CN101743303B - 细胞分选系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于通过微流体通道网络进行细胞分选的快速的、积极的控制的开关的微制造荧光激活细胞分选仪的设备和方法。该分选仪能够进行低应力、高效率的少量细胞(即1000‑100,000个细胞)的细胞群的分选。本发明包括在自备式塑料盒体中的微流体通道网络包装，其能够以无菌的一次性形式使微流体通道网络进行宏观尺度仪器的互连。使用单独的或组合的光学和/或流体切换力来实现切换。

Description

细胞分选系统和方法

技术领域

本发明涉及在微流体通道网络内使用力以提供开关，该开关能够选择性分选通过网络的靶细胞以将所述靶细胞与非靶细胞分开并收集它们的方法和装置。特别感兴趣的是光学切换力或流体切换力。

相关申请

本申请要求2007年7月23日提交的美国申请No.11/781,848的优先权，该申请要求2007年4月20日提交的美国临时申请No.60/925.563的优先权。

背景技术

传统的荧光活化细胞分选仪(FACS)在研究和临床应用中被广泛使用1。这些仪器能够进行非常快速的、多参数的分析和分选，但是一般要求较大的样本量，要求经过训练的操作者以用于操作和维修，并且灭菌困难。FACS仪器能够分析少至10,000和多达数以千万计的细胞。然而，低于100,000个细胞时，分选执行能力变弱¹。其它的分离方法诸如磁珠不像FACS那样要求同样多的细胞，但是它们受到非特异性结合、细胞和小珠聚集的困扰，并受到小珠自身可能干扰后续加工步骤的可能性的困扰。因此，为了分选得自原代组织的贵重的小样本或细胞，能够操作含有低细胞数的小样本量并允许有效回收被分选细胞群的细胞分选仪解决了独特的科学问题。

微制造细胞计数器能够分选少至1,000个细胞，同时在易于使用的封闭系统中消耗更少的试剂。后者是重要的，因为，与传统的FACS仪器不同的是，不产生气雾，减少了被分选细胞的污染风险，并且减少了使用生物危险材料进行操作的风险。已描述了几种微制造细胞分选仪，但是大部分都是“概念证实(proof of concept)”。Fu，等人²报道了以17个细胞/秒的通量进行大肠埃希氏杆菌(E.coli)的30倍富集。在分选后细菌只有20％能存活，并且在靶标储库中的分选纯度是30％。在后续的研究³中，通量增加到44个细胞/秒，但是靶标纯度降低到小于10％，回收率报道值为39％。Wolff，等人⁴能够从鸡红细胞中以12,000个事件/秒的通量分离小珠(beads)，达到100倍富集。然而，在靶标孔内的纯度为约1％。在这些研究中，富集被定义为靶标群在收集孔中的浓度与起始浓度相比的增加。纯度表示分选的准确度并且是被分选进入收集孔内的被分选靶细胞相对于所有细胞的百分数。回收率被定义为通过荧光检测器计数的细胞数与从收集孔被回收的细胞的数量比。后两种研究在微流体装置中使用压力开关，其切换整个流路，并因此切换在流体塞内所包含的任何粒子。在这些开关中的机械顺从性导致流体切换速度是通量的限速步骤³。还报道了电动流量控制，例如电渗^2，5，6或介电电泳^7，8，9，但是对缓冲的离子强度的高电场梯度和物理化学限制对于细胞而言是非理想条件。

Buican等人⁹首先提出了使用光学力用于使粒子偏转通过流体通道。通过光束被施加到粒子上的力由光功率和粒子及其周围流体介质的相对光学性质所决定。对于直径为约10μm的生物细胞而言，可以获得1pN/mW左右的力。尽管光学力较小，但是使细胞偏转进入相邻流动物流所必需的力也较小，例如，900pN移动10μm直径的细胞，20-40μm细胞在几个毫秒内横向跨越物流。该力是为克服处在这一横向运动所包含的速度下的细胞受到的粘滞阻力所必需的力。

关于光学力和一般背景技术的原理可参见美国专利6,744,038，其全文被并入本文作为参考。

在现有技术中已知多种用于在微流体装置中进行粒子分选的气压调制系统。通过交替改变接触微流体装置的气压，在微流体通道内流入的包含细胞的粒子可被引导到所需的一个或多个支路，从而可实现低成本的分选功能。

发明内容

如下所述，这些力在微流体通道网络内被用于实现切换，作为细胞分选系统可进行操作。通过检测得自在开关位置上游的微流体通道网络内流动的靶细胞的荧光信号来触发切换，尽管可同样地使用其它检测方式诸如光散射来激活开关。使用切换来引导细胞或粒子进入多个出口流动物流之一，而不改变基本的流动，从而收集所需的细胞用于其它应用。希望在微流体通道内的流动典型地是处在极低雷诺数下的层流。因此，以特定的层流层或流动物流流动的任何细胞，在缺乏与该层流层横向的任何力下时，将停留在该流动物流中。所述开关对细胞施加力就是实现这一目的，细胞与层流层横向发生转移，使细胞从经过一个出口离开分叉接合点的流动物流移动到经过第二出口离开分叉接合点的流动物流。

在一个实施方案中，细胞分选仪包括：适合接受在流体介质中的一个或多个细胞的细胞进口；流体连接到细胞进口的第一和第二缓冲剂进口，以向分选仪提供缓冲剂溶液；流体连接到细胞进口和第一和第二缓冲剂进口的流体通道；流体连接到流体通道的第一横流通道；流体连接到流体通道的第一和第二出口，这些出口位于横流通道下游，适合检测给定状态的细胞并响应给定状态的细胞产生信号的检测器，该检测器被布置为在第一横流通道的上游位置处检测细胞，连接到检测器并响应该信号而可致动以使得流体在横流通道内移动的横向力开关；从而当检测到给定状态的细胞时，横向力开关被激活以对细胞提供横向力，从而使细胞移动以便其选择性离开并进入第一或第二出口。

本发明在以下段落中详细描述了用于产生切换关和用于使切换最佳化的方法的方法学，微流体通道网络的设计和在微流体网络中细胞流或粒子流的性质，以便实现增强的分选性能。在光学切换的情况中，光学切换一般地通过将光学照明场投射进入微流体通道网络内、靠近微流体通道内的已确立流量的细胞轨道而工作。细胞与光场的相互作用对细胞产生力，该力使细胞横向转移到已建立的流量，从而细胞从一个流动物流以已确立流量移动到另一个流动物流，不发生细胞截留或不显著改变细胞以原流量的运动。

在下文中，术语细胞和粒子二者都可被理解为是指任何的生物细胞、生物粒子、天然有机或无机粒子以及人造的有机或无机粒子。在微流体通道网络中被分选的细胞的粒度范围通常是生物细胞的粒度范围，直径为约1微米到约50微米。更一般地说，具有约100纳米到约100微米直径的细胞是借助于微流体通道网络的阀进行分选的候选物。

在一个实施方案，使用光学开关。通常，已经使用激光来产生用在光学开关中的光束。目前用于光学开关的激光是近红外连续波激光，已知其在用于展示光学切换的能量密度和暴露时间下不伤害生物细胞的存活力。如果对粒子的损害不是问题的话，备选的激光源可被考虑用于不同的应用，包括可见波长激光或近紫外波长激光，或者其中可使用大的光流量来非常迅速移动粒子的脉冲激光。然而，光束源不限于激光，即使本发明的其它讨论使用了激光来产生光学切换。

在又一个实施方案中，可采用流体开关。优选地，可利用基于气动的流体开关。在另一种实施方案中，为细胞分选仪而设计的微流体晶片使用气压调制。用于流切换或细胞分选的单侧通道可用于微流体设备内。所述的通道几何形状为在微流体设备内进行有效的气动流切换作准备。在又一个方面，在单侧通道上的一对双切换阀使得气动切换响应时间最小化。在又一个方面，提供了盒体支座用于微流体晶片的气动控制。

关于流体切换系统的具体应用，流体分选仪切换系统包括：适合接受流体介质的进口；流体连接到进口的流体通道；流体连接到流体通道的第一和第二横流通道；连接到第一和第二横流通道的第一和第二气动阀；流体连接到流体通道的第一和第二出口；这些出口位于横流通道的下游；和控制系统，该控制系统连接到第一和第二阀，该控制系统提供了定时控制信号以致动第一和第二气动阀，特征在于第一阀在第二阀打开之前打开。在又一个方面，切换的进一步的特征在于第一阀在第二阀打开之后且在第二阀关闭之前关闭。在又一个方面，第二横流通道和第二气动阀可被取消以实现使用具有1或2个气动阀的单侧通道进行分选。

在又一个实施方案中，微流体细胞分选仪使用光学切换和气压调制。还提供了光学设计和光学-机械设计。优选使用双激光照明模块和暗照明模块。高效高NA(数值孔径)物镜优选被用于收集荧光。

在本发明的其它方面，采用了荧光信号检测和处理系统和方法。ADC被优选用于将模拟信号转化为数字信号。在一个实施方案中，数字信号处理算法在FPGA中实施。

任选地，提供了盒体的自对准。本发明解决了装载在系统中的盒体的自对准问题。

在其它方面，本发明涉及为微流体分选仪仪器而设计的应用软件。以可记录、无损失和高速(10兆比特/秒或更高)的格式在多次可执行应用和处理之间从外部设备对原始数据进行分流。

