CN101705234A

CN101705234A - Mapkkk家族基因dsm1基因在控制水稻抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN101705234A
Application number: CN200910272694A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 宁婧
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2010-05-12

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的应用。通过功能分析和鉴定获得一个控制水稻抗旱性的关键基因DSM1，验证了该基因在水稻抗旱性抗逆遗传改良中的应用。所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一：序列表SEQ NO：1中第159-3494位所示的核苷酸序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。将水稻内源基因DSM1的功能缺失或其表达量降低后，水稻抗旱性极限著下降；将含DSM1基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的抗旱能力得到显著提高。

Description

MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高甘露醇耐受能力的水稻DSM1基因在水稻抗逆性遗传改良中的应用。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻抗旱基因DSM1，通过共分离检测表明该突变体与干旱敏感表型是紧密连锁的，及通过超量表达DSM1基因，使转基因水稻甘露醇耐受能力提高，证实了该基因的功能。

背景技术

植物的生长除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响了植物的生长，限制了植物的分布。非生物逆境会造成作物产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了适应或抵御这些逆境条件，植物在经过长期的生物驯化之后，形成了一套防御干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。干旱、高盐和低温胁迫，都破坏了植物细胞的离子平衡，致使细胞脱水，使植物细胞受到离子和水分胁迫，引起植物体在基因表达，新陈代谢以及形态上的变化，这些变化包括一些基因表达升高或降低，生长的减缓甚至停止，体内激素(如ABA)的瞬时上升，体内调节渗透压的物质的聚集等(Seki M，Umezawa T，Urano K，Shinozaki K.Regulatory metabolic networks in drought stress responses.Curr Opin Plant Biol，2007，10：296-302)。并且植物在进化过程中也形成了一系列的信号转导路径来介导对胁迫的反应，从而控制植物的生长发育。

以往对植物信号转导路径的认识仅局限于直接感知信号的感应或受体蛋白，或直接调控反应的转录因子和目标基因。而对处于这两者之间的基因的了解却十分有限。在最近几年中，科学家们已经鉴定多条信号转导路径，如与盐胁迫有关的Salt-Overly-Sensitive(SOS)路径、与多种逆境有关的CDPK信号路径、与冷胁迫有关的ICE1(Inducer of CBF Expression 1)-CBF(C-Repeat Binding Protein)路径、与渗透压有关的ABA依赖型和非ABA依赖型的信号转导路径以及裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)级联信号通路，其中MAPK级联信号通路在植物的各种生理反应如细胞分裂、激素反应、非生物胁迫和生物胁迫中都起着及其重要的作用(Jonak C，Kiegerl S，Ligterink W，Barker P J，Huskisson N S，Hirt H.Stresssignaling in plants：a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought.Proc Natl AcadSci U S A，1996，93：11274-11279)。MAPK级联信号通路是高度保守的，他通过三级激酶级联反应，即MAPKKK(MAP Kinase Kinase Kinase)→MAPKK(MAP Kinase Kinase)→MAPK，但是，一直以来，人们只知道MAPK级联途径由这3种激酶组成，但就具体的MAPK级联通路的组成、生理功能、目标基因等情况还知之甚少，特别是参与非生物逆境应答的完整MAPK级联通路还未见报道。因此对非生物逆境应答的MAPK级联通路研究有很重要的意义(Tena G，Asai T，Chiu W L，Sheen J.Plant mitogen-activated protein kinasesignaling cascades.Curr Opin Plant Biol，2001，4：392-400)。

水稻是重要的粮食作物和模式植物，通过水稻突变体来研究一些与植物生长、发育和其他性状相关的基因已成为一种重要的基因功能研究手段。在我们的前期研究中分离到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个MAPKKK基因。鉴于水稻中MAPKKK是否能提高植物的抗逆性目前尚无相关报道。因此，从水稻中分离出MAPKKK基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的涉及一个MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。从水稻T-DNA突变体库中分离得到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个MAPKKK基因，基于这个突变体的表型，申请人将该基因命名为DSM1(drought-sensitive mutant 1)。本发明分离和应用一种包含DSM1基因的DNA片段，该片段赋予水稻在逆境条件下抗性增强的能力。其中，所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQNO：1中第159-3494位所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；或

3)1)和2)所包含的亚片断。

携带有本发明DSM1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

可使用包括本发明的DSM1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种。

本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物在逆境条件下的生长速度。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有DSM1基因编码区的核苷酸序列。

图1.根据插入位点设计引物验证共分离示意图。A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1代植株中，纯合突变体只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。

图2.根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。上一行引物：A+B，下一行引物：C+B，其中泳道2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24为T-DNA纯合；1，3，6，8，14，15为T-DNA杂合；4，7，9，10，12为T-DNA阴性。

