CN101735211B

CN101735211B - 2,3-二氢[1,5]苯并噻氮杂*类化合物或其盐在制备GSK-3β抑制剂中的用途

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Publication number: CN101735211B
Application number: CN2009101744569A
Authority: CN
Inventors: 楚勇; 黄朝辉; 胡海荣; 叶德泳
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-11-04
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2029-11-03
Also published as: CN101735211A

Abstract

本发明属药物化学领域，公开了式I所示的结构的非ATP竞争抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物。该类化合物能以非ATP竞争模式抑制GSK-3β的活性，可作为GSK-3β的小分子抑制剂应用于制备预防或治疗与GSK-3β相关疾病的药物。本发明进一步包括这类化合物、其药学上可接受的盐、或其药物组合物在预防或治疗与GSK-3β相关疾病中的应用。以上所述与GSK-3β相关的疾病可以是糖尿病和阿耳茨海默氏病。

Description

2,3-二氢[1,5]苯并噻氮杂*类化合物或其盐在制备GSK-3β抑制剂中的用途

技术领域

本发明属药物化学领域，涉及2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物及其药物用途，具体涉及2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物或其盐及其在制备抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性药物中的用途，尤其涉及一类能以非ATP竞争模式抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂卓类化合物，该类化合物可作为GSK-3β的非ATP竞争的小分子抑制剂用于制备预防或治疗与GSK-3β相关疾病的药物。

背景技术：

据国际糖尿病联合会预测，由于不良饮食习惯和缺乏锻炼，2025年全球糖尿病患者将高达3亿。其中大部为II型糖尿病患者。在中国，糖尿病已成为心血管疾病和肿瘤之后的第三大致死性疾病。

现有技术公开了在众多人类疾病中均发现糖原合成酶激酶3(GSK-3)的活性异常升高，如II型糖尿病人的GSK-3蛋白水平和活性就总是异常升高，且不受上游物质缺损的影响。研究证明，GSK-3的过量表达可导致一些病理学症状，如糖尿病以及某些神经退行性疾病。当前，开发糖原合成酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3，GSK-3)的小分子抑制剂用于治疗复杂性疾病，如癌症、糖尿病和早老年性痴呆症等正在成为一个新的研究热点。GSK-3是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，不仅参与肝糖代谢过程，还参与Wnt和Hedgehog信号通路，通过磷酸化多种底物蛋白来调节细胞的生理过程。GSK-3的小分子抑制剂能够抑制GSK-3的磷酸化活性，从而调控机体糖代谢、Tao蛋白代谢等过程，可用于治疗II型糖尿病或阿耳茨海默氏病等与GSK-3活性高表达相关的疾病(Eldar-Finkelman，Hagit，Trends in Molecular Medicine，8(3)：126-132，2002)。而且，GSK-3是胰岛素信号通路最下游的调节因子，对它进行选择性调控可能引起较少的副作用。

GSK-3是胰岛素信号通道重要的负调节因子，其功能受损或过度表达均直接导致II型糖尿病(Frame，Sheelagh；Zheleva，Daniella，Expert Opinion on TherapeuticTargets，10(3)：429-444，2006)。异常高活性的GSK-3通过抑制糖原合成酶的活性从而阻止糖原合成是导致血糖升高的主要原因(Nikoulina SE，Ciaraldi TP，MudaliarS，et al，Diabetes，49(2)：263-271，2000)；GSK-3还直接抑制胰岛素受体，影响糖代谢平衡(Eidar FH，Krebs EG.，Pro Nat Acad Sci USA，94(18)：9660-9664，1997)。胰岛素受体和糖原合成酶分别处于胰岛素糖代谢信号通路的最上游和最下游，其活性被抑制限制了胰岛素介导的大部分生理反应。

