CN101690810B - 一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂，它由以下重量份的组分组成：9.5份中药多糖、0.5份中药皂苷、30份吐温-20；所述的中药多糖和中药皂苷均提取自以下重量份的中药原料：桔梗100、半夏80、黄芩80、金银花80、连翘80、麦冬65、山豆根40、甘草50、赤芍80、玄参60、白芍80、生地黄45、板蓝根90、牡丹皮75、黄连60。本发明的疫苗佐剂在疫苗的加工、贮用过程中对免疫原具有显著的保护作用，并能引导免疫原在特定的机体部位产生特定的免疫反应，它实现了中药归经、免疫佐剂和免疫原保护剂合三为一的目的。

Description

一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂，具体涉及一种专门针对鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗的免疫佐剂，及其制备方法。

背景技术

传统免疫佐剂是通过富集免疫原(如铝胶)、缓释免疫原(如油乳剂)、激活单核吞噬细胞递呈抗原(如卡介苗、细菌脂多糖)以及多种综合作用(如不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂)来实现对免疫原的强化免疫和改变免疫途径的佐剂作用。

动物机体在免疫原的刺激下主要发生哪类免疫反应，主要取决于免疫佐剂激发哪一类辅助T细胞(Th)。Th1主要诱导细胞免疫反应，它通过分泌IL-2、IFN-γ、TNF-b刺激T细胞发挥免疫反应；Th2主要诱导体液免疫反应，它通过分泌IL-4、IL-5、IL-10刺激B细胞发挥免疫反应，产生高水平的循环和分泌型抗体。铝胶型疫苗诱导的免疫反应90％以上为Th2型，主要产生IgG1和IgA；卡介苗和细菌脂多糖型疫苗诱导的免疫反应为Th1型占主导地位。

Morein首次提出免疫刺激复合物(ISCOM)，它是一个全新的免疫佐剂，由皂苷、胆固醇、磷脂等构成的直径为30-40nm的球形笼状颗粒(Cox JC，SjolanderA，Barr Ig.ISCOMs and other saponin based adjuvants[J].Adv Drug Deiv Rev，1998，32(3)：247-271)。这种佐剂的特征在于通过皂苷高效地将免疫原递呈给单核巨噬细胞，为免疫应答奠定了强大的基础。

近年来，中药免疫佐剂也层出不穷，比如蜂胶免疫佐剂、人参皂苷佐剂(ZL02110578.2)、当归多糖-内酯复合免疫佐剂(ZL 94115186.7)等等，它们都是利用中药有效成分激活机体免疫来实现免疫佐剂作用的。

但是，上述这些现有的免疫佐剂效果还不够理想，一方面是由于这些免疫佐剂在同类疫苗中具有普适性，因而其作用基理缺乏对具体疾病的针对性，不能够充分地激活基体的免疫；另一方面，这些佐剂在免疫原的加工制作过程中往往不能有效地保护免疫原的生物活性。

基于上述技术背景，我们将以中医药归经原理制成的特定中药多糖、中药皂苷添加到免疫原溶液中，不仅利用水化膜原理在免疫原表面形成水化膜，保护了免疫原活性蛋白的的三维立体构象和生物活性，而且能够更有针对性地激活机体对本类疾病的免疫功能。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种新的免疫佐剂，它利用中药归经特性不仅能够针对具体病原充分激活机体免疫，而且能够更加有效的保护免疫原的生物活性。

本发明的目的还在于：提供所述免疫佐剂的制备方法。

所述发明目的通过以下技术方案实现：

提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂，由以下重量份的组分组成：9.5份中药多糖、0.5份中药皂苷、30份吐温-20。

