CN101705233B - 一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG及其应用，本发明通过计算机分析人单纯疱疹病毒I的全部氨基酸序列，筛选出了人单纯疱疹病毒I的型特异性蛋白gG的优势抗原表位，采用基因工程方法生产的重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，简称HSV IgG，能够避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，为人单纯疱疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料，利用本发明一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG为抗原，制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好地满足了人疱疹病毒感染临床诊断的需要，作为疫苗接种，可以预防病毒感染。

Description

一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白和以它作为抗原的检测试剂盒及其制备疫苗的应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)，呈球形，基因组为一线性DNA分子，由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成。30多种不同蛋白组成病毒结构蛋白(如衣壳蛋白、囊膜蛋白)，保护HSV的DNA，在HSV的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。

病人是传染源，主要通过直接密切接触和性接触传播。HSV经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等多种途径侵入机体。人感染非常普遍，感染率达80％～90％，常见的临床表现是粘膜或皮肤局部集聚的疱疹，偶而也可发生严重的全身性疾病，累及内脏。

HSV还可通过胎盘感染，影响胚胎细胞有丝分裂，易发生流产、造成胎儿畸形、智力低下等先天性疾病。约40％～60％的新生儿在通过HSV感染的产道时可被感染，出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变，其中60％～70％受染新生儿可因此而死亡，幸存者中后遗症可达95％。此外一些调查研究表明HSV可能与唇癌、外阴癌及子宫颈癌有关(Kriebs JM.Understanding herpes simplex virus：transmission，diagnosis，and considerations in pregnancymanagement.J Midwifery Womens Health.2008May-Jun；53(3)：202-8)。建立HSV感染的快速、准确检测方法是预防HSV感染的关键所在。

人单纯疱疹病毒分为I型和II型，目前疱疹病毒感染诊断方法有病毒分离(Tanchev S，Shentov B.Herpes simplex virus infection in pregnancy and transmission to neonatal.AkushGinekol(Sofiia).2005；44(6)：31-5.)、PCR法(Kimberlin DW.Diagnosis of herpes simplex virus inthe era of polymerase chain reaction.Pediatr Infect Dis J.2006Sep；25(9)：841-2.)和血清学检查(Eing BR，Lippelt L，Lorentzen EU，et al.Evaluation of confirmatory strategies for detectionof type-specific antibodies against herpes simplex virus type 2.Journal of ClinicalMicrobiology.2002，40(2)：407-413；Strick L，Wald A.Type-specific testing for herpessimplex virus[J].Expert Rev Mol Diagn，2004，4(4)：443-453；Martins TB，Welch RJ，HillHR，Litwin CM.Comparison of a Multiplexed HSV Type-specific IgM Serology Assay toELISA，Immunoblot and Western Blot.Clin Vaccine Immunol.2008Nov 19.)。血清学检查简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。

在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段。同时，HSV疫苗的研制也是进行HSV研究的重要领域之一。具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇的HSV蛋白抗原，在HSV的诊断和疫苗研制领域具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG的基因片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的是提供一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，是由下述方法制备的：

a、人工合成引物：

P1：5’ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCG3’

P2：5’ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGG3’

b、以人单纯疱疹病毒培养物为模板，PCR扩增，获得基因片段HSV I gG；

c、将基因片段HSV I gG插入表达载体pET-28a中，获质粒pET-28a-HSV I gG；

d、质粒pET-28a-HSV I gG转染埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中；

f、细菌破碎，蛋白纯化，得重组蛋白HSV I gG。

本发明又一个目的是提供一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体检测试剂盒，是以HSV I gG为抗原，标记物为胶体金的IgM抗体胶体金检测试剂盒或标记物为辣根过氧化物酶的IgM抗体酶联检测试剂盒；

所述的一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体胶体金检测试剂盒，是由以下方法制备的：

1)取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100ml纯化水中，配成1％氯金酸溶液；取1％氯金酸溶液1ml加入100ml沸水中，加入1％柠檬酸三钠2ml，继续煮沸30min，合成胶体金；