图3.水稻突变体表型。上：干旱胁迫前。下：干旱胁迫后。ZH11为野生型对照，dsm1-1为DSM1 T-DNA突变体。

图4.DSM1能被多种逆境(干旱、高盐、低温、ABA等)诱导表达。

图5.正常生长和120mmol/L甘露醇胁迫下，3个DSM1超量表达转基因家系(T1)和对照生长状况的比较。

图6.甘露醇胁迫地上部分统计结果。

图7.超表达实验所用pU1301载体图。

图8.DSM1基因抑制表达转基因家系干旱胁迫表型。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离DSM1T-DNA突变体，克隆包含有DSM1基因完整编码区段和基因的启动子区段的DNA片段，以及验证DSM1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：分离DSM1 T-DNA突变体

基于已报道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白质序列建立隐马尔可夫模型(HMMs：Hidden Markovmodel profiles)然后用HMMER扫描水稻全基因组，得到水稻基因组里所有可能的MAPKKK基因。然后从水稻突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)中挑取相应的T-DNA突变体。本发明所涉及的序列来源于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http://www.tigr.org)，KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 4”为准。

其中DSM1 T-DNA突变体的侧翼序列为：

TAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTTCGCAATCGTCGCCTTGATATTCCAGTATAACACTGATCCCGCCATTGCAGAAATAATAGCAAAATGCTGGCAGACGTTAGTGTGCCTAACTCACTTTGTCGCTCATCTGCATTCTTCCGGACGCACTAAAACCTGCATTCCATTTTCGGAATACACAACCATTTTCTCAGTGTTGCTTCCTGTATTTGGTGTAGGGACCCAAAATTGCGGCCATCATTTGCAGATATCATGGCCTCATTGAAACCACTGCTGAAAAACATGACCGCTCAAGCGCCAAGGCAGAGAGTACAACAAACCGACGAGTAAGAAAAAAGAGGATGTTACCAGCTGCCCGAAGGCCTAAGTATAGCATTTTTTTTTGTTTTTTGTTTAGTAACACCAATTGTGTGTTCGAGATTGGAAAGCGTGATGATGTTAGTGTGCTGGGTATCCATCTGGGAAGACCAGCGCTGCCAAACCCGTCCACGATGGAGGAAAATTGAACAGGGGCAAGAAACTGTGCAAACGCGAATCAAATGTTTAGCACAGTTCTTCCCCAAAAACACCAGTCTCAGGAAATCACATGGCGGGCGGAAGTTACACATGCTTTTTTCATACCATCTCTCTTTTCCTTTATCTCGTGTTCTCCACCAAATGGTAGTATTTGTGTAATATGGCAAGTAAAAAGAACAGAAAATGATTTGCTGTCCATCATGAAAAATGAAAAAGGAGAAAACGGTTGTTCAATCGTGCTCAGTGCTTCCCTAAACCCTACTGTGACAGGTGATTAGTGATGTTTAGAAATAACAAAATGTTATGAAAGACAGAAGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAACTGAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTCCGCCAGTCTTACACATTATTCCCAGGATGTGGCGTCATCGGCGACTAGGCGTGCCCTTGCCTATCTACTCGTTCTGGGAATTGGCATAGTTAATCTATACACAACTTCTCC

根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物A和B，及T-DNA上设计一条引物C，如图1，A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物.在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物.根据插入位点设计的引物序列为A(引物)：5′CACCGTCCTCGGGTTTATC3′B(引物)：5′AGTTTCTTGCCGCTGTTCA 3′C(引物)：5′AATCCAGATCCCCCGAATTA3′。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。PCR结果，如图1，2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24为T-DNA纯合；1，3，6，8，14，15为T-DNA杂合；4，7，9，10，12为T-DNA阴性。结果表明这个T-DNA插在第12个EXON，据ATG 7174bp处。

实施例2：鉴定突变体干旱胁迫表型

将已鉴定好基因型的纯合和野生型家系催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按2∶3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫12天，然后复水7天，拍照并调查植株的存活率。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型，在中度胁迫复水后，纯合植株基本全部死亡，而野生型仍有60％以上的存活率。该实验经行了3次生物学重复，结果一致。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。

为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代。将T1代收获的种子播种得到T2代纯合，杂合和野生型种子。同样经行上述胁迫实验，结果一致。

实施例3：检测水稻内源DSM1基因的表达水平

我们选用籼稻品种中花11号(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua 11)作为表达谱分析时材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养18-20天，至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将幼苗直接从水培液中取出暴露于空气中，分别在胁迫前、胁迫后6小时、24小时、36小时取样；高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，2小时、6小时、12小时取样；低温胁迫是把水稻幼苗放入4℃人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后3小时、7小时、12时取样。激素处理是用100μM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后3小时、6小时、12小时取样。所有的处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行的。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，42℃120min，70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5’-GTGGTCATGGTCCATTATTGCC-3’和5’-CCCAAACCCTCAACTGGCTTA-3’)对DSM1基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长72bp)。同时用引物(AF：5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR：5’-TGCACAAT GGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析.反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，40个循环.反应过程中进行荧光检测实时定量分析.结果表明，DSM1基因在高盐、ABA和干旱处理后诱导上升表达，在低温胁迫中也有轻微地下降表达(见图3).

