CN101712972A - 一种生物法生产α-环糊精的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物法生产α-环糊精(a-CGT)的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。采用来源于软化芽胞杆菌(Paenibacillus macerans，中国典型微生物保藏中心，CCTCCM 208063)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)生产α-CGT。应用本工艺生产α-CGT，淀粉的总转化率高达71％，产品中α-CGT所占比例为80％，β-CGT占20％。本发明具有流程简单，生产周期短，转化率高，得到的α-CGT纯度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物法生产α-环糊精的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。
背景技术
环糊精(Cyclodextrins，通常简称为CD)，是一类由淀粉或多糖在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖单元通过alpha-1，4-糖苷键首尾相连的环状化合物的总称，常见的有6、7和8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-、β-和γ-环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。三种常用的环糊精中，由于β-环糊精水溶解度最小，易于通过分步结晶的方法制得，因此目前工业生产中大量制备和广泛应用的是β-环糊精，但是β-环糊精由于溶解度小使其在对药物包合作用方面的应用受到限制，目前科技工作者正致力于提高β-环糊精的溶解度，并且开发出了一系列高溶解度的β-环糊精衍生物(袁超，金征宇，王晨光.改性环糊精及其应用，粮食与油脂，2006，(05))。
α-环糊精空腔直径略小于β-环糊精，其溶解度是β-环糊精溶解度的8倍，相比于β-环糊精，α-环糊精具有独特的性质和特有的用途，更适于包合具有低分子量的分子，可以用于分子识别和纳米材料，并且是一种非常好的膳食纤维，在食品、医药等领域已显示出无可比拟的优势。虽然市场已大量销售α-环糊精产品，但由于α-环糊精生产成本较高，导致α-环糊精价格昂贵。
生产α-环糊精的方法主要有化学法和生物法，化学法是将马赛兰氏淀粉与四氯乙烷反应，生成α-环糊精粗品，再经过滤和水蒸汽蒸馏后得到纯度相对较高的α-环糊精(汪家铭；环状糊精生产应用及市场前景，精细与专用化学品，1998(02)，19-20)。由于α-环糊精溶解度较大，所以化学法制备比较困难，而且会对环境造成较大污染，生物法目前被认为是极具应用潜力的方法。然而，有关生物法制备β-环糊精的报道较多，关于生物法生产α-环糊精的报道则较少。陈龙然从土壤中分离出一株地衣芽孢杆菌，该菌发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉后，产物以α-环糊精为主，β-环糊精次之，二者比例为2.47∶1，环糊精总产率为29.8％(陈龙然，康培，冯明光，王雅芬，一株产环糊精葡萄糖基转移酶的地衣芽孢杆菌的选育、产酶条件及酶学特性，微生物学报，2005(01))。目前生物法生产α-环糊精主要问题在于：一、缺少优良菌种，市场上缺少高产率并且定向生产α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)；二、缺少α-环糊精相应的生产工艺，针对α-环糊精在水中溶解度较高的问题，需要制定一套高效、经济的分离提取方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产α-环糊精的工艺，降低了α-环糊精的生产成本。
为解决上述问题，本发明技术方案为：
按照10％的浓度进行淀粉调浆，在50-90℃条件下搅拌5-15分钟；将温度设定为30℃-60℃，调pH5.0-6.0后，按照每克淀粉10-100个单位的量加入来源于软化芽胞杆菌(Paenibacillus macerans，中国典型微生物保藏中心，CCTCC M 208063)α-CGTase，加入体积分数为5％的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到α-CGT。
所述微生物发酵生产α-CGTase的方法为，在一定培养条件下，微生物发酵一定时间，得到含有α-CGTase的发酵液，发酵液经过粗过滤、精过滤、浓缩、干燥等全部工艺或部分工艺后得到α-CGTase粉沫或者粗酶液。
所述在50-90℃条件下搅拌5-15分钟淀粉调浆的目的在于使淀粉颗粒充分溶胀。
所述α-CGTase的最适反应温度为30℃-40℃，温度通过影响酶对底物的催化效率，从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。从降低生产成本考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适温度附近，这样大大降低加入的酶量，从而降低生产成本。
所述α-CGTase的最适pH范围为5.0-6.0，pH对α-CGTase活力的影响较大，从降低成本的角度考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适反应pH附近。
α-CGTase活力的测定采用甲基分光光度法：在pH 1.1-1.4的酸性条件下，由于甲基橙和α-CGT形成包结复合物而使溶液吸光度下降，在一定浓度范围内吸光度下降值(ΔA)与α-CGT浓度之间存在着线性关系。取1％(W/V)可溶性淀粉溶液1mL和50mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.0)2mL，与0.1mL适当稀释的粗酶液混匀，40℃水浴中反应10min后，立即冰浴中止反应，再加入1.2mol/L HCl溶液0.1mL及0.035mmol/L甲基橙溶液2mL，15℃静置30min，在507nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol α-CGT所需的酶量。