2)取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的约30nm胶体金406ml，用0.1M K₂CO₃调PH至7，量取5mg/ml HSV I gG2.65ml用PH8.2的20mM Tris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1％BSA 40ml，边搅拌边加入，继续搅拌10min，3000r/min 4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后(调至PH至7)，12000r/min 4℃离心45min，去上清，重复2次；用质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，HSV I gG胶体金复合物在原液至稀释一倍之间、喷金量为25.0μl/cm包被载金垫，然后在37℃、相对湿度30％以下通风干燥16-22小时后切割；

3)预切割NC膜(来源上海金标公司；型号HF12002)，粘贴背板，用浓度2.0mg/ml包被抗人IgM抗体，划线量为1.0μl/cm；和按包被浓度为5.0mg/ml、包被量为1.0μl/cm兔抗单纯疱疹病毒I型抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30％以下的条件下干燥1.0小时。

4)撕掉包被检测线和质控线的带背板NC膜检测线端的纸膜，将HSV I gG胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在HSV I gG胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽，封装。

本发明又一个目的是一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG在制备人单纯疱疹病毒I疫苗的应用。

本发明通过计算机分析人单纯疱疹病毒I的全部氨基酸序列筛选出人单纯疱疹病毒I的型特异性蛋白gG的优势抗原表位，包括人单纯疱疹病毒gG从N-末端第295位到第502位的208个氨基酸。其中，gG目的肽段DNA序列是gG第883位到第1506位核苷酸。

根据目的片段的DNA序列，即HSVI的gG上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计了PCR引物P1，P2；用于扩增gG第883位到第1506位核苷酸。引物P1和P2分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，并共同对应于gG上述片段的5’末端3’末端。生产了一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，其核苷酸系列序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，简称HSV I gG，能够避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，为人单纯疱疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料。利用本发明一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG为抗原，制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好地满足了人疱疹病毒感染临床诊断的需要，作为疫苗接种，可以预防病毒感染。

附图说明

图1表达质粒pET-28a-HSV I gG的构建流程图。

图2PCR扩增产物HSV I gG的凝胶电泳图，HSV为HSV I gG。

图3诱导后菌体12％SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

实施例一一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG的制备

1.人单纯疱疹病毒I蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

人工合成引物序列如下：

P1：ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCG

P2：ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGG

以上引物由华美生物技术有限公司合成；

以人单纯疱疹病毒培养物(中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物P1和P2扩增得到目的基因重组片段：gG。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARAMiniBEST Plasmid purification)回收目的基因HSV I gG，操作按产品说明书进行。

2.表达载体pET-28a-HSVI的构建及鉴定

pET-28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物gG目的DNA片段经NdeI和XhoI双酶切，产物纯化(采用TAKARA MiniBEST Plasmid purification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和EcoRI双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-HSV I gG。

3.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-HSV I gG用化学转化法((美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook)，(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12％SDS-PAGE分析(同上文献)，结果如附图3所示，表达人单纯疱疹病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株用8％甘油-70℃保存。

4.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG的表达纯化

诱导培养已构建的表达的一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG大肠埃希氏菌CGMCC No.株菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1∶10(W/V)加入菌体裂解液(50mm pH 8.0Tris-Cl，50mm NaCl，50％甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(Glutathione Sepharose4B柱料50ml装柱，400mlPBS缓冲液平衡过柱，流速5ml/min；超声离心后的上清液用200mlPBS稀释后上样，流速3ml/min；400mlPBS缓冲液洗柱，流速5ml/min；250ml洗脱缓冲液洗脱，流速3ml/min，紫外检测仪280nm检测，收集洗脱峰)和离子交换柱层析(100mlChelating Sepharose FF装柱，300ml200mm的NiCl2过柱，流速5ml/min；500ml平衡缓冲液洗注，流速10ml/min；将组氨酸亲和柱纯化收集液上柱，流速3ml/min，500ml平衡缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。

5.重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG Western-blot验证

为验证一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG蛋白质与抗HSV I抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗HSVI抗体阳性血清(购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗HSVI抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗HSVI抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。

表1HSV IgG Western-blot验证结果

血清样品	总例数	阳性例数	阴性例数	阳性检出率	阴性检出率
						兔抗HSV I抗体阳性血清	10	10	0	100％	0
对照正常兔血清	10	0	10	0	100％
						人抗HSV I抗体阳性血清	30	30	0	100％	0
人抗HSV I抗体阴性血清	30	0	30	0	100％