实施例4：DSM1基因超量表达、抑制表达载体的构建和遗传转化

为了能更好的分析DSM1基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达和抑制表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建方法如下：首先通过查找日本水稻全长数据库Knowledge-based Oryza Molecularbiological Encyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J033107F14(登录号：AK102767)，并购买其全长cDNA。已该全长cDNA为模板，用引物DSMFLF(5’-CCAGGTACCCAACAGTGGGCAATAGG-3’)和DSMFLR(5’-CCAGGATCCTGGTTTCAATGAGGCCATG-3’)，扩增出包含DSM1全长的DNA片断，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，50℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min。用BamHI和KpnI双酶切，回收次PCR片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含DSM1全长的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pCAMBIA1301U(见图7)是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(载体pCAMBIA1301来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的Ubiquitin启动子(参见：Toki S，Takamatsu S，Nojiri C，Ooba S，Anzai H，Iwata M，Christensen A H，QuailP H，Uchimiya H.Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants.Plant Physiol，1992，100：1503-1507)而得到的(见图7)，被命名为遗传转化的载体pCAMBIA1301U。

抑制表达载体构建方法如下：首先通过查找日本水稻全长数据库Knowledge-based Oryza Molecularbiological Encyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J033107F14，并购买其全长cDNA。以该全长cDNA为模板，用引物uz41maif(5′cca actagt ggtacc TTGTAGCACCACCTGACT3′)和uz41mair (5′cca gagctc ggatcc ATTGAAGACGCAACCACT3′)，扩增出包含DSM1全长的400bp片断，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。用BamHI和KpnI双酶切或SpeI和SacI双酶切，回收该PCR片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pds1301(见图7)酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含DSM1400bp的酶切片段和酶切后的载体pds1301(见图7)做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选获得阳性克隆。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将以上载体(pCAMBIA1301U和pds1301)导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)基础上改良进行(如下述具体步骤)。

具体遗传转化步骤如下：

(1)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。

(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。

(6)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26℃。

(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)愈伤组织诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

实施例5：DSM1超量表达转基因T₁代家系在甘露醇胁迫下的生长状况

本实施例选取了3个DSM1超量表达T₁家系进行了甘露醇胁迫实验。具体步骤如下：将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有0mmol/L和120mmol/L的甘露醇的1/2MS培养基上，在光照培养室生长10天后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不少于15棵植株，实验设置3次重复。结果表明：DSM1超量表达的转基因植株的生长在正常条件下略差于对照，但在逆境胁迫处理后生长要显著(t测验P＜0.01)优于对照，说明本发明的DSM1基因的表达可以缓解甘露醇胁迫造成的植株生长受阻，增强转基因植物对非生物逆境的抗性(见图5、图6)。

实施例6：DSM1抑制表达转基因T₁代家系在干旱胁迫下的生长状况

本发明选取了3个DSM1抑制表达T1家系进行了甘露醇胁迫实验.具体步骤如下：将抑制表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到正常1/2MS培养基上，在光照培养室生长10天后，将幼苗移入装有沙土的小圆桶中.试验用的沙土为南方水稻土与粗沙按重量份2∶3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复.等幼苗生长至4叶期后，对植株进行断水干旱胁迫12天，然后复水7天，拍照并调查植株的存活率.试验表明，本实施例与野生型对照相比，抑制表达植株表现为干旱敏感表型(图8).

序列表

<110>华中农业大学

<120>MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的应用

<130>

<141>2009-11-10

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3845

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3845)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(159)..(3494)