GSK-3是胰岛素信号通路最下游的调节因子，对它进行选择性调控可能引起较少的副作用。至今为止的研究表明，GSK-3抑制剂并无明显的副作用。对Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠连续注射GSK-3抑制剂CT99021[130mg/(kg·d)]达20小时，并未发现其肝、肺、脂肪等组织细胞中β连环蛋白及cyclinD1的mRNA水平升高，也未发现其它GSK-3小分子抑制剂对糖尿病哺乳动物存在明显副作用(Ring DB，Johnson KW，Henriksen EJ，et al，Diabetes，52(3)：588-595，2003)。事实上，LiCl作为最明确的GSK-3抑制剂已在临床使用50多年，至今未见导致肿瘤的报道(Vestergaard P，Licht RW.World J BiolPsychiatry，2(1)：18-26，2001)。

而且，对于糖尿病治疗而言，仅需对高活性的GSK-3进行短时间(约40min)、中强度(约30％～40％)的抑制即已足够；而要影响GSK-3对生长等其它功能的调节，通常需要高强度地抑制(＞75％)(McManus，Edward J.；Sakamoto，Kei；Armit，Laura J.；etal，EMBO Journal，24(8)：1571-1583，2005)。可以期望，适当地抑制高表达的GSK-3活性应该是安全而且有效的。

GSK-3有α和β两种亚型，其结构和功能都极为相似，目前研究最多的是β亚型。多家大型制药公司，如葛兰素史克、罗氏、礼来，Chiron已开发了多种GSK-3β抑制剂，正在进行临床前的研究。这些抑制剂均有十分明显的降糖作用，并可促进葡萄糖诱导的胰岛素释放、刺激葡萄糖摄取、提高细胞对胰岛素的敏感度等多种效应，显示出治疗糖尿病和胰岛素抵抗的巨大潜力。

此外，GSK-3作为神经退行性疾病的治疗靶也已开展了大量研究。GSK-3涉及与阿耳茨海默氏病(AD)相关的生物途径。AD的主要病理学特征即是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)和细胞内神经纤维缠结的形成和进展(Goate，A.et al.Nature，349，704-706，1991)，而GSK-3能通过磷酸化APP促使Aβ的产生(Hanger，D.P.，Hughes，K.，Woodgett，J.R.，et al.Neurosci.Lett.147，58-62，1992)。已有研究证明，通过抑制GSK-3，尤其是GSK-3β的活性可减少Aβ的生成和神经纤维混乱(LeClerc，C.et al.J.Biol.Chem.276，251-260，2001)。如锂盐作为一种明确的GSK-3抑制剂，在治疗浓度通过干扰APP剪切可以阻止Aβ的生成(Sun，X.et al.Neurosci.Lett.321，61-64，2002)。因此，GSK-3β抑制剂也可应用于治疗阿耳茨海默氏病。

但目前研究开发的GSK-3抑制剂几乎都是ATP竞争型抑制剂，即它们都作用于GSK-3的ATP作用区。由于ATP结合区在其它蛋白激酶中高度保守，与其作用可能潜在较多的副作用，因而此类抑制剂的选择性问题不容忽视。而作用于GSK-3非ATP结合区的非ATP竞争抑制剂应该具有更好的选择性和更小的副作用。

三维晶体结构研究已发现，与大多数酶不同，在GSK-3的ATP结合区之外有一个独有且GSK-3β高度保守的底物作用区(Dajani，R.et al.Cell，105(6)：721-732，2001；ter Haar，E.et al.Nat Struct Biol，8(7)：593-6.2001)。GSK-3的大多数底物，如糖代谢底物GS，必须首先预磷酸化后并作用于此结合区才能被GSK-3识别，进而参与糖代谢平衡(Fiol，C.J.et al.J.Biol.Chem.，262(29)：14042-14048，1987)。而GSK-3参与调控的Wnt信号通路中的axin，β-连环蛋白则不需要其他激酶的预磷酸化，其活性结合部位并不位于此区域(Ikeda，S.et al.EMBO J.17，1371-1384，1998)。GSK-3在各个信号通路中的功能互不干扰的特点很可能即与其相应底物与这个非ATP活性区的特异性结合有关。不难想象，能够竞争结合到这个特殊活性区的小分子可能仅仅抑制GSK-3的活性，而不致影响到其它酶的活性，具有较高的选择性；同时也不影响其它信号通道的功能，降低致癌的风险，具有较高的特异性。2002年报道的噻二唑酮类化合物(TDZD)是首个作用于此结合区的非ATP竞争抑制剂，它对GSK-3β有μM级的抑制作用，而对PKA，PKC，CK-2，CDK1/cyclin B等多种激酶均无抑制(Martinez，A.et al.J.Med.Chem.45(6)：1292-1299，2002)；后续研究也表明，此类化合物只要其作用模式是非ATP竞争的，都显示出了很好的选择性(Castro，A.et al.bioorgan.med.chem.，16(1)：495-510，2008)。卤甲基芳基酮类(HMK)是另一种非ATP竞争的GSK-3β小分子抑制剂，也显示出类似的高选择性(Conde，S.et al.J.Med.Chem.，46(22)：4631-4633，2003)。

