CN101718698B - Pcr-ce联用微流控芯片激光诱导荧光分析仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCR-CE联用微流控芯片激光诱导荧光分析仪，涉及一种生物医学检测分析仪。本发明的结构是：在机壳(00)内设置有PCR单元(10)、CE单元(20)、激光诱导荧光检测单元(30)和信号采集与处理单元(40)；PCR单元(10)和CE单元(20)相互连接后再与激光诱导荧光检测单元(30)连接，激光诱导荧光检测单元(30)和信号采集与处理单元(40)连接。本发明集成PCR、电泳分离、激光诱导荧光检测于一体，体积小、结构简单、易于操作、成本低；性能稳定，分析检测灵敏度高，疾病诊断周期短；适用于有关疾病的基因临床诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学检测分析仪，尤其涉及一种PCR-CE(聚合酶链式反应-毛细管电泳)联用微流控芯片激光诱导荧光分析仪。
背景技术
微全分析单元是上世纪90年代初开始兴起的一个全新的领域。微全分析单元涉及到很多学科领域，如分析化学、物理学、生物学、医学、药学、微加工技术、电子学、计算机等，通过对样品处理、分离及检测的集成化、微型化来实现常规实验室的基本功能，从而实现低成本、高通量、智能化、便携式的目标。
芯片实验室技术是将整个实验室的功能，从加样、反应、分离、检测等过程集成在只有几平方厘米的微型芯片上，目前已经在化学合成，细胞培养，药物高通量筛选，疾病诊断，食品安全，血液分析和环境检测等方面取得重要进展。微流控芯片技术的发展，使得芯片上PCR技术得以实现。随着微加工技术的发展，微流体所经过的沟道尺寸从微米级已经进入到纳米级，使得微流控技术的研究对象从细胞级进入到了分子级。微流控技术已经成为当今的研究前沿和热点。
微流控芯片的检测方法主要有：激光诱导荧光法、电化学法、化学发光法、质谱法等。其中，激光诱导荧光法具有灵敏度高，原理简单，容易集成在微流控芯片上，成为目前主要采用的检测方法。激光诱导荧光检测的光学单元主要有两种：一种是激发光光路与荧光光路相互垂直；另一种是共聚焦式，它是用显微物镜把入射光光束聚焦在微流控芯片沟道上，激发荧光通过同一物镜入射到光电倍增管上进行检测。目前市场上出现的激光诱导荧光检测技术的主要问题是检测器的体积比较大，价格昂贵，结构复杂，难以实现分析单元的微型化。
毛细管电泳技术自从问世以来，已经成为分析领域中必不可少的手段。毛细管电泳中常用到的是凝胶电泳，样品用量比较大，操作费时，灌注凝胶比较难，分析时间长，所用电压高。微流控芯片毛细管电泳，采用粘度低的聚合物筛分介质充当电泳介质，操作更容易。微流控毛细管电泳，由于分离沟道只有几个厘米长，分离时间大大缩小，仅仅需要几分钟，甚至几十秒。微流控毛细管电泳，所用试剂用量少，分离电压低，灵敏度更高。
目前，进行疾病基因诊断时，都是将样品提取出来，在PCR扩增仪上进行扩增，然后进行电泳检测。检测方法有：常规的毛细管凝胶电泳和微流控毛细管凝胶电泳。常规的PCR扩增仪由于体积大，升温与降温速度慢，使得扩增过程耗费时间长。而微流控芯片技术使得在微流控芯片上进行PCR扩增，扩增时间短，升温与降温速度快，大大缩短了扩增所需时间。而扩增出来的样品在进行电泳检测前还要花费一定的样品处理时间，使得整个疾病诊断周期较长。
发明内容
本发明的目的就是克服现有的疾病基因诊断样品提取、PCR样品扩增、电泳分离、激光诱导荧光检测整个过程中存在的处理样品时间长、样品用量大、人工工作量大、成本高和周期长等问题，提供一种PCR-CE联用微流控芯片激光诱导荧光分析仪。
本发明的目的是这样实现的：
在机壳内设置有PCR单元、CE单元、激光诱导荧光检测单元和信号采集与处理单元；
PCR单元和CE单元相互连接后再与激光诱导荧光检测单元连接，激光诱导荧光检测单元和信号采集与处理单元连接。
本发明的工作原理是：
通过微流控芯片技术，疾病DNA样品的PCR过程和毛细管电泳分离过程集成在一起，分析结果通过激光诱导荧光检测单元进行荧光信号检测，在计算机上进行分析结果的显示。疾病DNA样品的浓度很低，PCR过程是通过加热器实现3个不同的温区对疾病DNA进行扩增过程，以达到可以检测的水平。DNA扩增完后经过毛细管电泳实现疾病DNA样品中各组分的分离，通过对分离的结果进行分析，从而对疾病进行诊断。