在其它的实施方案中，提供了微流体盒体添装站。本发明描述了用于添装微流体设备的添装站。

在其它的方面，提供了用于生长监控和细胞例如胎细胞的选择的稀释克隆法。本发明描述了用于生长监控和所述细胞的选择的稀释克隆法。

附图说明

图1是在微流体通道网络中的“Y”形分选接合点的平面图。

图2是并入鞘流挟缩接合点和通过主要通道连接的“Y”型分选接合点并且流中的细胞具有50/50分流的微流体通道网络的平面图，其一起被称为50/50光学网络。

图3a和3b是并入鞘流挟缩接合点和通过主要通道连接的“Y”型分选接合点并且流中的细胞借助于差动鞘流速而偏斜分流的微流体通道网络的平面图，其与光学开关一起被称为鞘流偏斜的光学网络。

图4a和4b是并入鞘流挟缩接合点和通过主要通道连接的“Y”型分选接合点并且流中的细胞通过差异性出口宽度而偏斜分流的微流体通道网络的平面图，其与光学开关一起被称为鞘流偏斜的光学开关网络。

图5是具有双向激光线光学开关的50/50光学开关网络。

图6是具有双向激光光点光学开关的50/50光学开关网络。

图7a、7b和7c是在具有超过两个出口的更大型微流体通道网络中的激光线光学开关的平面图。

图8a、8b和8c显示了为调节和/或断续光学开关而设计的光学设计。

图9a和9b是与细胞流平行转移或与细胞流成一定角度转移的激光光点光学开关的鞘流偏斜光学开关网络的平面图。

图10a、10b、10c和10d显示了使用用于细胞检测的单一激光源和触发器判定方法的检测器布置和时间选择/触发器图解。

图11a、11b、11c和11d显示了使用用于细胞检测的两个激光源和触发器判定方法的检测器布置和时间选择/触发器图解。

图12是用于在底部和顶部玻璃基底二者中的微流体通道网络的光刻掩模的代表性设计的图解，当这些基底被结合形成单一网络时其提供了在主要通道内的细胞流的2维鞘流挟缩。

图13显示了图12中所述的设计的3维示例。

图14是微流体通道网络的侧视图的例证，其提供了细胞流在垂直方向和然后在水平方向的按序鞘流挟缩，在主要通道内产生细胞流的完全的2维鞘流挟缩。

图15是图14中所述的微流体通道网络的3维示例。

图16是当底部和顶部玻璃基底结合在一起形成图14和15中所示的微流体通道网络时，用于底部和顶部玻璃基底二者的代表性光刻掩模设计的图解。

图17是用于完整的微流体通道网络的光刻掩模的代表性实施方案，该微流体通道网络具有T-挟缩接合点和连接到出口的T-分叉接合点，用于实施基于光学开关的细胞分选方法。

图18是用于完整的微流体通道网络的光刻掩模的代表性实施方案，该微流体通道网络具有三角形挟缩接合点和连接到出口的Y-分叉接合点，用于实施基于光学开关的细胞分选方法。

图19显示了在完整的微流体细胞分选晶片中的微流体通道网络的优选的实施方案。

图20显示了用于基于光学开关的微流体通道网络细胞分选仪的自备式一次性盒体的优选的实施方案。

图21显示了用于基于光学开关的微流体通道网络细胞分选仪的光学系统的优选的实施方案。

图22显示了基于光学开关的微流体通道网络细胞分选仪用于光学开关的多种执行的代表性性能。

图23是在显示基于气动的流体切换的粒子轨道的微流体通道网络中的现有技术的“Y”形分选接合点的平面图。

图24a和24b是具有在不同的气动分压下显示可能的粒子轨道的双通道流体开关的微流体通道中的“Y”形分选接合点的平面图。

图25a和25b是具有在不同的气动分压下显示可能的粒子轨道的单通道流体开关的微流体频道中的“Y”形分选接合点的平面图。

图26显示了在具有单通道流体开关的微流体通道中的“Y”形分选接合点的优选的实施方案。

图27显示了在单通道流体开关中使气动切换响应时间最小化和控制气动模式的一对双切换阀。

图28a和28b显示了一对双切换阀和跨越通道的流量流作为时间的函数的图表，使得气动切换响应时间最小化并控制在双通道流体开关中的气动模式。

图29是用于微流体晶片的气动控制的盒体支座。

图30显示了在本文所述的仪器上进行的荧光校准小珠的测量。

图31a显示了用DAP1-染色的Jurkat细胞的荧光显微镜图像，以及图31b显示了具有CellTracker Green的靶标Jurkat细胞的荧光显微镜图像。

图32显示了添装微流体盒体的站。本发明描述了用于添装微流体设备的添装站。

图33显示了用于生长监视和胎细胞选择的稀释克隆法。本发明描述了用于生长监控和胎细胞选择的稀释克隆法。

图34是用于1维流集中的浅微流体通道。本发明描述了克服用于微流体流式细胞术或分选的1维流集中的固有的速度色散的方法。

图35显示了在多相微流体小滴内的细胞/粒子探测。本发明描述了若干用于检测多相位流体小滴内的细胞/粒子计数的方法。

图36是用于进行有效的试样收集的微流体出口端口构型。本发明描述了在使用微流体设备进行细胞或粒子分选之后若干样品收集的方法。

图37是用于多次样品分析或分选的微流体设备。本发明描述了若干个用于多次样品分析或分选的微流体设备。

图38是用于样品分析和回收的微流体分析晶片。本发明描述了若干个用于以更低稀释度样品分析和回收的微流体设备。

发明详述

图1显示了在1×2微流体通道网络(即具有一个主要输入通道11和从分叉接合点伸出的两个出口12和13的网络)中用来分选细胞的光学开关10的一个实施方案。分叉接合点的“Y”几何形状如图1所示，但是还可使用其它形状的分叉诸如“T”几何形状。通常，这些微流体通道在光学透明基底中被形成，从而能够将光学开关和其它细胞检测光学装置投射进通道中。该基底典型地，但非限制性地，为玻璃，石英，塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等等，和其它可浇铸的或可使用的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8)。微流体通道的深度典型地，但非限制性地，为10μm到100μm。微流体通道的宽度典型地，但非限制性地，为深度的1到5倍。在进行玻璃基底的光刻掩蔽、然后进行通道的等向性蚀刻来制造微流体通道的情况中，横截面典型地是矩形，或带有四分之一圆角的矩形。

流动条件被设置为使得当光束(在该情况下得自激光)被关掉或阻断，从而光束没有入射到接合点区域上时，所有细胞将优选地流入出口之一，例如右侧的出口13。当光束被开启或接通时，光束入射在接合点区域，并且通过细胞与光束相互作用所产生的光学力引导细胞进入左侧的出口12。在该实施例中，被选择用于引导细胞的光学图形是相对于流体流动的方向呈一定角度的细长的激光照明线。光学梯度力(Optical gradient forces)使细胞侧向离开细胞的主要物流线路，从而使得被切换的细胞然后离开主要通道进入一个出口例如12，而未被切换的细胞从细胞的主要物流离开并进入另一个出口例如13。在微流体通道网络中流动条件的设置和控制可以通过直接驱动泵、气压泵送、电动学、毛细管作用、重力或其它可产生流体流动的手段来完成。

就通量(细胞进入分叉接合点顶部的分选区域的时间率)，收率(靶细胞在靶标出口12内的分数)和纯度(在靶标出口12内靶细胞数/总细胞数的比)而言的分选机构的性能，受到各种因素的影响，每个因素影响光学开关的执行。光学开关可以若干个诸如以下的参数为特征：被投射进微流体通道网络的分选接合点区域内的光学图形的形状，图形相对于分叉接合点的位置，光学图形相对于其原始位置和形状的任何运动，光学开关激活的持续时间，用于产生光学开关图形的激光源的波长和功率，等等。光学开关的这些参数的特定值的选择尤其是由以下因素决定的：微流体通道系统的拓扑学和几何形状，微通道系统内的流速(细胞速度)，控制在主要通道内流动的细胞的位置的能力(细胞是在主要通道的中央流动还是偏离到一侧流动)，实现可靠切换所必需的细胞位移的量，通道的深度，通道的形状，和细胞与光学开关相互作用所产生的力。

通常，当细胞被引入到位于主要通道内的流时，它们可在流内的任何横向位置处沿着通道下移。因此，根据细胞横向位置的不同，由于微流体通道内的压力驱动流的公知的抛物线(对于圆柱形微流体通道而言)或准抛物线(对于更普遍的横截面而言)速度分布，而导致细胞可以不同的速度移动。这将使得难以使所有细胞流偏流到一个出口即13，如图1所示。使用这一流动几何学进行的任何光学切换将必然导致低通量和为产生光学切换可获得的激光功率的使用效率低。使用这一流动几何学进行的任何流体切换，由于在检测区域和切换区域之间的可变的细胞飞行时间，将导致低的通量、纯度和收率。使用适当的流动条件可以帮助减轻对光学切换或流体切换的性能造成的这些限制。

