CN101701184B - 微生物快速检测设备及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物快速检测设备及其检测方法，该设备包括检测盒以及盒内的样品瓶和参照瓶，样品瓶和参照瓶内分别装有被检测样品和无菌参照物，检测盒是一个与加热装置和抽真空装置连接的密闭盒体，它由内盒、隔热夹层与外盒套叠为一体，所述内盒的顶面分布有插瓶孔，样品瓶和参照瓶插入内盒中，其瓶口外沿承托在插瓶孔外周，每个样品瓶和参照瓶配有瓶塞，穿过瓶塞插有测试温度传感探头，每个测试温度传感探头的数据传输电缆与中央处理单元的输入端子连接。本发明可通过代谢热效应快速检测样品中微生物数量和种类，具有精度高、效率高的特点，可广泛应用于食品、人体组织和血液微生物的检测，还可应用于护肤品，餐具等用品的微生物检测。

Description

微生物快速检测设备及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种微生物检测设备及检测方法。

背景技术

在21世纪的今天，随着中国经济的飞速发展，人民生活水平发生了很大变化，饮食的品种和形式更加丰富多彩。但食品质量和安全性的问题也日益突出。利用更有效而快速的分析手段，建立可靠的食品安全监控体系，保障人民群众的身体健康，已成为各级政府和有关部门当务之急的工作。研究和开发具有自主知识产权的新一代食品快速检测技术和产品也成为我国科研工作者义不容辞的责任。

食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称为食源性疾病。随着环境的变迁和抗生素的滥用，虽然人们的居住和卫生条件不断改善，但对病菌的抵抗力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升趋势。因此，对食品中致病菌的检测也就越显重要。常规的检测大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否已受到污染，培养时间至少48小时，且由于目测计算菌落数量，不仅费力耗时，误差也较大。同时，还必须有专门的实验室，由专业技术人员在无菌条件下操作才能完成。这对于数以万计的中小型食品生产和加工企业而言，困难很大。只能将抽取的样品送至专门检测机构，等待数天后，才能得到结果。费时费钱，完全无法实时监控产品质量。

目前，国内外关于食品微生物快速检测技术的研究有两个主流方向：一是传统活细胞计数方法的改进。主要工作集中在操作规程的简化，改善培养条件，开发新一代样品制备系统和实验设备(培养基，实验器具等)，以及计数过程自动化等。这类方法可使传统方法的检测速度和效率得到提高，但程度有限。

另一类研究方向是通过测量微生物在生长和代谢过程中发生的变化，尤其是物理或化学变化来估测微生物的数量和种类。按照检测原理的不同，这类技术可大致分为以下几种。

1.阻抗法(impedence measurement)

其原理是通过测量因微生物生长而造成的培养基阻抗变化来间接显示微生物的数量。已上市的测量系统如法国的Bactometer，它通过测量细菌产生的离子浓度达到比培养基初始离子浓度低某一值时的历经时间，也称检出时间(DT)来标志样品细菌数量。是利用电阻，电容或总阻抗来测量离子浓度的三参数系统。能检测出的细菌门栏值是106-107个/毫升。另一上市产品是Malthus微生物快速分析仪。它利用细菌将培养基中的大分子代谢为带电荷更多的小分子，从而造成电导增加的物理原理来检测细菌数量。即活体微生物量与电导产生可检测出的改变的时间成反比。所以，污染越严重，检出时间(DT)越短。

国内天津大学最近提出利用细菌代谢产生的二氧化碳使培养基电导变化的原理来检测微生物数量的技术，不过尚未有正式产品问世。

2.ATP生物发光技术(bioluminescence，BL)

所有活体生物都含有ATP，当由荧火虫等生物制备的荧光素酶和ATP接触时就产生发光现象，检测发光强度就能间接得到活体微生物数量.利用此原理的检测仪器有十多种，如日本的AF-100，杜邦公司的生物光测量仪。

3.微量量热法(microcalorimetry)

它是通过测量细菌生长和代谢过程中产生的代谢热来间接估算微生物数量，这种方法需要预先绘制热曲线图和特别的高灵敏度微温度传感器.