本发明具有以下优点和积极效果：
1、集成PCR、电泳分离、激光诱导荧光检测于一体，体积小、结构简单、易于操作、成本低；
2、性能稳定，分析检测灵敏度高，疾病诊断周期短。
3、适用于有关疾病的基因临床诊断。
附图说明
图1是本发明的结构框图；
图2是本发明的结构示意图(主视剖面图)；
图3是本发明的光路原理图。
图中：
00-机壳，
01-支架；
10-PCR单元，
11-PCR加热器，12-芯片支架，13-XYZ三维移动平台，
14-集成PCR-CE芯片；
20-CE单元，
21-电极夹具， 22-可控高压输出电源，
23-螺旋平移器；
30-激光诱导荧光检测单元，
31-半导体固体激光器， 32-平面反射镜， 33-半反半透镜，
34-物镜， 35-凸透镜， 36-针孔，
37-滤光片， 38-光电倍增管；
40-信号采集与处理单元
41-信号采集、滤波、放大、模数转换电路， 42-计算机。
缩略语：
1、PCR-聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2、CE-毛细管电泳(Capillary electrophoresis)，是一种分离分析技术。具有快速、高效、高灵敏度、易定量、重现性好及自动化等优点，已广泛地应用于小分子、小离子、多肽及蛋白质的分离分析研究。它又在核酸分离方面显示出巨大的潜力。毛细管电泳的基本装置是一根充满电泳缓冲液的毛细管和与毛细管两端相连的两个小瓶微量样品从毛细管的一端通过“压力”或“电迁移”进入毛细管。电泳时，与高压电源连接的两个电极分别浸人毛细管两端小瓶的缓冲液中。样品朝与自身所带电荷极性相反的电极方向泳动。各组分因其分子大小、所带电荷数、等电点等性质的不同而迁移速率不同，依次移动至毛细管输出端附近的光检测器，检测、记录吸光度，并在屏幕上以迁移时间为横坐标，吸光度为纵坐标将各组分以吸收峰的形式动态直观地记录下来。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、总体
如图1，本发明在机壳00内设置有PCR单元10、CE单元20、激光诱导荧光检测单元30和信号采集与处理单元40；
PCR单元10和CE单元20相互连接后再与激光诱导荧光检测单元30连接，激光诱导荧光检测单元30再和信号采集与处理单元40连接。
二、功能块
0、机壳00
如图2，在机壳00内设置有支架01，供固定其它功能块用。
1、PCR单元10
如图2，PCR单元10包括PCR加热器11、芯片支架12、XYZ三维移动平台13和集成PCR-CE芯片14；
在机壳00内中部的支架01上设置有XYZ三维移动平台13，在XYZ三维移动平台13的左方连接有芯片支架12，在芯片支架12的上、下方分别设置有集成PCR-CE芯片14和PCR加热器11；
所述的PCR加热器11是一种由1～3个加热块(常用加热材料)组成的电加热器；
所述的芯片支架12是一种供连接和支撑用的金属架；
所述的XYZ三维移动平台13是一种常用的外购件；
所述的集成PCR-CE芯片14是一种自行设计的微流控芯片，由PCR部分和CE部分组成；PCR部分是一个PCR反应池或是一个PCR反应通道；CE部分由样品进样通道和样品分离通道组成，呈十字交叉或双T相连；PCR部分的反应池或反应通道与CE部分的样品进样通道相互连通。
该集成PCR-CE芯片14是利用经典的光刻显影以及湿法刻蚀方法在玻璃上制作出微米级的通道，利用钻头在玻璃上相应位置钻出储液池，再与另外一块相同材料的平面玻璃在高温下键合得到的；该集成PCR-CE芯片14也可以是通过电铸模具法将有机高聚物聚甲基丙烯酸甲酯在电铸模具上加热加压制备而成。
2、CE单元20
如图2，CE单元20包括电极夹具21、可控高压输出电源22和螺旋平移器23；
所述的电极夹具21是一种包含有2-4个铂电极的PCB板；
所述的可控高压输出电源22为一种0～6000V可调高压电源；
所述的螺旋平移器23有上市产品；