可以在许多方面确立适当的流动条件。在一个实施方案中，使用如图2所示的鞘流方案，通过从细胞输入通道流20的左侧21和右侧22两侧都附加缓冲剂流来挟缩细胞输入通道流20，实现了细胞在主要通道的中央1-维集中成为单行(在平面图为水平地)。通过从每一侧具有相等的流从而实现了使细胞保持在主要通道的中央。该流有效地产生流体分流面23，如图2所示，并且其最终将产生流体和细胞在分叉接合点处50/50分流。使用这一微流体通道设计和流动条件进行光学切换以从混合细胞群中分选靶细胞要求光学开关，该光学开关积极地将靶细胞切换到一个出口即如图1所示的12和将非靶细胞切换到另一个出口即如图1所示的13。使用这一微流体通道设计和流动条件进行流体切换以从混合细胞群中分选靶细胞要求流体切换，其积极地将靶细胞切换到一个出口即图1所示的12和将非靶细胞切换到另一个出口即图1所示的13。这种实施方案的一个实施例是如图24中的双通道流体开关。

作为替代，可如图3a-b所示，通过向鞘流通道两侧施加不相等的流，可使集中的细胞线路位置偏离主要通道的中央。这在主要通道内有效地引起从输入通道30向分流面33一侧偏离的细胞斜流。细胞流向主要通道倾斜的一侧与其中鞘流具有更高流速的一侧相反。也就是说，当右侧鞘缓冲剂32比左侧鞘缓冲剂31流得更快时，细胞线路在主要通道内朝着流的左侧偏斜，如图3a-b所示。然而，左侧鞘流也可具有更高的流速，从而推动细胞线路朝着主要通道的右侧偏斜。图3a-b还示出了荧光检测器34和光学开关35。荧光检测器被用作决定哪种细胞要被分选的机构，并且将在下文中进行详细的讨论。从图3b显而易见，有效的分选涉及使细胞移动跨越分流面，从离开分叉接合点到达荧光阴性非靶细胞微流体通道36的流动物流进入离开分叉接合点到达荧光阳性靶细胞微流体通道37的流动物流。鞘缓冲剂流速的操纵可以通过以下手段来实现：使用直接驱动泵、气压泵送、电动学、毛细管作用、重力或其它产生流体流的手段来单独地控制各自侧通道内的流速，或者通过特别地设计微流体鞘网络，通过小心地平衡每个微流体通道内的压力降以保证发生中央流(50/50分流)或偏流。

一个可供选择的实现所有细胞在荧光检测44之前从主要通道内的输入流40优选流入一个输出微流体通道即荧光阴性通道46的手段是：使用相等的鞘缓冲剂流速41和42获得中央挟缩，然后通过从分叉接合点相对于荧光阳性出口47具有更大的容积流体流动进入荧光阴性出口46，使细胞优选偏流进入荧光阴性通道。这一手段如图4a-b所示，其中左侧出口46比右侧出口47宽。这一构型有效地将分流面43布置到位于中央的细胞流的右侧。因此，在细胞处在所需位置时，然后使用光学开关或流体开关45将靶细胞转移跨越分流面进入右侧的靶细胞荧光阳性出口。这一手段通过右侧出口比左侧出口宽而是同等有效的，凭此靶细胞通过光学开关或流体开关被转移跨越分流面，所述分流面现在处在位于中央的细胞流的左侧，并因此被分选进入左侧出口。因此，通过特别地设计微流体通道出口网络，或者通过积极地控制在各自的出口内的出口反压，可以控制细胞流入所需的出口。

无论是使用中央流还是使用偏离流，集中的细胞流与流体分流面的各自的距离最终支配为实现可靠的切换所必需的细胞的位移大小。这进一步支配为实现可靠的光学切换所要求的激光线的长度和激光功率或为实现可靠的流体切换所要求的气动脉冲的振幅和持续时间。细胞流与分流面越靠近，则所要求的位移越短，分选过程变得更有效。为了被分类群的纯度增强和为了高通量，单向布置的单一开关，其作为光学开关或流体开关，要求样品流偏离分流面。以这种方式，错误分选的发生率最小化。对于大小不均匀的样品，诸如其中细胞和碎片的直径可从1微米到50微米不等的原代组织的单一细胞悬浮液，以通量为代价促成更大的偏离是有利的。对于更加均匀的样品例如细胞线或聚苯乙烯小珠而言，可选择更小的偏离以允许更大的通量。

作为所述设计的一种可供选择的方案是使用双向光学开关，其采用两个激光线。采用这一手段时，一个激光线分选所需细胞到一个出口，另一个激光线分选所有其它的细胞进入另一个出口。这一手段可以与图2所示的50/50分流构型或图3和图4中所示的偏移分离构型使用。在后一种情况中，当细胞不在切换区域内时，可以选择在激光的两个位置状态下任一个开着该激光，或者还可在此期间断续该激光。光学开关还可如下被制成双向光学开关：具有两个刚好位于分叉接合点上方的、入射在切换区域的镜像激光线，其独立地开启以引导细胞到从分叉接合点发出的两个出口中的任何一个。

在1×2微流体网络中使用激光线的双向光学开关的图解如图5所示。类似的双向光学开关还可使用被引导到通道任一侧的激光光点得以实现，如图6所示。与单向光学开关相同，单一激光源可用在双向光学开关中，或者，双向光学开关可使用两个独立的激光源。双向设计相对于单向设计可能提供一定的性能益处。第一个益处是纯度可能最大化，因为每个细胞都被激光所引导。第二个益处是流体流被简化，因为相等的流可以被引出自两个输出端口的每一个，代替使用一定的预定流比率。

尽管至此在本说明书中只考虑了流过一个输入主要通道进入分叉点到达两个出口的1×2微流体通道设计，但是也可使用具有1×N或M×N个输出的微流体网络”。在这些更大的网络中，通过具有任意大量的独立调制的激光线或独立的横流通道可以实现光学切换或流体切换。一些实施方案如图7a-c所示。另外，细胞还可通过相同的分选仪被回料多次以增加被分选细胞的纯度，或者，通道还可以用于多级分选的级联被布置。

当操作单向布置或双向布置的光学开关时，可以考虑两种不同的激活方式：被动方式或主动方式。被动方式为使得光学开关的状态是开启状态或关闭状态，与什么细胞可流过该通道无关。在该情况下，不要求知道细胞什么时候进入切换区域或有多少细胞进入切换区域，因此，根据激光的状态，在切换区域内的所有细胞被切换。作为替代，在主动方式下，细胞首先在其进入检测/选择区域时被检测，然后根据一定的判定过程被切换。图3a-b和图4a-b显示了这一方式的例子，该方式使用刚好被布置在切换区域之前的荧光检测器。在该情况下，所有的荧光细胞被引导到一个出口，并且所有的非荧光细胞被引导到另一个出口。用于判定过程的其它的非荧光检测/选择技术包括飞行时间(Time-Of-Flight)，散射，成像，电容或任何可鉴定所需细胞的检测方式。与检测/选择方法无关，可采用使用主动方式的切换，以根据一定的判定过程将一个细胞群与另一个细胞群分选开。

为了利用主动方式，光束必须被调制为响应判定过程而是开启或关闭的。与所用的激光数目无关，或无论光学开关是单向的还是双向的，激光可以多种方式进行调制，所述方式包括使用电光调制器，调制激光功率，断续激光，使用液晶调制器，使用检流计和使用声光调制器。对于使用两个激光的双向光学开关而言，单独的激光可独立地被开启或关闭；然而，当使用单一激光源时，光学开关线路的两个不同取向可通过使用偏振旋转器(诸如液晶调制器)并且两个不同线路图形中的每一个是两个单独偏振中的每一个得以实现。类似地，可以使用声光调制器或检流计反射镜来调节被用作光学开关的单一光点的位置，或者可以使用双轴声光调制器或双轴检流计反射镜来绘制两个被用作双向光学开关的不同的线路形状。

图8显示了为进行光学开关的调节和/或断续而作的三种不同的可能的光学设计。在图8a中，从朝着并通过液晶调制器(LCM)被引导的单一光束(激光)来制造双向光学开关。LCM是偏振旋转器，因此，如果光束在一个方向被偏振，其将直线穿过偏振分束器(PBS)，穿过圆柱形透镜产生线形，穿过另一个PBS，然后穿过一些聚焦光学器件，所述聚焦光学器件将线聚焦到微流体切换区域上。这有效地产生单线的双向光学开关，其用于将细胞切换到分叉的通道输出之一中。为了将细胞切换到另一个出口中，必需产生镜像线。这通过旋转改变光束偏振的LCM得以实现。因此，当光束入射在第一PBS时，其被引导进入另一路径：其通过不同的圆柱形透镜(产生线形)、穿过另一个PBS，其引导光束返回通过聚焦光学器件，所述聚焦光学器件将镜像线聚焦到微流体切换区域上。需要注意，使用圆柱形透镜来产生用于双向光学开关的线形；作为替代，可除去圆柱形透镜，产生用于光学开关的光点。在图8b中，不使用LCM和PBS的组合，可以使用声光调制器(AOM)，在有或者没有圆柱形透镜下，产生用于双向光学开关中的线或光点。这通过构建AOM以获得所要求的所需线形得以实现。另外，可使用AOM以开启/关闭的方式来断续光束，将光束引导到用于光学开关关闭条件的光阑。图8c显示了在图8a和图8b中所述的系统的组合。可以使用任何构型来代替AOM，所述任何构型采用AOM来改变光束的方向，根据所需的光束运动而采用单轴或双轴的检流计反射镜。