4.溶氧杼缌鞣

日本DAIKIN公司开发出一种通过检测因微生物消耗培养基中溶解氧导致的电流变化来间接计算样品所含微生物数量的仪器。

5.放射测量法(radio metric)

是将微量的放射性标记引入葡萄糖或其它糖类分子中，细菌生长时糖被利用并放出已标记的二氧化碳，从培养装置中导出后，用美国Johnston公司的放射测量仪检测，其放射量与细菌数量成正比关系。

总的来说，这一类方法可以大幅度提高检测速度，增加检测精度和减轻检测工作量，是今后的发展方向。

本发明所依据的原理原则上属于微量量热法范畴。由于食品污染越严重，所含活体微生物数量就越大，单位时间内代谢热效应的增量就越大，并且这种变化特性与微生物的种类相关。采用此种技术进行微生物检测的关键在于易受环境和人工干扰因素影响，难于正确检测出特定微生物在特定时间内释放出的微弱信号，而至今尚无检测设备能够解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物快速检测设备及其检测方法，要解决现有的微生物检测方法复杂，检测设备的测量精度易受环境和人工干扰因素影响，以及设备结构复杂、成本高的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

这种微生物快速检测设备，包括检测盒以及盒内的样品瓶和参照瓶，样品瓶和参照瓶内分别装有被检测样品和无菌参照物；

检测盒：是一个与加热装置和抽真空装置连接的密闭盒体，它由内盒、隔热夹层与外盒套叠为一体，所述内盒的顶面分布有插瓶孔，样品瓶和参照瓶插入内盒中，其瓶口外沿承托在插瓶孔外周，每个样品瓶和参照瓶配有瓶塞，穿过瓶塞插有测试温度传感探头，每个测试温度传感探头的数据传输电缆与中央处理单元的测试数据输入端子连接；

内盒的侧壁和底面分别连有一对导液管和一对导气管，上述导液管和导气管均连有电磁阀，进液管与加热装置的流体储热罐连通；

排液管与流体储热罐内的循环动力泵出液口连通；

盒底面的抽气管与抽真空装置的真空泵连通；

盒侧壁的放气管穿过外盒与大气相连通；

加热装置：有一个内装有流体、加热器和循环动力泵的流体储热罐，所述流体储热罐有保温外壳，上下两端分别带有流体进口和流体出口，流体储热罐有保温外壳，上下两端分别带有流体进口和流体出口，循环动力泵安装于流体储热罐的底部，流体内置有流体温度探头，流体温度探头的数据线与中央处理单元的流体温度数据输入端子连接，加热器和循环动力泵的启动开关分别经控制线与中央处理单元的控制端子连接；

抽真空装置：真空泵的吸入口与盒底面的抽气管连通，排气口与大气连通，驱动真空泵工作的电机启动开关经控制线与中央处理单元的一个控制信号输出端子连接；

中央处理单元：包括存储器、运算器、定时器、控制器、数据输入接口、控制信号输出接口和通讯接口；

存储器用于存储操作程序、检测程序、标定数据库和检测数据；

运算器用于将输入的各温度检测数据与标定数据库比较、分析、计算、处理并得出检测结果和控制方向；

控制器用于向加热器输出控制信息，控制加热器运行，并控制循环动力泵、真空泵、出液电磁阀、进液电磁阀、抽气电磁阀和放气电磁阀的启闭；

通讯接口由通讯线路与上位计算机连接；

电源模块：输出端由电源线分别与加热器、循环动力泵、驱动真空泵的电机和中央处理单元连接，输入端与外接电源连接；

液晶显示屏：与中央处理单元的显示输出端子连接，用于显示操作提示和各部件运行状态；

操作按钮：与中央处理单元的数据输入端子连接，用于人工控制各部件运行。

所述内盒的顶面在插瓶孔的周围和外盒上盖的四周垫有橡胶垫，瓶塞、测试温度传感探头、内盒上方的隔热夹层和外盒的上盖固定为一体，形成密封盖体，密封盖体的上面连接有把手。

所述样品瓶和参照瓶外表面涂有防辐射传热材料。

所述加热装置和抽真空装置、电源模块以及中央处理单元装在一个外壳内，液晶显示屏和操作按钮嵌在外壳上，外壳上还留有连接电源的插口。

所述加热装置的流体储热罐有保温外壳，上下两端分别带有流体进口和流体出口。

这种微生物快速检测设备的微生物快速检测方法，将装有被检测样品和参照物的瓶子放入同一密闭检测盒内，参照物是与样品物质完全相同、且采用不会改变参照物物理性质的手段彻底灭菌后得到的微生物的物质，检测前先使二者的起始温度达到一致，并在检测盒内保持恒温，在检测中避免每个瓶的热量散失和瓶间的热量传递，利用插入各瓶子内的流体温度探头在一段时间内采集传送的温度信号，并利用计算机绘制出各瓶内的温度-时间变化曲线，从样品温度-时间变化曲线中扣除参照物温度-时间变化曲线部分，并与计算机中存储的已有微生物温度-时间变化特性曲线进行比对，得出样品所含微生物数量及种类。