所述的中药多糖和中药皂苷均提取自以下重量份的中药原料：

桔梗100  半  夏80  黄  芩80  金银花80  连翘80

麦冬65   山豆根40  甘  草50  赤  芍80  玄参60

白芍80   生地黄45  板蓝根90  牡丹皮75  黄连60

由于新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感是以肺脏为主的五脏六腑功能失调的烈性急性混合传染病，所以建立了以归肺经为主兼五脏六腑为辅的清热解毒方剂。其中：归肺经中药包括桔梗、半夏、黄芩、金银花、连翘、麦冬和山豆根；归脾经中药包括甘草和赤芍；归肾经中药包括玄参；归肝经中药包括白芍和生地黄；归心经中药包括板蓝根、牡丹皮和黄连。

所述中药多糖是本发明免疫佐剂的主要成分，它在水溶液中使免疫原优先水化，起到蛋白保护剂的作用；在动物体内通过每种中药多糖特有的归经方式增强免疫原的免疫效果，起到免疫佐剂作用。

所述中药皂苷是表面活性分子物质，它们都有亲水-亲脂的双亲功能。中药皂苷的蛋白保护性和免疫佐剂作用很强；也以特有的归经方式增强免疫原的免疫效果，起到免疫佐剂作用。

吐温-20为亲水性较强的表面活性物质，亲水亲脂平衡值(HLB)在15.0以上。它主要作用是平衡佐剂的HLB，保持佐剂具有良好的水溶性。

本发明还提供所述免疫佐剂的制备方法，是将中药多糖、中药皂苷以及吐温-20按照所述比例混合，匀浆即制成本发明所述的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂。

其中，中药多糖和中药皂苷的提取可以通过现有技术中的多种手段实现，例如可以按照以下方法提取：

中药多糖的提取：

按比例取所述中药原料，经水煎、浓缩、乙醇沉淀、洗涤沉淀物，再通过浓缩并干燥，即制得所述的中药多糖；或将前一方法中得到的水煎浓缩液经活性炭柱层析，然后用水-乙醇洗涤液洗涤，再浓缩并干燥，即制得所述的中药多糖(卢艳花，中药有效成分提取分离技术，化学工业出版社，2005年1月第1版，295-314)。

中药皂苷的提取：

按比例取所述中药原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做如下的双向萃取和纯化：

a、往制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制的中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(1∶1体积比)的混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，去析出的中药皂苷干燥即可制得中药皂苷(卢艳花，中药有效成分提取分离技术，化学工业出版社，2005年1月第1版，172-194)。

本发明还提供所述佐剂在制备鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗中的应用，其中，所述佐剂在制备得到的疫苗中所占的体积比为2.0％～7.0％。

本发明所述的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂由两大部分组成，其中中药多糖和中药皂苷是核心，辅助部分为吐温-20。中药多糖、中药皂苷既有免疫增强的作用又有免疫原保护剂的作用。本发明利用它们实现了中药归经、免疫佐剂和免疫原保护剂合三为一的目的。

本发明所述佐剂的重要特征也体现在对中药归经理论的有针对性的运用上。中药归经是指中医临床用药时，中药通过经络的传导、转输，到达病所，发挥其防治作用的中药应用理论。现代的中西医结合研究和临床实践逐步证实了中医之肺为免疫屏障，脾促进免疫功能，肾为免疫治本，肝助免疫活动，心参与和调节免疫，将免疫的脏腑理论和西医的免疫理论有机地沟通起来，正确地指导了中药在免疫学中的科学实验和临床应用。

中药归经是以五脏六腑为中心的药理作用原理，使用不同归经的中药可以从不同的角度激发和增强机体免疫功能。归肺脾肾经的中药能够强化非特异免疫和特异免疫，增强单核细胞系统的吞噬能力，增强淋巴细胞转化，刺激T细胞分化、发育、成熟并分泌IL-1、IL-2和IFN-γ等淋巴因子，刺激B细胞分化、发育、成熟并分泌IgM、IgG、IgA等抗体；归肝心经的中药能够调节免疫功能，通过神经-内分泌-免疫三大系统的信息分子(如神经肽、神经递质、激素、淋巴因子、细胞因子等)纠正免疫功能的紊乱。