结果显示，用HSV I病毒培养物免疫兔子所得的10份兔抗HSVI抗体阳性血清和30份人抗HSV I抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗HSV I抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，HSV IgG与全病毒蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。实施例二、重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体胶体金检测试剂盒的制备和性能检定

1.重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体胶体金检测试剂盒的制备

将以上制得的HSV I gG用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定HSV I IgM抗体。

(1)试剂盒原理本发明根据免疫捕获法原理，用抗人IgM抗体包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组单纯疱疹病毒I型(HSV I)抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗HSV1特异性IgM抗体，则可与膜表面的抗人IgM抗体结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的HSV I抗原结合而呈现紫红色条带。

(2)试剂盒性能优化以阳性和阴性质控品(收集多家医院经临床验证的抗人单纯疱疹病毒I型IgM抗体阳性、阴性血清，用意大利SORIN公司提供的抗单纯疱疹病毒I型IgM抗体酶联试剂盒进行复检筛选，得到的抗单纯疱疹病毒I型IgM阳性、阴性血清建立为企业内部阳性和阴性质控品)为测试样品，采用方阵滴定确定最佳抗人IgM和HSV I gG抗原胶体金(HSV1-Ag.G)结合物的工作浓度，结果如表2，由结果得出，抗人IgM(抗人μ链)抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、HSV I-HSV I gG复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。

表2最佳抗人IgM和HSV I gG-Ag.G结合物工作浓度的选择

-：阴性反应(无检测线)；±：可疑阳性(检测线隐约可见)；+：阳性反应(出现检测线)；++：较强阳性反应(检测线清晰)；+++强阳性反应(检测线颜色深)(以下解释同)

在已确定抗人IgM抗体划线包被浓度为2.0mg/ml、HSV I gG-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，滴定选择最佳抗人IgM抗体划线量(喷金量为20μl/cm)为1.0μl/cm。结果见表3。

表3最佳抗人IgM抗体划线量的确定

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

在已确定抗人IgM抗体划线浓度为2.0mg/ml，划线量为1.0μl/cm和HSV I gG抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品(来源和标准同上)为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷金量为25.0μl/cm。结果见表4。

表4最佳HSV I gG抗原胶体金复合物喷金量的确定

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

在已确定抗原胶体金复合物包被量的基础上来选择质控线兔抗单纯疱疹病毒HSV I gG型抗体的包被浓度。兔抗单纯疱疹病毒HSV I gG型抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为5.0mg/ml。结果见表5。

表5质控线兔抗单纯疱疹病毒I型抗体包被浓度的选择

±：质控线隐约可见；+：出现质控线；++：质控线清晰；+++：质控线清晰粗大

抗人μ链划线包被后，分别用下述缓冲系统进行封闭，比较封闭效果，结果表明含PEG₂₀₀₀₀的封闭系统封闭后灵敏度和特异性都有所下降，其他封闭和不封闭的结果没有区别，所以选择不封闭硝酸纤维素膜。结果见表6。

表6不同封闭系统的反应板比较

-：阴性反应；±：可疑阳性；+：阳性反应；++：较强阳性反应；+++强阳性反应

(3)试剂盒的制备

1)取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100ml纯化水中，配成1％氯金酸溶液；取1ml的1％氯金酸溶液入100ml沸水中，加入2ml、1％的柠檬酸三钠，继续煮沸30min，合成胶体金；

2)取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的约30nm胶体金406ml，用0.1M K₂CO₃调PH至7，量取5mg/ml HSV I gG抗原2.65ml，用PH8.2的20mMTris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1％BSA 40ml，边搅拌边加入前述溶液，继续搅拌10min，3000r/min 4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min 4℃离心45min，去上清，重复2次；用内部质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，按前述确定的浓度、喷金量包被HSV I gG抗原胶体金复合物，然后在37℃、相对湿30％以下通风干燥16-22小时(过夜)后切割。

3)预切割NC膜，粘贴背板，按前面确定的浓度和划线量包被鼠抗人IgM(抗人μ链)抗体和兔抗单纯疱疹病毒I型抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30％以下的条件下干燥1.0小时。