竞争结合这个非ATP结合区甚至可以直接产生拟胰岛素作用。GSK-3自身磷酸化后的氨基酸残基可以占据这个特殊区域从而导致GSK-3的失活。胰岛素对GSK-3的抑制即是通过这种自占据模式实现的(Dajani，R.et al.Cell，105(6)：721-732，2001；terHaar，E.et al.Nat Struct Biol，8(7)：593-6.2001)。2003年报道的肽磷酸盐L803-mts正是选择性作用于GSK-3β的这个非ATP结合区。它可在μM级浓度提高人的胚胎肾293细胞的GS活性2.5倍，而对测试的6种其它激酶MAPK，PKA，PKB，PKC-δ和CK-2，甚至与GSK-3最密切的Cdc2均无抑制作用(Plotkin，B.et al.JPET，305(3)：974-980，2003)。对ob/ob大鼠每天腹腔注射400nmol，连续注射三周，也未引起血脂、体重等发生变化，组织病理学研究和血液化学成分分析也表明L803-mts并未引起明显毒副作用(Kaidanovich-Beilin，0.et al.JPET，316(1)：17-24，2006)。

发明内容：

本发明的目的是提供2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物及其药物用途，具体涉及2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物或其盐及其在制备抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性药物中的用途，尤其涉及一类能以非ATP竞争模式抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂卓类化合物，该类化合物可作为GSK-3β的非ATP竞争的小分子抑制剂用于制备预防或治疗与GSK-3β相关疾病的药物。所述的相关的疾病可以是糖尿病和阿耳茨海默氏病，但并不受限于此。

本发明中，所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物能在微摩尔浓度抑制GSK-3β活性。

本发明以GSK-3β的非ATP结合区为靶标，利用计算机虚拟筛选、设计和化学合成、并通过生物活性评价，得到具有全新化学骨架结构的GSK-3β非ATP竞争抑制剂。

本发明以GSK-3β晶体结构(PDB号1UV5)中的非ATP结合区为靶标，首先选取文献报道的GSK-3β的非ATP竞争抑制剂TDZD与此位点作用最密切的三个氨基酸Arg96，Lys205和Tyr216的质心构建筛选靶点。采用Swiss PDB Viewer检查蛋白缺失的残基，再在Autodock Tools中删去水分子和配体小分子，为受体大分子添加极性氢并加载KOLLMAN电荷。所得结构用AutoDock Tools转换成pdbqs文件作为受体分子文件，设定网格大小和网格参数，用AutoGrid模块计算每个网格点与探针原子的作用能；采用Autodock Tools对Mybridge数据库中的5万个分子预先都去掉所有氢原子，只加极性氢，计算Gasteiger-Hückel电荷，存为pdbq文件作为配体分子文件。在此基础上，采用Autodock 3.0.5分子对接软件对Mybridge数据库中的5万个分子分成15个结点分别进行对接研究，每一化合物产生20个构象。对接采用Lamarckian遗传算法，并用Solis andWets局部搜寻算法进行能量优化。修改Lamarckian算法3个参数maximum number ofenergy evalutions，maximum number of generations和docking runs分别为1500000、370000和20。其余所用参数除特别指明外均采用默认值。最后根据结合自由能及簇分析结果，取前60个具有最好打分的化合物，设计并合成了一系列衍生物进行生物活性筛选，从中发现了一类全新结构的能抑制GSK-3β活性的有机小分子化合物，并进一步通过酶动力学实验证实了此类化合物对GSK-3β的作用模式为非ATP竞争抑制。