当实现单向或双向光学开关的最佳切换效率时，可以考虑光学图形的多种变化。如上所述，激光线已被用作光学切换图形。激光线可以通过以下技术被产生：圆柱形透镜，扫描检流计反射镜或声光调制器，衍射光学，定制折射光学，或任何其它技术。迄今为止，已经使用圆柱形透镜，通过扫描检流计或通过使用声光调制器来产生激光线。激光线的长度可以为任意长度或者可如同单一点那样短。激光线可在线顶部具有更高的强度并且强度朝着线末端逐渐变小。另外，激光线可能是曲线弧形，其使细胞的输出方向最佳化。另外，激光线的角度或形状可以实时改变(即旋转以实现输出的最佳化)。对于使用多个出口的实施过程，可能产生任何的任意模式的2D空间激光线以实现每个输出细胞的方向最佳化。作为替代，激光线可由离散光点阵列产生。

为了进一步改善分选机构就通量、收率效率和纯度方面而言的性能，已经构建了光学开关从而使得当被选择细胞朝着分叉接合点沿主要通道流下时，激光光点与被选择细胞并排扫描，从而增加在细胞和激光之间的总的相互作用时间。光学开关使用的激光光点以直线沿着主要通道的长度朝着分叉接合点向下平移。由光点扫描的线可与主要通道的壁平行(图9a)或者可相对于细胞流动物流呈一定角度(图9b)。因此，所述角度可为0-90度。扫描光点的能力使用AOM或扫描检流计反射镜得以实现。以使用荧光或其它可以鉴定所需细胞的检测方式例如飞行时间、散射、成像或电容技术进行所需细胞的检测为基础的判定触发光学开关进行扫描。细胞位置在主要通道中可以是偏离位置或中央位置，其支配了由光点扫描的线的长度和用于实现有效切换/分选的激光功率。因此，当检测到所需细胞时，光学开关被开启，并且光点与所需细胞并排显现。然后光点与被选择细胞并排沿轨迹而行，并使用光学力来引导被选择细胞进入所需的出口。

如下描述了两种帮助有效触发光学开关或流体开关的手段。两种方法都典型地使用时间信号(temporal signal)来分析移动细胞，并使用该信息来产生切换或不切换的判定。该时间信号基本上是作为时间函数的信号的测量值，其可以就峰强度和峰宽度两方面而言获得特征性的时间指纹。该信号可以是荧光，散射(例如正向散射)，电容，成像或任何可以鉴定所需细胞的方式。一个手段是采用与两个或更多个检测器结合的单一激光源以实现细胞检测和细胞鉴定两方面。图10a-d显示了这一使用与荧光检测器和正向散射检测器组合的一个激光源的手段。由这些检测器得到的时间信号被用作切换判定的信息。细胞的存在由正向散射信号进行检验并且当该信号与处在预定范围内的荧光信号强度结合时；则该“门控”信息用于触发光学开关。需要注意，仅仅显示了单一的荧光检测器，然而可使用多个荧光检测器用于进一步细化细胞鉴定。在所述的情况下，采用相等的流速鞘缓冲剂使细胞流位于中央，使用具有不同宽度的出口在细胞流的右侧产生分流面。然而，如上所述，可以使用任何构型来操控细胞流和分流面的位置。另外，两种构型都存在验错检测器，其检验细胞是否被切换或未被切换。在该情况下，检测可以基于荧光，散射(例如正向散射)，电容，成像或任何可以鉴定所需细胞的方式。

图10a-b显示了当分选参数是阴性的并且光学开关或流体开关未被触发时，检测器布置和时间选择/触发器图解。这些细胞进入主要流体通道并且通过来自两侧的鞘缓冲剂被集中成为单行。当细胞行进经过检测/选择区域内的激光时，同时或几乎同时检测到荧光信号和正向散射信号。尽管细胞的存在成功地被正向散射信号检测到(在时间t₁)，但是荧光信号低于门控水平，光学开关不被触发(在时间t₂)。因此，不获得验错信号(在时间t₃)，因为没有细胞被切换。作为替代，图10c-d显示了当分选参数是阳性的并且光学开关或流体开关被触发时，检测器布置和时间选择/触发器图解。这里，当细胞行进经过检测/选择区域内的激光时，再次同时或几乎同时检测到荧光信号和正向散射二者(在时间t₁)，但是荧光信号处在门控水平内，并且光学开关或流体开关被触发(在时间t₂)。获得验错信号(在时间t₃)，因为细胞被切换。在该方法中，触发时间(在时间t₂)是从初始检测时间(t₁)起测量的预设值(Δt)，并且该Δt值由细胞的速度和光学开关相对于检测/选择区域的位置进行确定。该方法满意地实现了有效分选；然而作为进一步改善触发精度的手段，使用了第二方法。

图11a-d显示了该第二方法，其中使用了两个激光源而不是一个激光源。另外，如同如上所述的单一激光方法一样，得自这些检测器的时间信号被用作用于切换判定的信息。在检测区域中使用一个激光以在鉴定/选择区域之前单独地实现细胞检测。在该情况下，检测可以基于荧光，散射(例如正向散射)，电容，成像或任何可以鉴定所需细胞的检测方式。第二激光与两个或更多个检测器结合并用于实现细胞检测和细胞鉴定。另外，在该情况下，鉴定可以基于荧光，散射(例如正向散射)，电容，成像或任何可以鉴定所需细胞的检测方式。用于两个按序细胞检测步骤的目的为使得细胞流速可以得自在第一检测(在时间t₁)和第二检测(在时间t₂)之间的时差(Δt)。已知检测器窗之间的间距(d)将获得流速(v＝d/Δt)，然后使用该值与得自鉴定窗的光学开关或流体开关的已知距离(x)相组合，计算光学开关的触发时间(t₃＝x/v)。另外，当获得了用于细胞鉴定步骤的特定门控水平时再次发生切换。尽管只显示了单一的荧光检测器用于鉴定，但是可使用多个荧光检测器。在所述情况中，采用相等流速的鞘缓冲剂使细胞流位于中央，使用具有不同宽度的出口在细胞流的右侧产生分流面。然而，如上所述，可以使用任何构型来操控细胞流和分流面的位置。另外，两种构型都存在验错检测器，其检验细胞是否被切换或未被切换。在该情况下，检测可以基于荧光，散射(例如正向散射)，电容，成像或任何可以鉴定所需细胞的检测方式。

图11a-b显示了当分选参数是阴性的并且光学开关或流体开关未被触发时，检测器布置和时间选择/触发器图解。这些细胞进入主要流体通道并且通过来自两侧的鞘缓冲剂被集中成为单行。细胞的存在当其经过检测窗区域时由正向散射信号(在时间t₁)检验。当细胞经过鉴定/选择窗时，获得第二正向散射信号(在时间t₂)，然而，该信号与未处于门控水平内的荧光信号强度(在时间t₂)结合，并且光学开关或流体开关不被触发(在时间t₃)。不获得验错信号(在时间t₄)，因为没有细胞被切换。即使不分选细胞，使用(t₁)、(t₂)以及检测和鉴定窗之间的已知距离(d)获得细胞流的流速(v)。这使用以下关系式被获得：Δt＝(t₂)-(t₁)和v＝d/Δt。

作为替代，图11c-d显示了当分选参数是阳性的并且光学开关或流体开关被触发时，检测器布置和时间选择/触发器图解。这里，细胞的存在当其经过检测窗区域时再次由正向散射信号(在时间t₁)检验。当细胞经过鉴定/选择窗时，获得第二正向散射信号(在时间t₂)，然而，该信号与处于门控水平内的荧光信号强度(在时间t₂)结合，并且光学开关或流体开关被触发(在时间t₃)。现在获得验错信号(在时间t₄)，因为细胞被切换。在该方法中，触发时间(t₃)不是预设值，而是使用细胞流速率(v)和在光学开关和鉴定窗之间的已知距离(d)计算触发时间。这使用以下关系式被获得：Δt＝(t₂)-(t₁)；v＝d/Δt；(t₃)＝x/v。该方法允许更有效地进行分选，因为其可解决细胞流速的波动，并因此更精确地触发光学开关或流体开关。该方法对于光学切换的附加益处是，对于每个单独的细胞而言，有可能调节激光光点沿着通道下移的速率，从而使得其与如上测定的细胞的速度匹配，从而使细胞和光学开关的激光光点之间的相互作用时间最大化。激光光点的转移速度将通过改变AOM的驱动器而被改变。

另一个改善分选效率并同时引入如上所述的触发方法的方法是使用通道设计使细胞集中在主要通道中，所述通道设计产生真实样品核心，从而该核心被鞘缓冲剂完全包围。细胞沿着通道高度的位置的变化性可引起细胞检测和荧光强度的变化性。确保细胞处于主要通道中央的核心流中可改善分选效率，因为这使得由于细胞径向分布所导致的任何变化性最小化，并控制细胞需要移动以实现有效分选的距离。这种核心流可以使用鞘缓冲剂进行输入流物流的2维挟缩得以实现。

