CN101750449A - 脂蛋白毛细管涂层及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类脂蛋白毛细管涂层及其制备方法。该涂层可通过物理吸附法和化学键合法制备。物理吸附法是将浓度为0.01-10mg/mL脂蛋白溶液与毛细管内壁发生非共价相互作用，自组装到内表面形成涂层。化学键合法是先采用氨丙基硅氧烷对毛细管进行改性，引入氨基；然后以戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯或辛二酸二琥珀酰亚胺酯或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺为偶联剂，在缓冲液pH(4-9)和脂蛋白浓度(0.1-10mg/mL)条件下，共价连接毛细管壁的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，得脂蛋白涂层。该涂层保留有生物活性，可用于抑制毛细管表面吸附和电渗调控，也可用于生化分离分析。

Description

脂蛋白毛细管涂层及其制备方法

技术领域

本发明涉及一类脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，适用于毛细管电泳及电色谱法进行生化分离分析、临床诊断和环境污染物毒性分析。

背景技术

毛细管电泳(CE)及毛细管电色谱(CEC)技术是将经典的电泳技术与现代微柱色谱分离技术结合的产物，它使分析科学从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。近年来，随着生命科学和环境健康领域的迅猛发展，毛细管电泳和电色谱技术在生物大分子的分析鉴定(如蛋白质的分离、DNA片段及序列分析等)、临床疾病诊断和临床药物监测、代谢研究、病理研究等方面展现出独特的应用优势，广泛赢得科研工作者的亲睐。

尽管CE和CEC技术在当前取得了突飞猛进的发展，但是随着科研目的的不断深化以及人们对信息准确性、精确性要求的不断升级，该技术也面临着更为严峻的技术挑战。例如，生物样品或复杂基质在毛细管上的不可逆吸附问题，是进行有关生物大分子研究时经常遇到的关键难点之一。由于生物大分子的不可逆吸附，造成毛细管壁表面zeta电位变化，引起分离效果下降、重现性差、准确度降低等问题，甚至严重时导致生物样品的损失和毛细管损坏。

为了克服这一难题，人们提出了一些有效的改善措施，如采用高离子强度的电泳缓冲溶液，选择极端pH条件(pH＜2.5或＞10)，但目前最为普遍接受的是毛细管涂层方案。毛细管涂层技术主要是指采用物理涂敷或化学键合等方法，在毛细管内壁形成一层或多层的涂层材料的方法。按照涂层的制备方法和应用模式，可将毛细管涂层分为动态涂层和永久性涂层。表面活性剂和一些聚合物作为毛细管涂层材料备受关注。然而，大部分报道的方法都会不同程度地引起蛋白质变性或活性损失，成为很多研究中的美中不足。加拿大化学家Lucy等于近年来发展了半永久性的磷酯类涂层，在保证满意的分离效能和稳定性的同时，还实现了良好的生物相容性，为该研究领域注入了新的活力。磷脂是一种具有良好生物相容性的涂层材料，近年来被深入研究和报道。然而，良好的磷脂双层涂层结构的构建高度依赖于涂层条件，譬如自组装形成的磷脂囊泡的尺寸和类型，这大大限制了这种方法的实际应用。

蛋白质是一种天然的内源性、生物相容的生物大分子。将蛋白质作为毛细管涂层材料，除了可以抑制吸附和调控电渗的功能外，还将产生一个新的有应用价值的功用，即用作抗体和药物筛选、临床诊断的测试工具。

本发明基于上述目的，以脂蛋白作为涂层材料，分别采用物理自组装和化学键合两种方法制备了具有脂蛋白活性和生物相容性的毛细管涂层。与磷脂双层相比，脂蛋白涂层的构建更为简单、直接、稳定性好，涂层功用也更为广阔。

脂蛋白是血液和细胞膜中的一类运输蛋白，主要由脂质体和载脂蛋白组成。由于其结构和密度的差异，常用超速离心法把血浆脂蛋白分为：乳糜微粒(CM)，极低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒的功能是转运外源性脂肪；极低密度脂蛋白的功能是转运内源性脂肪；低密度脂蛋白的功能是转运胆固醇；高密度脂蛋白的功能是转运内源性胆固醇和磷脂。脂蛋白的功能和其结构密切相关。大部分脂蛋白是由磷脂、载脂蛋白(如Apo B和Apo E等)、胆固醇和胆固醇脂等构成。以低密度脂蛋白为例，分布在分子表面的磷脂和载脂蛋白(Apo B)在结构组成中各占1/4的比重。