α-CGT、β-环糊精的分析采用高效液相色谱。色谱条件：Waters 600 HPLC色谱仪，Waters自动进样器，色谱柱ZORBAX NH2(4.6mm×150mm)，Waters2410示差检测器；流动相(V/V)为70％乙腈水溶液，流速110mL/min；柱温30℃。处理样品时，粗酶液0.5mL与5.0％(W/V)淀粉溶液(50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)5mL混匀后在50℃反应24h后，4500r/min离心15min，弃沉淀，上清液中加入0.1mLα-淀粉酶液作用1h，0.45μm超滤膜过滤后取20μL上机分析。
所述有机溶剂可以为乙醇，异丙醇，正丁醇，正癸醇中任一一种，其中优选正癸醇。正癸醇不仅能与α-CGT特异性的形成包络物沉淀从而提高淀粉总的转化率，而且正癸醇可以通过水蒸气蒸馏几乎全部除去，极少残留在最终的产品中，不影响α-CGT在食品和医药领域中的应用。另外，正葵醇也是国标许可使用的食品添加剂。
所述回收有机溶剂，通过结晶手段得到α-CGT的具体方法为：
待反应结束后，将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括有机溶剂与α-CGT形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去有机溶剂，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-CGT的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-CGT的结晶。
本发明的技术原理如下：
α-CGTase除了能发生环化反应生产α-CGT外，还能发生水解、歧化和偶合反应，偶合反应是环化反应的逆反应，它可以将环糊精的环打开，然后转移到直链低聚糖上。在一定浓度麦芽低聚糖或葡萄糖等小分子糖的存在下，α-CGTase的环化反应受到抑制，影响最终收率。本发明直接采用糊化的淀粉来生产环糊精，在中温搅拌的条件下，淀粉颗粒充分溶胀，解除了葡萄糖等小分子糖对环化反应的抑制，提高了α-CGT的转化率。由于α-CGT可以与多种有机物形成不溶于水的包络物，添加一定比例的有机溶剂可以连续地从反应系统中去除环糊精，改变反应的平衡，使其向着环糊精的生成方向不断进行，有利于环糊精生产，同时解除了环糊精本身的产物抑制作用。
本发明是根据α-CGTase以及产物α-CGT的特点生产α-CGT的工艺，相对于现有技术，具有以下优点：
1)提供一种高转化率、低成本的α-CGT的生产方法，填补了该技术领域内的空白，为α-CGT大规模的生物法生产奠定了基础；
2)酶反应的温度比较低，不需要进行大量的升温降温控制，低能耗，特别适合工业化生产；
3)直接利用原淀粉作为底物，解除了葡萄糖、麦芽糖等小分子糖对α-CGT的生成的抑制作用，提高了α-CGT的转化率；
4)添加一定比例的有机溶剂，连续地从反应系统中去除环糊精，使其向着环糊精的生成方向不断进行，提高了α-CGT的转化率；
5)本反应总的反应周期短，只需要8-10小时；
6)有机溶剂去除过程方法简单，得到的产品纯度高，杂质少，可用于食品与医药等行业。
总体来讲，本发明具有生产成本低、原料转化率高、产品纯度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。
具体实施方式
实施例1：
原料预处理：
按照10％的浓度进行马铃薯淀粉调浆，在50-90℃条件下搅拌5-15分钟，使淀粉颗粒充分溶胀。
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括正癸醇与α-CGT形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去正癸醇，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-CGT的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-CGT的结晶。
结果见表1，淀粉的总转化率高达71％，产品中α-CGT所占比例为80％，β-CGT占20％。
表1不同实施例下α-CGT的生产情况
| 实施例 | 总转化率(％) | α-CGT所占比例(％) | β-CGT所占比例(％) |
| 1 | 71％ | 80％ | 20％ |
| 2 | 65％ | 75％ | 25％ |
| 3 | 63％ | 72％ | 28％ |
| 4 | 60％ | 65％ | 35％ |
| 5 | 72％ | 81％ | 19％ |
| 6 | 72％ | 81％ | 19％ |
| 7 | 71％ | 80％ | 20％ |
| 8 | 56％ | 60％ | 40％ |
| 9 | 57％ | 46％ | 54％ |
| 10 | 69％ | 74％ | 26％ |
实施例2
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为40℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达65％，产品中α-CGT所占比例为75％，β-CGT占25％。
实施例3
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后将温度设定为50℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达63％，产品中α-CGT所占比例为72％，β-CGT占28％。
实施例4
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度60℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达60％，产品中α-CGT所占比例为65％，β-CGT占35％。
实施例5