具体检测步骤如下：

步骤一，打开微生物快速检测设备的开关，根据预先估计的样品含菌量选择检测时间；

步骤二，流体储热罐内的加热器开始预热；

步骤三，拔起检测盒的密封盖体，插入样品瓶和参照瓶，参照瓶中的参照物是与样品物质相同、采用物理方法彻底灭菌后得到的不含微生物的物质；

步骤四，对测试温度传感探头和瓶塞进行灭菌处理后，对准相应的瓶口，将密封盖体重新放下并加压密封；

步骤五，根据样品和参照物的初始温度，设定流体储热罐内流体的预设温度；

步骤六，待流体达到预设温度后，开启盒侧壁进液管和进液电磁阀，开动循环动力泵，将流体储热罐内的流体注入检测盒的内盒，循环均温；

步骤七，待各瓶温度一致后，抽出盒内流体；

步骤八，关闭放气电磁阀，开启抽气电磁阀，开启真空泵，使检测盒保持恒定真空度；

步骤九，开始实时采集各瓶的测试温度传感探头传送的温度信号，利用计算机绘制出各瓶内的温度-时间变化曲线；

步骤十，利用计算机计算检测菌落总数并判断微生物种类，从样品温度变化曲线中扣除参照物温度变化曲线部分，并与计算机中已有微生物温度-时间变化特性曲线进行比对，直接显示出样品所含微生物数量及种类；

步骤十一，检测完成后，开启放气电磁阀，让检测盒内恢复到常压，开启上盖，取出样品瓶和参照瓶。

所述步骤五中流体的温度比放入检测盒中的样品和参照物的初始最高温度高5-10℃，最高不超过45℃。

所述步骤六中流体与瓶表面不润湿，流体采用矿物油类。

所述步骤八中真空度范围可为0.01-0.95大气压。

所述步骤十中检测菌落总数的计算过程为：

设样品瓶起始温度为Ty0，参照瓶起始温度为Tc0，样品瓶t时刻的温度为Tyt，参照瓶t时刻的温度为Tct，则从检测开始到t时刻，样品瓶的净温度增值：

ΔTyt＝(Tyt-Ty0)(Tct-Tc0)；

当检测设备设计合理，参数选择恰当，操作正常时，Ty0与Tc0十分接近，上式简化为：

ΔTyt＝Tyt-Tct；

将得到的ΔTyt与存于计算机中的标定数据比较，假定ΔTyt的大小位于数据库中同样条件下，同类样品的两个相邻数据ΔTy1和ΔTy2之间(ΔTy1＜ΔTy2)，它们相应的菌落总数分别为J1和J2，则该检测样品的菌落总数：

Jy＝J1+(ΔTyt-ΔTy1)(J2-J1)/(ΔTy2-ΔTy1)。

与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果：

本发明采用了特别的检测方式和装置，排除了大量的环境和人工干扰因素，正确检测出特定微生物在特定时间内释放出的微弱信号，通过一系列合适的放大，滤噪和转换方式，最终得到准确的微生物数量(菌落总数)，并鉴别出其种类。