具体讲，肺主气属卫，外合皮毛(素问·五脏生篇)，不仅对外邪有机械屏障作用，而且通过粘膜的特殊结构以其生理生化功能在分泌液、溶菌酶、IgA等的参与下发挥非特异和特异免疫功能。肺主气，不单指气体交换，也包括中医的正气，即通过肺吞噬细胞的吞噬、补体C₃、C₆的生成、干扰素的产生、识别和处理抗原，激发、调节、参与机体免疫；

脾主运化，主统血，为生化之源，后天之本。“脾为之卫”(素问·五癃津液别篇)。卫气的生成，元气的充沛，正气的强弱，都有赖于脾胃的供养，脾气的健旺。卫气、元气、正气概括了机体的部分免疫功能，脾是免疫活动的物质基础之一。从现代免疫学的角度来看，中医之脾包括解剖学中的脾，也包括单核吞噬细胞系统、淋巴结、散在的淋巴组织。单核吞噬细胞不仅用非特异免疫功能，同时可以启动特异免疫功能；脾、淋巴结、散在的淋巴组织它们都是B细胞、T细胞存在的主要场所，因而也是细胞免疫和体液免疫的主要场所。因此，脾是免疫的核心；

肾为先天之本，生命之根。肾藏精，主骨，生精(素问·痿论篇)，对单核细胞、B细胞、T细胞等许多免疫细胞以及与免疫相关的细胞的分化、发育、成熟和功能的发挥有着重要的激发作用；

肝主疏泄，调达一身之气，使五脏六腑功能舒畅而不发生障碍，从而保证了机体的正常活动。中医的肝包括了现代医学的肝在内，肝内的吞噬细胞可以吞噬经血液从消化道带来的微生物等异物，处理并递呈抗原决定簇与B细胞、T细胞，发动免疫反应。肝气不畅，神经紊乱，内分泌失调，削弱了机体的免疫力，因此肝是不可忽视的免疫环节；

心主血脉，主神志(素问·灵兰秘典篇)。这说明心可以通过血液组分、血流循环、血管内皮、大脑皮层、部分植物神经、长神经丛等影响免疫功能。

本发明运用上述中药归经理论，选择和配制了特定的中药配方作为中药多糖和中药皂苷的来源，进一步强化了免疫佐剂对机体免疫功能的激发和调动。

与现有技术相比，本发明的免疫佐剂具有以下有益效果：

1.具有免疫原保护剂作用

本发明所述的佐剂是利用富含羟基的中药多糖和亲水亲脂的中药皂苷，构建多维网络空间氢键结构，在免疫原表面形成假性水化膜，通过这种多维网络空间氢键假性水化膜实现本发明佐剂对免疫原的保护作用。在这两种必须材料中，中药多糖好像钢筋、水泥、砖瓦一样，依免疫原以氢键(键能42KJ/mol)粘结在一起形成多维网络空间，为免疫原搭建了大厦居所；中药皂苷就像铆钉一样，亲水基团以氢键和中药多糖的羟基结合，亲脂基团以疏水键和免疫原的疏水基团结合，将免疫原牢牢固定在中药多糖多维网络空间内；这样形成了稳定、坚固的多维网络空间氢键假性水化膜，更好地保护免疫原免受外界环境的破坏。当免疫原在加工制作、贮用时，中药多糖形成的多维网络空间首先接受外界热能而水并无序地运动起来，但是由于多维网络空间的结构特点，致使中药多糖分子上的羟基在失水时能即刻与免疫原表面的氨基和羟基等直接形成氢键，导致了整个分子运动趋于零。这种多维网络空间氢键假性水化膜钝化了免疫原对外界热能的感应，减轻了免疫原分子内部次生键的振动和肽链的延伸，保持了免疫原的三位构象和生物活性。所以，本发明佐剂具有显著的免疫原保护剂的效果。因此使用本发明的免疫佐剂可以使免疫原更加稳定、更耐存储和更易运输。