本发明的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物及其药学上可接受的盐，其结构通式如下式I所示：

其中，X任选地为O、S或N原子，优选为0；

R₁、R₂、R₃、R₄独立地为氢、卤素、硝基、羟基、甲基、羟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、乙酰基或者乙酰氧基，或者R₁和R₂、R₁和R₃、R₂和R₄分别环合成6元芳环或脂环。

R₅为芳香基，优选为苯基和取代苯基；其中所述取代基为1-4个，取代基任意选自于卤素、硝基、氨基、氰基、羟基、羧基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、三氟甲氧基、酰基或者酰氧基。

R₆为芳香基，优选为呋喃基、吡啶基、萘环、苯基、取代苯基。其中所述取代基为1-4个，取代基任意选自于卤素、硝基、羟基、氨基、氰基、羟基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、三氟甲氧基、酰基或者酰氧基。

n取自0～6，且为整数，优选为1。

本发明中，当X为0时，R₅为(C₆-C₁₀)芳香基，且R₆为5-7元芳杂环、苯基和取代苯基，n为1～3。

本发明中，R₅选自于苯基和取代苯基，R₆选自呋喃基、吡啶基、苯基、取代苯基。其中所述取代基为1-4个，该取代基任意选自于卤素、硝基、羟基、甲基，甲氧基、三氟甲氧基、乙酰基或者乙酰氧基。

本发明所述的“药学上可接受的盐”具体地可列举为与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的盐，或与甲酸、乙酸，甲磺酸、乙磺酸等有机酸形成的盐。

本发明的另一个目的是提供包含上述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明又一目的是提供上述化合物以及包含该化合物的组合物用于制备预防或治疗GSK-3β相关疾病的药物。所述GSK-3β相关疾病可以是糖尿病和阿耳茨海默氏病，但不局限于此。

本发明的有益效果在于：

1.本发明发现并证明了一类对GSK-3β具有抑制活性的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物。

2.本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物在体外抑制活性实验中，证明对GSK-3β具有微摩尔浓度级的抑制作用。

3.本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物经酶动力学实验证实其对GSK-3β的抑制是非ATP竞争抑制。

4.本发明所述化合物可用于制备预防或治疗糖尿病和阿耳茨海默氏病的药物，但不受限于此。

5.本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物可用于制备预防或治疗与GSK-3β相关疾病的药物。

附图说明：

图1是已知的ATP竞争型对照品SB 216763对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见SB 216763的曲线与对照曲线相交于Y轴，表明其的确是ATP竞争型抑制剂，证明本发明动力学测试体系正确可靠。

图2是本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物CYbc对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见两个浓度CYbc的曲线均与对照曲线相交于X轴，表明CYbc为非ATP竞争型抑制剂。

图3是本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物HZah对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见HZah的曲线与对照曲线基本相交于X轴，表明HZah为非ATP竞争型抑制剂。

图4是本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂类化合物HZIIc对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见HZIIc的曲线与对照曲线基本相交于X轴，表明HZIIc为非ATP竞争型抑制剂。

下面结合实施例和附图进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的原料为商业上可购得的或者可以很容易地由本领域技术人员根据已知文献方法制备的。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

具体实施方式：

本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物的制备参见以下实施例。

实施例1：制备5-苄基-2，3-二氢-2-(2-呋喃)[1，5]苯并噻氮杂-4-酮(CYbc)