4)撕掉包被检测线和质控线的NC膜(带背板)检测线端的纸膜，将抗原胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在抗原胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽。抽取18条，用内部质控血清检测半成品检测卡。

5)将每个检测卡单独封装，每个独立包装为1人份，20人份封装成1盒。抽样检验。

各缓冲液配方如下：

1)抗人IgM抗体包被缓冲液配方：20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.2)见表7。

表7

内容	500ml
		Tris	1.2g
2M HCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

2)兔抗单纯疱疹病毒I型抗体包被缓冲液配方：20mM Tris-Cl缓冲液(pH8.2)见表8。

表8

内容	500ml
		Tris	1.2g

2MHCl	按需要
		纯化水	定容到500ml
0.45μm过滤膜	按需要

3)抗原胶体金复合物包被缓冲液配方：20mM TBS缓冲液(pH8.2)见表9。

表9

内容	1000ml
		Tris	2.4g
0.15M氯化钠	8.8g
		2MHCl	按需要
1→100BSA	10g
		纯化水	定容到1000ml
0.45μm过滤膜	按需要

(4)试剂盒使用操作方法：

1)打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

2)将检测卡倾斜成加样孔端低于另-端不少于1.0cm。

3)取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温(15℃～30℃)放置25分钟观察并记录结果。。

4)检验结果判定：

阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带(检测线和质控线位置)；

阴性：判读窗口仅出现一条紫红色线条带(检测线和质控线位置)。

无效：判读窗口质控线位置无紫红色线条带。

2.试剂盒性能检测实验

(1)特异性(准确性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

(2)灵敏度(特异性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

(3)与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与意大利SORIN公司试剂盒检测260份血清样本的比较实验结果如表10。

表10与意大利SORIN抗疱疹病毒I型IgM抗体试剂盒的比较测试结果

检测总符合率：(49+206)/260＝98.1％，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

实施例三重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体酶联检测试剂盒的性能检定

将实施例一制得的HSV I gG蛋白用作试剂盒酶标抗原制备的底物，用ELISA法测定HSV1IgM抗体。

1该试剂盒原理和组分如下：

1)试剂盒原理：本品系用抗人IgM包被的微孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记基因工程HSV I gG抗原为示踪物，TMB显色系统，应用捕获法原理检测人血清或血浆中的抗单纯疱疹病毒IgM抗体。

2)试剂盒主要组成成分：

预包被板、酶结合物、阴性对照、阳性对照、浓缩洗液(20×)、底物液A、底物液B、中止液。

2试剂盒性能检定

特异性(准确性)测定：按捕获ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度(特异性)测定：按捕获ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

精密性测定：按捕获ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗HSV1强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表11，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15％。

表11试剂盒的精密性

血清	平均OD	最大OD	最小OD	CV(％)
					强阳性1	3.823	4.128	3.091	2.6
强阳性2	3.221	3.688	2.565	4.5
					阳性1	2.315	2.694	1.612	7.3
阴性	0.022	0.113	0.002	6.6

阳性对照	2.652	3.220	2.102	6.2
					阴性对照	0.030	0.111	0.010	4.9

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与意大利SORIN公司试剂盒检测260份血清样本的比较实验结果如表12。

表12与意大利SORIN抗疱疹病毒I型IgM抗体试剂盒的比较测试结果

检测总符合率＝(49+208)/260＝98.8％，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林大学

<120>一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>615

<212>DNA

<213>单纯疱疹病毒I(Herpes simplex virus，HSV)

<400>1

caaccccaac tccagaccac cggtcgtccc tcgcatgaag cccccaacat gacccagacc  60

ggcaccaccg actctcccac cgccatcagc cttaccacgc ccgaccacac accccccatg  120

ccaagtattg gactggagga ggaggaagag gaggaggggg ccggggacgg cgaacatctt  180

gaggggggag atgggacccg tgacacccta ccccagtccc cgggcccagc cttcccgttg  240

gctgaggacg tcgagaagga caaacccaac cgtcccgtag tcccatcccc cgatcccaac  300

aactcccccg cgcgccccga gaccagtcgc ccgaagacac cccccaccat tatcgggccg  360

ctggcaactc gccccacgac ccgactcacc tcaaagggac gacccttggt tccgacgcct  420

caacataccc cgctgttctc gttcctcact gcctcccccg ccctggacac cctcttcgtc  480

gtcagcaccg tcatccacac cttatcgttt ttgtgtattg gtgcgatggc gacacacctg  540

tgtggcggtt ggtccagacg cgggcgacgc acacacccta gcgtgcgtta cgtgtgcctg  600

ccgtccgaac gcggg                                                   615

<210>2

<211>205

<212>PRT

<213>单纯疱疹病毒I(Herpes simplex virus，HSV)