相关实验如下：

1、使用本发明实施例4制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗和常规油乳剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗，置于37℃环境中，保存1月后，应用到下一步的临床试验中。

2、将30日龄SPF鸡40只，每组10只，分成4组。1组为本发明实施例4制备的疫苗37℃处理实验组，每只SPF鸡皮下注射37℃处理的本发明实施例4制备的疫苗0.5ml；2组为常规油乳剂苗37℃处理实验组，每只SPF鸡皮下注射37℃处理的常规油乳剂苗0.5ml；3组为本发明实施例4制备的疫苗低温保存实验组，每只SPF鸡皮下注射2-8℃保存本发明实施例4制备的疫苗0.5ml；4组为常规油乳剂苗低温保存实验组，每只SPF鸡皮下注射2-8℃保存常规油乳剂苗0.5ml。28日后，分别采血，分离血清，测定HI抗体效价。结果见下表1.

表1.本发明佐剂制备的疫苗与现有技术疫苗耐热、耐储存效果的比较

从上表可见，本实验结果充分展示了本发明佐剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗的耐热特性。一方面，本发明佐剂制备的疫苗在置于37℃环境中保存1月后，仍然能对鸡产生非常好的免疫效果，与低温保存下的产品没有明显区别；而通过同样方法处理过的常规油乳剂疫苗免疫鸡后，鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感的四种HI抗体效价与低温保存的相同产品相比出现大幅度下降，失去了免疫预防效果。另一方面，在2-8℃低温保存下，本发明佐剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗免疫效果同样明显高出常规油乳剂鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗。从而说明了本发明佐剂对免疫原的保护作用和强化免疫功效。

2.具有增强免疫的免疫佐剂作用

本发明佐剂的主要成分是中药提取物中药多糖和中药皂苷，依据前述的中药归经理论，本发明免疫佐剂中的中药多糖和重要皂苷能够保护免疫器官、增加免疫器官重量、增强单核吞噬细胞功能、增强T细胞功能、增强B细胞功能、增强NK细胞功能、增加补体含量和增强补体活性、诱生IL-1、IL-2、IFN、CSF、TNF等细胞因子，有效地激发和调节免疫功能。所以，本发明佐剂必然体现出增强免疫的免疫佐剂特征。

3.本发明佐剂具有中药归经的特殊药理作用

本发明佐剂首先利用中药多糖分子多维网络空间继承了传统免疫佐剂富集和缓释免疫原的特点，同时通过激活单核吞噬细胞实现类似弗氏佐剂的特点；其次也利用中药皂苷递呈免疫原的作用而继承了免疫刺激复合物(ISCOM)的特点。但本发明佐剂不是简单地继承了已有免疫佐剂的药理特点，而是在中医经络理论的指导下，应用中药归经的临床实践，赋予佐剂显著的中医药理作用特色，从不同的角度强化了免疫原的免疫性能：有的从肺经出发强化单核吞噬细胞的吞噬和递呈抗原作用，有的从脾经出发直接刺激T细胞和B细胞功能，有的从肾、肝、心经出发通过各种神经因子、激素因子和免疫因子在神经-内分泌-免疫三大系统间调节免疫功能，有的应用综合归经原理全面调动机体的免疫功能。

以上第2、3点的有益效果可以由以下实验进一步证明：

使用本发明佐剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗的临床预防效果实验：

【受试鸡情况】

受试鸡群为即将开始产蛋的鸡群，品种不受限制，饲养在曾经流行过鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感感染的老疫区。