本发明具有以下特点：

(1)、直接检测代谢效应，而不是检测代谢产物对特定物质产生的物理或化学变化。对检测精度的提高和设备部件的简化都带来质的改进。

(2)、特别设计的探头和设备能使最微弱代谢变化也能被检测出来。

(3)、专门设计的参照物，能使环境和人为干扰因素降到最低。

(3)、特别设计的硬，软件系统能准确记录特定微生物的代谢特性，为微生物的鉴别提供了可能。

(4)、实时的数据采集模式，全自动化的操作和信息处理方式，先进的人机界面设计。

本发明和传统检测方法及现有国外快速检测方法相比，具有以下竞争优势：

(1)、快速，本技术能将传统方式所需的48小时检测时间缩短到1到2小时或更短。

(2)、高精度，能将国外各类专门仪器所需的最低细菌数门栏值大幅减少(1/2或更低)。能检测出的菌落数低至1-2个/克(毫升)。

(3)、高效率，本产品能同时检测数十个，甚至上百个样品。

(4)、使用方便，整个检测系统为便携式箱体，非专业人员经短期培训就能操作并可在现场使用。

(5)、自动化原则，采用先进的电子和IT技术，使系统具有较高级的自动化和信息处理方式。

(6)、无易耗零件或材料，不同于绝大多数国内外检测仪器，本发明设备不需任何经常更换的材料，药品，试纸或零件。

本发明可通过代谢热效应快速检测样品中微生物数量和种类，采用设参照物质的方法去除环境温度的影响。采用流体循环方法达到样品瓶起始温度一致，采用真空及防辐射涂层方法减小瓶间传热，采用与国标法对比的方法将热效应转换为菌落总数。采用与预设温度时间曲线对比的方法确定微生物种类。检测设备中，样品检测盒用于安置样品瓶和参照瓶，并使正式检测前的起始温度一致，在检测中尽可能防止热量散失和瓶间热量传递。控制主机提供起始温度一致所需的流体和检测过程中盒内的预定真空度；实时接收样品瓶和参照瓶的温度模拟信号，经过数模转换，滤噪和放大后，送入计算机。计算机分析和处理这些数据，通过样品和参照物质的对比，找出微生物真实代谢热特征，再与预存于计算机数据库中的微生物代谢特征数据比较，得到微生物数量和种类的判断，最终显示并打印。具有精度高、效率高的特点，可广泛应用于食品、人体组织和血液微生物的检测，还可应用于护肤品，餐具等用品的微生物检测。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。

图1是微生物快速检测设备的结构示意图。

图2是检测盒内样品管和参照管的排布图。

图3是检测盒内样品管和参照管的排布图。

图4是检测盒内样品管和参照管的排布图。

图5是检测得到的实时温度-时间曲线图。

附图标记：1-内盒、2-流体、3-橡胶垫、4-插瓶孔、5-测试温度传感探头、6-瓶塞、7-进液电磁阀、8-出液电磁阀、9-抽气电磁阀、10-放气电磁阀、11-外盒、12-隔热夹层、13-把手、14-排液管、15-抽气管、16-进液管、17-流体进口、18-流体出口、19-循环动力泵、20-加热器、21-流体温度探头、22-中央处理单元、23-流体储热罐、24-真空泵、25-数据传输电缆、26-液晶显示屏、27-操作按钮、28-电源模块、29-插口、30-直流电源线、31-控制线、32-通讯接口、33-上位计算机、34-通讯线路、35-放气管、36-外壳、37-样品瓶、38-参照瓶。

具体实施方式

实施例参见图1所示，这种微生物快速检测设备，包括检测盒以及盒内的样品瓶37和参照瓶38，样品瓶和参照瓶内分别装有被检测样品和无菌参照物。

检测盒：是一个与加热装置和抽真空装置连接的密闭盒体，它由内盒1、隔热夹层12与外盒11套叠为一体。隔热夹层12与外盒固连为一体，隔热夹层能进一步减少环境温度的干扰，可用在冰箱或保温箱里使用的常规保温材料(如泡沫塑料)制成。内盒的顶面分布有插瓶孔4，在插瓶孔的周围和外盒上盖的四周垫有橡胶垫3，带凸沿的样品瓶插入内盒后，如果盒内为负压，则凸沿与橡胶垫之间将保持紧密接触，且盒内压力越低，接触越紧，盒内越容易保持一定负压(或真空度)，样品瓶和参照瓶外表面涂有防辐射传热材料。内盒壁2可由绝热的硬质材料(如聚四氟乙烯)制成，能够经受一定的盒内负压而不变形，样品瓶或参照瓶由绝热性较好的材料(如玻璃)制成，外表面涂有防辐射传热的材料(如银或铝)，可以通过电镀，喷涂或类似于热水瓶胆的制作工艺，甚至普通的银镜反应制成。样品瓶和参照瓶插入内盒中，其瓶口外沿承托在插瓶孔外周，每个样品瓶和参照瓶配有瓶塞6。瓶塞6由绝热良好的弹性材料(如橡胶或软木)制成，与瓶口能严密接触，防止瓶内热量散失。穿过瓶塞插有测试温度传感探头5，每个测试温度传感探头的数据传输电缆25与中央处理单元22的测试数据输入端子连接。瓶塞6、测试温度传感探头5、内盒上方的隔热夹层和外盒的上盖固定为一体，形成密封盖体，密封盖体的上面连接有把手13。