<400>2

Gln Pro Gln Leu Gln Thr Thr Gly Arg Pro Ser His Glu Ala Pro

1               5                   10                  15

Asn Met Thr Gln Thr Gly Thr Thr Asp Ser Pro Thr Ala Ile Ser

            20                  25                  30

Leu Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Prp Met Pro Ser Ile Gly Leu

        35                  40                  45

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu His Leu

    50                  55                  60

Glu Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro Gln Ser Pro Gly

65                  70                  75

Pro Ala Phe Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asp

                80                  85                  90

Arg Pro Val Val Pro Ser Pro Asp Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg

            95                  100                 105

Pro Glu Thr Ser Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Ile Ile Gly Thr

        110                 115                 120

Leu Ala Thr Arg Pro Thr Thr Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Pro

    125                 130                 135

Leu Val Pro Thr Pro Gln His Thr Pro Leu Phe Ser Phe Leu Thr

                140                 145                 150

Ala Ser Pro Ala Leu Asp Thr Leu Phe Val Val Ser Thr Val Ile

            155                 160                 165

His Thr Leu Ser Phe Leu Cys Ile Gle Ala Met Ala Thr His Leu

        170                 175                 180

Cys Gly Gly Trp Ser Arg Arg Gly Arg Arg Thr His Pro Ser Val

    185                 190                 195

Arg Tyr Val Cys Leu Pro Ser Glu Arg Gly

200                 205

Claims (5)

1.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG的基因片段，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求2所述的一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白HSV I gG，是由下述方法制备的：

a、人工合成引物：

P1：ACCATATGCAACCCCAACTCCAGACCACCG

P2：ACCTCGAGCCCGCGTTCGGACGGCAGG

b、以人单纯疱疹病毒培养物为模板，PCR扩增，获得基因片段HSV I gG；

c、将基因片段HSV I gG插入表达载体pET-28a中，获质粒pET-28a-HSV I gG；

d、质粒pET-28a-HSV I gG转染埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；

f、细菌破碎，蛋白纯化，得重组蛋白HSV I gG。

4.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：是以HSV I gG为抗原，标记物为胶体金的IgM抗体胶体金检测试剂盒或标记物为辣根过氧化物酶的IgM抗体酶联检测试剂盒；所述的HSV I gG，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种重组人单纯疱疹病毒I蛋白IgM抗体胶体金检测试剂盒，是由以下方法制备的：

1)取1.0g的HAuCl₄.H₂O溶解于100ml纯化水中，配成1％氯金酸溶液；取1％氯金酸溶液1ml加入100ml沸水中，加入1％柠檬酸三钠2ml，继续煮沸30min，合成胶体金；

2)取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的30nm胶体金406ml，用0.1M K₂CO₃调PH至7，量取5mg/ml HSV I gG 2.65ml用PH8.2的20mM Tris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1％BSA 40ml，边搅拌边加入，继续搅拌10min，3000r/min 4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min 4℃离心45min，去上清，重复2次；用质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，HSV I gG胶体金复合物在原液至稀释一倍之间、喷金量为25.0μl/cm包被载金垫，然后在37℃、相对湿度30％以下通风干燥16-22小时后切割；

3)预切割NC膜，粘贴背板，浓度2.0mg/ml、划线量为1.0μl/cm包被抗人IgM抗体和按包被浓度为5.0mg/ml、包被量为1.0μl/cm兔抗单纯疱疹病毒I型抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30％以下的条件下干燥1.0小时；

4)撕掉包被检测线和质控线的带背板NC膜检测线端的纸膜，将HSV I gG胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在HSV I gG胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽，封装；

所述的HSV I gG，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

Images