上色的芯片算作阳性芯片。数据用Fisher Exact方法进行统计学显著性检验.P＜0.05。图1C示例了正常，原位导管癌，和侵袭性癌的免疫组化染色。结果显示，所有5个正常组织中都不表达Tim17蛋白，而Tim17蛋白最早在早期乳腺疾病，乳腺增生中有部分表达；到早期肿瘤原位导管癌时达到了表达高峰(检测的肿瘤中100％表达，6/6)。结果显示，Tim17能作为乳腺癌预防和早期检测的标志物。

在本发明的第六方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。用途包括用多肽免疫动物获得针对多肽的抗体，再通过抗体检测蛋白的表达。可以通过血液，组织，及其他体液(如乳腺吸液，nipple aspirate)进行检测。编码序列的作用包括通过其设计引物，探针，及siRNA，shRNA等用于检测DNA，RNA的表达，突变，和由于抑制基因表达达到抑制肿瘤生长的治疗效果。所述用途在实施例3、4、5中有所描述。

在本发明的第七方面，提供了一种药物组合，它含有安全有效量的本发明的人Tim17拮抗剂以及药学上可接受的载体。优选的拮抗剂是小分子干扰RNA序列。这些药物组合物可治疗肿瘤。具体的是，用pLVTHM载体构建成的pLVTHM-sTimm17A，以及用其产生的缺陷病毒。这些结果在实施例3中有所描述。

在本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

表1是Tim17在人正常和肿瘤组织中的表达。

表1

其中，^a小叶原位癌Lobular carcinoma in situ；^b导管原位癌Ductal carcinoma in site；

^c浸润性癌Infiltrating carcinoma；^d年龄；P值以Fisher Exact统计计算。.

Claims (4)

1.序列如SEQ ID NO：1所示的Tim17多肽在制备以质谱或抗体为基础的检测肿瘤标志物或诊断制剂中的用途。

2.Tim17多肽编码蛋白序列SEQ ID NO：2在制备抑制肿瘤生长制剂中的用途，所述的抑制方式是使用含有人Tim17编码序列或其片断的小分子干扰RNA的人工合成化合物pLVTHM-sTimm17A抑制TIMM17A；

所述的pLVTHM-sTimm17A是按照shRNA的设计规则，设计三个序列的23碱基shRNA，将其中具有较好的抑制基因表达效果的序列克隆到pLVTHM载体的MluI和ClaI位点，产生的载体为pLVTHM-sTimm17A。

3.按权利要求1或2的用途，其中所述的肿瘤是乳腺癌、肺癌、肝癌、肠癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌。

4.按权利要求1或2的用途，其中所述的肿瘤是乳腺癌。

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