【疾病诊断标准】

对实验中死亡的病鸡进行病理剖解诊断，确诊标准：

1、鸡新城疫

以病鸡腺胃乳头出血、肌胃角质膜下出血、小肠有岛屿状出血坏死为主要特征，兼下列任意两项或多项症状：

(1)、病鸡鸡冠紫红发黑，体温升高，呼吸困难，甩头流鼻涕；

(2)、歪脖点头，翅下垂腿麻痹，拉黄绿色稀便；

(3)、全身粘膜、浆膜出血，盲肠淋巴结出血，直肠出血；

(4)、卵泡出血、变形，输卵管、子宫出血。

2、传染性支气管炎

(1)、病鸡张嘴呼吸，伸颈打喷嚏，气管啰音；

(2)、产蛋率下降，产软蛋、畸形蛋，卵清稀薄；

(3)、气管粘膜水肿，存有透明粘液，气管和支气管交界处有干酪样阻塞物；

(4)、卵泡出血破裂，输卵管及子宫水肿、出血，肾肿大有时呈花般肾。

3、减蛋综合征

(1)、产蛋率下降，产软蛋、无壳蛋及畸形蛋；

(2)、卵泡发炎、变形、萎缩，输卵管萎缩，子宫粘膜水肿。

4、禽流感

以病鸡气管充血、出血和腺胃乳头化脓性出血、肌胃角质膜下出血、腺胃和肌胃间出血为主要特征，兼下列任意两项或多项症状：

(1)、病鸡鸡冠紫红发黑，体温升高，呼吸困难，甩头流鼻涕，脸肿，拉黄绿色稀便；

(2)、全身粘膜、浆膜出血；

(3)、卵泡变形易破裂，输卵管内有白色分泌物。

【实验及观察方法】

在鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感感染的老疫区的鸡场，将蛋鸡群分为三组，即本发明实施例4制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗免疫组(A)、常规鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗免疫组(B)和非免疫组(C)。在蛋鸡开产28和14天时，A、B组分别使用相应的疫苗进行免疫，C组注射生理盐水，方法是疫苗组每鸡肌肉注射0.5ml四联灭活疫苗，生理盐水组每只鸡肌肉注射0.5ml生理盐水。然后饲养100天，在整个饲养期间对发病鸡行进跟踪诊断，确定是否由鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感引起，并统计病鸡数，按以下方法计算出疫苗免疫保护率：

疫苗免疫保护率＝(免疫数-发病数)/免疫数×100％

【实验结果】

实验结束后统计实验结果得知，本发明免疫佐剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗免疫组(A)的免疫保护率88.36％，发病率11.64％；而常规鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗免疫组(B)的免疫保护率83.49％，发病率16.51％；生理盐水组(C)的鸡由鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感引起发病，发病率93.58％。通过应用生物统计学分别对三个实验组的保护率进行两两t检验，充分表明它们相互之间都存在极显著差异(u＞2.58，p＜0.01)，因此证明了本发明免疫佐剂制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗的免疫保护效果优于常规鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗。具体实验结果见表2。

表2.各实验组的免疫保护效果

注：表中“**”均表示与同指标的其他组数据比较具有高度显著性差异。

具体实施方式：

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的特征。

实施例1.制取中药多糖

来源：

桔梗100公斤、半夏80公斤、黄芩80公斤、金银花80公斤、连翘80公斤、麦冬65公斤、山豆根40公斤、甘草50公斤、赤芍80公斤、玄参60公斤、白芍80公斤、生地45公斤、板蓝根90公斤、牡丹皮75公斤、黄连60公斤。制备：

a、将实施例1所述的中药方剂原料切碎、洗净后，用冷水浸泡2小时至药心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加热至沸腾后在90℃的情况下，在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液。

b、将a制备的浓缩药液，再通过10000转/分离心20分钟，弃去沉淀物，获得上清液并经负压浓缩，使其形成干物质为25％的浓缩药液。

c、将b的浓缩药液加4-8倍的95％的乙醇，静置过夜，弃去乙醇上清液，沉淀物水浴加热除去乙醇或负压蒸馏除去乙醇，然后加水溶解并通过100KD滤膜过滤，除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质，收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤，除去有机小分子和无机分子及离子等杂质，被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时；取出浓缩至少量体积，加5倍量99％乙醇沉淀，搅拌，静置过夜，3000-5000转/分离心20分钟；沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥，即为中药多糖。