<223>

<400>1

ggagtcaata cctgcctaaa gttgagttac cccttccgcc tcagcgtcag tggccatgtc 60

ggatccaccc acccaccacc agcaacagtg ggcaataggc caatagctgc tgctgcgacg 120

gcgacctcgg cggcggcggc ggcggcggtg gcgacggc atg aag aac ttc ttc agg 176

Met Lys Asn Phe Phe Arg

1 5

g ctc cac atc ggg gag ggg tcg ggc gac ggc gcc tcc tcg tct ccc 224

Lys Leu His Ile Gly Glu Gly Ser Gly Asp Gly Ala Ser Ser Ser Pro

10 15 20

cct cca ccg ccc tcc tcg agg aag ggg agc ggc ggg gtg ggg ggt aat 272

Pro Pro Pro Pro Ser Ser Arg Lys Gly Ser Gly Gly Val Gly Gly Asn

25 30 35

cat cac ctg cac gcc gag cag agg cag cca tcg gcg tcg gcg gtg tcg 320

His His Leu His Ala Glu Gln Arg Gln Pro Ser Ala Ser Ala Val Ser

40 45 50

agc tgg ctt gat tcc gtc cca ggt cgg cct cag ccc cct acg ccg tcg 368

Ser Trp Leu Asp Ser Val Pro Gly Arg Pro Gln Pro Pro Thr Pro Ser

55 60 65 70

acg ccg tcg gag gcg gag ggg tcg ccg ttc tcg tcg tcg gta ggg tcg 416

Thr Pro Ser Glu Ala Glu Gly Ser Pro Phe Ser Ser Ser Val Gly Ser

75 80 85

ggg gcg gag gag agg agg caa tcc gtg gcg gct gag agg agg aga tcg 464

Gly Ala Glu Glu Arg Arg Gln Ser Val Ala Ala Glu Arg Arg Arg Ser

90 95 100

cag gag gag gag tgg gag agg agg cgg tcg cag gag gaa gag gcc gtg 512

Gln Glu Glu Glu Trp Glu Arg Arg Arg Ser Gln Glu Glu Glu Ala Val

105 110 115

agg gag atg agg cgg tcg cag gag gag gac gag gtg gag gag cga gtg 560

Arg Glu Met Arg Arg Ser Gln Glu Glu Asp Glu Val Glu Glu Arg Val

120 125 130

ata agg gag tcg tcg gag gcg gag gag agg aag cgg gtc agg gag aag 608

Ile Arg Glu Ser Ser Glu Ala Glu Glu Arg Lys Arg Val Arg Glu Lys

135 140 145 150

gag gac gac gac ctt gag gag ttc cag ctg cag ctt gtg ctt gag atg 656

Glu Asp Asp Asp Leu Glu Glu Phe Gln Leu Gln Leu Val Leu Glu Met

155 160 165

agc gcg cgg gac aat cct gaa gag atg gag att gaa gtt gcc aag cag 704

Ser Ala Arg Asp Asn Pro Glu Glu Met Glu Ile Glu Val Ala Lys Gln

170 175 180

atc agc ctg ggc ttc tgc ccg cct cag agc tct act gca gag gcc ctc 752

Ile Ser Leu Gly Phe Cys Pro Pro Gln Ser Ser Thr Ala Glu Ala Leu

185 190 195

gcg gcc cga tac tgg aat ttc aac gcc ctt ggc tat gat gac aga ata 800

Ala Ala Arg Tyr Trp Asn Phe Asn Ala Leu Gly Tyr Asp Asp Arg Ile

200 205 210

tca gat ggg ttt tat gat ctc tat gtg act ggg aat ggc ccg gct tca 848

Ser Asp Gly Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Thr Gly Asn Gly Pro Ala Ser

215 220 225 230

ata acc atg ccc tct ctt aaa gat ttg cga gcg cag tca cta tca cat 896

Ile Thr Met Pro Ser Leu Lys Asp Leu Arg Ala Gln Ser Leu Ser His

235 240 245

agg gtc aac tgg gaa gct gta ttg gta cac aga ggt gaa gat cct gag 944

Arg Val Asn Trp Glu Ala Val Leu Val His Arg Gly Glu Asp Pro Glu

250 255 260

ctt atg aaa ctt gac cag acg gct cta atc atg agc ctt gaa ctc cgt 992

Leu Met Lys Leu Asp Gln Thr Ala Leu Ile Met Ser Leu Glu Leu Arg

265 270 275

gaa tct aaa cct tca gaa ttt gtt gga aat gat ttg gtt cag aaa ctt 1040

Glu Ser Lys Pro Ser Glu Phe Val Gly Asn Asp Leu Val Gln Lys Leu

280 285 290

gct ggc cta gta gcc aga cac atg ggt gga act ttt ttt gat tct gag 1088

Ala Gly Leu Val Ala Arg His Met Gly Gly Thr Phe Phe Asp Ser Glu

295 300 305 310

ggc atg ttg gtg aaa tac cag aaa atg atg aga tac ctg aga acc agt 1136

Gly Met Leu Val Lys Tyr Gln Lys Met Met Arg Tyr Leu Arg Thr Ser

315 320 325

att gga agt gta gtt gtt cct ctt ggc caa tta aaa att ggt ctg gca 1184

Ile Gly Ser Val Val Val Pro Leu Gly Gln Leu Lys Ile Gly Leu Ala

330 335 340

cgt cat cgt gca ctg cta ttt aag gtt ttg gcc gat aac att ggt atc 1232

Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys Val Leu Ala Asp Asn Ile Gly Ile