(a).2-呋喃丙烯酸的制备

丙二酸(20.8g，0.2mol)、糠醛(16.6ml，0.2mol)、吡啶(10ml，0.12mol)和0.5mL哌啶均匀混合，搅拌回流2小时。氨水调至碱性，水相中加入盐酸至酸性，收集固体，水洗至中性，50％的乙醇/水溶液重结晶得无色晶体18.95g，产率69％。经¹HNMR和MS确证结构。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：6.32(d，1H，J＝16.04Hz，＝CH-COOH)；6.49-6.50(dd，1H，J＝1.96Hz，J＝3.52Hz，furan-4H)；6.68(d，1H，J＝3.13Hz，furan-3H)；7.52(d，1H，J＝15.56Hz，furan-5H)；δ7.52(d，1H，J＝1.96Hz，-CH＝CH-COOH).MS(-ESI)：137.1(M-H)^-，275.0(2M-H)^-.

(b).2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂-4(5H)-酮的制备

2-呋喃丙烯酸(14.7g，0.106mol)、邻氨基苯硫酚(13.32g，0.106mol)、适量分子筛于190℃反应6.5小时。过滤除去分子筛，滤液冷却析出白色固体，乙腈重结晶得白色晶体，产率60％。¹HNMR和MS确证结构。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：2.82-2.93(m，2H，-CH₂-)；4.93(dd，1H，J＝6.26Hz，J＝10.95Hz，-CH-)；6.16(d，1H，J＝3.13Hz，furan-3H)；6.30(m，1H，J＝1.96Hz，J＝3.13Hz，furan-4H)；7.15-7.59(m，5H，furan-5H，PhH)；8.19(s，1H，-NH-).MS(+ESI)：246.1(M+H)⁺；491.2(2M+H)⁺；513.1(2M+Na)⁺.

(c).5-苄基-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(CYbc)的制备

60％的NaH(0.6g，6mmol)加入到溶有2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂卓-4(5H)-酮(0.49g，2mmol)的8ml DMF中，25℃搅拌30分钟后于0℃滴加溶有苄基氯(0.46ml，4mmol)的6mlDMF溶液，继续搅拌1小时。反应液经盐酸酸化，冷却，沉淀水洗至中性，甲醇重结晶得白色晶体0.28g，产率42％。¹HNMR和MS确证结构。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：2.81-2.92(m，2H，-CH₂-)；4.89(dd，1H，J＝5.86Hz，J＝12.52Hz，-CH-)；5.01(AB，1H_a，J＝15.26Hz，-N-CH₂-)；5.17(AB，1H_b，J＝15.26Hz，-N-CH₂-)；5.99(d，1H，J＝2.35Hz，furan-3H)；6.26(s，1H，furan-4H)；7.14-7.47(m，10H，furan-5H，PhH).MS(+ESI)：336.1(M+H)⁺

以下2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物均采用相应起始原料，经类似方法合成得到。

实施例2：制备5-(4-氯苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂-4-酮(HZaa)

白色针晶，产率94％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.47(d，1H，J＝7.6Hz)；7.40(td，1H，J＝7.0，1.3Hz)；7.29(d，1H，J＝4.4Hz)；7.24(s，2H)；7.23(s，2H)；7.20(d，1H，J＝3.6Hz)；7.18(t，1H，J＝7.5Hz)；5.99(d，1H，J＝3.0)；5.25(d，1H，J＝15.2Hz)；4.86(d，1H，J＝15.2Hz)；4.90-4.85(m，1H)；2.91-2.79(m，2H，)。MS(API-ES)；m/z 370.0(M⁺+H)，392.1(M+Na)。

实施例3：制备5-(3-氯苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZah)

淡黄色固体，产率85％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：2.81-2.93(m，2H，-CH₂-)；4.87-4.91(m，1H)；4.93(d，1H，J＝15.21Hz，AB)；5.19(d，1H，J＝15.30Hz，AB)；6.00(d，1H，J＝2.96Hz)；6.26(s，1H)；7.16-7.49(m，9H，PhH).MS(+ESI)：370.0(M+H)⁺。

实施例4：制备5-(3-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZac)