实施例2.中药皂苷的制备

将实施例1所述的中药方剂原料切碎、洗净后，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做双向萃取和纯化：

a、往水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(1∶1)的混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，去析出的中药皂苷干燥即可制得中药皂苷。

实施例3.本发明的佐剂合成

将实施例1中药多糖、实施例2中药皂苷以及市购吐温-20按照本发明佐剂的特征组成和重量公斤数，即中药多糖9.5公斤、中药皂苷0.5公斤、吐温-20 30公斤混合，10000转/分钟高速切割匀浆，即制成本发明的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂。

实施例4.本发明佐剂在鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗制备中的应用

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗系用鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、禽流感H9N2亚型A/chicken/Henan Puyang/2/98(H9N2)株(即HP株)分别接种鸡胚培养，减蛋综合征病毒Z16株接种鸭胚培养，收集胚液，超滤浓缩，经甲醛溶液灭活后，加入本发明的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂和常规矿物油佐剂混合乳化制成。

1毒种

制造本品用的毒种为鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、减蛋综合征病毒Z16、禽流感病毒H9N2亚型A/chicken/HenanPuyang/2/98(H9N2)株(即HP株)；效检用强毒为鸡新城疫病毒北京株(CVCCAV1611株)、禽流感病毒H9N2亚型HP株。La Sota株、M41株和鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611株)由中国兽药监察所鉴定、保存和供应；其余由河南农业大学禽病研究所鉴定、保管和供应。

2疫苗制造及半成品检验

2.1按照农业部批准《鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗(La Sota株+M41株+Z16株+HP株)制造及检验试行规程》进行半成品生产及检验。

2.2将检验合格的半成品进行浓缩，得到应用本发明佐剂的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗用毒液。

2.3灭活及灭活检验

将毒液进行灭活，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，检验合格后备用。

3鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗的制备

3.1油相制备

按体积份取94份注射用白油，和6份司本-80，混合后加热，然后在得到的溶液中加入硬脂酸铝2重量份(即按照2g/100ml的比例添加)，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

3.2本发明的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂水相制备

取本发明实施例3合成的免疫佐剂4～12％(v/v％)，分别装入4个罐中，灭菌，冷却，再分别加入鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒和禽流感H9N2亚型病毒的灭活胚液各96～88％(v/v％)，充分振摇，直至本发明完全溶解，分别制成4种水相。

3.3乳化

按体积份计，取3.1步制备的油相3份置油相罐内，开动电机慢速搅拌，同时分别徐徐加入3.2步制备的4种水相各1份，加完后再以10000r/min搅拌2-5分钟，在终止搅拌前，再按照1g/100ml的比例加入硫柳汞溶液，使硫柳汞最终重量百分比浓度为0.01％。乳化后，取样3-5ml，以3000r/min离心15分钟，应不分层。分别制成鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感H9N2亚型4种单苗后，将4种单苗等体积在乳化罐内充分混合，即制成四联苗。

3.4分装定量分装，加盖密封。

4成品检验

4.1性状

外观：黄白色乳剂。

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散。

稳定性：取疫苗10ml，装于离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不大于0.5ml。

粘度：用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应在8秒钟以内。

4.2无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.3安全检验

用1-2月龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。

4.4效力检验

4.4.1鸡新城疫部分：采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

4.4.1.1血清学方法：用30-60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只作对照。接种后21-28日，每只鸡各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶16，对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1∶4。

4.4.1.2免疫攻毒法：用30-60日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只作对照。接种后21-28日，每只鸡分别肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒(CVCCAV1611株)105.0ELD50，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应至少保护7只。

4.4.2鸡传染性支气管炎部分：用14-42日龄龄SPF鸡20只，各点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份，接种后21-28日分别采血，分离血清，同时再各接种本疫苗0.5ml，二次接种后21-28日再分别采血，分离血清。将两次血清分别作HI抗体效价测定。二免血清HI抗体效价的几何平均值(GMT)应较首免血清HI抗体效价的几何平均值高3倍以上。