345 350 355

ccc tgt cga ctc ctg aaa gga agg cag tac act gga tcg gac gat ggg 1280

Pro Cys Arg Leu Leu Lys Gly Arg Gln Tyr Thr Gly Ser Asp Asp Gly

360 365 370

gct ttg aat att gtg aaa ttt gat gat gga agg gag ttc att gtt gat 1328

Ala Leu Asn Ile Val Lys Phe Asp Asp Gly Arg Glu Phe Ile Val Asp

375 380 385 390

ctt gtc gca gat cct ggt aca ctt att cct tca gat ggt gct gtt ttg 1376

Leu Val Ala Asp Pro Gly Thr Leu Ile Pro Ser Asp Gly Ala Val Leu

395 400 405

tct aca gaa ttt gaa gaa agt tcc ttc tca aat aat cat cat ttt aac 1424

Ser Thr Glu Phe Glu Glu Ser Ser Phe Ser Asn Asn His His Phe Asn

410 415 420

aaa gat aat gac atc agg cag ttg gga tct tca aat agt tta tcg aat 1472

Lys Asp Asn Asp Ile Arg Gln Leu Gly Ser Ser Asn Ser Leu Ser Asn

425 430 435

tct gca tgt agt tct ttt gag tgt gag tta ctt gac aga aga tct aca 1520

Ser Ala Cys Ser Ser Phe Glu Cys Glu Leu Leu Asp Arg Arg Ser Thr

440 445 450

tgg atc aac gtt ggt cct tct gat agt gat gga gct aca acg agc cag 1568

Trp Ile Asn Val Gly Pro Ser Asp Ser Asp Gly Ala Thr Thr Ser Gln

455 460 465 470

aca agt aaa aac aat caa caa aat aca cta tca gat tca ttc ggg att 1616

Thr Ser Lys Asn Asn Gln Gln Asn Thr Leu Ser Asp Ser Phe Gly Ile

475 480 485

tta tct gtt agc aca ttc act agt gaa aat agg cct att aca aat gaa 1664

Leu Ser Val Ser Thr Phe Thr Ser Glu Asn Arg Pro Ile Thr Asn Glu

490 495 500

tca aga agt aca gac gac att gct gcc gca aag aac aaa gaa aga tca 1712

Ser Arg Ser Thr Asp Asp Ile Ala Ala Ala Lys Asn Lys Glu Arg Ser

505 510 515

agt gta aca att aat tct tcg tca act tca cct tca cct tct tcc cca 1760

Ser Val Thr Ile Asn Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Pro Ser Ser Pro

520 525 530

gaa gta ggc agt act cca gct gtc cgg agg atg aaa gta aag gat att 1808

Glu Val Gly Ser Thr Pro Ala Val Arg Arg Met Lys Val Lys Asp Ile

535 540 545 550

tcg gag tac atg att aat gct gcc aaa gag aat cca caa cta gct cag 1856

Ser Glu Tyr Met Ile Asn Ala Ala Lys Glu Asn Pro Gln Leu Ala Gln

555 560 565

aag atc cat gag gtt tta ctt gaa aat gga gtt gta gca cca cct gac 1904

Lys Ile His Glu Val Leu Leu Glu Asn Gly Val Val Ala Pro Pro Asp

570 575 580

ttg ttt tca gaa gat tcc atg gaa gag cca aag gac ctc atc gtg tat 1952

Leu Phe Ser Glu Asp Ser Met Glu Glu Pro Lys Asp Leu Ile Val Tyr

585 590 595

gac acc acc ctt ttt caa agc aag gat gaa atg aaa aag agg atg aat 2000

Asp Thr Thr Leu Phe Gln Ser Lys Asp Glu Met Lys Lys Arg Met Asn

600 605 610

gaa ctt ggg tcg agg gaa tat gct gat cgt ggt cat ggt cca tta ttg 2048

Glu Leu Gly Ser Arg Glu Tyr Ala Asp Arg Gly His Gly Pro Leu Leu

615 620 625 630

cct cat cat cct gga cat gaa ctc cca tca aaa gtt cct cac cgg gca 2096

Pro His His Pro Gly His Glu Leu Pro Ser Lys Val Pro His Arg Ala

635 640 645

cct cta gac tca ctt aag cca gtt gag ggt ttg ggc att gac cac ccc 2144

Pro Leu Asp Ser Leu Lys Pro Val Glu Gly Leu Gly Ile Asp His Pro

650 655 660

cct gac atc caa gat aac aca tct ttt att tct cag tat gaa cct tct 2192

Pro Asp Ile Gln Asp Asn Thr Ser Phe Ile Ser Gln Tyr Glu Pro Ser

665 670 675

gca cct ccc cag gaa gct tca tcg cag ctt aca aag caa ttg cct gtt 2240

Ala Pro Pro Gln Glu Ala Ser Ser Gln Leu Thr Lys Gln Leu Pro Val

680 685 690

acg gct gct gct gtt gca act gct gca gtg gtt gcg tct tca atg gtt 2288

Thr Ala Ala Ala Val Ala Thr Ala Ala Val Val Ala Ser Ser Met Val

695 700 705 710

gtt gct gct gct aaa tca aac aat gat gtg aac ttt gac gtg cct gtt 2336

Val Ala Ala Ala Lys Ser Asn Asn Asp Val Asn Phe Asp Val Pro Val

715 720 725

gca gct gct gca aca gtc act gca gct gca gtt gtt gcc aca act gct 2384

Ala Ala Ala Ala Thr Val Thr Ala Ala Ala Val Val Ala Thr Thr Ala

730 735 740

gct gtt agc aag caa tat gaa cac ttg gag cct ggt aat cag ctg cat 2432

Ala Val Ser Lys Gln Tyr Glu His Leu Glu Pro Gly Asn Gln Leu His

745 750 755

agt tta cca agt ccc tcc gaa ggg aat gaa tca atc gag aaa agt gca 2480

Ser Leu Pro Ser Pro Ser Glu Gly Asn Glu Ser Ile Glu Lys Ser Ala

760 765 770

gat gag ttt tgg gat aaa cag aat ttt gaa att gat cat ggt caa gat 2528

Asp Glu Phe Trp Asp Lys Gln Asn Phe Glu Ile Asp His Gly Gln Asp

775 780 785 790

aat act ttg gat caa gaa aaa gat tca gct gaa gtt cgc cag gat gct 2576

Asn Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp Ser Ala Glu Val Arg Gln Asp Ala