黄色柱状晶体，产率78％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：8.16(s，1H)；8.08(d，1H，J＝8.1Hz)；7.72(d，1H，J＝7.6Hz)；7.50-7.42(m，3H)；7.34-7.30(m，2H)；7.20(t，1H，J＝7.5Hz)；6.26(m，1H)；6.00(d，1H，J＝3.1Hz)；5.50(d，1H，J＝15.4Hz)；4.92-4.89(m，1H)；4.90(d，1H，J＝15.2)；2.93-2.82(m，2H)。

实施例5：制备5-(4-硝基苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZab)

黄色针晶，产率56％。¹HNMR(400MHz，CDCl ₃)：δppm：8.12(d，2H，J＝8.6Hz，)；7.50(d，3H，J＝8.4Hz)；7.42(t，1H，J＝7.7Hz)；7.30(d，2H，J＝5.1Hz)；7.21(t，1H，J＝7.7Hz)；6.27(bs，1H)；6.01(d，1H，J＝3.0Hz)；5.46(d，1H，J＝15.6Hz)；4.91(d，1H，J＝15.6Hz)；4.89(t，1H，J＝6.0Hz)；2.88(m，2H).MS(API-ES)：m/z381.0(M⁺+H)，403.0(M+Na)。

实施例6：制备5-(4-甲基苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZam)

白色针晶，产率83％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.46(d，1H，J＝7.7Hz)；7.37(td，1H，J＝1.4，7.0Hz)；7.29-7.27(3H)；7.19(d，2H，J＝7.9Hz)；7.16(t，1H，J＝7.5Hz)；7.06(d，2H，J＝7.8Hz)；6.26(t，1H，J＝1.8Hz)；5.99(d，1H，J＝3.1Hz)；5.13(d，1H，J＝15.1Hz)；4.97(d，1H，J＝15.1Hz)；4.89(dd，1H，J＝5.9，6.5Hz)；2.90-2.83(AB system，2H)；2.29(s，6H).MS(API-ES)：m/z350.2(M⁺+H)。

实施例7：制备5-(1-(4-甲氧基苯基)乙酮基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZan)

白色针晶，产率89％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：8.01(d，2H，J＝8.8Hz)；7.53(d，1H，J＝7.4Hz)；7.40(td，1H，J＝1.4，6.6Hz)；7.32-7.29(2H)；7.21(t，1H，J＝7.1Hz)；6.97(d，2H，J＝8.8Hz)；6.27(s，1H)；6.02(d，1H，J＝2.9Hz)；5.80(d，1H，J＝17.3Hz)；4.88(dd，1H，J＝6.0，6.2Hz)；4.55(d，1H，J＝17.4Hz)；3.89(s，3H)；3.00-2.89(AB system，2H).MS(API-ES)：m/z 394.1(M⁺+H)，809.2(2M+Na)。

实施例8：制备5-(1-(4-甲基苯基)乙酮基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZap)

白色针晶，产率92％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.93(d，2H，J＝8.1Hz)；7.53(d，1H，J＝7.7Hz)；7.40(td，1H，J＝1.5，6.4Hz)；7.32-7.26(5H)；7.21(t，1H，J＝7.5Hz)；6.27(s，1H)；6.02(d，1H，J＝2.8Hz)；5.82(d，1H，J＝17.5Hz)；4.88(dd，1H，J＝6.1，6.1Hz)；4.57(d，1H，J＝17.5Hz)；3.00-2.89(AB system，2H)；2.43(s，3H).MS(API-ES)：m/z 378.1(M⁺+H)，777.2(2M+Na)。

实施例9：制备5-(3-氨基苄基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZe01)

白色细针晶，产率87％。。¹HNMR(400MHz，CDCl ₃)：δppm：7.48-7.02(6H，Ph)；6.72-6.54(3H)；6.26(s，1H)；6.00(s，1H)；5.05-4.89(m，3H)；3.63(b，2H，NH₂)；2.92-2.84(2H，ABX).MS(API-ES)：m/z 351.1(M+H)。