4.4.3鸡减蛋综合征部分：用21-42日龄SPF鸡10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，另取SPF鸡10只作对照。21-35日后，分别采血，分离血清，测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体效价几何平均滴度应不低于1∶128，对照鸡HI抗体效价应不高于1∶4。

4.4.4禽流感部分：取21～42日龄SPF鸡15只，其中10只各颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照，21日后，分别采血，分离血清，用H9亚型HP株禽流感抗原测定HI抗体效价。免疫鸡HI抗体几何平均滴度应不低于1∶64，对照鸡HI抗体效价应不高于1∶4。

4.5甲醛、硫柳汞含量测定

分别按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合兽用生物制品通则规定。

5作用与用途

用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感，成年鸡免疫期为4个月。

6用法与用量

颈部皮下或肌肉注射。开产前一个月左右种鸡、蛋鸡，每只0.5ml。

Claims (5)

1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂，其特征在于：它由以下重量份的组分组成：9.5份中药多糖、0.5份中药皂苷、30份吐温-20；

所述的中药多糖和中药皂苷均提取自以下重量份的中药原料：

桔梗100   半  夏80    黄  芩80    金银花80    连翘80

麦冬65    山豆根40    甘  草50    赤  芍80    玄参60

白芍80    生地黄45    板蓝根90    牡丹皮75    黄连60

2.权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述的中药多糖是按照以下方法提取的：

1)将所述中药原料切碎、洗净后，用冷水浸泡2小时至药心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加热至沸腾后在90℃的情况下，在热回流浓缩工艺下煎煮180分钟同时浓缩得到浓缩药液；

2)将步骤1)制备的浓缩药液，再通过10000转/分离心20分钟，弃去沉淀物，获得上清液并经负压浓缩，使其形成干物质为25％的浓缩药液；

3)将步骤2)得到的浓缩药液加4-8倍的95％的乙醇，静置过夜，弃去乙醇上清液，沉淀物水浴加热除去乙醇或负压蒸馏除去乙醇，然后加水溶解并通过100KD滤膜过滤，除去杂蛋白、内毒素等大分子杂质，收集滤过液再通过1KD纳滤膜过滤，除去有机小分子和无机分子及离子等杂质，被截留的物质稀释后逆向水流透析24小时；取出浓缩至少量体积，加5倍量99％乙醇沉淀，搅拌，静置过夜，3000-5000转/分离心20分钟；沉淀物除去乙醇并经过喷雾干燥，即为中药多糖。

3.权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述的中药皂苷是按照以下方法提取的：

按所述比例取所述中药原料，用乙醇或甲醇提取，回收溶剂，取残渣饼用水溶解或混悬制成水溶液，然后再做如下的双向萃取和纯化：

a、往水溶液中加入石油醚或乙醚，将水溶液中的亲脂物质色素和油质回收，把中药皂苷留在水溶液中；

b、往a步制得的水溶液中加入亲水性较强的有机溶剂丁醇，溶液中亲水性较强的物质继续留在水溶液中，中药皂苷转移到有机溶剂萃取液中，收集有机溶剂萃取液，减压干燥，制得粗制中药皂苷；

c、将b步制得的粗制中药皂苷溶于乙醇或甲醇中，再逐渐滴加乙醚、丙酮或体积比为1∶1的乙醚-丙酮混合液，至中药皂苷从溶液中析出为止，将析出的中药皂苷干燥即可制得所述的中药皂苷。

4.权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：按照所述比例，将所述的中药多糖、中药皂苷以及吐温-20混合匀浆，即制成本发明所述的鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗佐剂。

5.权利要求1所述的疫苗佐剂在制备鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感四联灭活疫苗中的应用，其特征在于：所述佐剂在制备得到的疫苗中所占的体积比为2.0％～7.0％。