795 800 805

gaa aga acc tca gat aag tca agc gga aca gag agt gca aaa tct gaa 2624

Glu Arg Thr Ser Asp Lys Ser Ser Gly Thr Glu Ser Ala Lys Ser Glu

810 815 820

atc act ctg gat gat gtt gcg gag ttt gaa atc caa tgg gaa gaa att 2672

Ile Thr Leu Asp Asp Val Ala Glu Phe Glu Ile Gln Trp Glu Glu Ile

825 830 835

act att ggg gaa cgc att ggt ctt gga tca ttt gga gaa gtt tat aga 2720

Thr Ile Gly Glu Arg Ile Gly Leu Gly Ser Phe Gly Glu Val Tyr Arg

840 845 850

gga gag tgg cat gga aca gaa gtt gct gta aag aag ttt ctg caa caa 2768

Gly Glu Trp His Gly Thr Glu Val Ala Val Lys Lys Phe Leu Gln Gln

855 860 865 870

gat att tca agt gat gct ctg gaa gaa ttt aga act gag gtg cga ata 2816

Asp Ile Ser Ser Asp Ala Leu Glu Glu Phe Arg Thr Glu Val Arg Ile

875 880 885

atc aag agg ttg cgg cat ccg aat gtt gtt ctc ttc atg ggt gct att 2864

Ile Lys Arg Leu Arg His Pro Asn Val Val Leu Phe Met Gly Ala Ile

890 895 900

act cgt gta ccc aat ctt tct att gtc aca gaa ttt ctt cca aga ggt 2912

Thr Arg Val Pro Asn Leu Ser Ile Val Thr Glu Phe Leu Pro Arg Gly

905 910 915

agc tta ttt cgg tta att cat cgt ccc aac aac cag ttg gat gaa aga 2960

Ser Leu Phe Arg Leu Ile His Arg Pro Asn Asn Gln Leu Asp Glu Arg

920 925 930

aag cgc tta aga atg gca ctt gat gtg gca cgt ggt atg aat tat cta 3008

Lys Arg Leu Arg Met Ala Leu Asp Val Ala Arg Gly Met Asn Tyr Leu

935 940 945 950

cat aac tgc aca ccg gtg ata gtc cat cga gat ctg aag tct cca aac 3056

His Asn Cys Thr Pro Val Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Pro Asn