实施例10：制备5-苯甲酰基-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂-4-酮(HZxa)

白色细针晶，产率96％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.86(d，2H，J＝7.4Hz)；7.61(d，1H，J＝7.3Hz)；7.52(t，1H，J＝7.4Hz)；7.43-7.38(3H)；7.34-7.24(4H)；6.30(dd，1H，J＝1.87Hz，1.2Hz)；6.10(s，1H)；4.88(t，1H，J＝8.6Hz)；2.96(dd，2H，J＝1.57Hz，7.9Hz).MS(API-ES)：m/z 350.2(M+H)；372.1(M+Na)。

实施例11：制备5-(4-甲基苯基-1-磺酰基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZxb)

白色细针晶，产率89％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.87(d，2H，J＝8.2Hz)；7.75(d，1H，J＝7.9Hz)；7.57(t，1H，J＝7.8Hz)；7.49(d，1H，J＝7.0Hz)；7.41(t，1H，J＝7.5Hz)；7.31(d，2H，J＝8.4Hz)；7.25(s，1H)；6.21(s，1H)；5.83(d，1H，J＝3.2Hz)；4.48(q，1H，)；2.80-2.61(m，2H，AB)；2.45(s，3H).MS(API-ES)：m/z 400(M+H)。

实施例12：制备5-(3-苯基丙基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZaq)

淡黄色固体，产率83％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.53(dd，1H，J＝1.3，6.4Hz)；7.43(td，1H，J＝6.5，1.5Hz)；7.27-7.18(5H)；7.13(t，1H，J＝7.3Hz)；7.08(d，2H，J＝7.1Hz)；6.25(dd，1H，J＝1.8，3.0Hz)；5.98(d，1H，J＝3.2Hz)；4.86(dd，1H，J＝5.8，12.3Hz)；4.40(m，1H)；3.47(m，1H)；2.82-2.56(4H)；1.90(m，2H).MS(+ESI)：398.0(M+H)⁺。

实施例13：制备5-(2-苯基乙基)-2，3-二氢-2-(2-呋喃基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZal)

淡黄色针晶，产率84％。¹HNMR(400MHz，CDCl ₃)：δppm：7.52(dd，1H，J＝1.2，7.6Hz)；7.45(td，1H，J＝7.9，1.5Hz)；7.31-7.17(8H)；6.26(dd，1H，J＝1.8，3.0Hz)；5.99(d，1H，J＝3.2Hz)；4.87(dd，1H，J＝5.8，12.7Hz)；4.45(m，1H)；3.71(m，1H)；3.13(m，1H)；2.84-2.71(3H).MS(API-ES)：m/z 350.2(M⁺+H)，372.1(M+Na)。

实施例14：制备5-苄基-2，3-二氢-2-苯基[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZIIc)

白色针晶，产率90％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.58-7.14(14H，Ph)；5.25-5.21(1H，AB system)；4.99-5.03(1H，AB system)；4.88-4.83(1H，ABX system)；2.94-2.82(2H，ABX system).MS(API-ES)：m/z 346.11(M+H)；368.0(M+Na)。

实施例15：制备5-苄基-2，3-二氢-2-(3，4-二氯苯基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZIIka)

白色针晶，产率86％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：7.55(d，1H，J＝7.5Hz，)；7.42(t，1H，J＝7.1Hz，)；7.35-7.21(m，11H，Ph)；6.98(dd，1H，J＝6.4 and 1.9Hz，)；5.23(d，1H，J＝15.3Hz，)；4.99(d，1H，J＝15.3Hz，)；4.78(t，1H，J＝9.0Hz，)；2.82(d，2H，J＝9.1Hz，).MS(API-ES)：m/z 414.1(M⁺)，829.2(2M+H)。

实施例16：制备5-苄基-2，3-二氢-2-(吡啶-3-基)[1，5]苯并噻氮杂

-4-酮(HZIIja)