该方法要求底部基底和顶部基底；每个在其中形成有微流体通道网络。图12a-b和图13显示了实现这一目的的方法，其中在一个基底上的通道设计是在另一个基底上的设计的镜像。因此，当两个基底组装在一起时，采用彼此相对的通道设计，通道网络覆盖并形成完整的流体导管。图12a-b显示了采用这一方法的一种设计类型，样品通道显示为虚线。该方法的关键特征是保证样品通道比鞘通道更浅，从而使得当基底被组装在一起时样品导管似乎作为孔进入接合点。这如图13所示，其中可观察到细胞进入接合点，然后从四面被挟缩，产生样品核心，其流入主要通道的中央。需要注意，通道可通过湿法化学腐蚀或激光蚀刻玻璃或石英而形成，或者通过在塑料或聚合物中进行成型或压花而形成。

另一种方法涉及具有一系列交叉通道，其被布置为使得在第一个接合点/交叉点，细胞被垂直朝着主要通道的一个壁推动，下一个接合点/交叉点强迫该细胞流垂直进入主要通道的中央，然后在第三个接合点/交叉点处来自两侧的最终挟缩流在主要通道内流动的样品中央的周围产生完整的鞘缓冲剂覆盖物。这如图14和图15所示，一个可能的通道图解如图16所示。在该实施例中，在接合点(A)处，样品从顶部基底流入该接合点并向下流入位于底部基底内的通道，其中侧鞘缓冲剂从侧向流入接合点。样品当其继续朝着下一个接合点(B)流动时被稍微集中和推到底部通道的上壁。在接合点(B)处，样品沿着底部通道的顶部从接合点A流到接合点(B)。此时第二个鞘缓冲剂从顶部基底流入接合点(B)并且样品被向下推到位于底部基底内的通道的中部。样品继续沿着底部通道的中部朝着下一个接合点(C)流动。此时第三个鞘缓冲剂从两侧流入接合点(C)，并且样品被挟缩成为单行。样品现在当其继续流动时作为样品核心被鞘缓冲剂所包围，在主要输入通道内水平地和垂直地位于中央。

另一个方法采用其轴与1维鞘缓冲剂垂直的浅通道，以使抛物线速度色散的影响最小化。在微流体通道内的1维流集中期间，入口中央物流中的粒子或细胞仅沿着一个方向被挟缩。在与挟缩和流向垂直的方向，仍然保留抛物线速度模式。靠近通道中央的粒子流动快，而靠近通道壁的粒子流动慢。结果是，粒子或细胞以使检测事件和切换事件的同步化变复杂的速度分布沿流通道下移。图34显示了克服在1维微流体流集中期间的固有问题的方法，使用在垂直方向上可与粒子或细胞的粒度相比的通道深度。例如，粒子或细胞的直径为10微米，则通道深度可以是15微米。在该情况下，粒子或细胞占据通道深度方向的大部分，从而使得它们经历使速度分布得以平均并使通道内的速度色散变窄的速度。

在图1-16中所述的所有的微流体通道网络设计已经利用传统的光刻掩模和被掩模玻璃基底的等向性蚀刻在玻璃基底中被产生。等向性蚀刻典型地产生这样的微流体通道，即该微流体通道在通道中央具有深度d_e和在通道的顶部具有宽度w＝w_p+2×d_e，其中w_p是限定通道的光刻图形的宽度。通道的底部轮廓在每个边缘由于等向性蚀刻而具有半径为d_e的四分之一圆轮廓并且被蚀刻通道的顶部是敞开的。玻璃基底，典型地是玻璃盖玻片，被热结合到具有被蚀刻的微流体通道的基底上，以密封通道的顶部并完成微流体通道网络。在热结合之前通常在顶部基底内转孔，以提供用于流体流进入和外出到微流体通道网络的通孔，但是，作为替代，也可在被蚀刻的底部基底内而不是在顶部基底内钻孔。通道的深度d_e根据化学蚀刻过程的速率和蚀刻步骤的持续时间的不同而异。微流体通道的深度典型地但非限制性地为10微米到100微米。微流体通道的宽度典型地但非限制性地为深度的2到5倍。这通过在光刻掩模上使用典型地但非限制性地为5微米到400微米的线得以实现。如前所述的，可使用其它的基底，诸如塑料或可成型的或可浇铸的聚合物。在这些情况下，微流体通道典型地具有矩形横截面，然而在别的方面却类似于在玻璃基底内的通道。其中产生微流体通道网络的玻璃基底的尺寸典型地但非限制性地为5毫米×5毫米到25毫米×50毫米，总厚度典型地但非限制性地为500微米到2毫米。顶部基底典型地具有相同的大小，厚度典型地但非限制性地为300微米到1毫米。通孔的直径典型地但非限制性地为200微米到600微米。完成的基底，具有微流体通道网络和被结合的覆盖板，该覆盖板具有通孔用于流体流进入和外出的流体孔，被称为微流体分选晶片或为了简便起见被称为晶片。

图1-16中所示的微流体通道网络通常只描述了入口微流体通道的局部几何形状，鞘缓冲剂挟缩接合点通道，细胞鉴定和光学开关主要通道，以及主要通道向出口的分叉点。该描述需要进行扩展以在各通道内提供区域以在宏观尺度流体装置或盒体内产生对储库的连接，其提供了与如上所述的通孔的接口，从而提供了流体流从网络的进入和外出。这些微流体通道中的每一个的横截面和长度需要经过调整以保证根据被选择以实现在通道内流动的技术的不同来控制在整个微流体通道网络内的流动。这些通道的横截面和长度二者都由用于生成光刻掩模的图形来确定。

图17显示了用于完整的微流体通道网络的掩模的一个实施方案，所述微流体通道网络具有进口通道，到T-挟缩接合点的两个鞘通道和从T-分叉接合点分出的两个出口。该掩模被设计用来提供7∶1的容积挟缩比率(鞘流速是细胞进口流速的七倍)。通道的长度被设计用来提供充分的压力降，使得能够使用标准的低流动性注射器泵或低压力气动控制器以确立流动。该设计还反映了为能够仅使用两个泵需要平衡压力，一个泵用于细胞进口通道和一个泵用于两个鞘通道，出口保持在大气压力下。鞘通道进口位于设计顶部的末端处，细胞进口通道开始处低于此，在两个鞘通道中央，并且足够长，从而提供被设置为7∶1挟缩比率的适当的压力降，并且两个出口位于底部左侧和右侧的末端处。

图18显示了并入了用于挟缩接合点和Y-分叉接合点的三角形接合点的另一种实施方案，其设计提供了10∶1的容积挟缩比率。该设计在其它方面与图17所示的设计是几何相似的。许多其它的设计明显是可能的，但是它们共有的共同特征是需要提供流体进入和外出以及为确立流体流所选择的方法提供适当的压力降和压力平衡。使用类似的设计条件产生用于制造如前所述的2维挟缩流网络的微流体通道网络的光刻掩模。

图19显示了在完整的微流体分选晶片中的微流体通道网络的优选的实施方案。确定了用于细胞样品流和用于鞘缓冲剂流的两个进口端口，鉴定了用于荧光阳性靶细胞和用于荧光阴性非靶细胞即废物的两个出口端口。晶片是24毫米×40毫米。被蚀刻基底的厚度是1.1毫米。被结合的覆盖板的厚度是550微米。微流体通道深50微米。细胞进口微流体通道宽110微米。鞘流和出口微流体通道宽150微米，主要微流体通道也是如此。鞘流挟缩接合点是颠倒的等边三角形，每边长300微米，在接合点的顶部通过三角形的底边将细胞进口通道与在接合点的底部通过三角形的顶点连接于来自主要通道每侧的两个鞘流挟缩通道。该微流体通道网络设计经过最佳化以在所有四个端口处都使用液流的气动控制以建立网络流。

微流体连接到晶片可采用多种方式。一个方式是使用直接连接到端口的挠性微流体管道，通过胶粘或使用各种可在端口处附着于晶片表面的管道接合器。该管道可直接连接到注射器泵或类似系统，其为处置细胞样品和鞘缓冲剂提供了体积，并且为使这些体积流过晶片提供压力。使用用于处置样品体积的注射器泵要求泵被洗净并且再装载每个样品并产生携带一种样品或一种样品对下一种样品污染的可能性。

用于微流体连接到晶片的改善的方法采用盒体，该盒体使用紫外线可固化粘合剂、PSA(压敏粘合剂)粘合片或其它传统的结合方法诸如热结合被直接附着于晶片上。该盒体具有四个嵌入式储库，其分别提供对细胞进口通道、两个鞘通道(得自一个储库)和两个出口中的每一个的接口连接。这种盒体提供了无菌操作细胞样品和被分选靶细胞和废物的可能性，因为它们可以在细胞分选之前和之后被完全地限制在该盒体的体积内。用于这种盒体和晶片系统的液流可以通过使用两个气压控制器被提供，所述气压控制器单独地加压细胞进口和鞘缓冲剂储库，以诱导流过晶片的微流体通道网络到达处于大气压力下的出口储库。

通过使用四个气动控制器提供了改善的流动控制方法，所述四个气动控制器单独地加压细胞进口、鞘缓冲剂、靶细胞收集储库和废物收集储库中的每一个。这种流动控制系统提供了单独地调节如前所述的在鞘挟缩接合点处的容积挟缩比率、调节主要微流体频道内的细胞流速用于荧光分析和光学开关、和调节在切换分叉点处的分流比以能够实现偏流的能力。