因此，本发明将不同的脂蛋白固定到毛细管上，既可以有效地抑制由硅羟基带来的不可逆吸附，又可进行与脂蛋白功能相关的应用研究。通过实验，初步表明脂蛋白涂层在蛋白质生化分离分析、环境污染物体内运输机制和自由基致蛋白损伤方面具有一定应用价值。相应地，认为在临床诊断、抗体和药物筛选、环境健康效应研究等方面也将具有良好的应用前景。

发明内容

本发明涉及一类脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，其目的在于研制出一种大分子涂层，并保留一定生物活性和生物相容性，使之既可用于毛细管表面吸附的抑制和电渗调控，又可以用于生化分析和临床检测等具体应用。脂蛋白包括极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和乳糜微粒。

本发明的另一目的在于提供上述脂蛋白涂层的制备方法，该方法操作简单，易于保持脂蛋白的活性和稳定性。

本发明所涉及的脂蛋白毛细管涂层的制备可以通过两种方法实现，即物理吸附法(或称自组装法)和化学键合法。

物理吸附法(自组装法)制备脂蛋白毛细管涂层的原理：在一定浓度的缓冲溶液(0.1-100mM，pH 4-9)和温度(4-37℃)条件下，使脂蛋白(浓度0.01-10mg/mL)与石英或玻璃毛细管内壁的硅羟基发生疏水、静电吸引等非共价相互作用，从而自组装到内壁表面形成结合层；然后用缓冲液洗去未结合的脂蛋白，制得脂蛋白毛细管涂层。

化学键合法制备脂蛋白毛细管涂层的原理：先依据溶胶-凝胶技术，用γ-氨丙基三乙氧基硅烷或γ-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化试剂对毛细管进行改性，引入氨基活性基团，制得氨基修饰的毛细管；然后以过量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺体系(EDC/NHS)为偶联剂，在一定缓冲溶液pH值(pH 4-9)、温度(4-37℃)以及脂蛋白浓度(0.1-10mg/mL)的条件下，共价连接毛细管上的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，将脂蛋白固定到毛细管内壁；最后用缓冲液洗去未结合的脂蛋白，制得脂蛋白毛细管涂层。

本发明所涉及的脂蛋白毛细管涂层及制备方法具有以下几个特点：具有良好的生物相容性，适用于生物大分子的分离和分析；保留脂蛋白的活性，可模拟生物膜进行其与生物大分子、小分子之间的相互作用研究，可用于临床诊断和药理研究；可根据脂蛋白的等电点(pI5-6)，通过选择电泳缓冲液来对电渗进行调控；具有磷脂和载脂蛋白等活性组份，可为药物载体的设计和外源性物质体内运输过程的机制提供研究工具。

附图说明

图1为化学键合法制备脂蛋白涂层的合成路线示意图。

图2为缓冲液pH与低密度脂蛋白涂层产生电渗的关系图。

图3为脂蛋白毛细管涂层用于蛋白质的分离色谱图。

具体实施方式

脂蛋白毛细管涂层及其制备方法，用以下实施方案举例说明。

在制备脂蛋白涂层之前，首先要进行毛细管的预处理。毛细管先用色谱纯甲醇冲洗1小时，然后用1mol/L氢氧化钠冲洗1-2小时，去离子水清洗毛细管15分钟，再用1mol/L盐酸冲洗1-2小时，最后用去离子水冲洗15分钟，高纯氮气吹干备用。预处理完成后，进行脂蛋白涂层的制备。

实施例1物理吸附法制备低密度脂蛋白毛细管涂层

称取5.0mg的低密度脂蛋白冻干粉，充分溶解于5.0mL的25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，配制成1.0mg/mL的涂层溶液。将该涂层溶液在10psi压力下通过经预处理的毛细管15分钟，然后用硅橡胶封住毛细管两端，毛细管内灌注有上述低密度脂蛋白涂层溶液，于室温下静置2-4小时。再次灌装涂层溶液，封住毛细管两端，于室温下静置2小时以上。完成上述操作后，用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗毛细管30分钟，去除未与管壁结合的低密度脂蛋白，毛细管两端用硅橡胶密封，并置于冰箱内4℃保存。

高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。

实施例2氨丙基修饰的毛细管的制备

移取0.1mL的γ-氨丙基三甲氧基硅烷，溶于1.0mL的水(稀醋酸调pH 5)-甲醇(2∶8，体积比)的混合溶液中，充分混匀后迅速充入预处理的毛细管中，将毛细管两端用硅橡胶密封，室温下反应2-4小时。反应完成后，依次用甲醇、水冲洗毛细管各30分钟，然后毛细管在高纯氮气保护下，置于105-120℃的烘箱内陈化干燥2小时以上。通过上述处理步骤，得到氨丙基修饰的毛细管。