内盒的侧壁和底面分别连有一对导液管和一对导气管，上述导液管和导气管均连有电磁阀，进液管16与加热装置的流体储热罐23连通。排液管14和进液管16外侧裹有保温层。

排液管14与流体储热罐内的循环动力泵19出液口连通。

盒底面的抽气管与抽真空装置的真空泵连通。

盒侧壁的放气管穿过外盒与大气相连通。

加热装置：有一个内装有流体2、加热器20和循环动力泵19的流体储热罐23，流体储热罐23包有保温外壳，上下两端分别带有流体进口17和流体出口18。如果采用液体(如水或油)作为传热介质，可由流体进口加入液体。如果直接采用空气作为介质。此口可以关闭。由流体出口将使用太久的流体放出，以便换入新的传热介质。

循环动力泵19安装于流体储热罐的底部，流体2内置有流体温度探头21，流体温度探头21的数据线与中央处理单元22的流体温度数据输入端子连接，加热器20和循环动力泵19的启动开关分别经控制线31与中央处理单元22的控制端子连接。

抽真空装置：真空泵24的吸入口与盒底面的抽气管15连通，排气口与大气连通，驱动真空泵工作的电机启动开关经控制线与中央处理单元22的一个控制信号输出端子连接。

中央处理单元22：包括存储器、运算器、定时器、控制器、数据输入接口、控制信号输出接口和通讯接口。

存储器用于存储操作程序、检测程序、标定数据库和检测数据。

运算器用于将输入的各温度检测数据与标定数据库比较、分析、计算、处理并得出检测结果和控制方向。

控制器用于向加热器输出控制信息，控制加热器运行，并控制循环动力泵19、真空泵24、出液电磁阀8、进液电磁阀7、抽气电磁阀9和放气电磁阀10的启闭。

通讯接口32由通讯线路34与上位计算机33连接。计算机可采用普通的台式或笔记本式电脑，采用通用操作系统，软件兼容，用常用的计算机高级语言(如C语言)编程。

电源模块28：输出端由电源线分别与加热器20、循环动力泵19、驱动真空泵的电机和中央处理单元22连接，输入端与外接电源连接。

液晶显示屏26：与中央处理单元22的显示输出端子连接，用于显示操作提示和各部件运行状态。

操作按钮27：与中央处理单元22的数据输入端子连接，用于人工控制各部件运行。

所述加热装置和抽真空装置、电源模块28以及中央处理单元22装在一个外壳36内，液晶显示屏26和操作按钮27嵌在外壳上，外壳上还留有连接电源的插口29。液晶显示屏26显示操作提示和各部件(检测盒，真空泵，储热罐)运行状态。

因本发明采用物理方法间接检测微生物种类和数量，所以必须和直接检测的生物方法(国标法)对比，才能精确量化。对比的结果将作为数据预先输入计算机的数据库中。此过程称为标定。标定内容有二：

(1)菌落总数标定。选择同一样品，均匀处理后分为等量的两份。一份进行生物法(国标法)检测(稀释后保温箱培养48小时，显微镜下目测后乘稀释倍数)，得到该样品菌落总数。比如300个/毫升。同时另一半样品进入本发明设计的检测箱，按预定步骤实时采集温度数据，记录在一定条件下(检测气压和起始温度)的预设时间内，样品温度的纯增加值(已扣除环境温度影响)。比如在检测盒内真空度(见后述)为0.1个大气压，检测起始温度为30℃时，样品温度在1.0小时后纯增加值是0.15℃，1.5小时后增加了0.17℃，2.0小时后增加了0.195℃等。将这些数据存入计算机。以后检测另外的样品时，保持同样气压和起始温度条件，如果样品在同样时间内增加了同样的温度值，则所含菌落总数相同，即同为300个/毫升。考虑到不可能将菌落总数从大到小进行无穷次标定，可选择分级进行，即选择菌落总数在1-10，10-50，50-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-400，400-500(个/毫升)，....范围内的各一样品进行标定。再采用插值法通过软件计算出菌落总数值。(见后面计算公式)。当然，分级越细，误差会越小，但先期的工作量也越大。原则上，不同种类的样品需建立不同的标定数据库。

(2)生物种类标定。选择专门培养的单一微生物加入无菌的样品中，需要时还需加入营养物。均匀化后分为等量两分。同样按两种方法检测。记录在一定条件下，扣除环境温度影响后样品的温度增长曲线，分析曲线数学特征(增长速率，拐点，渐近线等等)，一并记录在计算机中。以后在同样条件下检测时，遇到出现完全相同的曲线时，就可以断定样品中含有该种微生物，其数量与生物法测出的相等。当然，真实的样品可能含有不止一种微生物，这需要大量的前期工作，预先混合好不同比例的异种微生物进行标定。建立数以千计的曲线，才能得到较好结果。