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉20个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达72％，产品中α-CGT所占比例为81％，β-CGT占19％。
实施例6
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉100个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达72％，产品中α-CGT所占比例为81％，β-CGT占19％。
实施例7
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH6.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正葵醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
同实施例1
结果见表1，淀粉的总转化率高达71％，产品中α-CGT所占比例为80％，β-CGT占20％。
实施例8
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的乙醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括乙醇与α-CGT形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去乙醇，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-CGT的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-CGT的结晶。
结果见表1，淀粉的总转化率高达56％，产品中α-CGT所占比例为60％，β-CGT占40％。
实施例9
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的异丙醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括异丙醇与α-CGT形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去异丙醇，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-CGT的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-CGT的结晶。
结果见表1，淀粉的总转化率高达57％，产品中α-CGT所占比例为46％，β-CGT占54％。
实施例10
原料预处理：
同实施例1
酶法生产工艺：
预处理后设置温度30℃，调pH5.0后，按照每克淀粉10个单位的比例加入α-CGTase，然后加入反应体积5％的正丁醇后，充分反应8-10小时。
α-CGT的提取工艺：
将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括正丁醇与α-CGT形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去正丁醇，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-CGT的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-CGT的结晶。
结果见表1，淀粉的总转化率高达69％，产品中α-CGT所占比例为74％，β-CGT占26％。
实施例11
环糊精葡萄糖基转移酶的制备：
3L发酵罐，培养基装液量为1.5L，接入软化芽胞杆菌(Paenibacillus macerans，CCTCCM 208063)，37℃条件下培养72h后下罐，将发酵液12000rpm离心15min除去菌体，得到上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶酶液。
发酵培养基组成为：
甘油：10g；蛋白胨：18g；酵母膏：20g；NH4Cl：12g；KH2PO4：2.31g；K2HPO4-3H2O：16.43；MgCl2：5mmol。
软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans，CCTCC M 208063)固体粉末的制备：
将软化芽胞杆菌发酵液经过微滤装置过滤，收集透出液；将透出液经过截留分子量为3万道尔顿的醋酸纤维超滤膜过滤，收集浓缩液；用真空冷冻干燥机处理浓缩液得到粉末状α-CGTase。
Claims (3)
1.一种生物法生产α-环糊精的生产工艺，其特征在于，按照10％的浓度进行淀粉调浆，在50-90℃条件下搅拌5-15分钟；设定温度30℃-60℃，调pH5.0-6.0后，按照每克淀粉10-100个单位的量加入来源于软化芽胞杆菌(Paenibacillus macerans，中国典型微生物保藏中心，CCTCC M 208063)α-环糊精葡萄糖基转移酶，加入体积分数为5％的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到α-环糊精。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于所述回收有机溶剂、结晶方法为：将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括有机溶剂与α-环糊精形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去有机溶剂，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到α-环糊精的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到α-环糊精的结晶。
3.根据权利要求1或2所述的生产工艺，其特征在于，所述的有机溶剂为乙醇，异丙醇，正丁醇，正癸醇中任一一种。
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