实施例3以戊二醛为偶联剂的化学键合法制备低密度脂蛋白毛细管涂层

移取0.5mL 50％的戊二醛水溶液，加入到4.5mL的25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，充分混匀后，在5psi的压力下充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管，1小时后用硅橡胶密封毛细管两端，静置于室温反应2-6小时。然后用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)将反应未尽的戊二醛溶液冲出，得到戊二醛修饰的毛细管。

按照实施例1所述方法配制1.0mg/mL的低密度脂蛋白涂层溶液，将该溶液充入上述经戊二醛处理过的毛细管中，30分钟后封住两端，于室温下继续反应2-4小时。在此反应过程中，脂蛋白与戊二醛的醛基发生共价作用，生成希夫碱式化合物。用磷酸盐缓冲溶液将反应未尽的脂蛋白涂层溶液冲出，再用浓度为0.5mg/mL的氰基硼氢化钠溶液(在25mmoL磷酸盐缓冲液中，pH 6.4)冲洗20分钟。用硅橡胶密封毛细管两端，于室温下继续反应4-8小时，将不稳定的希夫碱结构还原成较稳定的亚胺结构(见附图1)。最后用25mmoL磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)将反应液冲出，得到低密度脂蛋白的毛细管涂层。如不立即使用，须置于冰箱4℃保存。

高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。

实施例4以N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)为偶联剂制备高密度脂蛋白毛细管涂层

称取5.0mg的DSC溶于5mL乙腈中，充分混匀。将上述溶液充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管中，20分钟后用硅橡胶密封毛细管两端，并置于45℃水浴中反应2-4小时。待反应完成后，依次用乙腈、去离子水和25mmoL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗毛细管10分钟。

按照实施例1所述方法配制1.0mg/mL的高密度脂蛋白涂层溶液，将该溶液充入上述经DSC处理过的毛细管中，于室温下反应2-4小时。待反应完成后，用25mmoL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗毛细管30分钟，得到高密度脂蛋白的毛细管涂层(见附图1)。如不立即使用，须置于冰箱4℃保存。

低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将高密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。

实施例5以辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)为偶联剂制备高密度脂蛋白毛细管涂层

以DSS为偶联剂制备极低密度脂蛋白毛细管涂层的操作与实施例4相同，仅须将N，N-琥珀酰氨基碳酸酯更换为DSS(见附图1)。

低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将高密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。

实施例6以EDC/NHS为偶联剂的化学键合法制备极低密度脂蛋白毛细管涂层

称取5.0mg的极低密度脂蛋白，溶于5mL的25mmoL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中；向该溶液中依次加入2.0mg EDC和3.0mg NHS，室温下漩涡震荡5分钟，静置25分钟。将上述溶液充入由实施例2制备的氨丙基修饰毛细管中，15分钟后用硅橡胶密封毛细管两端，4℃-25℃反应4小时以上。待反应完成后，用25mmoL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗毛细管30分钟，得到极低密度脂蛋白的毛细管涂层(见附图1)。

高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜微粒以及混合脂蛋白涂层合成方案与上述操作相同，仅需将极低密度脂蛋白涂层溶液替换成相应的脂蛋白溶液。

实施例7脂蛋白毛细管涂层对于电渗的控制

由实施例1制备的物理吸附(自组装)型脂蛋白毛细管涂层与实施例3-5制备的化学键合型脂蛋白毛细管涂层有相近的电渗控制行为。通过上述实施方案制备的脂蛋白毛细管涂层，可根据使用电泳缓冲液的不同实现对电渗的控制。电渗淌度的计算公式为：

电渗(cm²/Vs)＝毛细管总长(cm)×有效长度(cm)/[电压(V)×迁移时间(s)]

以物理吸附型和化学键合型低密度脂蛋白涂层为例，选定实验条件为：涂层毛细管内径50μm，总长50cm，有效长度40cm，施加电压15kV，以N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)为电渗标记物，进样压力0.5psi，进样时间5秒。在此条件下，如果将电泳缓冲液(25mmoL磷酸盐缓冲液)pH值从4逐渐改变到pH 8时，电渗淌度将会发生方向和绝对值大小的改变(见附图2)。并且，线性拟合曲线与X轴(pH值)的交点在5.3-5.5之间，与低密度脂蛋白的等电点(pI约为5.5)接近。

实验结果验证了脂蛋白毛细管涂层对电渗的可控性。这一特点可以为不同的分析及分离目的提供灵活简便的操作参数，从而提高分离效率和分析速度。

实施例8脂蛋白毛细管涂层用于蛋白质的生化分离和分析

采用化学键合法制备的低密度脂蛋白涂层，对细胞色素c(Cyt c)、溶菌酶(Lys)、核糖核酸酶A(RNase A)和α-糜蛋白酶原A(α-Chy A)4种碱性蛋白进行了分离。电泳条件：毛细管内径50μm，总长50cm，有效长度40cm，施加电压+15kV，以25mmoL磷酸盐溶液(pH 7.4)为电泳缓冲液，混合样品中各蛋白质浓度0.2mg/mL，进样压力0.5psi，进样时间5秒。结果表明，在上述电泳条件下，以上4种碱性蛋白质达到完全电泳分离，分离度大于1.5(见附图3)。蛋白质的分离效率为8700-124000块理论塔板/米，回收率在82％-96％之间，日间和日内精密度相对标准偏差(RSD)为1.2％-5.7％(见表1)，满足上述碱性蛋白质生化分离以及定性定量分析的要求。