这种微生物快速检测设备的微生物快速检测方法，具体检测步骤如下：

步骤一，打开微生物快速检测设备的开关，根据预先估计的样品含菌量选择检测时间。

步骤二，流体储热罐内的加热器开始预热。

步骤三，拔起检测盒的密封盖体，插入样品瓶和参照瓶，参照瓶中的参照物是与样品物质相同、采用物理方法彻底灭菌后得到的不含微生物的物质，如紫外线灭菌。

步骤四，对测试温度传感探头和瓶塞进行灭菌处理后，对准相应的瓶口，将密封盖体重新放下并加压密封。

步骤五，根据样品和参照物的初始温度，设定流体储热罐内流体的预设温度。流体的温度比放入检测盒中的样品和参照物的初始最高温度高5-10℃，最高不超过45℃。

步骤六，待流体达到预设温度后，开启盒侧壁进液管和进液电磁阀，开动循环动力泵，将流体储热罐内的流体注入检测盒的内盒，循环均温。流体与瓶表面不润湿，流体采用矿物油类。

步骤七，待各瓶温度一致后，抽出盒内流体。

步骤八，关闭放气电磁阀，开启抽气电磁阀，开启真空泵，使检测盒保持恒定真空度；真空度范围可为0.01-0.95大气压。在检测过程中，内盒内始终保持一定真空度，可以维持瓶和瓶之间的绝热，也将环境温度的影响减到最小。

步骤九，开始实时采集各瓶的测试温度传感探头传送的温度信号，利用计算机绘制出各瓶内的温度-时间变化曲线。

步骤十，利用计算机计算检测菌落总数并判断微生物种类，从样品温度变化曲线中扣除参照物温度变化曲线部分，并与计算机中已有微生物温度-时间变化特性曲线进行比对，直接显示出样品所含微生物数量及种类。

所述检测菌落总数的计算过程为：

设样品瓶起始温度为Ty0，参照瓶起始温度为Tc0，样品瓶t时刻的温度为Tyt，参照瓶t时刻的温度为Tct，则从检测开始到t时刻，样品瓶的净温度增值：

ΔTyt＝(Tyt-Ty0)(Tct-Tc0)；

当检测设备设计合理，参数选择恰当，操作正常时，Ty0与Tc0十分接近，上式简化为：

ΔTyt＝Tyt-Tct；

将得到的ΔTyt与存于计算机中的标定数据比较，假定ΔTyt的大小位于数据库中同样条件下，同类样品的两个相邻数据ΔTy1和ΔTy2之间(ΔTy1＜ΔTy2)，它们相应的菌落总数分别为J1和J2，则该检测样品的菌落总数：

Jy＝J1+(ΔTyt-ΔTy1)(J2-J1)/(ΔTy2-ΔTy1)。

步骤十一，检测完成后，开启放气电磁阀，让检测盒内恢复到常压，开启上盖，取出样品瓶和参照瓶。

开始新一轮检测时，可换上灭菌后的新瓶，使用灭菌器械将样品和参照物加入新瓶中，再使灭菌后的探头和瓶塞各自对准相应的瓶口，将上盖重新放下并加压，使各瓶塞与瓶口完全密封，并让探头进入样品或参照物中。然后按前述步骤开启和关闭各电磁阀，重新向检测盒内注入流体均温和抽真空，开始新一轮检测。上盖到位后，应保证与周围的隔热层紧密接触。以最大限度减小环境温度的影响。