淡黄色固体，产率60％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δppm：8.52(d，1H，J＝4.69Hz)；8.43(s，1H)；7.57(dd，1H，J＝1.96，7.82Hz)；7.35-7.30(m，8H，PhH)；5.32(d，1H，J＝16.02Hz，AB)；5.16(d，1H，J＝16.04Hz，AB)；3.71(dd，1H，J＝5.09，9.78Hz)；3.36(dd，1H，J＝5.09，14.08Hz)；2.86(dd，1H，J＝9.78，14.48Hz).MS(+ESI)：381.0(M+H)。

实施例17生物活性评价实验

①体外酶抑制活性测试

采用[γ-32P]ATP作为标记试剂，通过检测GSK-3β的磷酸化底物pGSM的放射计数来反映酶的活性水平。计算该浓度下化合物的抑制率，进而测量不同浓度下的抑制率得到化合物的半抑制浓度(IC50值)。实验中采用的阳性对照物为ATP竞争型的GSK-3β小分子抑制剂SB 216763(Sigma S3442)。

所用的主要试剂如下：

GSK-3β(upstate，产品号14-306)；GSM(upstate，产品号14-533)；ATP·2Na(Roche)；P81纸(upstate，20-134)；[γ-³²P]ATP(北京市福瑞生物工程公司核酸研究室)；SB 216763(sigma-RBI)

实验操作如下：

(1)、依次加入5×buffer 8.5uL，GSK-3β溶液(4ng/uL)2.5uL，GSM溶液(20ng/uL)2.5uL，待测化合物溶液1.25uL(终浓度100uM，)，[γ-³²P]ATP溶液(1uCi/uL)10uL。30℃水浴中孵育10分钟后，加入EDTA·2Na溶液(100mM)5uL，终止反应。

(2)、取20uL反应液滴加到P81纸上，放置2分钟。

(3)、将上述P81纸转移到25mL锥形瓶，加0.75％磷酸溶液20mL，振摇(220r/m)5分钟。重复洗涤3次

(4)、加入丙酮20mL，振摇(220r/m)5分钟。

(5)、将P81纸转移到托盘，烘箱40℃烘烤10分钟。

(6)、将P81纸转移到闪烁瓶，加3mL闪烁液，读取放射计数。

活性筛选结果显示，2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类系列化合物对GSK-3β具有微摩尔浓度级的抑制作用。

表1是部分化合物的结构及活性数据。

表1

②酶动力学测试确定本发明所述化合物对GSK-3β的作用模式

测试一定浓度化合物在一系列不同ATP浓度时GSK-3β的活性，计算出反应速率。通过反应速率的倒数(1/v)对ATP浓度的倒数(1/[ATP])作图得到Lineweaver-Burk图。根据直线的相交点，确定2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物的作用类型。已知的GSK-3β的ATP竞争型小分子抑制剂SB216763(Sigma S3442)作为参照品进行平行测试以验证测试体系的可靠性。

先将[γ-³²P]ATP储备液(10uCi/uL)用cocktail缓冲液稀释到1.5uCi/uL，此时非标记ATP浓度为250uM。然后用高纯水稀释成一系列ATP浓度：100μM，70μM，50μM，30μM，20μM，15μM。配制一定浓度的待测化合物，运用上述体外酶抑制活性测试方法测试其在该系列浓度ATP中酶的活性。计算反应速率并对ATP浓度进行双倒数作图，判断酶抑制剂是ATP竞争型还是非ATP竞争型。

通过双倒数图证明了本发明所述的2，3-二氢[1，5]苯并噻氮杂

类化合物对GSK-3β的抑制为非ATP竞争抑制。附图为三个实施例CYbc，HZah和HZIIc对GSK-3β活性测试的动力学数据双倒数图。图中显示，三个化合物的曲线均与对照曲线相交于X轴，表明其为非ATP竞争抑制。已知阳性参照品SB 216763为ATP竞争型抑制剂，在此体系中所测得的曲线的确与对照曲线相交于Y轴，表明其是ATP竞争型抑制剂。