955 960 965

cta ctg gtt gac aag aat tgg gtt gtg aag gtt tgc gac ttt ggt tta 3104

Leu Leu Val Asp Lys Asn Trp Val Val Lys Val Cys Asp Phe Gly Leu

970 975 980

tct aaa atg aag aac aag acc ttc ttg tca tca aga tca aca gct gga 3152

Ser Lys Met Lys Asn Lys Thr Phe Leu Ser Ser Arg Ser Thr Ala Gly

985 990 995

aca gcg gag tgg atg gca cct gaa gta ctt cgt aat gaa cca tca 3197

Thr Ala Glu Trp Met Ala Pro Glu Val Leu Arg Asn Glu Pro Ser

1000 1005 1010

gac gag aaa tgc gat gtt ttt agc tat ggg gtc ata ctg tgg gaa 3242

Asp Glu Lys Cys Asp Val Phe Ser Tyr Gly Val Ile Leu Trp Glu

1015 1020 1025

ctt tgt aca tta ctg caa cct tgg gga ggc atg aac gcc atg caa 3287

Leu Cys Thr Leu Leu Gln Pro Trp Gly Gly Met Asn Ala Met Gln

1030 1035 1040

gtc gtc gga gct gtt ggg ttt cag aat cgt cgc ctt gat att cca 3332

Val Val Gly Ala Val Gly Phe Gln Asn Arg Arg Leu Asp Ile Pro

1045 1050 1055

gat aac act gat ccc gcc att gca gaa ata ata gca aaa tgc tgg 3377

Asp Asn Thr Asp Pro Ala Ile Ala Glu Ile Ile Ala Lys Cys Trp

1060 1065 1070

cag acg gac cca aaa ttg cgg cca tca ttt gca gat atc atg gcc 3422

Gln Thr Asp Pro Lys Leu Arg Pro Ser Phe Ala Asp Ile Met Ala

1075 1080 1085

tca ttg aaa cca ctg ctg aaa aac atg acc gct caa gcg cca agg 3467

Ser Leu Lys Pro Leu Leu Lys Asn Met Thr Ala Gln Ala Pro Arg

1090 1095 1100

cag aga gta caa caa acc gac gag taa gaaaaaagag gatgttacca 3514

Gln Arg Val Gln Gln Thr Asp Glu

1105 1110

gctgcccgaa ggcctaagta tagcattttt ttttgttttt tgtatagtaa caccaattgt 3574

gtgttcgaga ttggaaagcg tgatgatgtt agtgtgctgg gtatccatct gtgaagacca 3634

gcgctgccaa acccgtccac gatggaggaa aattgaacag cggcaagaaa ctgtgcaaac 3694

gcgaatcaaa tgtttagcac agttcttccc caaaaacacc agtctcagga aatcacatgg 3754

cgggcggaag ttacacatgc ttttttcata ccatctctct tttcctttat ctcgtgttct 3814

ccaccaaatg gtggtatttg tgtaatatgg c 3845

<210>2

<211>1111

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa

<400>2

Met Lys Asn Phe Phe Arg Lys Leu His Ile Gly Glu Gly Ser Gly Asp

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Arg Lys Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Val Gly Gly Asn His His Leu His Ala Glu Gln Arg Gln Pro

35 40 45

Ser Ala Ser Ala Val Ser Ser Trp Leu Asp Ser Val Pro Gly Arg Pro

50 55 60

Gln Pro Pro Thr Pro Ser Thr Pro Ser Glu Ala Glu Gly Ser Pro Phe

65 70 75 80

Ser Ser Ser Val Gly Ser Gly Ala Glu Glu Arg Arg Gln Ser Val Ala

85 90 95

Ala Glu Arg Arg Arg Ser Gln Glu Glu Glu Trp Glu Arg Arg Arg Ser

100 105 110

Gln Glu Glu Glu Ala Val Arg Glu Met Arg Arg Ser Gln Glu Glu Asp

115 120 125

Glu Val Glu Glu Arg Val Ile Arg Glu Ser Ser Glu Ala Glu Glu Arg

130 135 140

Lys Arg Val Arg Glu Lys Glu Asp Asp Asp Leu Glu Glu Phe Gln Leu

145 150 155 160

Gln Leu Val Leu Glu Met Ser Ala Arg Asp Asn Pro Glu Glu Met Glu

165 170 175

Ile Glu Val Ala Lys Gln Ile Ser Leu Gly Phe Cys Pro Pro Gln Ser

180 185 190

Ser Thr Ala Glu Ala Leu Ala Ala Arg Tyr Trp Asn Phe Asn Ala Leu

195 200 205

Gly Tyr Asp Asp Arg Ile Ser Asp Gly Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Thr

210 215 220

Gly Asn Gly Pro Ala Ser Ile Thr Met Pro Ser Leu Lys Asp Leu Arg

225 230 235 240

Ala Gln Ser Leu Ser His Arg Val Asn Trp Glu Ala Val Leu Val His

245 250 255

Arg Gly Glu Asp Pro Glu Leu Met Lys Leu Asp Gln Thr Ala Leu Ile

260 265 270

Met Ser Leu Glu Leu Arg Glu Ser Lys Pro Ser Glu Phe Val Gly Asn

275 280 285

Asp Leu Val Gln Lys Leu Ala Gly Leu Val Ala Arg His Met Gly Gly

290 295 300

Thr Phe Phe Asp Ser Glu Gly Met Leu Val Lys Tyr Gln Lys Met Met

305 310 315 320

Arg Tyr Leu Arg Thr Ser Ile Gly Ser Val Val Val Pro Leu Gly Gln

325 330 335

Leu Lys Ile Gly Leu Ala Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys Val Leu

340 345 350

Ala Asp Asn Ile Gly Ile Pro Cys Arg Leu Leu Lys Gly Arg Gln Tyr

355 360 365

Thr Gly Ser Asp Asp Gly Ala Leu Asn Ile Val Lys Phe Asp Asp Gly

370 375 380

Arg Glu Phe Ile Val Asp Leu Val Ala Asp Pro Gly Thr Leu Ile Pro

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ala Val Leu Ser Thr Glu Phe Glu Glu Ser Ser Phe Ser