图20显示了自备式一次性盒体的优选的实施方案，该盒体为细胞样品体积、鞘缓冲剂体积和分别用于靶细胞和废物的两个出口收集体积提供了流体储库。盒体由丙烯酸类塑料制成或者可由机器制造或浇铸而成。如果适当，可用其它塑料或适当的材料代替丙烯酸类塑料。细胞样品体积通常呈锥形形状，朝着进口微流体通道的端口逐渐变细。在优选的实施方案中，进口储库包含聚丙烯嵌片以使细胞粘附最小化并因此使细胞收率最大化。将晶片用UV粘合剂粘合到光学窗口区域，并且来自晶片的出口端口与它们各自的储库体积接口。用咬对盖密封储库体积，该咬对盖具有钻孔，用于气动控制器和单个储库之间的连接。该盖包括硅橡胶垫圈以帮助抵靠盒体主体进行密封。还并入0.1微米的聚丙烯过滤器以在盒体体积和外界环境之间产生气体可透过、而液体不能透过的界面。这保持了盒体上的无菌条件并且使任何对使用者或仪器造成的生物危害污染最小化。

准备盒体以进行细胞分选：首先通过使用带有luer配合的普通注射器、用鞘缓冲剂溶液通过鞘端口添装微流体通道网络。以这种方式，通道经过添装并且鞘储库填充800微升并且每个出口储库填充200微升。细胞样品储库被吸出过量的缓冲剂液体，然后使用移液管将5-25微升的细胞样品置于样品输入储库中。然后加上盒体盖并摁压到位，提供了其中进行细胞分选操作的自备式系统。

盒体被设计用来放置在支座上，该支座将晶片的主要通道布置为使得投射光学开关光束进入通道内的光学成象系统被适当地对准并聚焦进入通道。盒体支座还包括压力歧管板，该板具有4-6个端口，它们通过外部管道连接到四个气动控制器。每个歧管端口使用O形圈被密封到其各自的盒体盖端口上，并且这些密封使用凸轮-锁定机构通过对着盒体盖按压歧管而被制成是不漏的。图29显示了用于流体切换的盒体支座的优选的实施方案，其将两个气动阀集成在歧管上，以便缩短气动脉冲的体积和通路长度。无需介于其间的管道，歧管即可进行得自来源的气压与气压端口的接合。这使得可实现更快的切换速度用于更高的性能并增补了得自图27-28所示的切换构型的性能获益。

用于光学切换的光学系统的优选的实施方案如图21所示。将具有连接到咬对盖上的气动歧管的主体布置为使得光学切换区域位于从盒体上方看见的透镜系统和从下方看见的透镜系统二者的焦点上。将得自488nm激光的输出光束投射经过成像系统进入刚好位于分选区域上游的如图3-7和图9-11所示的主要通道内，以提供用于检测得自荧光阳性靶细胞的荧光的激发。荧光发射被同一透镜所收集并通过二向色镜和适当的荧光发射过滤器被成像到光电倍增管上。得自光电倍增管的信号通过电子设备进行处理以测量得自细胞的荧光水平并确定在主要通道内的流动物流中荧光阳性靶细胞的存在。荧光激发波长不限于488纳米波长，并还可以是适用于鉴定靶细胞的荧光团的任何波长。如果使用不同的激发光照，则荧光发射过滤器的波长必须相应地改变。当鉴定荧光阳性细胞时，电子设备触发AOM以引导得自IR-激光的、通常是得自在5W到20W输出功率之间的1070nm激光操作的光束在光学切换位置进入主要通道。在优选的实施方案中，AOM经过控制以产生如图9b所述的光学切换图形，尽管可以实施前面所述的任一光学切换方法。盒体下方的透镜将488纳米激发光照成像到光电二极管上。使用由该光电二极管检测的信号来帮助区别荧光标记细胞与可携带荧光标记的较小碎片，以及来鉴定可能形成的细胞块。这些事件作为用于分选到靶标出口的候选物被淘汰。

又一个优选的实施方案将引入适当的成像和光滤波，以根据用于激发荧光的488nm激光对细胞进行的照明提供正向散射信号。该光学装置将提供一定范围的角灵敏度，诸如但不限于用于正向散射信号探测的0.8°到10°的范围。该信号可以帮助表征除了荧光信号之外的细胞，而且帮助区别细胞与碎片。正向散射光照不限于荧光激发激光，并还可是由被适当地成像在主要通道内的附加光源所提供的任何其它的波长。

又一个优选的实施方案将并入另外的荧光检测通道，其对处于不同波长的荧光发射敏感，典型地对使用单一激发波长诸如但不限于488nm的荧光发射敏感。每个检测通道并入具有适当的二向色镜的PMT和用于另外的荧光团的荧光发射波长的发射过滤器。以这种方式可容易地容纳二到四个荧光检测通道。以这种方式使用超过一个的荧光团提供了多重检测标准的能力，从而鉴定使用光学开关进行分选的靶细胞。

又一个优选的实施方案将并入验错能力，其提供了光学照明，典型地作为跨越网络内的通道之一的窄线，并且典型的处于更长的波长下，但不限于得自固态激光器的785nm波长，其处于用于荧光检测和正向散射检测的波长范围以外，但是比典型地处于1070nm处的光学开关波长短。该光源可被适当地成像在微流体通道网络中以提供可用于检测经过网络内任何垂直平面的粒子行程的线。其提供了另外的检查光学开关性能的性能的能力并提供了另外的如图11所述的用于光学开关的触发器的时间选择的能力。

光学系统的又一个优选的实施方案将并入另外的处于但不限于750nm的光学照明，例如，通过对得自LED的光进行带通滤波所生成的光学照明，并使用该光照明微流体通道区域。该区域将通过750nm的带通滤波器成像到CCD摄像机上，以提供对在微流体通道网络内在分叉接合点处和/或在挟缩接合点处流动的细胞的性能的目视观察。在摄像机之前的滤波器将足够阻断与荧光的激发或检测有关的和与正向散射/侧向散射光学装置和误差检测光学装置有关的任何更短的波长辐射。滤波器还阻断得自光学开关的具有更长波长1070nm的光。

图20所示的盒体的优选的实施方案被设计用来保持微流体通道网络为水平构型，从而使得所有的通道和进口/出口端口处于相同的垂直水平。这使得重力对通过微流体通道的压力降的影响最小化，导致在网络内的更稳定的和更可控的流动。然而，重力仍将对流体内细胞具有影响，特别是当细胞从细胞样品储库通过进入细胞进口微流体通道时。为了帮助控制重力对细胞在该储库中的沉降的影响和重力对细胞在挟缩接合点处的细胞流速增加之前在进口微流体通道内的相对更慢的流体内的沉降的影响的分选仪的优选实施方案是增加细胞的浮力，从而使得细胞的沉降最小化。增加浮力可以通过在样品缓冲剂中使用添加剂来完成。这些流变控制添加剂的实例，特别是具有假塑性或剪切稀化或二者的那些，为黄原胶，鹿角菜胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基瓜尔胶，阿拉伯树胶，黄蓍树胶，藻酸盐，聚丙烯酸酯，卡波姆。其它添加剂包括Histopaque^TM，其是聚蔗糖和泛影酸钠的混合物，和Optiprep^TM，其是碘克沙醇在水中的60％w/v的溶液。这些添加剂的使用浓度根据被分选细胞的密度的不同而异。例如，在Optiprep^TM的情况下，浓度可为5％到40％。最后，样品缓冲剂的盐度和蔗糖的添加还可用于调节细胞的浮力。

用于细胞样品体积和用于鞘流的缓冲剂可以是与被分选细胞是生物相容并且与用于荧光检测模式和用于光学开关的光学照明相容的任何缓冲剂，也就是说，该缓冲剂在荧光激发波长/检测波长和光学开关波长处具有足够低的吸光度。鞘缓冲剂的优选的实施方案使用PBS/BSA，一种具有1％牛血清清蛋白(BSA)级分5的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2。细胞缓冲剂的优选的实施方案使用具有14.5％Optiprep的PBS/BSA用于活细胞样品和具有27％Optiprep的PBS/BSA用于各种福尔马林固定的细胞样品。

通过如前所述的分选的通量、纯度和回收率评价了在微流体通道网络中的细胞分选光学切换方法的性能。图20所述的盒体经过最佳化以允许测量所述性能，因为其由丙烯酸类塑料制成，靶标收集储库和废物收集储库的底部是透明的，并且可使用倒置荧光显微镜对被分选进入这些储库的细胞就数目和荧光标记两方面进行定量表示。评价了如图3-11所述的几种开关构型。这些评价使用活HeLa∶HeLaGFP细胞的50∶50的混合物进行，该混合物使用1侧或2侧固定激光光点或0°或8°1侧激光扫描进行分选。激光在240Hz下进行扫描。激光开启时间是4毫秒并且对于所有的切换模式而言激光功率是20W。对于扫描光点方法而言，聚焦的IR激光光点沿着主要通道移动约70微米。

如图22所示，如图6所示的采用激光光点的双向光学开关，对于靶细胞-非靶细胞的50∶50混合物而言，在高达50个细胞/秒的通量下，提供了良好的纯度和回收率的结果。然而，在更低的亚群浓度(未显示数据)下，激光功率不能有效用于切换非靶细胞，并且重合误差在更高的细胞通过速率下增加。另外，未被切换的小粒子将污染靶标储库。