螺旋平移器23固定在芯片支架12上，电极夹具21与螺旋平移器23相连，通过调节螺旋平移器23使电极夹具21上下移动；电极夹具21通过导线和可控高压输出电源22连接，给铂电极供电。
3、激光诱导荧光检测单元30
如图2、3，激光诱导荧光检测单元30包括固体激光器31、平面反射镜32、半反半透镜33、物镜34、凸透镜35、针孔36、滤光片37和光电倍增管38；
其光路是：固体激光器31产生的激光经平面反射镜32反射后进入半反半透镜33；其反射光经物镜34到集成PCR-CE芯片14后即产生荧光，荧光又依次通过物镜34、半反半透镜33、凸透镜35、针孔36和滤光片37后进入光电倍增管38，检测荧光信号(模拟信号)。
4、信号采集与处理单元40
如图2，信号采集与处理单元40包括前后连接的信号采集、滤波、放大、模数转换电路41和计算机42；
信号采集、滤波、放大、模数转换电路41是一种常用的电路，实现荧光信号的采集、滤波、放大和模数转换，得到荧光信号(数字信号)；
计算机42是一种常用的计算机，将荧光数字信号显示和分析。
三、本分析仪的操作步骤如下：
①将加好样品溶液和缓冲溶液的集成PCR-CE芯片14放置于芯片支架12上，调节螺旋平移器23使电极夹具21向下移动，从而将电极夹具21上的电极分别插入集成PCR-CE芯片14对应的储液池中；使用XYZ三维移动平台13调整集成PCR-CE芯片14的位置，使得集成PCR-CE芯片14的检测通道与激光诱导荧光检测光路在同一平面上。
②打开半导体固体激光器31，再调节XYZ三维移动平台13，使激光光束的聚焦点在集成PCR-CE芯片14检测沟道的检测点上，盖好外壳00的盖子。
③打开PCR加热器11，待PCR扩增完后打开光电倍增管38，打开信号采集、滤波、放大、模数转换电路41，打开可控高压输出电源22，调节光电倍增管38的工作电压，选择合适的检测灵敏度。
④调节可控高压输出电源22，同时在集成PCR-CE芯片14上同步进行样品的进样、分离过程；在此过程中，荧光信号的检测、数据的采集与处理、荧光图谱的显示都会同时进行。
⑤待样品分析过程结束后，将集成PCR-CE芯片14取出，用去离子水将集成PCR-CE芯片14的储液池及沟道清洗干净。
Claims (1)
1.PCR-CE联用微流控芯片激光诱导荧光分析仪，其特征在于：
在机壳(00)内设置有PCR单元(10)、CE单元(20)、激光诱导荧光检测单元(30)和信号采集与处理单元(40)；
PCR单元(10)和CE单元(20)相互连接后再与激光诱导荧光检测单元(30)连接，激光诱导荧光检测单元(30)和信号采集与处理单元(40)连接。
所述的PCR单元(10)包括PCR加热器(11)、芯片支架(12)、XYZ三维移动平台(13)和集成PCR-CE芯片(14)；
在机壳(00)内中部的支架(01)上设置有XYZ三维移动平台(13)，在XYZ三维移动平台(13)的左方连接有芯片支架(12)，在芯片支架(12)的上、下方分别设置有集成PCR-CE芯片(14)和PCR加热器(11)；
所述的PCR加热器(11)是一种由1～3个加热块组成的电加热器；
所述的芯片支架(12)是一种供连接和支撑用的金属架；
所述的XYZ三维移动平台(13)是一种常用的外购件；
所述的集成PCR-CE芯片(14)是一种微流控芯片，由PCR部分和CE部分组成；PCR部分是一个PCR反应池或是一个PCR反应通道；CE部分由样品进样通道和样品分离通道组成，呈十字交叉或双T相连；PCR部分的反应池或反应通道与CE部分的样品进样通道相互连通；
所述的CE单元(20)包括电极夹具(21)、可控高压输出电源(22)和螺旋平移器(23)；
所述的电极夹具(21)是一种包含有2-4个铂电极的PCB板；
所述的可控高压输出电源(22)为一种0～6000V可调高压电源；
所述的螺旋平移器(23)有上市产品；
螺旋平移器(23)固定在芯片支架(12)上，电极夹具(21)与螺旋平移器(23)相连，通过调节螺旋平移器(23)使电极夹具(21)上下移动；电极夹具(21)通过导线和可控高压输出电源(22)连接，给铂电极供电。
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