参见图2-4所示，检测盒内样品管和参照管的排布原则有两条：

(1)参照管的数量尽可能少，以免占用过多空间。

(2)参照管的位置应尽可能有代表性，以避免环境温度对不同位置的干扰差别。

图2中的管位置呈环形布局。从检测盒周围温度对盒中各管的温度影响看，各瓶位置完全对等，所以只需在任意位置1处用一个瓶作为参照瓶即可。

图3中的管位置呈正方形布局，由于周围温度对各位置的影响不完全相同，所以取1和2位置的瓶作为参照瓶，将两瓶的温度数据平均后作为参照物的数据进入计算比较合适。

图4中对于更多瓶和更复杂的布局，最好在两条原则之间取平衡。既充分考虑不同位置的差别，又尽可能少设参照瓶。可选择中心和边缘的各一瓶，即3和4位置放置参照瓶。

微生物快速检测设备的检测实例如下：

采用本发明设备，按照前述检测步骤得到下面检测结果：样品是某品牌高温灭菌奶(还有1个月保质期到期)。参照物是同一袋奶，但紫外线灭菌25分钟。样品和参照物均为45毫升。环境温度范围25-28℃。流体预设温度为23.05℃。盒内真空度为0.2大气压。样品瓶起始温度为23.04℃，参照瓶起始温度为23.045℃。检测得到的实时温度-时间曲线如图5所示。图5中纵坐标代表温度(℃)，横坐标代表时间(一个点代表4秒钟)。上升较快的是样品瓶温度曲线，较慢的是参照瓶温度曲线。如图5可见，因室温较高，环境温度仍然对检测盒有影响。采用前述公式(1)和(2)扣除这种影响后，样品瓶在正式检测1小时后的净温度增值为0.15。

查同样条件下该品牌奶的标定数据库，发现与0.15℃最近的两相邻温度增值为0.12℃和0.20℃，相应的菌落总数分别是155和370(个/毫升)，按前述计算公式(3)，得到该样品的菌落总数为：

J＝155+(0.15-0.12)(370-155)/(0.20-0.12)

＝236(个/毫升)。

同一样品用国标法检测，得到的菌落总数为250个/毫升，与上述结果十分接近。证实了本发明技术和设备设计的合理性。同样的对比检测仪已进行多次。能够重复得到类似结果。

Claims (10)

1.一种微生物快速检测设备，包括检测盒以及盒内的样品瓶（37）和参照瓶（38），样品瓶和参照瓶内分别装有被检测样品和无菌参照物，其特征在于：

检测盒：是一个与加热装置和抽真空装置连接的密闭盒体，它由内盒（1）、隔热夹层（12）与外盒（11）套叠为一体，所述内盒的顶面分布有插瓶孔（4），样品瓶和参照瓶插入内盒中，其瓶口外沿承托在插瓶孔外周，每个样品瓶和参照瓶配有瓶塞（6），穿过瓶塞插有测试温度传感探头（5），每个测试温度传感探头的数据传输电缆（25）与中央处理单元（22）的测试数据输入端子连接；

内盒的侧壁和底面分别连有一对导液管和一对导气管，上述导液管和导气管均连有电磁阀，进液管（16）与加热装置的流体储热罐（23）连通；

排液管（14）与流体储热罐内的循环动力泵（19）出液口连通；

盒底面的抽气管（15）与抽真空装置的真空泵（24）连通；

盒侧壁的放气管（35）穿过外盒（11）与大气相连通；

加热装置：有一个内装有流体（2）、加热器（20）和循环动力泵（19）的流体储热罐（23），所述流体储热罐（23）有保温外壳，上下两端分别带有流体进口（17）和流体出口（18），循环动力泵（19）安装于流体储热罐的底部，流体（2）内置有流体温度探头（21），流体温度探头（21）的数据线与中央处理单元（22）的流体温度数据输入端子连接，加热器（20）和循环动力泵（19）的启动开关分别经控制线（31）与中央处理单元（22）的控制端子连接；

抽真空装置：真空泵（24）的吸入口与盒底面的抽气管（15）连通，排气口与大气连通，驱动真空泵工作的电机启动开关经控制线与中央处理单元（22）的一个控制信号输出端子连接；

中央处理单元（22）：包括存储器、运算器、定时器、控制器、数据输入接口、控制信号输出接口和通讯接口；

存储器用于存储操作程序、检测程序、标定数据库和检测数据；

运算器用于将输入的各温度检测数据与标定数据库比较、分析、计算、处理并得出检测结果和控制方向；

控制器用于向加热器输出控制信息，控制加热器运行，并控制循环动力泵（19）、真空泵（24）、出液电磁阀（8）、进液电磁阀（7）、抽气电磁阀（9）和放气电磁阀（10）的启闭；

通讯接口（32）由通讯线路（34）与上位计算机（33）连接；

电源模块（28）：输出端由电源线分别与加热器（20）、循环动力泵（19）、驱动真空泵的电机和中央处理单元（22）连接，输入端与外接电源连接；

液晶显示屏（26）：与中央处理单元（22）的显示输出端子连接，用于显示操作提示和各部件运行状态；

操作按钮（27）：与中央处理单元（22）的数据输入端子连接，用于人工控制各部件运行。

2.根据权利要求1所述的微生物快速检测设备，其特征在于：所述内盒的顶面在插瓶孔（4）的周围和外盒上盖的四周垫有橡胶垫（3），瓶塞（6）、测试温度传感探头（5）、内盒上方的隔热夹层和外盒的上盖固定为一体，形成密封盖体，密封盖体的上面连接有把手（13）。