图22还显示了图9所示的1侧切换方法的性能，其具有固定激光光点或在流动方向上与液流平行或与流呈轻微角度移动的光斑。样品核心流动物流偏离到废物出口，从而使得在缺乏光学开关下所有细胞被默认流入废物出口。这些方法都提供了改善的性能，如图所示。这两个方法的性能交叉的事实暗示了光学开关的触发不是最佳的，并且暗示了如图10和图11所示的光学开关的主动触发将改善性能。

图23显示了在1×2(即具有一个主输入通道和从分叉接合点伸出的两个出口的网络)中用来分选细胞或粒子的气动流体开关的一个实施方案。分叉接合点的“Y”几何形状如图23所示，但是还可使用其它分叉诸如“T”几何形状。通常，这些微流体通道在光学透明基底中被形成，从而能够将细胞检测光学装置投射进通道中。该基底典型地，但非限制性地，为玻璃，石英，塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等等，和其它可浇铸的或可使用的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8)。微流体通道的深度典型地，但非限制性地，为10微米到100微米。微流体通道的宽度典型地，但非限制性地，为深度的1到5倍。在通过玻璃基底的光刻掩蔽、然后进行通道的等向性蚀刻来制造微流体通道的情况中，横截面典型地是矩形，或带有四分之一圆角的矩形。

流动条件被设置为使得气压P0＞P1＞P2并且在流体中的细胞优先从最高压力到最低压力流动。当压力P1增加，使得P0＞P2＞P1时，则流体流被扰动并当流体优先流下“Y”接合点的相反支路时重新建立平衡。该系统可通过修复P0＞P1＞P2的关系而恢复其初始状态。

就通量(进入分叉接合点顶部的分选区域的细胞的时间率)而言的分选机构的性能受到如图23所示的流体向后-蔓延的限制。当流体开关被激活时，在建立新的流径之前观察到粒子运动的方向倒转和向上游流动。由这一运动所诱导的时间延迟限制了切换速度以及实现可接受的收率效率(在靶标出口内靶细胞的分数)和纯度(在靶标出口内靶细胞数/总细胞数的比率)的事件的频率。

图24显示了在1×2微流体通道网络(即具有一个主输入通道和从分叉接合点伸出的两个出口的网络)中用来分选细胞的双通道流体开关的一个实施方案。分叉接合点的“Y”几何形状如图24所示，但是还可使用其它分叉诸如“T”几何形状。在分析区域和分叉接合点之间布置了一双横流通道。横流通道在尺寸上可为对称的，或者一侧大于另一侧以支持在一个方向上的更快切换。通常，这些微流体通道在光学透明基底中被形成，从而能够将细胞检测光学装置投射进通道中。该基底典型地，但非限制性地，为玻璃，石英，塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等等，和其它可浇铸的或可使用的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8)。微流体通道的深度典型地，但非限制性地，为10微米到100微米。微流体通道的宽度典型地，但非限制性地，为深度的1到5倍。在进行玻璃基底的光刻掩蔽、然后进行通道的等向性蚀刻来制造微流体通道的情况中，横截面典型地是矩形，或带有四分之一圆角的矩形。

流动条件被设置为使得当流体开关(在该情况下得自气压)被关掉，从而在接合点区域内的压力P3＝P4时，所有细胞将优先地流入出口之一，例如右侧的出口。当流体开关在改变压力使得P3＞P4下被打开时，流体塞位移了流动物流，从而使得靠近流体塞的细胞被引导进入左侧出口。在微流体通道网络中流动条件的设置和控制可以通过直接驱动泵、气压泵送、电动学、毛细管作用、重力或其它可产生流体流动的手段来完成。

就通量(细胞进入分叉接合点顶部的分选区域的时间率)，收率效率(靶细胞在靶标出口12内的分数)和纯度(在靶标出口12内靶细胞数/总细胞数的比)而言的分选机构的性能，受到各种因素的影响，每个因素影响光学切换的执行。流体切换可用诸如以下的若干参数来表征：被投射进入微流体通道网络的分选接合点区域内的压力差(P4对P3)，切换通道相对于分叉接合点的位置，流体切换激活的持续时间，用于产生流体位移的最大压力等等。流体开关的这些参数的特定值的选择尤其是由以下决定的：微流体通道系统的拓扑学和几何形状，微通道系统内的流速(细胞速度)，控制在主要通道内流动细胞位置的能力(细胞是在主要通道的中央流动还是偏离到一侧流动)，实现可靠切换所必需的细胞位移的量，通道的深度，通道的形状，和细胞与光学开关相互作用所产生的力。

图25显示了在1×2微流体通道网络(即具有一个主输入通道和从分叉接合点伸出的两个出口的网络)中用来分选细胞的单通道流体开关的一个实施方案。分叉接合点的“Y”几何形状如图25所示，但是还可使用其它分叉诸如“T”几何形状。单横流通道可位于在分析区域和分叉点之间的主要通道的任一侧上。通常，这些微流体通道在光学透明基底中被形成，从而能够将细胞检测光学装置投射进通道中。该基底典型地，但非限制性地，为玻璃，石英，塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等等，和其它可浇铸的或可使用的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8)。微流体通道的深度典型地，但非限制性地，为10微米到100微米。微流体通道的宽度典型地，但非限制性地，为深度的1到5倍。在进行玻璃基底的光刻掩蔽、然后进行通道的等向性蚀刻来制造微流体通道的情况中，横截面典型地是矩形，或带有四分之一圆角的矩形。

流动条件被设置为使得当流体开关(在该情况下得自气压)被关掉，从而在接合点区域内的压力为中性时，所有细胞将优先地流入作为侧通道的在相同侧上的出口，在该情况下为例如右侧的出口。当流体切换在改变压力使得P3＞P2下被开启时，流体塞位移流动物流，从而使得靠近流体塞的细胞被引导进入左侧出口。在微流体通道网络中流动条件的设置和控制可以通过直接驱动泵、气压泵送、电动学、毛细管作用、重力或其它可产生流体流动的手段来完成。

单通道流体开关的优选的实施方案如图26所示。偏流通过右侧通道比左侧通道宽得以实现。切换通道沿着其大部分通路长度也比主要通道宽，并且在流体插入点处逐渐变细。这降低了为通过在更小截面积上集中力来实现分选所必需施加的气压的峰值幅度。这允许进行更快的操作和改善的通量。

就通量(细胞进入分叉接合点顶部的分选区域内的时间率)，收率效率(在靶标出口内的靶细胞的分数)和纯度(在靶标出口内靶细胞数/总细胞数的比)而言的分选机构的性能，受到各种因素的影响，每个因素影响光学开关的执行。流体开关可用诸如以下的若干参数来表征：被投射进入微流体通道网络的分选接合点区域内的最大压力，切换通道相对于分叉接合点的位置，流体开关激活的持续时间等。流体开关的这些参数的特定值的选择尤其是由以下决定的：微流体通道系统的拓扑学和几何形状，微通道系统内的流速(细胞速度)，控制在主要通道内流动的细胞的位置的能力(细胞是在主要通道的中央流动还是偏离到一侧流动)，实现可靠切换所必需的细胞位移的量，通道的深度，和通道的形状。对于哺乳动物细胞，具有约50微米×150微米横截面并在20-50毫米的通路长度内具有0.5到1.0psi压力降的通道将实现每分钟1-5微升的流速并且使用1-3psi的切换压力足够实现每秒上百个事件的切换速率。为了普遍适用于100纳米到100微米的粒子，用于样品和鞘流的典型的压力降在10到100毫米的通路长度内为0.1到10psi。在目前的晶片设计中选择鞘：靶压力的比率为2∶1以确保样品物流的适当挟缩。通道横截面可被制成5到150微米深×10到1,000微米宽，根据流过晶片的细胞或粒子的类型的不同而异。

图27显示了双阀开关构型，其允许控制气压脉冲的最大压力，上升时间，下降时间和总时间以致动流体开关。三个端口可被连接到气压源、环境空气或真空。为了快速切换，P1被保持在大于环境空气的高压下，并且P2和P3保持在环境空气下。在中位下，两个阀都被关闭或关掉。当需要切换事件时，第一个阀被打开，其施加气压到切换通道。在短暂延迟(例如小于5-10毫秒)后第二个阀被打开，其迅速将逾量压力从P1排放到端口P3以外。第一个阀被关闭以在切换通道内排放剩余压力到环境水平，然后第二个阀被关闭以使得系统返回其中位。这使得气动脉冲比单阀的关-开-关循环时间(例如约5到10毫秒)更短。选择比所需的最大压力高数倍的压力P1(例如对于具有所需的2psi峰值的脉冲为8psi)并与在端口P2和P3处的环境空气或真空相结合，气压脉冲可具有用于流体开关的最大性能的形状。

图28显示了用于如24中所示的双通道流体开关的双阀构型。在第一通道中，单一阀调节高压源，并且第二通道处于环境空气中。在该构型中，由阀的关-开-关循环周期(例如5-10毫秒)决定最短可能的脉冲。在第二构型中，阀位于流体开关的每个侧通道上。在该情况下，两个阀都可被用于调节外部压力源。在比阀的关-开-关循环时间更短的可变时间延迟后，在第一个阀之后可开放第二个阀。以这种方式，可缩短气压脉冲以增加流体开关的速度和性能。