脂蛋白涂层与分析物之间除存在疏水和静电相互作用外，还可能存在一定的亲和作用。脂蛋白涂层具有良好的结构特征及生物相容性，可以抑制蛋白质等生物大分子在毛细管壁上的不可逆吸附，适用于蛋白质的生化分离和分析。

表1低密度脂蛋白毛细管涂层电泳分离蛋白质的性能

实施例9低密度脂蛋白毛细管涂层用于自由基氧化损伤机理的研究

采用低密度脂蛋白涂层毛细管，研究二价铜离子(Cu²⁺)诱导低密度脂蛋白的自由基氧化损伤。电泳条件：毛细管内径50μm，总长50cm，有效长度40cm，施加电压+15kV，以25mmoL磷酸盐溶液(pH 7.4)为电泳缓冲液，以0.2％DMF为电渗标记物，混合样品中各蛋白质浓度0.2mg/mL，进样压力0.5psi，进样时间5秒。CuSO₄溶液的配制：称取8.0mg(50μmol)的无水硫酸铜，溶于10mL的25mmoL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，配制成5μmol的CuSO₄溶液。低密度脂蛋白涂层的氧化修饰：将上述CuSO₄溶液分别冲入3支尺寸相同的低密度脂蛋白涂层毛细管内，密封两端，置于37℃水浴分别孵育2、6和12小时。反应完成后，用电泳缓冲液将管内溶液冲出，并继续冲洗20-30分钟，最后接入毛细管电泳仪进行电渗测定和蛋白质分离。

按照实施例7所述方法测定电渗，按照实施例8所述方法进行蛋白质分离。脂蛋白的折合氧化率用电渗流的相对变化表示，即[(Cu²⁺氧化后的电渗-未氧化电渗)/未氧化电渗]×100％。结果表明，二价铜离子(Cu²⁺)可以诱导低密度脂蛋白的自由基氧化损伤，而且随着处理时间的增长折合氧化率也随之增加，脂蛋白涂层的稳定性下降，对蛋白质分离的效率也显著降低(见表2)。

脂蛋白的氧化修饰是引发动脉粥状硬化的主要诱因之一，自由基的存在会促进脂蛋白的氧化损伤。利用脂蛋白毛细管涂层可进行脂蛋白自由基氧化损伤以及动脉粥状硬化致病机理的研究。

表2Cu²⁺导致的涂层性能变化与脂蛋白的自由基氧化之间的关系

Claims (5)

1.一类脂蛋白毛细管涂层，其特征在于，毛细管内壁固定有一层或多层脂蛋白；脂蛋白包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒。

2.一种脂蛋白毛细管涂层的制备方法，其特征在于，可以通过物理吸附(或称自组装法)和化学键合的方法将脂蛋白固定到毛细管内壁，形成脂蛋白毛细管涂层。

3.根据权利要求1所述的脂蛋白毛细管涂层，其特征在于，具有磷脂、载脂蛋白、胆固醇脂等组份，保留有脂蛋白的活性。

4.根据权利要求2所述的脂蛋白毛细管涂层的方法，其特征在于，物理吸附法(或称自组装法)的原理为：在缓冲溶液(0.1-100mM，pH 4-9)和温度(4-37℃)条件下，使脂蛋白(浓度0.01-10mg/ml)与石英或玻璃毛细管内壁的硅羟基发生疏水、静电吸引等非共价相互作用，从而自组装到内壁表面，制得脂蛋白毛细管涂层。

5.根据权利要求2所述的脂蛋白毛细管涂层的方法，其特征在于，化学键合法的原理为：先采用γ-氨丙基三乙氧基硅烷或γ-氨丙基三甲氧基硅烷等硅烷化试剂对毛细管进行改性，引入氨基活性基团；然后以过量的戊二醛或N，N-琥珀酰氨基碳酸酯(DSC)或辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺体系(EDC/NHS)为偶联剂，在缓冲溶液pH值(pH 4-9)、温度(4-37℃)以及脂蛋白浓度(0.1-10mg/mL)的条件下，共价连接毛细管上的氨基与脂蛋白上的氨基酸残基，从而将脂蛋白固定到毛细管内壁。

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