405 410 415

Asn Asn His His Phe Asn Lys Asp Asn Asp Ile Arg Gln Leu Gly Ser

420 425 430

Ser Asn Ser Leu Ser Asn Ser Ala Cys Ser Ser Phe Glu Cys Glu Leu

435 440 445

Leu Asp Arg Arg Ser Thr Trp Ile Asn Val Gly Pro Ser Asp Ser Asp

450 455 460

Gly Ala Thr Thr Ser Gln Thr Ser Lys Asn Asn Gln Gln Asn Thr Leu

465 470 475 480

Ser Asp Ser Phe Gly Ile Leu Ser Val Ser Thr Phe Thr Ser Glu Asn

485 490 495

Arg Pro Ile Thr Asn Glu Ser Arg Ser Thr Asp Asp Ile Ala Ala Ala

500 505 510

Lys Asn Lys Glu Arg Ser Ser Val Thr Ile Asn Ser Ser Ser Thr Ser

515 520 525

Pro Ser Pro Ser Ser Pro Glu Val Gly Ser Thr Pro Ala Val Arg Arg

530 535 540

Met Lys Val Lys Asp Ile Ser Glu Tyr Met Ile Asn Ala Ala Lys Glu

545 550 555 560

Asn Pro Gln Leu Ala Gln Lys Ile His Glu Val Leu Leu Glu Asn Gly

565 570 575

Val Val Ala Pro Pro Asp Leu Phe Ser Glu Asp Ser Met Glu Glu Pro

580 585 590

Lys Asp Leu Ile Val Tyr Asp Thr Thr Leu Phe Gln Ser Lys Asp Glu

595 600 605

Met Lys Lys Arg Met Asn Glu Leu Gly Ser Arg Glu Tyr Ala Asp Arg

610 615 620

Gly His Gly Pro Leu Leu Pro His His Pro Gly His Glu Leu Pro Ser

625 630 635 640

Lys Val Pro His Arg Ala Pro Leu Asp Ser Leu Lys Pro Val Glu Gly

645 650 655

Leu Gly Ile Asp His Pro Pro Asp Ile Gln Asp Asn Thr Ser Phe Ile

660 665 670

Ser Gln Tyr Glu Pro Ser Ala Pro Pro Gln Glu Ala Ser Ser Gln Leu

675 680 685

Thr Lys Gln Leu Pro Val Thr Ala Ala Ala Val Ala Thr Ala Ala Val

690 695 700

Val Ala Ser Ser Met Val Val Ala Ala Ala Lys Ser Asn Asn Asp Val

705 710 715 720

Asn Phe Asp Val Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Val Thr Ala Ala Ala

725 730 735

Val Val Ala Thr Thr Ala Ala Val Ser Lys Gln Tyr Glu His Leu Glu

740 745 750

Pro Gly Asn Gln Leu His Ser Leu Pro Ser Pro Ser Glu Gly Asn Glu

755 760 765

Ser Ile Glu Lys Ser Ala Asp Glu Phe Trp Asp Lys Gln Asn Phe Glu

770 775 780

Ile Asp His Gly Gln Asp Asn Thr Leu Asp Gln Glu Lys Asp Ser Ala

785 790 795 800

Glu Val Arg Gln Asp Ala Glu Arg Thr Ser Asp Lys Ser Ser Gly Thr

805 810 815

Glu Ser Ala Lys Ser Glu Ile Thr Leu Asp Asp Val Ala Glu Phe Glu

820 825 830

Ile Gln Trp Glu Glu Ile Thr Ile Gly Glu Arg Ile Gly Leu Gly Ser

835 840 845

Phe Gly Glu Val Tyr Arg Gly Glu Trp His Gly Thr Glu Val Ala Val

850 855 860

Lys Lys Phe Leu Gln Gln Asp Ile Ser Ser Asp Ala Leu Glu Glu Phe

865 870 875 880

Arg Thr Glu Val Arg Ile Ile Lys Arg Leu Arg His Pro Asn Val Val

885 890 895

Leu Phe Met Gly Ala Ile Thr Arg Val Pro Asn Leu Ser Ile Val Thr

900 905 910

Glu Phe Leu Pro Arg Gly Ser Leu Phe Arg Leu Ile His Arg Pro Asn

915 920 925

Asn Gln Leu Asp Glu Arg Lys Arg Leu Arg Met Ala Leu Asp Val Ala

930 935 940

Arg Gly Met Asn Tyr Leu His Asn Cys Thr Pro Val Ile Val His Arg

945 950 955 960

Asp Leu Lys Ser Pro Asn Leu Leu Val Asp Lys Asn Trp Val Val Lys

965 970 975

Val Cys Asp Phe Gly Leu Ser Lys Met Lys Asn Lys Thr Phe Leu Ser

980 985 990

Ser Arg Ser Thr Ala Gly Thr Ala Glu Trp Met Ala Pro Glu Val Leu

995 1000 1005

Arg Asn Glu Pro Ser Asp Glu Lys Cys Asp Val Phe Ser Tyr Gly

1010 1015 1020

Val Ile Leu Trp Glu Leu Cys Thr Leu Leu Gln Pro Trp Gly Gly

1025 1030 1035

Met Asn Ala Met Gln Val Val Gly Ala Val Gly Phe Gln Asn Arg

1040 1045 1050

Arg Leu Asp Ile Pro Asp Asn Thr Asp Pro Ala Ile Ala Glu Ile

1055 1060 1065

Ile Ala Lys Cys Trp Gln Thr Asp Pro Lys Leu Arg Pro Ser Phe

1070 1075 1080

Ala Asp Ile Met Ala Ser Leu Lys Pro Leu Leu Lys Asn Met Thr

1085 1090 1095

Ala Gln Ala Pro Arg Gln Arg Val Gln Gln Thr Asp Glu

1100 1105 1110

Claims

1.一种控制水稻抗旱性的基因DSM1在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于，该基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第159-3494位所示的DNA序列；或

2)编码与1)中第159-349 4位编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。