3.根据权利要求1所述的微生物快速检测设备，其特征在于：所述样品瓶和参照瓶外表面涂有防辐射传热材料。

4.根据权利要求1所述的微生物快速检测设备，其特征在于：所述加热装置和抽真空装置、电源模块（28）以及中央处理单元（22）装在一个外壳（36）内，液晶显示屏（26）和操作按钮（27）嵌在外壳上，外壳上还留有连接电源的插口（29）。

5.一种应用权利要求1-4任意一项微生物快速检测设备的微生物快速检测方法，其特征在于：将装有被检测样品和参照物的瓶子放入同一密闭检测盒内，参照物是与样品物质完全相同、且采用不会改变参照物物理性质的手段彻底灭菌后得到的微生物的物质，检测前先使二者的起始温度达到一致，并在检测盒内保持恒温，在检测中避免每个瓶的热量散失和瓶间的热量传递，利用插入各瓶子内的流体温度探头在一段时间内采集传送的温度信号，并利用计算机绘制出各瓶内的温度-时间变化曲线，从样品温度-时间变化曲线中扣除参照物温度-时间变化曲线部分，并与计算机中存储的已有微生物温度-时间变化特性曲线进行比对，得出样品所含微生物数量及种类。

6.根据权利要求5所述的微生物快速检测方法，其特征在于具体检测步骤如下：

步骤一，打开微生物快速检测设备的开关，根据预先估计的样品含菌量选择检测时间；

步骤二，流体储热罐内的加热器开始预热；

步骤三，拔起检测盒的密封盖体，插入样品瓶和参照瓶，参照瓶中的参照物是与样品物质相同、采用物理方法彻底灭菌后得到的不含微生物的物质；

步骤四，对测试温度传感探头和瓶塞进行灭菌处理后，对准相应的瓶口，将密封盖体重新放下并加压密封；

步骤五，根据样品和参照物的初始温度，设定流体储热罐内流体的预设温度；

步骤六，待流体达到预设温度后，开启盒侧壁进液管和进液电磁阀，开动循环动力泵，将流体储热罐内的流体注入检测盒的内盒，循环均温；

步骤七，待各瓶温度一致后，抽出盒内流体；

步骤八，关闭放气电磁阀，开启抽气电磁阀，开启真空泵，使检测盒保持恒定真空度；

步骤九，开始实时采集各瓶的测试温度传感探头传送的温度信号，利用计算机绘制出各瓶内的温度-时间变化曲线；

步骤十，利用计算机计算检测菌落总数并判断微生物种类，从样品温度变化曲线中扣除参照物温度变化曲线部分，并与计算机中已有微生物温度-时间变化特性曲线进行比对，直接显示出样品所含微生物数量及种类；

步骤十一，检测完成后，开启放气电磁阀，让检测盒内恢复到常压，开启上盖，取出样品瓶和参照瓶。

7.根据权利要求6所述的微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤五中流体的温度比放入检测盒中的样品和参照物的初始最高温度高5-10℃，最高不超过45℃。

8.根据权利要求6所述的微生物快速检测设备，其特征在于：所述步骤六中流体与瓶表面不润湿，流体采用矿物油类。

9.根据权利要求6所述的微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤八中真空度范围为0.01-0.95大气压。

10.根据权利要求6所述的微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤十中检测菌落总数的计算过程为：

设样品瓶起始温度为Ty0，参照瓶起始温度为Tc0，样品瓶t 时刻的温度为Tyt，参照瓶t 时刻的温度为Tct，则从检测开始到t时刻，样品瓶的净温度增值：

ΔTyt = （Tyt-Ty0）-（Tct-Tc0）；                         

当检测设备设计合理，参数选择恰当，操作正常时，Ty0与Tc0十分接近，上式简化为：

ΔTyt = Tyt-Tct；                                        

将得到的ΔTyt与存于计算机中的标定数据比较，假定ΔTyt的大小位于数据库中同样条件下，同类样品的两个相邻数据ΔTy1和ΔTy2之间（ΔTy1<ΔTy2），它们相应的菌落总数分别为J1和J2，则该检测样品的菌落总数：

Jy = J1 + （ΔTyt-ΔTy1）（J2-J1）/（ΔTy2- ΔTy1）。

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