已经构建了基于完整的流体开关的细胞分选仪器。使用该仪器获得的测量结果的实例如图30-31所示。在图31中，测量了荧光校准小珠(例如Spherotech SPHERO小珠或BDQuantibrite小珠)并显示了两个强度的明显分离。平均强度、标准偏差和CV统计学与制造商推荐值是一致的。图31显示了分选细胞群的实施例。在该实施例中，用CellTracker^TMGreen(Invitrogen Corp.)染色的1％Jurkat细胞的靶标群掺入未被染色的Jurkat细胞群。细胞使用对样品为0.3psi的压力，对鞘缓冲剂为0,6psi的压力和对切换阀为1.5psi的压力进行分选。约35000个细胞经过分析并且336个靶细胞被鉴定和分选进入靶标孔内。对靶标储库的检查发现了在共369个细胞中有331个靶细胞。这得到了经计算为99％的回收率和90％的纯度。

为了操作微流体晶片，对所有微流体通道进行最初的流体添装要求以不截留气泡或引入尘粒的方式进行，所述气泡或尘粒对流造成阻滞。这需要在稳定的气压下从洁净的高加压空气源施加可重现体积的空气。一般，无尘系统如净化操作台或层流洁净橱是添装微流体装置所必需的。如图32所示的装置，即添装站，以简单的和经济的方式满足了这些要求。添装站上的夹钳物理地保持盒体并提供了用于高压进入的密封。小型的亚微米孔隙过滤器附着于夹钳上以无尘方式向填充有流体的储库供应高压空气。可使用可拆除的注射器提供可控体积的空气或可使用连接到高压源的自动阀。这在整个微流体通道内均匀地分配了预定体积的不含气泡的流体。

图33显示了用于监控生长和分离克隆群的细胞稀释克隆法。具有几个纳升体积的微孔可使用多种材料制造，所述材料包括，但非限制性地，玻璃，石英，塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等等，和其它可浇铸的或可使用的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8)。微流体通道的深度典型地，但非限制性地，为10微米到100微米。微流体通道的宽度典型地，但非限制性地，为深度的1到5倍。在进行玻璃基底的光刻掩蔽、然后进行通道的等向性蚀刻来制造微流体通道的情况中，横截面典型地是矩形，或带有四分之一圆角的矩形。纳米孔阵列的实例如图33所示。在该情况下，孔是100微米×100微米正方形，深度为70微米，并是使用PDMS柔性光刻法制造。该孔在等离子体中进行灭菌并被插入24孔组织培养板中。将悬浮在介质中的细胞装载在各孔内并通过重力沉降在纳米孔内，其中它们可被定期进行监控以观察生长动力学或在单一时间点收获优选的克隆集落。这些孔还可作为固定元件或作为可移动嵌片被并入分选装置的输出储库内。

图35显示了在多相微流体小滴内进行细胞/粒子计数(例如被囊封在微流体通道内的小滴内的细胞/粒子)的光学检测方法。施加适当的信号处理，可以基于得自细胞/粒子的信号峰值检测小滴内的细胞/粒子数。在一个方法中，将整个通道进行照明并且单一检测器测量了信号诸如正向散射信号，其指示了在小滴内存在或不存在细胞。更复杂的检测采用跨越通道并与流向垂直布置的正向散射检测器阵列，以便为计数和局部化小滴内的细胞/粒子提供更好的空间分辨率。在又一个方法中，可对单一检测器散射测量附加暗场照明和成像。当正向散射信号检测小滴的前沿时，CCD摄像机可以同步化以获得小滴的暗场像。细胞/粒子在图像中将是亮点，其可经过加工和鉴定用于计数。

在许多分选情况下，细胞或粒子的靶标群可能较小，但是收集储库的表面积较大。粒子可能粘住储库壁，这降低了收集效率。图36显示了使细胞或粒子与表面的相互作用最小化的手段。在一种方法中，将被分选靶细胞收集在封闭区域内，该封闭区域比流体位移了更小的体积，使得在细胞和收集储库壁之间的接触最小化。由于表面张力，被收集的液体在封闭区域上形成被润湿的小滴。在另一种方法中，收集储库的表面可通过涂布基于烃或氟烃的硅烷化而变得疏水。因为疏水性涂层，被收集的含细胞或粒子的液体将被封闭在接近出口孔的小滴内。在另一种方法中，可使用单独配合但是可拆除的容器来收集被分选细胞。该单独的容器可用于进一步处理细胞，其将使细胞损失最小化，同时将被分选细胞从收集储库转移到另一个储库(例如多孔培养平板)中。收集容器在底部具有通向微流体装置内的出口孔的孔。孔的直径可低于一个毫米，从而表面张力防止通过该孔发生渗漏。由柔软材料(例如基于硅氧烷的橡胶，PDMS)制成的衬垫被插入到收集容器和微流体装置之间用于密封和结合。

通常希望在细胞计数分析后回收样品。图38显示了微流体装置，其挟缩细胞流用于分析但是以更低的稀释度回收细胞。样品使用如图2和图38所示的鞘缓冲剂进行集中流动。在样品经过分析区域后，微流体通道被分流成三个通道。中央通道是样品回收通道，左侧通道和右侧通道收集过量的鞘缓冲剂以降低样品稀释。通过适当选择通道宽度和施加的压力，样品稀释程度可被调节到1∶1稀释度到鞘流的稀释度(典型地为1∶20)。在一定条件下，即极稀样品的条件下，被收集的样本可代之以进行浓缩。

图37显示了为多次样品分析或分选而设计的微流体装置。该设计不要求在装载可能引起荧光背景改变的不同样品后改变盒体或重新排列。本发明包括三个样品储库，两个样品储库用于样品，一个样品储库用于缓冲剂，以使两个样品远离交叉污染。通过调节压力，可注射每个样品并进行挟缩用于流式细胞计数分析。例如，采用两个样品A和B，对于A的分析，对样品A的储库施加最高压力，缓冲剂储库处于中等压力，而样品B的储库被保持在最低压力下。通过交替具有最高压力的通道，所需通道将流向分析区域(最高压力)或其流动被阻止(最低压力)。可在每个样品之间引入纯缓冲剂以允许在分析区域中清楚地分离信号。可被装载并按序操作的样品数对于被附加到微流体晶片的每个独立的分隔缓冲通道可被增加到2。

图38还显示了可进行具有可调节稀释度的两个样品的多路复用的微流体装置的实施例。该装置采用了两个样品通道A和B和分离缓冲剂。为了分析样品A，使用以下的压力设定：P_sw_A＜P_sw_B＜P_B＜P_sb＜P_A＜P_sth。为了分析样品B，使用了以下的压力设定：P_sw_B＜P_sw_A＜P_A＜P_sb＜P_B＜P_sth。为了防止样品之间的交叉污染，分离缓冲剂可在样品A和B测量之间沿着通道向下流动。使用附加的压力端口，该设计可放大规模用于三个或更多个样品。图38显示了在两个样品之间切换的该装置的实施例。

尽管已经通过举例说明实施例相当详细地描述了上文的本发明用于清楚理解的目的，但是本领域普通技术人员显然可根据本发明的教导对其进行某种改变和更改而不脱离本发明书的精神和范围。

Claims (6)

1.微流体细胞分选仪，其包括：

适合接受在流体介质中的一个或多个细胞的细胞进口；

流体连接到细胞进口的第一和第二缓冲剂进口，以向分选仪提供缓冲剂溶液；

流体连接到细胞进口和第一和第二缓冲剂进口的流体通道，

流体连接到流体通道的第一横流通道，所述第一横流通道位于第一和第二流体缓冲剂进口的下游；

流体连接到流体通道的第二横流通道，所述第二横流通道位于第一和第二流体缓冲剂进口的下游，且第二横流通道位于流体通道的与第一横流通道相对侧上；

流体连接到流体通道的第一和第二出口，这些出口位于第一和第二横流通道的下游，

适合检测给定状态的细胞并响应给定状态的细胞产生信号的检测器，该检测器被布置为在第一横流通道的上游位置处检测细胞，

连接到检测器和第一和第二横流通道的气动横向力开关，其响应信号而可致动以产生气压脉冲，从而引起流体在横流通道内移动，所述气动横向力开关包括：

连接到第一横流通道的第一气动阀；

连接到第二横流通道的第二气动阀；

连接检测器和气动横向力开关的控制系统，提供定时控制信号以顺序方式促动第一和第二气动阀，其特征在于第一气动阀在第二气动阀打开之前打开；

从而当检测到给定状态的细胞时，气动横向力开关被激活以对细胞提供横向力，从而使细胞移动以便其选择性离开进入第一或第二出口。

2.权利要求1的微流体细胞分选仪，其中流过流体通道的流体流是层流。

3.权利要求1的微流体细胞分选仪，其中第一和第二缓冲剂进口具有不同的尺寸。

4.权利要求1的微流体细胞分选仪，其中第一和第二出口具有不同的尺寸。

5.权利要求4的微流体细胞分选仪，其中第一出口比第二出口具有更大容积的流体流。

6.权利要求1的微流体细胞分选仪，其特征在于第一气动阀在第二气动阀打开之后和在第二气动阀关闭之前关闭。